ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



NGUYỄN PHƢƠNG THÖY


NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH VIRUT ROTA LƢU HÀNH GÂY
BỆNH TIÊU CHẢY TRẺ EM VÀO BỆNH VIỆN NHI
KHÁNH HÕA NĂM 2010






LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC




Hà Nội – Năm 2013

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN PHƢƠNG THÖY





NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH VIRUT ROTA LƢU HÀNH
GÂY BỆNH TIÊU CHẢY TRẺ EM VÀO BỆNH VIỆN
NHI KHÁNH HÕA NĂM 2010

Chuyên ngành : Vi sinh vật học
Mã số : 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. LÊ THỊ LUÂN



Hà Nội – Năm 2013


Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý

1. MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chƣơng 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1 SƠ LƢỢC LỊCH SỬ PHÁT HIỆN VIRUT ROTA 3
1.2 HÌNH THÁI VÀ CẤU TRÖC 3
1.2.1 Hình thái 3
1.2.2 Cấu trúc 4
1.3 PHÂN NHÓM VÀ CÁC TÝP HUYẾT THANH 10
1.3.1 Phân nhóm 10
1.3.2 Týp huyết thanh 11
1.4 TÍNH CHẤT LÝ HÓA 11
1.4.1 Tính bền vững với PH 11
1.4.2 Tính chịu nhiệt 11
1.4.3 Tính nhạy cảm 12
1.4.4 Tính đề kháng 12
1.5 ĐẶC TÍNH VIRUT ROTA TRÊN TẾ BÀO NUÔI CẤY MÔ 12
1.6 QUÁ TRÌNH NHÂN LÊN CỦA VIRUT ROTA 13
1.7 KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CỦA VIRUT ROTA 15
1.7.1 Khả năng gây bệnh cho trẻ em 15
1.7.2 Khả năng gây bệnh ở ngƣời lớn 15
1.7.3 Cơ chế gây bệnh 16
1.8 DỊCH TỄ HỌC BỆNH TIÊU CHẢY CẤP DO VIRUT ROTA 16
1.8.1 Nguồn bệnh 16


Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý

1.8.2 Đƣờng lây truyền 16
1.8.3 Mùa bệnh 16
1.8.4 Lứa tuổi mắc bệnh 17

1.8.6 Miễn dịch 17
1.9 SỰ PHÂN BỐ CÁC KIỂU GEN CỦA VIRUT ROTA 18
1.9.1 Phân bố trên thế giới 18
1.9.2 Phân bố tại Việt Nam 19
1.10 TÌNH HÌNH MẮC BỆNH TIÊU CHẢY CẤP VÀ VẮC XIN PHÕNG NGỪA
BỆNH TiÊU CHẢY CẤP DO VIRUT ROTA 20
1.10.1Tình hình mắc bệnh tiêu chảy cấp do virut Rota trên thế giới và Việt Nam 20
1.10.1.1 Tình hình mắc bệnh do virut Rota trên thế giới 20
1.10.1.2 Tình hình mắc bệnh do virut Rota tại Việt Nam 21
1.10.2 Tình hình sử dụng vắc xin phòng ngừa bệnh tiêu chảy cấp do virut Rota 22
1.10.2.1 Các chủng virut Rota đƣợc cân nhắc để phát triển vắc xin 22
1.10.2.2 Các loại văc xin đƣợc nghiên cứu và sử dụng 23
1.11 CÁC PHƢƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN VIRUT ROTA 25
1.11.1 Các kỹ thuật phát hiện virut Rota………………………………………… 25
1.11.2 Các kỹ thuật phát hiện kháng thể virut Rota 26
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27
2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 27
2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27
2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 27
2.2.2Phƣơng pháp thực hiện 28
2.2.2.1 Lấy mẫu bệnh phẩm 28
2.2.2.2 Xác định virut Rota trong mẫu bệnh phẩm bằng phƣơng pháp ELISA 29
2.2.2.3 Phƣơng pháp tách chiết ARN từ mẫu phân 32
2.2.2.4 Phƣơng pháp xác định týp virut Rota bằng RT – PCR 34
2.2.2.5 Chạy điện di và đọc kết quả 40


Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý

2.2.2.6 Phƣơng pháp thống kê xử lý số liệu 42

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 43
3.1 XÁC ĐỊNH TỶ LỆ TCC DO VIRUT ROTA TẠI BỆNH VIỆN NHI KHÁNH
HÕA NĂM 2010 43
3.2 TỶ LỆ BỆNH NHÂN TCC DO VIRUT ROTA THEO THÁNG 44
3.3 TỶ LỆ BỆNH NHÂN TCC DO VIRUT ROTA THEO NHÓM TUỔI 47
3.4 TỶ LỆ BỆNH NHÂN TCC DO VIRUT ROTA THEO GIỚI TÍNH 50
3.5 ĐẶC TÍNH CÁC CHỦNG VIRUT ROTA LƢU HÀNH TẠI BỆNH VIỆN NHI
KHÁNH HÕA NĂM 2010 51
3.5.1 Đặc tính chủng P 51
3.5.2 Đặc tính chủng G 56
3.6 Sự lƣu hành các chủng tổ hợp G – P của virut Rota 61
3.6.1 Sự phân bố các chủng tổ hợp G – P tại miền Trung 61
3.6.2 Sự lƣu hành các chủng tổ hợp G – P theo thời gian 62
KẾT LUẬN 64
KIẾN NGHỊ 65
TÀI LIỆU THAM KHẢO 66
2.


Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ADN
Deoxyribonucleic Acid
Axit Deoxyribonucleic
CDC
Centers for Disease Control
and Prevention
Trung tâm Kiểm soát và phòng chống
bệnh, Mỹ

ELISA
Enzyme-linked
immunosorbent assay
Kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme
Gmix
Mixed G-genotype
Chủng virut Rota có kiểu gen G hỗn hợp
Gnt
Untypable G- genotype
Chủng virut Rota không thể xác định kiểu
gen G
IgA
Immuno globulin A
Globulin miễn dịch A
IgG
Immuno globulin G
Globulin miễn dịch G
NSP
Non-structure Protein
Protein không cấu trúc
OD
Optical density
Mật độ quang học
Pmix
Mix P-type
Chủng virut Rota có kiểu gen P hỗn hợp
Pnt
Untýpable P-genotype
Chủng virut Rota không thể xác định kiểu
gen P

ARN
Ribonucleic Acid
Axit Ribonucleic
RT-
PCR
Reverse transcription
polymerase chain reaction
Phản ứng chuỗi Polymerase phiên mã
ngƣợc
TCC

Tiêu chảy cấp
WHO
World Health Organization

Tổ chức Y tế Thế giới



Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý

3. DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1. Đặc điểm chuỗi nucleotit các đoạn gen của virut Rota [16,18] 5
Bảng 2. Các gen và protein của virut Rota [6,8] 7
Bảng 3. Týp huyết thanh của virut Rota [6,8] 11
Bảng 4. Sự phân bố các chủng lƣu hành trên toàn cầu, năm 2001 – 2008 [66] 18
Bảng 5. Các chủng virut Rota đƣợc cân nhắc để phát triển vắc xin [6] 22
Bảng 6. Các primer đƣợc sử dụng để định týp G và týp P 35
Bảng 7. Bảng tra kích thƣớc các kiểu gen G, P sau khi điện di 41
Bảng 8. Tỷ lệ TCC do virut Rota hàng năm tại Việt Nam [1,2,3] 44

Bảng 9. Phân bố theo tháng tỷ lệ trẻ mắc bệnh TCC do virut Rota 45
Bảng 10. Tỷ lệ mắc virut Rota theo nhóm tuổi tại bệnh viện Nhi Khánh Hòa năm
2010 47
Bảng 11. Tỷ lệ mắc bệnh do virut Rota theo giới tính 50
Bảng 12. Tỷ lệ lƣu hành các kiểu gen P tại bệnh viện nhi Khánh Hòa năm 2010 52
Bảng 13. Sự phân bố các kiểu gen theo khu vực trong cả nƣớc 53
Bảng 14. Tỷ lệ các kiểu gen P lƣu hành theo thời gian 55
Bảng 15. Tỷ lệ lƣu hành các kiểu gen G tại bệnh viện nhi Khánh Hòa năm 2010 57
Bảng 16. Sự phân bố các chủng G theo khu vực 58
Bảng 17. Tỷ lệ lƣu hành các kiểu gen G theo thời gian 59
Bảng 18. Sự lƣu hành các chủng G – P tại miền Trung năm 2010 61
Bảng 19. Sự lƣu hành các chủng tổ hợp G – P theo thời gian 62



Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý

4. DANH MỤC HÌNH
Hình 1. Hình ảnh virut Rota chụp dƣới kính hiển vi điện tử [58] 4
Hình 2. Hình minh họa cấu trúc của virut Rota 5
Hình 3: Tái dựng hình ảnh của virut Rota dựa trên hình ảnh chụp qua kính hiển vi
điện tử 9
Hình 4: Chu trình nhân lên của virut Rota trong tế bào 14
Hình 5. Sự phân bố số bệnh nhân tử vong theo khu vực trên thế giới và số bệnh nhân tử
vong tại các quốc gia Châu Á [33] 21
Hình 6. Sơ đồ tóm tắt quy trình thực hiện 28
Hình 7. Sơ đồ mô tả nguyên lý của phƣơng pháp ELISA 29
Hình 8. Kết quả ELISA khi chƣa cho chất dừng phản ứng 31
Hình 9. Kết quả ELISA sau khi cho chất dừng phản ứng 31
Hình 10. Đọc kết quả mẫu bệnh phẩm trên máy ELISA 32

Hình 11. Vị trí các Primer và bản sao ADN thu đƣợc để xác định kiểu gen G 36
Hình 12. Vị trí các Primer và bản sao ADN thu đƣợc để xác định kiểu gen P 36
Hình 13. Ảnh minh họa vị trí mẫu trên bản gel 41
Hình 14. Ảnh minh họa kiểu gen G phân tích trên gel agarose 2% 42
Hình 15. Ảnh minh họa kiểu gen P phân tích trên gel agarose 2% 42
Hình 16. Tỷ lệ bệnh nhi mắc bệnh TCC vào bệnh viện Nhi Khánh Hòa 43
năm 2010 43
Hình 17. Biểu đồ tỷ lệ trẻ em mắc bệnh TCC do virut Rota theo tháng tại các khu vực . 46
Hình 18. Sự phân bố TCC do virut Rota theo nhóm tuổi 49
Hình 19. Tỷ lệ trẻ dƣơng tính với virut Rota phân bố theo giới tính tại bệnh viện nhi
Khánh Hòa năm 2010 50
Hình 20. Kết quả điện di trên gel agarose xác định kiểu gen P 51
Hình 21. Tỷ lệ các kiểu gen P tại bệnh viện nhi Khánh Hòa năm 2010 52
Hình 22: Sự phân bố các kiểu gen theo khu vực trong cả nƣớc 53
Hình 23. Sự phân bố kiểu gen P theo thời gian 55


Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý

Hình 24. Kết quả điện di trên gel agarose xác định kiểu gen G 56
Hình 25. Sự phân bố các kiểu gen G lƣu hành tại miền Trung năm 2010 57
Hình 26. Sự lƣu hành các kiểu gen G tại miền Trung năm 2009 và năm 2010 60
Hình 27. Sự phân bố các tổ hợp G – P của virut Rota 61
Hình 28. Sự lƣu hành các chủng tổ hợp G – P theo thời gian 62


Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý

1
ĐẶT VẤN ĐỀ

Virut Rota đƣợc phát hiện vào đầu những năm 70 của thế kỷ XX, là một
virut ARN sợi đôi, thuộc họ Reovitridae [37]. Virut Rota là một trong những
nguyên nhân quan trọng nhất gây viêm dạ dày ruột mà không do vi khuẩn ở trẻ nhỏ
dƣới 5 tuổi. Tuy nhiên ngƣời ta cũng quan sát thấy ở trẻ lớn hơn và cả ở ngƣời lớn.
Virus rota đƣợc đánh giá là đã gây ra 40% trong tổng số vụ nhập viện do tiêu
chảy của trẻ dƣới 5 tuổi trên toàn cầu và gây ra mỗi năm 100 triệu ca tiêu chảy cấp
cùng 450 đến 800 nghìn ca tử vong [67]. Ở các nƣớc phát triển có 35% - 52% trẻ
em bị tiêu chảy cấp (TCC) do virut Rota. Còn ở các nƣớc đang phát triển, virut Rota
là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tiêu chảy và tử vong ở trẻ dƣới 2
tuổi. Ƣớc tính hàng năm ở những nƣớc này có trên 12,5 triệu trẻ em dƣới 5 tuổi bị
TCC do virut Rota và khoảng 873.000 trƣờng hợp tử vong [50],[51].
Tại Việt Nam, hàng năm tỷ lệ mắc tiêu chảy do virut Rota chiếm trên 50%
trong số trẻ dƣới 5 tuổi bị tiêu chảy vào điều trị tại 1 số bệnh viện Nhi lớn của Việt
Nam. Số trẻ chết do virut Rota chiếm từ 4% - 8% trong tổng số trẻ dƣới 5 tuổi bị
chết vì mọi nguyên nhân [6].
Bệnh lây lan theo đƣờng phân – miệng, từ ngƣời sang ngƣời nên trong điều
kiện vệ sinh của nƣớc ta còn kém thì bệnh rất dễ lây lan thành vụ dịch lớn. Virut
Rota khi xâm nhập vào cơ thể nhân lên ở ruột non, phá hủy tế bào trụ niêm mạc ruột
gây ra các rối loạn dẫn đến tình trạng mất nƣớc và điện giải, bệnh nhân suy sụp rất
nhanh nếu không đƣợc chuẩn đoán và điều trị kịp thời rất dễ dẫn đến tử vong.
Hiện nay, trên thế giới đã cấp phép lƣu hành hai loại vắc xin là: vắc xin
Rotarix của hãng Glaxo Smith Kline và Rotateq của Merck. Các vắc xin này đƣợc
sử dụng ở nhiều quốc gia nhƣng hiệu lực bảo vệ lại khác nhau theo khu vực, điều
này đƣợc giải thích là do tính đa dạng về di truyền của các chủng virut Rota và sự
lƣu hành các chủng có sự biến đổi theo không gian và thời gian [6,8].
Tại Việt Nam đã sản xuất đƣợc vắc xin virut Rota uống, từ chủng phổ biến
G[1]P[8] đã đƣợc làm giảm độc lực Kết quả thử nghiệm lâm sàng đƣợc đánh giá là
đạt về mức độ an toàn trên cơ thể ngƣời lớn và trẻ em [5]. Việc giám sát dịch tễ học



Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý

2
và xác định đặc tính của các chủng virut Rota trong thời gian dài trên thế giới cũng
nhƣ tại Việt Nam, trƣớc và sau khi sử dụng vắc xin là cơ sở đánh giá hiệu quả của
các vắc xin đang sử dụng, sự biến đổi bất thƣờng của các chủng virut Rota để từ đó
có hƣớng phát triển vắc xin mới hiệu quả hơn.
Xuất phát từ thực tiễn trên, để góp phần đánh giá tình hình tiêu chảy cấp do
virut Rota ở Việt Nam, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu:
“ Nghiên cứu đặc tính virut Rota gây bệnh tiêu chảy ở trẻ em vào bệnh
viện Nhi Khánh Hòa năm 2010” nhằm các mục tiêu sau:
1. Xác định tỷ lệ bệnh nhi bị tiêu chảy cấp do virut Rota tại bệnh viện Nhi
Khánh Hòa và mối liên quan của bệnh này với yếu tố mùa, tuổi, giới.
2. Xác định đặc tính các týp virut Rota lƣu hành tại bệnh viện Nhi Khánh Hòa.


















Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý

3
5. CHƢƠNG 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 SƠ LƢỢC LỊCH SỬ PHÁT HIỆN VIRUT ROTA
Năm 1943, Jacob Light và Horace Hodes đã chứng minh rằng các tác nhân đi
qua màng lọc vi khuẩn có khả năng gây ra tiêu chảy cho bò. Năm 1972, Kapikian
lần đầu tiên phát hiện ra chủng virut có liên quan đến bệnh tiêu chảy và đặt tên là
Norwalk[14]. Năm 1973 Bishop R.F và cộng sự quan sát bằng kính hiển vi điện tử
mảnh sinh thiết ruột non của trẻ em chết vì bệnh tiêu chảy cấp thấy có virut giống
nhƣ Reovirus (Reovirus – like), có đƣờng kính 70nm và ông đặt tên cho virut này là
Rotavirus vì hình thể của nó rất giống cái bánh xe với các nan hoa. Năm 1974,
Flewett. Bryden, Midleton cũng đề cập tới vai trò của virut Rota trong bệnh viêm dạ
dày ruột. Sau này những nghiên cứu về hình thái học bằng âm bản những lát cắt cực
mỏng của tổ chức nhiễm virut Rota, quan sát dƣới kính hiển vi điện tử cho phép xác
định virut Rota thuộc họ Reoviridae [15,18].
Ở Việt Nam mãi đến năm 1980 mới nghiên cứu và xác định virut này là
nguyên nhân chính gây nên bệnh tiêu chảy ở trẻ em. Từ năm 1998 đến nay, đƣợc sự
hợp tác và tài trợ của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), Trung tâm Kiểm soát và
Phòng ngừa bệnh tật CDC-Atlantta- Mỹ, Trung tâm nghiên cứu, sản xuất vắc xin và
Sinh phẩm y tế đã tiến hành giám sát bệnh tiêu chảy do virut Rota và xác định các
chủng lƣu hành phổ biến tại Việt Nam [6,8].
1.2 HÌNH THÁI VÀ CẤU TRÖC
1.2.1 Hình thái
Hạt virut trƣởng thành dạng khối cầu 20 mặt, đƣờng kính khoảng 75nm. Dƣới
kính hiển vi điện tử virut Rota giống hệt nhƣ một cái bánh xe có các gai ngắn và một
cái vành rất nhẵn. Tên “Rota” tiếng La tinh có nghĩa là “bánh xe” xuất phát từ hình
thái của nó.[58]



Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý

4

Hình 1. Hình ảnh virut Rota chụp dƣới kính hiển vi điện tử [58]
1.2.2 Cấu trúc
Virut Rota có dạng khối cầu 20 mặt, đƣờng kính khoảng 75nm, chuỗi
nucleocapsit của virut đƣợc tạo thành bởi 3 vòng xoắn đồng tâm. Vỏ Capsit của
virut Rota có dạng đối xứng 20 mặt, 132 capsomer sắp xếp đối xứng xoắn
[15,19,58]
 Cấu trúc capsit của virut Rota gồm 3 lớp rõ rệt.
 Lớp ngoài chứa protein cấu trúc VP4 và VP7 .
 Lớp trong chứa protein cấu trúc VP6 là loại kháng nguyên đặc hiệu nhóm,
chiếm 50% hạt virut và có thể đƣợc phát hiện trong kỹ thuật ELISA.
 Lớp lõi chứa protein cấu trúc VP1, VP2 và VP3.
Các nghiên cứu bằng kỹ thuật điện di miễn dịch và kính hiển vi điện tử đã
khẳng định: Capsit trong mang kháng nguyên đặc hiệu nhóm, capsit ngoài mang
kháng nguyên đặc hiệu týp, nhân của virut không mang tính kháng nguyên .


Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý

5

Hình 2. Hình minh họa cấu trúc của virut Rota
Chú thích : Neutralization antigen: Kháng nguyên trung hoà
Subgroup antigen : Kháng nguyên phân nhóm
Core : Lõi

 Hệ gen:
Bộ gen của virut rota gồm 11 đoạn ARN sợi kép, có độ lớn khoảng 18.555
cặp bazơ, trọng lƣợng phân tử của 11 đoạn ƣớc tính từ 10.10
6
- 14.10
6
Dalton. Mỗi
gen có khối lƣợng phân tử từ 2.10
5
- 2,2.10
6
Dalton và mã hoá cho một protein cấu
trúc hoặc không cấu trúc, trừ gen 9 và gen 11 [8,13,28].
Bảng 1. Đặc điểm chuỗi nucleotit các đoạn gen của virut Rota [16,18]
Đoạn gen
Số cặp Bazơ
Tỷ lệ G + C ( %)
Số axit amin
1
3.302
34,60
1.088
2
2.690
32,90
881
3
2.591
28,90
835

4
2.362
34,70
776
5
1.581
33,90
491


Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý

6
Đoạn gen
Số cặp Bazơ
Tỷ lệ G + C ( %)
Số axit amin
6
1.356
38,60
397
7
1.104
33,50
315
8
1.059
35,50
317
9

1.062
35,90
326
10
751
40,2
175
11
667
38,60
198
Tổng cộng
18.525
-
5.799
Khi điện di trên gel polyacrylamit 11 gen này chia làm 4 khu vực [30,44]
- Khu vực I gồm các đoạn gen 1, 2, 3 và 4 có khối lƣợng phân tử cao nhất (theo
bảng 1 và hình 2) khi chạy trên gel polyacrylamit sẽ chạy chậm nhất.
- Khu vực II gồm các đoạn 5 và 6.
- Khu vực III gồm các đoạn 7, 8, 9.
- Khu vực IV gồm các đoạn 10 và 11 có khối lƣợng phân tử thấp nhất, khi chạy
điện di trên bản gel sẽ chạy nhanh nhất.
 Protein
Hạt virut chứa ít nhất 6 protein cấu trúc [6,21,37]:
- Các gen 1, 2, 3 và 6 mã hoá cho các protein VP1, VP2, VP3 và VP6 .
- Đoạn gen 4, 9 mã hoá cho các protein capsit lớp ngoài VP4 và VP7.
- Các gen còn lại ( 5, 7, 8, 10 và 11) mã hoá cho các protein không cấu trúc
(NSP1, NSP2, NSP3, NSP4, NSP5). Đặc điểm protein của virut Rota đƣợc trình
bày ở bảng 2 nhƣ sau:









Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý

7
Bảng 2. Các gen và protein của virut Rota [6,8]
Đoạn
gen
Sản
phẩm
protein
Khối lƣợng
phân tử
protein
Vị trí
trong hạt
virut
Chức năng
1
VP1
125.005
(125K)
Bao quanh
sợi ARN
ARN polymerase phụ thuộc ARN, liên kết với

ARN sợi đơn, tạo phức hợp với VP3
2
VP2
102.431
(94K)
Bao quanh
sợi ARN
Kích thích tái tạo ARN của virut
3
VP3
98.120
(88K)
Bao quanh
sợi ARN
Enzyme Guanylyl transferase xúc tác
cho quá trình gắn mũ 5
‟
của mARN trong
quá trình cải biến trƣớc dịch mã
4
VP4
86.782
(88K)
Capsít
lớp ngoài
Ngƣng kết hồng cầu, kháng nguyên
trung hòa
5
NSP1
58.654

