ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
  






LÊ LAN PHƯƠNG





XÁC ĐỊNH KHÁNG NGUYÊN PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH
CỦA BỆNH NHÂN UNG THƯ GAN





LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC






Hà Nội - 2012
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN





Lê Lan Phương





XÁC ĐỊNH KHÁNG NGUYÊN PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH
CỦA BỆNH NHÂN UNG THƯ GAN


Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: CH.60.42.30


LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC


NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS. Trịnh Hồng Thái


Hà Nội - 2012

MỤC LỤC

BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT a
DANH MỤC CÁC BẢNG d
DANH MỤC CÁC HÌNH e
MỞ ĐẦU 1
Chương 1 - TỔNG QUAN 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ GAN 3
1.1.1. Phân loại ung thư gan nguyên phát 3
1.1.2. Nguyên nhân dẫn tới ung thư gan 4
1.1.3. Các giai đoạn của ung thư gan 6
1.1.4. Các phương pháp chẩn đoán ung thư gan 8
1.2. NGHIÊN CỨU CHỈ THỊ SINH HỌC ĐỐI VỚI UNG THƯ 9
1.2.1. Chỉ thị sinh học đối với ung thư 9
1.2.2. Tiếp cận nghiên cứu chỉ thị sinh học đối với ung thư 10
1.2.3. Các loại chỉ thị sinh học đối với ung thư gan 11
1.3. MIỄN DỊCH CHỐNG UNG THƯ 13
1.3.1. Đáp ứng miễn dịch chống ung thư 13
1.3.2. Kháng nguyên ung thư 13
1.3.3. Chỉ thị ung thư liên quan đến đáp ứng miễn dịch 14
1.4. NGHIÊN CỨU PROTEOMICS MIỄN DỊCH UNG THƯ GAN 15
1.4.1. Khái quát về proteomics và ứng dụng của proteomics 15
1.4.2. Hệ protein gan người 16
1.4.3. Nghiên cứu proteomics miễn dịch ung thư gan 17
Chương 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 24
2.1. NGUYÊN LIỆU 24
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 24

2.1.2. Hóa chất 24
2.1.3. Thiết bị 25
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25
2.2.1. Xử lý mẫu mô gan 25

2.2.2. Định lượng protein theo phương pháp Bradford 27
2.2.3. Điện di hai chiều 27
2.2.4. Western Blot 28
2.2.5. Phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều, kết quả Western Blot 29
2.2.6. Cắt và thủy phân spot trên bản gel điện di hai chiều 30
2.2.7. Phân tích khối phổ và nhận dạng protein 31
Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 33
3.1. TÁCH CHIẾT PROTEIN TỪ MÔ GAN 33
3.2. PHÂN TÍCH HÌNH ẢNH BẢN GEL ĐIỆN DI HAI CHIỀU 34
3.2.1. Phân tách hệ protein mô gan trên bản gel diện di hai chiều 34
3.2.2. Phân tích biểu hiện của protein trên bản gel điện di hai chiều 36
3.3. NHẬN DẠNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP MALDI-TOF MS 41
3.4. THẨM TÁCH MIỄN DỊCH - WESTERN BLOT HAI CHIỀU 44
3.4.1. Xác định tỷ lệ pha loãng kháng thể bậc một thích hợp 44
3.4.2. Kết quả Western Blot hai chiều 46
3.5. ĐẶC ĐIỂM, VAI TRÒ CỦA CÁC PROTEIN BIỂU HIỆN KHÁC BIỆT 47
3.5.1. Protein liên quan đến chu trình tế bào và apoptosis 50
3.5.2. Protein liên quan đến quá trình miễn dịch và bảo vệ cơ thể 52
3.5.3. Protein tham gia cấu trúc tế bào 53
3.5.4. Protein tham gia các quá trình trao đổi chất 54
3.5.5. Protein liên quan đến quá trình phiên mã, dịch mã và cải biến 55
3.5.6. Protein có phản ứng miễn dịch với huyết tương 56
KẾT LUẬN 60

KIẾN NGHỊ 61
TÀI LIỆU THAM KHẢO 62
PHỤ LỤC i
Phụ lục 1. Danh sách bệnh nhân ung thư tế bào gan i
Phụ lục 2. Phân tách protein mô gan của 5 bệnh nhân HCC trên bản gel điện di
hai chiều ii

Phụ lục 3. Kết quả nhận dạng protein bằng cơ sở dữ liệu NCBI sử dụng phần
mềm Mascot vi
Phụ lục 4. Kết quả phản ứng Western Blot mẫu mô gan của 3 bệnh nhân HCC
viii


a

BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT
α
1
AT
Alpha-1-antitrypsin
ABC
Ammonium bicarbonate
AcCN
Acetonitrile
ACTB
Beta-actin
AFP
Alpha fetoprotein
AFB1
Aflatoxin B
1

CATD
Cathepsin D
CHAPS
3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonic acid
CHCA

