Enzym thực vật
MỤC LỤC
PHẦN 1: NHỮNG ENZYM SẢN XUẤT TỪ THỰC VẬT
1.1. TỔNG QUAN 5
1.2. PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN ENZYM TỪ THỰC VẬT 5
1.2.1. Quy trình công nghệ 5
1.2.2. Thuyết minh quy trình công nghệ 6
1.2.2.1. Phá vỡ tế bào 6
1.2.2.2. Thu dịch enzym thô 6
1.2.2.3. Tách enzyme 8
1.2.2.4. Tinh sạch 13
1.2.2.5. Kết tinh 14
1.3. NHỮNG TIÊU CHUẨN TINH KHIẾT CỦA ENZYM 14
1.4. ENZYM SẢN XUẤT TỪ THỰC VẬT 14
1.4.1. Bromelin 14
1.4.1.1. Đặc điểm 14
1.4.1.2. Sản xuất 18
1.4.1.3. Ứng dụng 21
1.4.1.4. Sản phẩm thương mại 24
1.4.1.5. Hướng nghiên cứu 27
1.4.2. Papain 29
1.4.2.1. Đặc điểm 29
1.4.2.2. Sản xuất 33
1.4.2.3. Ứng dụng 34
1.4.2.4. Sản phẩm thương mại 37
1.4.3. Ficin 39
1.4.3.1. Đặc điểm 39
1.4.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến enzym ficin 41
PHẦN 2 : ENZYM ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
2.1. ENZYM PECTINASE 44
2.1.1. Phân loại 46

2.1.2. Đặc điểm enzym pectinase 46
2.1.2.1. Enzym pectinase từ thực vật 46
2.1.2.2. Enzym pectinase từ vi sinh vật 50
2.1.3. Ứng dụng enzym pectinase trong thực phẩm 52
2.1.4. Ứng dụng enzym pectinase trong sản xuất nước dứa 55
2.2. ENZYM AMYLASELASE 57
2.2.1. Phân loại 58
2.2.2. Đặc điểm 58
2.2.2.1. Enzym amylase từ thực vật 58
2.2.2.2. Enzym amylase từ vi sinh vật 60
2.2.3. Ứng dụng amylase trong thực phẩm 61
2.2.4. Một số chế phẩm thương mại 64
Trang 1
Enzym thực vật
2.3. ENZYM CENLLULASE 64
2.3.1. Phân loại 65
2.3.2. Đặc điểm 65
2.4. ENZYM OXY HÓA – KHỬ 67
2.4.1. Enzym peroxydase 67
2.4.2. Enzym polyphenoloxydase 67
2.4.3. Enzym glucooxydase 68
TÀI LIỆU THAM KHẢO 69
Trang 2
Enzym thực vật
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Thành phần amino acid và những nhóm khác của bromelin
15
Bảng 1.2: Những tính chất vật lý của protein thân 16
Bảng 1.3: Hoạt tính phân giải casein của bromelin 16
Bảng 1.4: Hoạt tính phân giải Benzoyl-L-Arginine amide (BAA) của

bromelin 17
Bảng 1.5: Hằng số Michaelis với các cơ chất tổng hợp khác nhau của
bromelin thân 17
Bảng 1.6: Ảnh hưởng trạng thái và điều kiện bảo quản trên hoạt tính của
bromelin 18
Bảng 1.7: Tính chất vật lý của papain 30
Bảng 1.8: Giá trị dinh dưỡng trên100 g chất quả 33
Bảng 1.9: %RDI 34
Bảng 1.10: Mức độ phân giải (%) một số protein thực phẩm phụ thuộc
trạng thái cơ chất của papain 38
Bảng 1.11: Thành phần amino acid của phân tử enzyme ficin 40
Bảng 1.12: Tính chất vật lí của ficin 41
Bảng 2.1 : Phân loại enzym pectinase 53
Bảng 2.2 : Hàm lượng pectin của một số quả và dịch quả 53
Bảng 2.3 : Một số tính chất của amylase từ các nguồn khác nhau 59
Bảng 2.4 : Ứng dụng enzym amylase 61
Bảng 2.5 : hiệu suất chuyển hóa tinh bột bằng enzym cố định trong sản
xuất syro fructose 64
Trang 3
Enzym thực vật
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 : Cấu trúc sợi hydrate carbon của bromelin 14
Hình 1.2 : Chất chiết từ lá và thân dứa (Ananas comosus) với hàm lượng
bromelain cao, được sản xuất dưới dạng viên nén, chứa 200mg
bromelin/viên 24
Hình 1.3 : Chế phẩm bromelin có hoạt lực cao (1200gdu/g hay 1800mcu/g)