(53K)
Không
cấu trúc
Không có vai trò cho sinh trƣởng của
virut
6
VP6
44.816
(41K)
Capsít
lớp trong
Cấu trúc và kháng nguyên đặc hiệu loài
7
NSP3
34.600
(34K)
Không
cấu trúc
Làm tăng hoạt tính của mARN virut và
ngừng tổng hợp protein trong tế bào vật
chủ
8
NSP2
36.700
(35K)
Không
cấu trúc
NTPase tham gia đóng gói hạt virut và
sao chép hệ gen
9

VP7
37.368
(38K)
Capsít
lớp ngoài
Protein cấu trúc và kháng nguyên trung
hòa
10
NSP4
20.290
(28K)
Không
cấu trúc
Độc tố ruột, vai trò trong quá trình hình
thành hạt virut
11
NSP5
21.725
( 26K)
Không
cấu trúc
Độc tố ruột


Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý

8
+ Protein cấu trúc
Ba protein mang tính đặc hiệu kháng nguyên của virut là VP4, VP6 và VP7
[22,25,58]:

- VP4 là một protein nhạy cảm với proteasa (P serotype) là kháng nguyên có đặc
tính ngƣng kết hồng cầu. Nhờ enzym protease phân hủy, VP4 đƣợc phân cắt
một cách đặc hiệu thành VP5* và VP8* giúp cho sự xâm nhập của virut vào tế
bào. VP4 định ra týp P của virut Rota.
- VP6 là kháng nguyên chung cho các dƣới nhóm của virut Rota. Chúng đƣợc sử
dụng trong các thử nghiệm phát hiện nhiễm virut Rota nhóm A.
- VP7 là một glycoprotein (G serotype) là kháng nguyên trung hoà đặc hiệu cho
týp huyết thanh, định ra týp G của virut Rota [16,20,22,25,35]
Ngoài ra các protein nằm trong lõi cũng có vai trò rất quan trọng trong quá
trình nhân lên của virut Rota:
- VP1 là enzym ARN polymerase nằm trong lõi hạt virut tham gia vào quá trình
phiên mã tạo ra các phân tử mARN và tạo ra các bản sao genom ARN cho các
hạt virion mới .
- VP2 có hoạt tính liên kết ARN không đặc hiệu, nhận biết cả ARN sợi đơn và
sợi kép. Việc lắp ráp VP2 vào trong lõi không phụ thuộc vào protein khác và
dsARN, do VP2 mang vùng chứa Ala – 387 và vùng kẹp hóa leucine có vai trò
quan trọng trong việc tự lắp ráp vào lõi.
- VP3 là một phần của màng lõi trong của hạt virion và là enzym Guanylyl
transferase, có vai trò gắn mũ vào đầu 5
‟
trong quá trình cải biến sau phiên mã
phân tử mARN, bảo vệ mARN khỏi sự phân hủy của các nuclease .
Ban đầu ngƣời ta gọi hạt virut hoàn chỉnh là hạt virut có 2 vỏ, mặc dù số
liệu mới đây cho thấy rằng những hạt virut này có 3 lớp. Sự thiếu vỏ ngoài của phân
tử lớp kép thƣờng đƣợc miêu tả nhƣ hạt thô ráp bởi vì mặt ngoài của chúng nhô ra
cấu trúc siêu phân tử của capsit trong (VP4) [17]. Những nghiên cứu đầu tiên về cấu
trúc virut Rota đã nhất trí cho rằng hạt virut có 20 mặt đối xứng [16,44].


Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý


9
Theo Roseto và các cộng sự [44], bằng kỹ thuật đông khô đã có báo cáo về
sự hiện diện của 132 capsome đƣợc sắp xếp đối xứng lệch. Họ cũng chỉ ra rằng lớp
ngoài có các lỗ nhỏ tƣơng ứng với các lỗ của vỏ trong capsit. Sau này Ludert và các
cộng sự cũng khẳng định cấu trúc capsit trong của virut Rota băng kỹ thuật phá vỡ
hạt virut và kỹ thuật tƣơng tự [28]. Cấu trúc lớp kép và lõi có thể là sản phẩm của
việc biến đổi liên tục của hạt 3 lớp.[16,17]
Nghiên cứu về virut Rota bằng kính hiển vi điện tử lạnh cho thấy VP4 hiện
diện trên vỏ ngoài capsit nhƣ một loạt 60 gai ngắn có kích thƣớc 10-12nm. Trọng
lƣợng phân tử 88.000D cấu tạo nên 1,5% protein của hạt virut. VP4 đóng vai trò thứ
yếu trong việc cấu tạo nên vỏ capsit ngoài. VP4 đƣợc mã hóa bởi gen 4 của các
chủng virut Rota đƣợc mô tả. Phần VP4 hƣớng vào trong tƣơng tác với cả VP7 và
protein capsit trong VP6. Sự tƣơng tác VP4-VP7 và VP4-VP6 bao hàm rằng VP4
có thể tham gia duy trì chính xác hình học giữa lớp trong và ngoài vỏ capsit cũng
nhƣ phạm vi ảnh hƣởng chức năng. [49]


Hình 3: Tái dựng hình ảnh của virut Rota dựa trên hình ảnh chụp qua kính
hiển vi điện tử
VP7 là lớp vỏ ngoài bao gồm 780 phân tử, VP7 tƣơng tác với phần chóp của
VP6. VP7 là một loại glycoprotein cũng là kháng ngyên trung hòa chủ yếu của virut
Rota, là kháng nguyên đặc hiệu cho tuýp huyết thanh. VP7 có trọng lƣợng phân tử


Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý

10
34.000D nhƣng lại cấu tạo nên 30% protein của hạt virut. VP7 nằm ở vỏ capsit
ngoài định hình nên bề mặt nhẵn của vỏ ngoài.