α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid
cs
Cộng sự
Da
Dalton
DTT
Dithiothreitol
ELISA
Enzyme-linked immunosorbent assay
(Xét nghiệm hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme)
GS
Glutamine synthetase
HBV
Hepatitis B virus (Virus viêm gan B)
HBsAg
Hepatitis B surface Antigen (Kháng nguyên bề mặt virus viêm
gan B)
HCC
Hepatocellular carcinoma (Ung thư tế bào biểu mô gan)
HCV
Hepatitis C virus (Virus viêm gan C)
HLPP
Human Liver Proteome Project (Dự án Proteome gan người)
HPT
Haptoglobin
HUPO
Human Proteome Organisation (Tổ chức Proteome người)
HRP
Horse - radish peroxidase


b

HSP
Heat shock protein (Protein sốc nhiệt)
IAA
Iodoacetamide
IEF
Isoelectric Focusing (Điện di phân vùng đẳng điện)
IPG
Immobilized pH gradient (Gradient pH cố định)
LC-MS/MS
Liquid Chromatography coupled with tandem Mass Spectrometry
(Sắc ký lỏng kết nối với khối phổ)
MALDI-TOF
Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight
MFAP3
Microfibrillar-associated protein 3
MHC
Mayjor Histocampatibility Complex
(Phức hệ phù hợp tổ chức mô chủ yếu)
MS
Mass spectrometry (Khối phổ)
Mw
Molecular weight (Khối lượng phân tử)
PBS
Phosphate Buffer Saline (Đệm muối phosphate)
PCNA
Proliferating cell nuclear antigen
PDIA1
Protein disulfide-isomerase

PDIA3
Protein disulfide-isomerase A3
PMF
Peptide Mass Fingerprint (Đặc trưng khối peptide)
PMSF
Phenylmethanesulfonyl fluoride
PVDF
Polyvinylidene fluoride
p53
Cellular tumor antigen p53
SDS
Sodium dodecyl sulfate
SDS-PAGE
SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis
(Điện di trên gel polyacrylamide có SDS)
SEREX
Serological Analysis of Recombinant cDNA Expression Libraries
(Phân tích huyết thanh bằng thư viện biểu hiện cDNA tái tổ hợp)
SODC
Superoxide dismutase [Cu-Zn]

c

SODM
Mn-SOD
Superoxide dismutase [Mn]
Manganese superoxide dismutase
Spot
Điểm protein
ST7L

Suppressor of tumorigenicity 7 protein-like
TAA
Tumour Associated Antigen
(Kháng nguyên liên quan đến ung thư)
TAP
Transporters of Antigen Peptide
(Phân tử vận chuyển peptide kháng nguyên)
TFA
Trifluoroacetic acid
TNM
Tumor Node Metastasis
(Kích thước khối u - Hạch Lympho - Di căn)
TSA
Tissue Specific Antigen (Kháng nguyên đặc hiệu mô)
TSTA
Tumour Specific Transplantation Antigen
(Kháng nguyên ghép đặc hiệu ung thư)


d

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1. Tiêu chuẩn phân kỳ lâm sàng bệnh ung thư gan 7
Bảng 2. Các chỉ thị ung thư gan mới được công bố (20 năm gần đây) 12
Bảng 3. Các hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu 24
Bảng 4. Các bước chạy điện di đẳng điện trên thanh strip dài 7cm và 17cm 28
Bảng 5. Tổng số spot trên mỗi bản gel điện di hai chiều 36
Bảng 6. Thống kê các spot biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thư so với mô gan
bình thường của từng bệnh nhân trên bản gel 2-DE 17cm, pH 3 - 10 39
Bảng 7. Thống kê các spot biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thư so với mô gan

bình thường của từng bệnh nhân trên bản gel 2-DE 7cm, pH 4 - 7 39
Bảng 8. Danh sách các protein biểu hiện khác biệt trên bản gel của mô gan ung thư
so với mô gan bình thường được xác định dựa trên cơ sở dữ liệu EMBL 40
Bảng 9. Danh sách các protein được xác định bằng MALDI-TOF MS từ bản gel mô
gan ung thư so sánh với mô gan đối chứng của bệnh nhân HCC 42
Bảng 10. Tóm tắt chức năng chính của các protein biểu hiện khác biệt giữa mô gan
ung thư so với mô gan đối chứng đã đươc nhận dạng 48



e

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1. Ung thư gan xuất phát từ chính tế bào gan 3
Hình 2. Cơ chế gây ung thư của các tác nhân ung thư gan 5
Hình 3. Quy trình chiết protein từ mô gan 26
Hình 4. Phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều sử dụng phần mềm Phoretix . 30
Hình 5. Điện di kiểm tra các phân đoạn dịch chiết protein từ mô gan bình thường và
mô gan ung thư trên gel polyacrylamide 10% có SDS 33
Hình 6. Phân tách protein mô gan của bệnh nhân 8460 trên bản gel điện di hai chiều
35
Hình 7. Hình ảnh 3-D của spot trên bản gel điện di hai chiều 37
Hình 8. Minh họa các spot biểu hiện khác biệt giữa bản gel mô ung thư so với bản
gel mô bình thường 37
Hình 9. Các spot biểu hiện khác biệt giữa bản gel 2-DE mẫu mô gan ung thư so với
mô gan bình thường của bệnh nhân HCC mã 8935 38
Hình 10. Phân tích khối phổ các peptide thu được sau khi thủy phân spot protein
C-256-B bằng trypsin 41
Hình 11. Phân tách protein chiết từ mô gan bệnh nhân HCC trên gel polyacrylamide
và màng PVDF chuẩn bị cho phản ứng Western Blot 45

Hình 12. Kết quả phản ứng Western Blot khi ủ màng với dung dịch kháng thể bậc 1
có độ pha loãng khác nhau 45
Hình 13. Kết quả phản ứng Western Blot mẫu mô gan của bệnh nhân 8977 47
Hình 14. Tỷ lệ các nhóm protein tham gia vào các quá trình sinh học khác nhau 50
Hình 15. Sơ đồ nhận diện kháng nguyên nhờ protein MHC lớp I 58
LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng
1