25
Hình 1.4: Bột bromelin bổ sung vào thức ăn cho gia súc 25
Hình 1.5: Quercetin & Bromelain - Thuốc giúp bệnh thống phong 25

Hình 1.6: Bromelain - Tinh chất quả dứa trị viêm mũi 26
Hình 1.7: Tâm hoạt động của papain 30
Hình 1.8: Cơ chế ảnh hưởng của pH 32
Hình 1.9: Cơ chế hoạt động 33
Hình 1.10: Vườn đu đủ trồng để lấy nhựa 34
Hình 1.11: Công nhân đang thu nhận nhựa từ trái đu đủ 35
Hình 1.12: Papain ứng dụng trong mỹ phẩm 39
Hình 1.13: Papain trongcác loại dược phẩm 39
Hình 2.1 : Cấu trúc của pectinase từ carrot 47
Hình 2.2 : Polygalacturonase từ erwinia carotovora ssp. carotovora 49
Hình 2.3 : Ảnh hường của pectinase đến hiệu suất trích ly nước dứa 56
Hình 2.4 :Ảnh hưởng của pectinase Ultra SP-L đến hiệu suất trích ly dứa

57
Hình 2.5: Ảnh hường pectinase 3XL đến quá trình làm trong dịch dứa
57
Trang 4
Enzym thực vật
PHẦN 1: NHỮNG ENZYM SẢN XUẤT TỪ THỰC VẬT
1.1 TỔNG QUAN [3]:
Enzym là những chất không thể tổng hợp bằng phương pháp hoá học, chỉ
có thể thu nhận chúng từ các nguồn sinh học. Mặc dù enzym có trong tất cả các
cơ quan, mô của động vật, thực vật cũng như trong tế bào vi sinh vật, song việc
tách enzyme gặp rất nhiều khó khăn, nhất là tách với quy mô công nghiệp một
cách thuận lợi về kinh tế chỉ có thể tiến hành đối với nguyên liệu có chứa hàm
lượng lớn enzym. Có ba nguồn nguyên liệu sinh học cơ bản: các mô và cơ quan
động vật, mô và cơ quan thực vật, tế bào vi sinh vật.
Từ thực vật người ta cũng thu được một số chế phẩm enzym thuỷ phân như
papain, bromelin, ficin, amylase, urease, …
• Người ta thu papain từ nhựa (mủ) đu đủ xanh bằng cách

khuấy nhựa một thời gian và sau đó tách lấy kết tủa protein và đem sấy
khô nghiền nhỏ.
• Bromelin thu từ thân dứa. Sau khi hái quả người ta bỏ lá và
ép thân lấy dịch rồi dùng dung môi hữu cơ kết tủa enzym trong dịch ép.
• Ficin được tách từ dịch ép thân và lá giống Ficus.
• Amylase được thu nhận từ nguồn malt đại mạch và các hạt
nảy mầm khác, được sử dụng chủ yếu trong công nghệ sản xuất rượu bia,
bánh kẹo.
• Urease từ hạt đậu tương, lipase từ hạt thầu dầu, β_amylase
từ củ khoai lang, saccharase từ lá củ cải đường …
1.2 PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN ENZYM TỪ THỰC VẬT [3],[4]:
1.2.1. Quy trình công nghệ:
Trang 5
Enzym thực vật
1.2.2. Thuyết minh quy trình công nghệ:
1.2.2.1. Phá vỡ tế bào:
Trong cơ thể sinh vật, enzym có trong tế bào chất và các cấu tử (nhân
microxom, mitochrondri …) của tế bào. Các phân tử enzym không có khả năng đi
qua màng của tế bào và màng của các cấu tử (mitochrondri) của tế bào. Do đó, để
có thể chiết rút các enzym nội bào cần phải phá vỡ cấu trúc của các tế bào.
Có thể phá vỡ cấu trúc của tế bào bằng các biện pháp:
• Xay nhuyễn
• Nghiền: nghiền với bột thủy tinh hoặc cát sạch.
• Đồng hóa: dùng áp lực cao để phá vỡ tế bào mô thực vật, từ
đó làm giảm độ nhớt của dịch chiết, phóng thích các enzym nội bào mà
không làm biến tính chúng. Điều này cũng tạo thuận lợi khi ta sử dụng
phương pháp siêu lọc để làm tinh sạch enzym.
• Sử dụng sóng siêu âm.
• Sử dụng dung môi hữu cơ: rượu butylic, aceton, glycerine
1.2.2.2.Thu dịch enzym thô:

Sau khi đã phá vỡ cấu trúc tế bào, enzym được chiết bằng nước, bằng các
dung dịch đệm thích hợp hoặc các dung dịch muối trung tính.
Có thể sử dụng các phương pháp lắng, lọc, ly tâm, trích ly.
1.2.2.3.Tách enzym:
Có thể sử dụng nhiều phương pháp như:
Trang 6
Enzym thực vật
 Phương pháp kết tủa enzym:
Nguyên tắc:
Điểm đẳng điện của đa số protein thấp hơn 7, do đó trong điều kiện sinh lý,
các phân tử protein có tích điện âm thừa và chính những điện tích âm thừa này kết
hợp với đầu mang điện tích dương của phân tử nước cũng như các ion dương.
Điều này làm cản trở sự kết tủa của chúng. Enzym có bản chất protein, do đó để
kết tủa được enzym phải phá vỡ lớp nước xung quanh bằng cách bổ sung vào dung
dịch enzym các dung môi hoặc các hóa chất ưa nước có ái lực với nước mạnh hơn
protein để lôi kéo nước ra khỏi phân tử protein, giúp protein tủa xuống.
Các dung môi thường sử dụng là acetone, ethanol, các muối trung tính ở
nồng độ cao như ammonium sulphate.
Những yếu tố chính ảnh hưởng hiệu suất và chất lượng chế phẩm enzym là:
- Nồng độ của ammonium sulphate.
- pH của dịch chiết.
- Nhiệt độ kết tủa.
- Thời gian tiếp xúc của tác nhân đệm và dịch chiết.
 Phương pháp siêu lọc:
Dung dịch enzym thu được từ nguyên liệu thực vật sẽ có chứa nhiều tạp
chất. Đầu tiên sử dụng phương pháp lọc để loại trừ các chất bẩn. Sau đó chuyển
sang dùng phương pháp siêu lọc để loại bỏ các chất có phân tử lượng thấp hơn
enzym đồng thời cô đặc enzym.
Màng siêu lọc: được cấu tạo bằng các sợi rỗng. Trong mỗi sợi rỗng lại có
chứa nhiều sợi rỗng xếp song song và gắn chặt với lớp ngoài tạo thành những lỗ

để các chất thấm qua. Các sợi này được chế tạo từ các loại polymer bền như fluoro
polymer (FS), cellulose acetate (CA), polysulphone(GR)…. Tùy theo mục đích cụ
thể mà người ta sử dụng loại màng thích hợp.
Ví dụ:
 Cô đặc protein dùng màng FS, GR.
 Cô đặc enzym dùng màng GR.
Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình siêu lọc:
- Nhiệt độ: nhiệt độ phải thích hợp với loại sản phẩm và loại màng sử
dụng. Khi chọn nhiệt độ cần lưu ý đến khả năng kết tủa của protein và sự
tăng nhiệt độ trong quá trình siêu lọc vì các yếu tố này có thể làm bít màng.
- Áp suất: thường áp suất của dòng chảy sẽ tăng cùng với sự gia tăng áp
suất cho đến khi đạt giá trị cực đại. Nếu áp suất tăng cao hơn nữa thì tốc độ
dòng chảy sẽ giảm.
Những thuận lợi của phương pháp siêu lọc:
- Có thể lựa chọn màng thích hợp với từng mục đích cụ thể.
- Đối với enzym có thể cô đặc 25 lần mà không bị mất hoạt tính.
- Siêu lọc vừa làm cô đặc, vừa tinh sạch được enzym. Trong quá trình
thực hiện, nếu cho thêm nước vào thì độ tinh sạch của enzym càng cao.
Trang 7
Enzym thực vật
- Trong quá trình siêu lọc, nếu nhiệt độ cao có thể làm mất hoạt tính của
enzym, do đó nhiệt độ 10-20
o
C được xem là khoảng nhiệt độ thích hợp
nhất cho năng suất mà không làm mất hoạt tính enzym càng cao. Trong
quá trình siêu lọc có thể thực hiện tốt ngay ở nhiệt độ thấp (5
o
C).
 Phương pháp hấp phụ:
Hấp phụ “trong thể tích” (thêm chất hấp phụ trực tiếp vào trong dịch