+ Protein không cấu trúc [6 ]
- NSP1 đƣợc mã hóa bởi từ gen 5 ,có đặc tính liên kết ARN. Ngƣời ta chứng
minh đƣợc rằng các chuỗi cystein của NSP1 có vai trò quan trọng cho hoạt tính
liên kết ARN. NSP1 có đặc hiệu với tất cả 11 đoạn ARN của virut Rota. Đích
liên kết là vị trí gần đầu 5‟ của mARN và có thể thuộc 34 nucleotit đầu tiên của
mARN
- NSP2 là một protein liên kết ARN tích lũy trong thể vùi của virut (viroplasms)
và cần thiết cho quá trình sao chép genom của virut. NSP2 có đặc tính liên kết
ARN tuy nhiên không đặc hiệu virut, đầu cacboxyl của NSP2 chứa vùng bảo
thủ cao có 37 acid amin và đƣợc dự đoán là domain liên kết ARN.
- NSP3 liên kết mARN của virut trong những tế bào nhiễm và ức chế tổng hợp
protein trong tế bào vật chủ.
- NSP4 là một độc tố trong ruột của ngƣời bị bệnh tiêu chảy và là độc tố ruột do
virut đầu tiên đƣợc phát hiện.
- NSP5 và NSP6 đƣợc mã hóa nhờ gen 11 bởi hai khung đọc mở (ORF) khác
nhau.
1.3 PHÂN NHÓM VÀ CÁC TÝP HUYẾT THANH
1.3.1 Phân nhóm
Virut Rota đƣợc phân chia theo nhóm, phân nhóm dựa trên các protein vỏ
capsit của virut.Theo Lambert J.P (1992) virut rota đƣợc chia thành 5 nhóm A, B,
C, D và E. Nhóm A có 2 phân nhóm là 1 và 2, phân nhóm 1 có týp huyết thanh 2,
phân nhóm 2 có týp huyết thanh 1, 3 và 4 [6,8].
Baoming (1995) chia thành 7 nhóm là A, B, C, D, E, F và G, trong đó chỉ có
nhóm A, B, C gây bệnh cho cả ngƣời và động vật. Nhóm D, E, F, G chỉ thấy ở động
vật . Nhóm A hay gặp nhất, gây ra hầu hết các vụ dịch tiêu chảy nặng ở trẻ em.
Nhóm B, C thƣờng gây những vụ dịch lẻ tẻ, hay gặp ở trẻ lớn và ngƣời trƣởng
thành [6,8]


Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý


11
1.3.2 Týp huyết thanh
Trong mỗi phân nhóm virut Rota đƣợc phân loại theo các týp huyết thanh
dựa trên protein capsit là VP4 và VP7. VP4 là một loại protein chống phân tách
proteaza - protein P, định ra týp huyết thanh P và VP7 một loại glycoprotein -
protein G, định ra týp huyết thanh G. Hai gen mã hoá cho những protein này theo lý
thuyết có thể phân chia độc lập với nhau. Đặc điểm týp huyết thanh đƣợc trình bày
ở bảng 3 nhƣ sau:
Bảng 3. Týp huyết thanh của virut Rota [6,8]
Protein
Đặc điểm
VP7
VP4
Kiểu huyết thanh
G
P
Số lƣợng týp huyết thanh
14
20
Kiểu gen phổ biến
G1, G2, G3, G4, G9
P4, P8, P6

Các protein capsit VP4 và VP7 có liên quan tới tính sinh miễn dịch của cơ
thể khi virut Rota xâm nhiễm. Trên thế giới có 4 chủng virut Rota phổ biến nhất là
G1P[8], G3P[8], G4P[8], G2P[4]. Tuy nhiên, sự lƣu hành của các chủng virut Rota
có khác nhau đáng kể ở các vùng khí hậu khác nhau, một số chủng không thông
thƣờng lại phân bố ở một vài quốc gia đang phát triển, chẳng hạn P6 kết hợp với
týp huyết thanh G9 chiếm 9,50% tổng số các chủng virut Rota ở Ấn Độ. Do vậy,

việc giám sát dịch tễ týp huyết thanh G và P nhằm xác định týp phổ biến đóng vai
trò rất quan trọng trong việc phát triển vắc xin Rota mới [6, 16].
1.4 TÍNH CHẤT LÝ HÓA
1.4.1 Tính bền vững với PH
Virut Rota bền vững với pH ở diện rộng (pH từ 3 đến 10) nhờ đó mà có
virut Rota thể tồn tại và phát triển tốt trong ruột ngƣời [8].
1.4.2 Tính chịu nhiệt
Virut Rota có thể sống nhiều giờ trên bàn tay và nhiều ngày trên bề mặt rắn,
virut vẫn ổn định và có khả năng gây bệnh khi sống trong phân một tuần. Ở 4
0
C


Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý

12
thậm chí ở 20
0
C với sự có mặt của 1,5 mM CaCl
2
virut rota vẫn giữ đƣợc tính gây
nhiễm trùng trong nhiều tháng [10,20], ở - 20
0
C virut có thể tồn tại nhiều năm [6].
Virut dễ bị bất hoạt ở nhiệt độ cao trên 45
0
C. Nếu đông tan băng nhiều lần
thì virut mất khả năng gây nhiễm trùng . Virut có khả năng tồn tại lâu trong buồng
bệnh nhân nên tỷ lệ nhiễm trùng bệnh viện khá cao [6].
1.4.3 Tính nhạy cảm