M U
Ung thư gan hiện là một trong các loại ung thư phổ biến nhất trên thế giới và
Việt Nam, đây là bệnh ung thư có tỷ lệ tử vong cao, hơn nữa, tỷ lệ mắc bệnh đang có
xu hướng tăng lên. Theo thống kê năm 2008, ước tính trên thế giới có khoảng
748.300 trường hợp mắc ung thư gan và 695.900 ca tử vong do ung thư gan. Việt
Nam thuộc khu vực Đông Nam Á là nơi có tỷ lệ mắc ung thư gan cao nhất [18]. Theo
thống kê của bệnh viện K, nước ta có tỷ lệ mắc ung thư gan nguyên phát cao do
nhiễm virus viêm gan B và virus viêm gan C [41]. Do đó, việc nghiên cứu về tác
nhân gây bệnh, cơ chế và phương pháp chẩn đoán, phát hiện sớm ung thư gan có vai
trò quan trọng đối với việc giảm tỷ lệ mắc và giảm tỷ lệ tử vong ở loại ung thư này.
Hiện nay, các phương pháp xét nghiệm lâm sàng như: sinh thiết gan, chụp
cắt lớp vi tính, siêu âm chẩn đoán hình ảnh và xác định các chỉ thị sinh học như
anpha fetoprotein là các “tiêu chuẩn vàng” để chẩn đoán ung thư gan. Tuy nhiên,
các xét nghiệm này có nhiều hạn chế do chỉ phát hiện được bệnh vào giai đoạn
muộn làm giảm khả năng sống sót của bệnh nhân ung thư gan [38]. Nhu cầu đặt ra
là phải tìm kiếm các chỉ thị sinh học mới giúp chẩn đoán, phát hiện ung thư gan ở
giai đoạn sớm.
Trong những năm gần đây, các nhà khoa học đang tập trung nghiên cứu tìm
kiếm các chỉ thị ung thư gan sử dụng công cụ proteomics. Phần lớn các protein có
trong huyết tương đều được tổng hợp từ gan. Mô gan của bệnh nhân ung thư gan
cũng có khả năng tổng hợp nhiều protein liên quan đến khối u. Do đó, các tín hiệu
protein trong mô gan có thể dùng làm công cụ để chẩn đoán sự tiến triển của bệnh

gan, phát triển chẩn đoán phân tử [29]. Hơn nữa, nhiều nghiên cứu đã chứng minh
rằng các protein nội bào có liên quan đến quá trình hình thành khối u, kích thích đáp
ứng miễn dịch sinh ra các tự kháng thể [26] và nhiều kháng nguyên ung thư đã được
xác định trong cơ thể bệnh nhân ung thư [27]. Vì thế, các tự kháng thể có thể được
dùng để chẩn đoán lâm sàng ung thư và dùng trong phân tích proteomics để nhận
dạng các kháng nguyên liên quan đến khối u có khả năng liên quan đến sự chuyển
LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng
2

dạng ác tính của tế bào. Đây là hướng nghiên cứu mới nhằm tìm kiếm các chỉ thị
sinh học ung thư liên quan đến đáp ứng miễn dịch.
Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu:
“Xác định kháng nguyên phản ứng miễn dịch của bệnh nhân ung thư gan”
nhằm mục đích:
- Tìm hiểu sự biểu hiện của các protein ở mô gan ung thư so với mô gan bình
thường của bệnh nhân ung thư gan thông qua các điểm protein trên bản gel điện di
hai chiều.
- Nhận dạng được một số protein khác biệt đặc trưng giữa mô gan ung thư so
với mô gan bình thường.
- Xác định được protein có phản ứng miễn dịch (kháng nguyên ung thư gan)
đặc hiệu với các kháng thể trong huyết tương bệnh nhân ung thư gan.
Đề tài được thực hiện tại Phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc
Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại học
Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng
3

- TNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ GAN
Ung thư gan là một trong các dạng bệnh lý phổ biến nhất trên thế giới và tỷ

lệ tử vong do ung thư gan xếp hàng thứ ba trên tổng số các trường hợp tử vong do
ung thư. Tại Mỹ, từ năm 2004 đến 2008, tỷ lệ mắc mới ung thư gan mỗi năm tăng
3,6% ở nam giới và 3% ở nữ giới, xu hướng này đã tồn tại từ năm 1992. Các nhà
nghiên cứu dự đoán trong năm 2012 sẽ có khoảng 28.720 trường hợp mắc mới ung
thư gan, hơn 80% trong số đó là ung thư tế bào biểu mô gan [8].
Ung thư gan gồm hai dạng là ung thư gan nguyên phát và ung thư gan thứ
phát (di căn). Ung thư gan nguyên phát là ung thư xuất phát từ các loại tế bào gan
(hình 1). Ung thư gan thứ phát là do các tế bào ung thư của các cơ quan, bộ phận
khác trong cơ thể di chuyển theo dòng máu hoặc mạch bạch huyết tới gan và định
khu tại đây, hình thành khối u. Ung thư di căn gan không mang các đặc trưng của
ung thư xuất phát từ gan, vì vậy, trong phạm vi luận văn này, chúng tôi chỉ đề cập
tới ung thư gan nguyên phát với dạng phổ biến nhất là ung thư tế bào biểu mô gan
(Hepatocellular Carcinoma - HCC) thường gọi là ung thư gan [49].

Hình 1t phát t chính t bào gan [49]
1.1.1. Phân loi an nguyên phát
Dựa vào phân loại mô bệnh học và loại tế bào phát sinh ung thư, ung thư gan
nguyên phát được phân thành các loại chính như sau [42]:
LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng
4

- Ung thư tế bào biểu mô gan là dạng ung thư biểu mô hay gặp nhất trong ung
thư gan. Ung thư bắt nguồn từ các tế bào biểu mô, đây là loại tế bào gan chủ yếu, do
đó, HCC chiếm 85 - 95% các trường hợp ung thư gan nguyên phát [32].
- Ung thư tế bào ống mật, đây là dạng ung thư bắt đầu ở các đường mật nhỏ
trong gan. Dạng ung thư này chỉ chiếm khoảng 5 - 15% [32]. Nguy cơ mắc dạng
ung thư này sẽ tăng cao khi bệnh nhân bị sỏi mật, loét đường tiêu hóa hay nhiễm
các dạng ký sinh trùng trong gan.
- Ung thư biểu mô hỗn hợp, đây là dạng ung thư hiếm gặp, tế bào ung thư gồm
cả tế bào biểu mô gan và tế bào ống mật.

- U nguyên bào gan là loại u gan ác tính ở trẻ em, hiếm gặp ở người lớn. U
nguyên bào gan xuất hiện có thể do các gene hoạt động bất thường.
- Ung thư tế bào mạch là loại ung thư rất hiếm gặp, nó bắt nguồn từ mạch máu
trong gan do gan tiếp xúc với các hóa chất công nghiệp như vinyl chlorid hoặc các
hóa chất gây ung thư.
1.1.2. Nguyên nhân dn t
Mặc dù vẫn còn nhiều tranh cãi về cơ chế chính xác dẫn đến ung thư gan,
song các nghiên cứu đều chỉ ra rằng tác nhân gây ung thư là đa nhân tố và quá trình
tiến triển thành ung thư rất phức tạp, phải trải qua nhiều bước [39]. Các yếu tố nguy
cơ chính có thể tiến triển thành HCC bao gồm: các tác nhân gây bệnh như nhiễm
virus viêm gan B (Hepatitis B virus - HBV), virus viêm gan C (Hepatitis C virus -
HCV) dẫn tới viêm gan mạn tính; xơ gan; các loại hóa chất như: rượu, aflatoxin B1,
vinyl chlorid, asen hoặc các rối loạn trao đổi chất như nhiễm sắt ở mô, bệnh thiếu
hụt α
1
- antitrypsin [38]. Tuy rằng, các yếu tố nguy cơ có thể tác động đến tế bào
gan theo các con đường khác nhau nhưng cuối cùng đều làm biến đổi di truyền và
dẫn đến hình thành tế bào ung thư (hình 2).
LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng
5


Hình 2.  13]
Theo số liệu hồi cứu năm 2006 của Wong và cộng sự (cs) cho thấy, nhiễm
HBV mạn tính được xem như là yếu tố nguy cơ chính dẫn đến HCC. Các bệnh nhân
có phản ứng dương tính với kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B (HBsAg) có
nguy cơ phát triển thành HCC cao gấp 70 lần so với người có phản ứng âm tính
HBsAg. Nhiễm HBV là một bệnh phổ biến ở các nước Đông Nam Á, Trung Quốc,
Đài Loan, Hàn Quốc, Châu Phi, tại những vùng này có tới 85% - 95% bệnh nhân
HCC dương tính với HBsAg. Nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng việc HBV chèn

DNA của mình vào hệ gene người bệnh sẽ làm mất tính ổn định của nhiễm sắc thể,
hoạt hóa các gene gây ung thư hoặc gây bất hoạt các gene ức chế khối u như TP53.
Ngoài ra, các sản phẩm protein của HBV có thể gây rối loạn chu trình tế bào, tạo
điều kiện cho sự tiến triển của các tác nhân gây ung thư, đồng thời hoạt hóa các yếu
tố phiên mã và promoter của các gene cần thiết cho hoạt động sống của virus [38].
Nhiễm virus viêm gan C mạn tính cũng là một yếu tố nguy cơ dẫn đến ung
thư gan. Ở các nước phát triển như Nhật Bản, Ý, Pháp và một số nước thuộc Nam
Âu, tỷ lệ bệnh nhân ung thư gan có tiền sử viêm gan C chiếm đa số [14]. Các nhà
Luận văn cao học Lê Lan Ph-ơng
6

nghiờn cu ó phỏt hin ra rng protein lừi ca HCV cú th tỏc ng ti quỏ trỡnh
sinh trng t bo bng cỏch kỡm hóm hot ng phiờn mó ca promoter p53 [38].
ng nhim HCV v HBV lm tng nguy c mc ung th gan t 2 n 6 ln so vi
nhim c lp mt loi virus.
Aflatoxin l nhng cht gõy ung th cú c tớnh cao c hỡnh thnh khi
thc phm v nc b nhim nm Aspergillus flavus v Aspergillus parasiticus.
cỏc nc ang phỏt trin thuc Chõu Phi hay mt s ni Chõu , ngi dõn n
cỏc thc phm nhim aflatoxin thỡ nguy c mc ung th gan cng tng. Aflatoxin cú
th trc tip lm tn thng gene TP53 gõy bt hot protein p53. ng nhim
aflatoxin B
1
(AFB1) v HBVs gõy ra bin i p53 gc serine 249. HBV lm hot
húa cỏc cytochrome P450 gõy bt hot quỏ trỡnh trao i AFB1 to ra cht gõy t
bin l AFB1-8,9-epoxide v cỏc hp cht cha oxy cú kh nng hot ng húa hc
mnh lm t bo mn cm vi AFB1 [14].
Ngoi ra, cỏc yu t khỏc nh tui, gii tớnh v chng tc cng gúp phn lm
tng nguy c b ung th gan. Nam gii cú nguy c b ung th gan cao hn n gii
t hai n ba ln. Mt s nghiờn cu v ni tit ó ch ra rng, th th hormone gii
tớnh cú biu hin thay i trong khi u HCC [29]. Kt qu iu tra dõn s M cho