Khả năng gây nhiễm trùng của virut Rota tùy thuộc vào sự có mặt của lớp vỏ
capsít [6,8].
Virut Rota nhạy cảm với EDTA (Ethylen Diamin Tetra Acetic), do EDTA có
khả năng phá vỡ lớp vỏ capsit và làm mất khả năng nhiễm trùng của virut . Sodium
thyocianate biến hạt virut có 2 lớp thành hạt virut chỉ có 1 lớp capsit. Sodium
dodecyl sulfate 0,1%, phenol, formalin, betapropiolacton và đặc biệt là ethanol 95%
là chất khử trùng hiệu quả nhất làm mất lớp vỏ capsít của virut [16,17].
1.4.4 Tính đề kháng
Virut Rota nói chung đề kháng với fluorocacbon, ete, chloroform,
deoxycholate và dung dịch không ion . Virut Rota cũng không chịu tác dụng của
kháng sinh, chỉ dùng kháng sinh trong trƣờng hợp bội nhiễm hay nhiễm khuẩn phối
hợp [6].
Kháng thể IgA trong sữa mẹ có khả năng kháng lại virut rota, nhiều thử
nghiệm giám sát trên thế giới cũng nhƣ tại Việt Nam đã chứng minh đƣợc sữa mẹ
có mức hiệu giá cao và trung bình có khả năng trung hòa virut trong vắc xin thử
nghiệm [6].
1.5 ĐẶC TÍNH VIRUT ROTA TRÊN TẾ BÀO NUÔI CẤY MÔ:
Virut Rota có thể nuôi cấy trên tế bào ruột bào thai ngƣời hoặc nuôi cấy trên
tế bào thận bào thai ngƣời.
Một vài dòng tế bào thƣờng trực có nguồn gốc là tế bào biểu mô nhƣ tế bào
thận bò Madin-Darby, tế bào thận lợn PK15 và tế bào thận khỉ xanh Châu Phi CV1,
cũng thích hợp cho việc nuôi cấy virut Rota.


Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý

13
Tỷ lệ gây nhiễm virut Rota ngƣời trên tế bào nuôi thƣờng bị giảm ở những
lần cấy truyền sau. Sau 2 đến 5 lần cấy truyền thì chủng virut Rota sẽ bị mất đi.
Theo một số tác giả, enzyme phân giải protein bình thƣờng có mặt ở ruột có thể

giúp cho virut Rota xâm nhập vào tế bào. Một số tác giả đã thành công trong việc
phân lập virut Rota ngƣời từ bệnh nhân bị viêm dạ dày ruột cấp trên tế bào thận khỉ
Cynomolgus tiên phát và kỹ thuật nuôi quay trong môi trƣờng có trypsin. Nhiều tác
giả cũng công nhận phƣơng pháp có hiệu quả để nuôi cấy và phân lập virut Rota
ngƣời là việc sử dụng enzym phân giải protein nhƣ tripsin, elatin, pancreatin để làm
tăng tính gây nhiễm của virut Rota ngƣời đối với tế bào nuôi [16,17].
1.6 QUÁ TRÌNH NHÂN LÊN CỦA VIRUT ROTA
Các điểm đặc trƣng nhất của quá trình virut Rota nhân lên trong tế bào nhƣ sau [6]:
 Quá trình sao chép xảy ra hoàn toàn trong tế bào chất.
 Tế bào không chứa các enzym dùng cho sao chép sợi kép ARN, vì thế virut
phải tự cung cấp các enzym cần thiết.
 ARN sợi (-) đƣợc dùng làm khuôn để sao chép sợi (+) nhờ enzym ARN
polymeraza phụ thuộc ARN. Sợi (+) này dùng để tổng hợp các protein, đồng
thời phiên mã tạo ARN sợi (-). Khi sợi (-) đƣợc tổng hợp hoàn toàn, nó thực
hiện việc liên kết với sợi (+).
 Sự phân giải tế bào sẽ giải phóng các hạt virut khỏi các tế bào nhiễm.
Các giai đoạn chính của quá trình sao chép virut Rota bao gồm: giai đoạn
hấp phụ, xâm nhập và cởi áo; quá trình tổng hợp và sao chép; giai đoạn lắp ráp và
giải phóng virut ra khỏi tế bào vật chủ.


Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý

14

Hình 4: Chu trình nhân lên của virut Rota trong tế bào
*Giai đoạn hấp phụ, xâm nhập và cởi vỏ [6]
Sự xâm nhập của virut Rota ngƣời phụ thuộc vào việc tách lớp vỏ ngoài của
virut bằng trypsin. Virut đã đƣợc xử lý trƣớc bằng trypsin sẽ trực tiếp xâm nhập qua
màng tế bào vào trong bào tƣơng của tế bào.

Một giả thuyết khác cho rằng, những hạt virut đã đƣợc hoạt hoá bằng trypsin
dính vào màng tế bào sẽ bơm trực tiếp axít nucleic qua khe hở hình thành giữa
capsomer và lỗ trên màng tế bào. Cơ chế này tƣơng tự nhƣ phóng axít nucleic vào tế
bào vi khuẩn của phage .
Những hạt virut chƣa đƣợc xử lý bằng trypsin sẽ vào tế bào bằng con đƣờng
thực bào, những virion này sau khi gắn vào màng tế bào khoảng 20 phút sẽ vào
trong lysosome .
*Giai đoạn tổng hợp và sao chép
Khi ARN của virut đã vào trong bào tƣơng tế bào cảm thụ thì quá trình sao
chép sẽ đƣợc tiến hành. Quá trình dịch mã không đồng đều, các bản sao là những
sợi ARN dƣơng sao chép từ sợi ARN âm. [11].
Xâm nhập
Nhập
bào
Hạt Virut 2 lớp
Phá vỡ tế
bào và giải
phóng virut
Nhân
mARN phiên mã
Dịch mã
Virut có vỏ
bao bọc
tạm thời