thy nhng ngi gc Chõu cú t l ung th cao nht, ngi M da en cng cú
t l mc ung th cao hn so vi ngi da trng.
Ti Vit Nam, theo s liu thng kờ ti bnh vin Vit c trong nm 2008,
s bnh nhõn nam mc u gan cao gp 3 ln so vi bnh nhõn n; s bnh nhõn b u
gan cú phn ng dng tớnh vi HBsAg chim 65,9% tng s bnh nhõn u gan;
bnh nhõn u gan trong tui t 20 n 60 tui chim 73,88%, bnh nhõn u gan
thuc nhúm tui di 20 v trờn 60 tui ch chim 26,12% [ti liu cha cụng b].
1.1.3. Cỏc giai n c
Cn c theo Tiờu chun phõn k lõm sng Quc t bnh ung th (nm 1993),
thụng qua cỏc chn oỏn lõm sng, s dng k thut hỡnh nh xỏc nh kớch c
khi u nguyờn phỏt v tỡnh trng b xõm ln cỏc mch mỏu, cỏc giai on ca ung
LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng
7

thư gan được mô tả ở bảng 1 [45, 32]. Ngoài cách phân giai đoạn theo kích thước u,
hạch lympho, di căn (Tumor Node Metastasis - TNM), ung thư gan còn được phân
loại thành 4 giai đoạn, gồm: giai đoạn I, II, IIIA/B/C và giai đoạn IV [32].
Bng 1. Tiêu chun phân k lâm sàng bn [32]
Phân loi TNM
T
N
n
T
1
- Có 1 khối u không xâm
lấn đến mạch máu xung quanh.
N
0
- Không có hạch di căn.
M

0
- Không có sự di căn tới
vùng xa.

Giai đoạn I
T
1
, N
0
, M
0

T
2
- Một khối u đã xâm lấn
mạch máu hoặc nhiều khối u
trên một lá gan, đường kính u
không quá 5cm.

Giai đoạn II
T
2
, N
0
, M
0

T
3
- Có nhiều khối u đường

kính lớn hơn 5cm hoặc một
khối u xâm lấn đến tĩnh mạch
cửa hoặc phân nhánh chính của
tĩnh mạch cửa gan.

Giai đoạn IIIA
T
3
, N
0
, M
0

T
4
- Một hoặc nhiều khối u
xâm lấn trực tiếp tới các cơ
quan khác hoặc làm thủng phúc
mạc tạng.
N
1
- Có hạch bạch huyết di căn

Giai đoạn IIIB
T
4
, N
0
, M
0


Giai đoạn IIIC
T bt k
N
1
, M
0

M
1
- Có di căn tới vùng xa

Giai đoạn IV
T bt k
N bt k
M
1

Luận văn cao học Lê Lan Ph-ơng
8

1.1.4
Gan c cu to ch yu bi cỏc t bo biu mụ gan, loi t bo ny cú kh
nng tỏi sinh mnh nh phõn bo liờn tc, do ú, ung th gan phỏt trin rt nhanh,
kớch thc gan cú th tng gp ụi sau 4 thỏng. Cỏc triu chng ca HCC thng
bc l khi bnh ó nghiờm trng v khi u ó ln, vỡ vy, vic phỏt hin HCC vo
giai on mun gõy khú khn trong vic iu tr, õy chớnh l lý do dn n t l t
vong do HCC rt cao, chim khong 70% cỏc trng hp t vong do ung th trờn
ton th gii [14].
Hin nay, phỏt hin HCC ch yu da vo vic xột nghim mỏu nh

lng alpha fetoprotein (AFP) trong huyt thanh. AFP l mt glycoprotein cú khi
lng 70kDa, c tng hp gan v tỳi noón hong ca thai, sau ú c tit vo
huyt thanh tun th 13 ca thai k. Sau khi sinh, nng AFP trong huyt thanh
gim v ngi bỡnh thng khe mnh ch cũn 3 - 5ng/ml, rt khú phỏt hin
c ngi trng thnh. AFP cú th c dựng sng lc ngi cú nguy c b
ung th gan cao [39]. Tuy vy, AFP trong mỏu khụng c trng cho ung th gan vỡ
nng AFP cú th cng tng trong mt s trng hp khỏc: thai nghộn bỡnh
thng, viờm gan giai on phc hi, viờm gan mn tớnh, ung th t bo mm nh
ung th tinh hon hay mc mt s dng ung th khỏc nh ung th d dy, ung th
ng mt [5]. Xột nghim AFP cng khụng nhy bi cú khong 15% - 30% bnh
nhõn ung th gan m hm lng AFP vn khụng tng [39], nht l i vi cỏc khi
u gan nh hn 3cm.
Hm lng AFP cao cú th ngh n ung th gan nhng khụng th l yu t
quyt nh chc chn. Vỡ th, chn oỏn ung th gan cn kt hp xột nghim nh
lng AFP v chn oỏn hỡnh nh bng siờu õm, chp ct lp vi tớnh hay chp cng
hng t cú th thy c hỡnh dng, kớch thc v kt cu ca khi u, nhng
chn oỏn chớnh xỏc u lnh tớnh hay ỏc tớnh thỡ nht thit phi sinh thit gan. Tuy
nhiờn, sinh thit gan gõy nguy c chy mỏu cao, dũ dch mt, vt bm mỏu v nhim
khun cú th xy ra, ng thi tng nguy c bin u lnh tớnh chuyn dng thnh ỏc
LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng
9

tính và thúc đẩy di căn [50]. Do đó, cần tìm kiếm các chỉ thị sinh học có độ nhạy và
độ đặc hiệu cao hơn để hỗ trợ cho AFP giúp chẩn đoán sớm ung thư gan [26].
1.2. NGHIÊN CỨU CHỈ THỊ SINH HỌC ĐỐI VỚI UNG THƯ
Chỉ thị sinh học là các phân tử được tìm thấy trong máu, các loại dịch của cơ
thể hoặc trong mô đặc trưng cho một quá trình sinh lý hoặc các giai đoạn bệnh lý.
Chỉ thị sinh học có thể được dùng để xem xét đáp ứng của cơ thể đối với một phác
đồ điều trị bệnh hoặc một trạng thái nhất định [46].
1.2.1. Ch th sinh hi vi 

Ngày nay, chỉ thị sinh học là một trong những công cụ quan trọng nhất để
phát hiện sớm ung thư, xác định chính xác sự tiến triển của bệnh, tiên lượng và theo
dõi điều trị ung thư nhằm kéo dài thời gian sống, giảm tỷ lệ tử vong ở bệnh nhân
ung thư. Các chỉ thị ung thư là những đại phân tử xuất hiện ở một bệnh ung thư, có
nồng độ thay đổi theo chiều hướng tăng lên liên quan đến sự phát sinh và tăng
trưởng của những khối u ác tính. Chỉ thị ung thư là những chất do các tế bào hoặc
mô ung thư tổng hợp và tiết ra từ khối u bị phá vỡ hoặc được tạo ra từ các phản ứng
của cơ thể đối với khối u, gồm hai dạng: chỉ thị tế bào và chỉ thị thể dịch. Chỉ thị
ung thư dạng tế bào bao gồm: các kháng nguyên bề mặt các tế bào, các thụ thể
hormone và thụ thể yếu tố tăng trưởng, những biến đổi di truyền (biến đổi gene) của
tế bào. Chỉ thị ung thư dạng thể dịch bao gồm: các chất được phát hiện ở những
nồng độ không bình thường có mặt trong huyết thanh, nước tiểu, các loại dịch của
cơ thể [3].
Dựa vào khả năng đặc hiệu với bệnh, chỉ thị ung thư có thể được phân loại
và đánh giá theo các tiêu chí sau [3]:
- Đặc hiệu cao: chỉ thị ung thư không tìm thấy ở đối tượng khỏe mạnh hoặc u
lành tính.
- Độ nhạy cao: chỉ thị ung thư dễ phát hiện ở giai đoạn sớm khi chỉ có một tế
bào ung thư xuất hiện.
LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng
10

- Đặc hiệu cơ quan: chỉ xuất hiện ở cơ quan bị ung thư.
- Xuất hiện tương quan với giai đoạn ung thư và kích thước khối u.
- Tương quan với tiên lượng về thời gian sống.
- Có giá trị dự báo.
Đối với ung thư gan, chỉ thị ung thư được ứng dụng theo hai hướng chính
sau [29]:
- Sàng lọc các nhóm nguy cơ cao để xác định được ung thư khi kích thước
khối u còn nhỏ (< 3cm) để có liệu pháp điều trị hiệu quả.

- Xác nhận chẩn đoán ung thư ở những bệnh nhân có khối u lớn đã được phát
hiện nhờ chụp X quang.
1.2.2. Tip cn nghiên cu ch th sinh hc i v
Hiện nay, có ba cách tiếp cận đang được áp dụng rộng rãi để nghiên cứu các
chỉ thị sinh học phục vụ cho việc chẩn đoán phân tử, phát hiện sớm ung thư [17].
- Sử dụng các kỹ thuật genomics để xác định, nhận dạng các gene lạ có liên
quan đến các loại ung thư riêng biệt. Tuy nhiên, kết quả của các nghiên cứu này mới
chỉ cung cấp thông tin về khả năng mắc bệnh chứ không thể biết được nguy cơ thực
sự của bệnh.
- Phương pháp proteomics xác định được hầu hết các protein có triển vọng trở
thành các protein chỉ thị ung thư. Các kỹ thuật proteomics có thể xác định chính xác
đặc điểm bệnh học phân tử của khối u, tiên lượng bệnh, dự đoán được các ảnh
hưởng của việc điều trị và giúp phát triển lĩnh vực y học cá nhân. Hạn chế của
phương pháp này là một số protein chỉ thị ung thư chỉ được tìm thấy ở trong mô ung
thư mà không có mặt trong máu.
- Sử dụng các hệ thống dò tìm dựa vào kháng thể để nhận dạng các kháng
nguyên ung thư. Song do có hiện tượng phản ứng chéo trong phản ứng miễn dịch,
do đó, kết quả của phương pháp này không đảm bảo tính đặc hiệu.
Luận văn cao học Lê Lan Ph-ơng
11

S kt hp cỏc phng phỏp trờn s lm tng tin cy cho cỏc ch th phõn
t, tng tớnh chớnh xỏc khi chn oỏn bnh. K thut proteomics õy cú vai trũ rt
quan trng, b sung cho k thut genomics v dũ tỡm khỏng th nhn dng khỏng
nguyờn khi u. K thut ny ó c ỏp dng rng rói nghiờn cu ch th phõn t
ca nhiu dng ung th khỏc nhau [17]. S phỏt trin ca cỏc k thut genomics,
proteomics giỳp chỳng ta m rng hiu bit v bn cht sinh hc ca ung th; ngy
cng phỏt hin v s dng c nhiu phõn t ch th vi nhy v tớnh c hiu
cao trong chn oỏn lõm sng.
1.2.3. Cỏc loi ch th sinh hi v