Loại bỏ
vỏ ngoài



Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý

15
Các protein của virut đƣợc tổng hợp đồng thời với sự sao chép ARN của
virut. Các protein cấu trúc bao gồm VP1, VP2, VP3, VP4, VP6 và VP7 có tác dụng
tạo capsit của virut. Các protein không cấu trúc bao gồm NSP1, NSP2, NSP3,
NSP4, NSP5 tham gia vào quá trình sinh tổng hợp ARN [11].
*Giai đoạn lắp ráp và giải phóng
ARN sợi kép tạo thành sẽ đƣợc lắp ráp với các protein cấu trúc tạo thành hạt
virut hoàn chỉnh trong bào tƣơng tế bào và đƣợc giải phóng ra ngoài tế bào bằng
cách ly giải tế bào chủ hoặc nảy chồi [11].
1.7 KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CỦA VIRUT ROTA
1.7.1 Khả năng gây bệnh cho trẻ em
Virut rota nhóm A là nguyên nhân hàng đầu gây viêm dạ dày ruột cấp dẫn
đến tiêu chảy ở trẻ em, đặc biệt là trẻ từ 6 đến 24 tháng tuổi. Trẻ sơ sinh hiếm khi bị
bệnh, chủ yếu là nhiễm trùng không triệu chứng hoặc biểu hiện bệnh rất nhẹ [8, 11],
có khoảng 10% - 20% trẻ sơ sinh bị nhiễm virut rota có biểu hiện lâm sàng [6].
Nhiễm trùng không triệu chứng ở trẻ sơ sinh có thể liên quan tới kháng thể từ mẹ
truyền qua nhau thai cho con hoặc kháng thể và các yếu tố ức chế trypsin trong sữa
mẹ, enzym pancreatic chƣa hoàn chỉnh Nhƣ vậy, mặc dù sữa mẹ không phải là
phòng đƣợc nhiễm virut rota nhƣng có thể phòng đƣợc bệnh tiêu chảy nặng [6].
Ngoài gây viêm dạ dày ruột cấp, virut rota còn có thể gây viêm ruột hoại tử,
lồng ruột, tắc mật ngoài gan, xuất huyết đƣờng niệu, nhiễm trùng huyết Tuy
nhiên, hiện nay chƣa có bằng chứng điển hình có tính thuyết phục về vấn đề này
1.7.2 Khả năng gây bệnh ở người lớn
Nhiễm trùng do virut Rota cũng khá phổ biến ở ngƣời lớn, thƣờng do virut
nhóm B gây ra, tuy nhiên ngƣời mắc có thể không có triệu chứng hoặc bị tiêu chảy
mãn tính. Theo một nghiên cứu khoảng 55% ngƣời lớn khi tiếp xúc với trẻ em nằm
viện vì viêm dạ dày ruột do virut Rota có lƣợng kháng thể tăng trong thời gian con

cái họ nằm viện [6]. Một nghiên cứu khác cho thấy 11% - 70% ngƣời lớn bị nhiễm
trùng đã biểu hiện thành bệnh tiêu chảy.


Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý

16
1.7.3 Cơ chế gây bệnh
Virut Rota vào cơ thể ngƣời theo đƣờng phân - miệng và virut nhân lên
chủ yếu ở niêm mạc tá tràng. Ở đây, virut nhân lên trong bào tƣơng và phá huỷ
tế bào, tế bào bị tổn thƣơng có các vi nhung mao teo ngắn, các bể lƣới nội sinh
căng phồng, ty lạp thể phồng, vi nhung mao thƣa thớt, không đều. Tổn thƣơng tế
bào dẫn đến rối loạn hấp thu các chất dinh dƣỡng, nƣớc và điện giải. Các chất
carbonhydrat ứ đọng bên trong ruột làm tăng áp suất thẩm thấu, kéo nƣớc vào
lòng ruột, hậu quả dẫn đến rối loạn tiêu hoá, gây tiêu chảy làm mất nhiều nƣớc
và mất nhiều chất điện giải [2, 6,8].
1.8 DỊCH TỄ HỌC BỆNH TIÊU CHẢY CẤP DO VIRUT ROTA
1.8.1 Nguồn bệnh
Ngƣời và một số loài động vật nhƣ bò, cừu, khỉ, chó là vật chủ của virut
Rota. Virut có trong phân bệnh nhân và đƣợc thải ra ngoài với số lƣợng lớn trong
thời kỳ tiêu chảy cấp. Số lƣợng virut trong ruột ở thời kỳ tiêu chảy cấp có thể đạt
cao điểm là 10
11
/ml phân. Sau khi thải ra ngoài, chúng còn tồn tại trong phân và
môi trƣờng khá lâu đủ để gây nhiễm cho ngƣời khác.
1.8.2 Đường lây truyền
Virut Rota chủ yếu lây truyền theo đƣờng phân - miệng, ngoài ra còn có thể
lây theo đƣờng hô hấp. Bệnh hiếm khi truyền từ động vật sang ngƣời. Virut Rota có
thể tồn tại lâu trong môi trƣờng và đề kháng với các chất tẩy rửa thông thƣờng nhƣ
cồn, nƣớc javen nên khả năng lây nhiễm cao, đặc biệt trẻ từ 6 – 24 tháng tuổi dễ

nhiễm bệnh nhất do các bé thƣờng tiếp xúc với đồ vật bằng tay, miệng. Đôi khi
virut Rota có thể gây bệnh cho những thành viên khác trong gia đình và những
ngƣời có tiếp xúc gần gũi với trẻ mắc bệnh [6].
1.8.3 Mùa bệnh
Ở các nƣớc khí hậu ôn đới, tiêu chảy do virut rota thƣờng xuất hiện vào mùa
đông [6,7]. Theo thống kê có tới hơn 50% trẻ nhập viện mắc bệnh TCC là do virut
Rota gây nên.Ở các nƣớc nhiệt đới và các nƣớc đang phát triển, yếu tố mùa ít rõ rệt
hơn, bệnh có thể gặp quanh năm [6].