i vi nghiờn cu ung th gan, cỏc phng phỏp trờn u ó c ỏp dng
tỡm ra cỏc ch th phõn t, bao gm c DNA v protein, c bit l cỏc khỏng th
c hiu. Mt trong nhng hng nghiờn cu quan trng nht l phõn tớch tỡm ra
cỏc ch th phõn t nhn dng kiu hỡnh ỏc tớnh ca t bo. Cỏc phõn t ch th
ny bao gm: cỏc phõn t tham gia vo quỏ trỡnh tng sinh t bo, gõy bin i
DNA; gene TP53; cỏc protein khỏc tham gia iu khin chu trỡnh t bo; cỏc gene
gõy ung th v cỏc th th ca chỳng; cỏc yu t liờn quan n s cht theo chng
trỡnh ca t bo v s hot ng ca telomerase. Mt hng nghiờn cu khỏc l tỡm
ra cỏc ch th phõn t liờn quan n quỏ trỡnh xõm ln v di cn ca ung th, cỏc ch
th phõn t loi ny gm cỏc phõn t bỏm dớnh (Adhesion), cỏc enzyme thy phõn
protein lm gim cht gian bo, cỏc yu t sinh trng tham gia vo s hỡnh thnh
mch giỳp khi u phỏ v v bc, di cn n cỏc v trớ khỏc trong c th [31].
Cho n nay, ngoi AFP ó c xỏc nh cú giỏ tr, cú nhiu ch th sinh
hc khỏc ó c nghiờn cu chn oỏn HCC. Trong mt nghiờn cu tng quan
v ch th ung th gan, tỏc gi Hong Vn Sn (2011) ó lit kờ mt s ch th ung
th gan ang c nghiờn cu (bng 2). a s cỏc ch th mi ny vn ang c
nghiờn cu lõm sng, trong ú, ch th huyt thanh AFP-L3, des-gamma-carboxy-
prothrombin (DCP), glypican-3 (GPC-3) cú nhiu ha hn [5].

LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng
12

Bng 2. Các ch th c công b [5]
Loi
STT
Tên ch th sinh hc

Chỉ thị trong
huyết thanh
1

AFP gắn LCA
1991
2
AFP gắn Lectin L3
1993
3
AFP gắn concanavalin
1995
4
DCP
1997
5
Methyl hóa gene P16
1999
6
Telomerase
2000
7
Transforming Growth Factor β1
2002
8
AFP monosialyl
2002
9
Insulin-like growth Factor II
2003
10
Glutamate carboxypeptidase
2003
11

NH
2
Fragment GPC-3
2004
12
Telomerase reverse transcriptase mARN
2007
13
Interleukin-6
2009
Chỉ thị ở mô
14
Glypican-3
2009
15
Heat shock protein 70
2009
16
Glutamin synthetase
2009
Trong những năm gần đây, các nhà nghiên cứu trên thế giới đã công bố
nhiều chỉ thị ung thư nhằm phát hiện sớm, sàng lọc, chẩn đoán chính xác và theo
dõi điều trị HCC. Đa số các chỉ thị mới này hiện vẫn đang được nghiên cứu trên lâm
sàng. Do đó, hướng nghiên cứu chỉ thị sinh học ung thư gan vẫn đang được triển
khai và tiếp tục phát triển. Hiện nay, các nhà khoa học đang tập trung theo hướng
nghiên cứu tìm kiếm các protein kháng nguyên liên quan đến khối u, các protein
này kích thích sinh ra kháng thể trong huyết thanh, đây cũng là các dạng chỉ thị ung
thư tiềm năng.

LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng

13

1.3. MIỄN DỊCH CHỐNG UNG THƯ
1.3.1. ng min dch ch
Khi nghiên cứu ung thư thực nghiệm, có nhiều bằng chứng thể hiện có sự
kiểm soát của hệ thống miễn dịch của vật chủ đối với kháng nguyên ung thư. Mặc
dù, một số ung thư có thể lẩn tránh khỏi sự kiểm soát của hệ thống miễn dịch bằng
nhiều cơ chế như dung nạp, kháng thể phong bế, gây suy giảm miễn dịch, nhưng
phần lớn ung thư có đáp ứng miễn dịch [7].
Các tế bào ung thư có thể bị phân hủy bởi các tế bào tham gia đáp ứng miễn
dịch không đặc hiệu, gồm: đại thực bào, tế bào giết tự nhiên và bạch cầu ưa axít.
Đáp ứng miễn dịch loại này không cần có kháng thể hay kháng nguyên đặc hiệu.
Trong đáp ứng miễn dịch đặc hiệu chống ung thư, vai trò của đáp ứng miễn dịch
dịch thể không rõ bằng đáp ứng miễn dịch tế bào, song các nghiên cứu cũng chứng
minh được sự có mặt của các kháng thể đặc hiệu trong ung thư. Nhiều nghiên cứu
ung thư ở động vật thực nghiệm đã chứng minh vai trò của tế bào T độc (Tc) trong
phân hủy tế bào khối u khi đáp ứng miễn dịch đặc hiệu tế bào. Quá trình này đòi hỏi
phải hoạt hóa tế bào TCD
8
+
bởi các tế bào trình diện kháng nguyên có mang MHC
lớp I và các cytokin tương ứng (Interleukin-2, Interleukin-4) [7].
1.3.2
Khi tế bào bình thường chuyển dạng thành tế bào ung thư, quá trình này làm
xuất hiện các protein mà tế bào bình thường không có hoặc có rất ít. Các protein
này là các kháng nguyên ung thư và “lạ” đối với cơ thể và trở thành đích của các tế
bào đáp ứng miễn dịch tự nhiên và đáp ứng miễn dịch đặc hiệu. Dưới đây là một vài
loại kháng nguyên ung thư [7]:
- Kháng nguyên ghép đặc hiệu ung thư (Tumour specific transplantation
antigen - TSTA), kháng nguyên này được phát hiện khi ghép các mảnh ung thư. Khi

đó, TSTA sẽ kích thích cơ thể nhận sinh đáp ứng miễn dịch chống ung thư ghép.
Đặc điểm TSTA của ung thư do hóa chất hoặc tia xạ là tính đặc hiệu kháng nguyên
phụ thuộc vào mô ung thư, chứ không phụ thuộc vào hóa chất gây ung thư. Ngược
LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng
14

lại, TSTA của ung thư do virus gây ra có tính đặc hiệu phụ thuộc vào chủng virus,
không phụ thuộc vào mô ung thư. Tuy nhiên, đáp ứng miễn dịch đặc hiệu chống
TSTA chỉ mới được xác định trong thực nghiệm ghép ung thư.
- Kháng nguyên đặc hiệu mô (Tissue specific antigen - TSA) là kháng nguyên
có trên bề mặt các tế bào bình thường và có đặc tính riêng cho từng loại tổ chức.
Ung thư xuất hiện từ mô nào thường biểu hiện kháng nguyên đặc hiệu ở mô đó.
TSA không kích thích đáp ứng miễn dịch chống ung thư, song nó có thể sử dụng
làm đích cho miễn dịch điều trị và làm chỉ thị tìm nguồn gốc xuất phát mô ung thư.
- Kháng nguyên liên quan đến ung thư (Tumour associated antigen - TAA) là
kháng nguyên phát hiện được trong các loại ung thư mà không có hoặc có rất ít
trong tế bào mô bình thường. Ở người, kháng nguyên này được xác định bằng các
kháng thể đơn dòng [7].
TAA là các peptide hay protein đặc hiệu khối u, chúng có thể biểu hiện tăng
hoặc giảm bất thường, bị đột biến hay cuộn gấp sai gây ra đáp ứng miễn dịch ung
thư. Vì vậy, nghiên cứu nhằm tìm ra các chỉ thị ung thư là các TAA giúp chẩn đoán
sớm ung thư có vai trò quan trọng. Nhiều chỉ thị sinh học là các TAA đã được xác
định, như kháng nguyên ung thư phôi thai (Carcino embryonic antigen - CEA) đặc
trưng cho ung thư ruột kết, protein AFP đặc trưng cho ung thư gan, CA19-9 cho
ung thư dạ dày - ruột và CA-125 cho ung thư buồng trứng [34].
1.3.3. Ch th ng min dch
Hiện nay, các nghiên cứu xác định chỉ thị sinh học ung thư đang được tiến
hành theo hai hướng: hướng thứ nhất là xác định tự kháng thể trong huyết thanh của
bệnh nhân ung thư bắt nguồn từ những kháng nguyên ung thư. Hướng thứ hai là xác
định sớm ung thư dựa vào việc phát hiện ra các kháng nguyên liên quan đến khối u.

Khi tế bào bình thường chuyển dạng ác tính thành tế bào ung thư, trong khối
u xuất hiện các protein biểu hiện bất thường, bị đột biến hoặc biến đổi sau dịch mã,
đây chính là các kháng nguyên liên quan đến ung thư. Nhiều nghiên cứu đã chứng
minh các TAA gây ra đáp ứng miễn dịch sinh ra các kháng thể kháng TAA trong
Luận văn cao học Lê Lan Ph-ơng
15

huyt tng v mt s TAA ó c xỏc nh trong c th bnh nhõn ung th [27].
Hn na, t bo ung th cng gii phúng nhiu protein vo mỏu. Do ú, hng
nghiờn cu chn oỏn sm ung th da vo xột nghim mỏu, huyt tng ca bnh
nhõn ung th xỏc nh TAA ang rt c quan tõm.
Bờn cnh ú, trong quỏ trỡnh ỏp ng min dch chng ung th, trong huyt
thanh ca bnh nhõn ung th cú xut hin cỏc t khỏng th c hiu chng li cỏc
khỏng nguyờn ca chớnh c th. Cỏc t khỏng th ny mang nhiu c im u vit
khin chỳng tr thnh nhng ch th phõn t giỳp phỏt hin ung th giai on
sm: (a) c xỏc nh giai on sm ca bnh do phn ng min dch gia cỏc
t khỏng th v cỏc TAA xy ra giai on u ca quỏ trỡnh hỡnh thnh khi u,
chỳng l kt qu ca quỏ trỡnh khuch i qua h min dch ca con ngi; (b) cú
kh nng khỏng li quỏ trỡnh phõn gii protein v trỏnh c s chuyn húa phõn t.
Do ú, i sng ca chỳng kộo di khong 21 ngy; (c) cỏc t khỏng th cú mt
trong huyt thanh ca bnh nhõn, nờn cú th c xỏc nh, phõn tớch bng cỏc k
thut n gin nh cỏc xột nghim mỏu [28].
1.4. NGHIấN CU PROTEOMICS MIN DCH UNG TH GAN
1.4.1. Khỏi quỏt v proteomics v ng dng ca proteomics
Proteomics l mt lnh vc khoa hc nghiờn cu v proteome - sn phm ca
genome hay chớnh l tp hp cỏc protein c biu hin trong t bo, mụ hoc c th
nhng iu kin v ti thi im xỏc nh [23].
Mc ớch ca nghiờn cu proteomics l nhn din c tt c cỏc protein
c mó húa trong h gene ca sinh vt v xỏc nh: (a) phm vi v phng thc
biu hin, hot ng ca h protein cỏc kiu t bo v loi mụ khỏc nhau; (b) s

phõn b di mc t bo; (c) nhng ci bin sau dch mó; (d) mi tng tỏc vi
nhng protein v thnh phn khỏc; (e) mi quan h cu trỳc - chc nng Ngoi ra,
nghiờn cu proteomics cng cung cp nhng hiu bit tng th v s biu hin ca
cỏc protein nhng trng thỏi sinh lý, phỏt trin v bnh lý khỏc nhau [2].