enzym) hoặc trên cột (sắc kí hấp phụ) được dùng phổ biến trong việc tách và làm
sạch enzym. Hấp phụ chọn lọc enzym có thể thực hiện bằng một trong hai cách:
chất hấp phụ protein tạp hoặc chất hấp phụ enzym. Quá trình hấp phụ thường được
tiến hành ở 0
o
C. Enzym sau đó được chiết bằng các dung môi thích hợp.
1.2.2.4.Tinh sạch
Enzym rất dễ bị giảm hoạt tính và biến tính dưới tác dụng của các tác nhân
bên ngoài. Do đó khi tinh chế enzym, để tránh sự biến tính protein gây ảnh hưởng
xấu đến hoạt tính enzym, cần tiến hành nhanh ở điều kiện nhiệt độ thấp, thời gian
ngắn, môi trường có pH thích hợp và không có mặt các tác nhân gây biến tính.
Các phương pháp thường được áp dụng khi tinh chế enzym là:
- Hấp phụ trên gel
- Phương pháp thẩm tích
- Cột sắc kí (ví dụ: DEAE –cellulose)
- Kết tủa phân đoạn hay bằng dung môi hữu cơ
Để tinh chế enzym hiệu quả cần kết hợp nhiều phương pháp khác nhau.
 Phương pháp hấp phụ có chọn lọc:
Đây là một trong những phương pháp tinh chế enzym quan trọng và thành
công nhất, thường được dùng để làm đặc dung dịch enzym.
Nguyên tắc: cho dịch enzym chảy từ từ qua cột chất hấp phụ. Tùy theo khả
năng tương tác của các chất hấp phụ với từng loại enzym, các enzym khác nhau sẽ
được hấp phụ trên chất hấp phụ với khả năng khác nhau. Sau đó dùng các dung
dịch đệm thích hợp để chiết rút enzym ra khỏi cột.
Có thể hấp phụ chọn lọc enzym theo hai cách:
- Hấp phụ âm tính:
Dùng chất hấp phụ để tách tạp chất ra khỏi dung dịch enzym.
- Hấp phụ dương tính:
Enzym được hấp phụ và được tách ra khỏi những cấu tử khác trong
dung dịch, sau đó được rửa giải bởi dung dịch đệm pH kiềm hoặc các

dung dịch đệm khác. Sau khi ly tâm để loại các hợp chất không tan,
dung dịch enzym có thể được thẩm tách để loại dung dịch đệm.
Để hấp phụ enzym tốt nhất, cần tuân theo những nguyên tắc chung sau:
- Hàm lượng protein trong dung dịch không vượt quá 1%.
- Tỷ lệ của gel (trọng lượng khô) đối với protein thường là 20:1
- Môi trường acid pH = 5 – 6
Trang 8
Enzym thực vật
- Nồng độ chất điện ly (muối) thấp trong dung dịch. Sự tồn tại của bất kì
một lượng muối nào cũng gây ảnh hưởng tới quá trình hấp phụ. Vì thế
một lượng lớn hơn chất hấp phụ phải được sử dụng để thu được kết quả
mong muốn.
- Sự hấp phụ enzym hiệu quả nhất khi được tiến hành ở 0
o
C trong lúc trộn
dung dịch với chất hấp phụ để đạt trạng thái cân bằng. Đây là một
phương pháp nhanh, sự cân bằng giữa các chất hấp phụ và dung dịch
hình thành rất sớm và chỉ sau vài phút ly tâm sẽ lắng được chất hấp phụ.
Quá trình được tiến hành tuần tự như sau:
- Cho vào dung dịch enzym liên tiếp những lượng gel thích hợp.
- Trộn đều
- Quay lắng
- Thu hồi từng phần gel trước khi cho phần tiếp theo vào.
Để mức độ tinh khiết của enzym thu được cao nhất, lượng chất hấp phụ
phải được điều chỉnh sao cho những phân đoạn đầu tiên (phần sẽ được loại bỏ) lấy
đi khoảng 10% enzym và sau khi thu những phân đoạn hoạt động, phải còn lại
10% enzym trong dung dịch.
Để thu nhận enzym ta sẽ tiến hành rửa giải từ chất hấp phụ. Nếu enzym
không được rửa hấp bằng nước thì cần phân tán phần hấp phụ vào nước và ly tâm
lại. Trong sản xuất, để gel phân tán tốt trong nước rửa hoặc chất giải hấp cần phải

có cánh khuấy với tốc độ cao. Giải hấp enzym sẽ hiệu quả hơn trong dung dịch
đệm base nhẹ (pH = 7,6). Quá trình càng hiệu quả với dung dịch (NH
4
)
2
SO
4
10%.
Thể tích dung dịch rửa giải không nên quá lớn, thường là ít hơn thể tích gel ly tâm.
Nên tiến hành rửa giải nhiều lần với thể tích nhỏ hơn là một lần với thể tích lớn.
 Phương pháp thẩm tích
Lấy enzym thô pha trong dung dịch đệm thích hợp, sau khi tất cả enzym đã
hòa tan thì cho hỗn hợp vào túi cellophane rồi đặt túi vào cốc có chứa dung dịch
đệm ban đầu. Túi cellophane được chuẩn bị bằng cách trước khi dùng được tráng
đầy bằng dung dịch đệm trên. Tiến hành thẩm tích trong thời gian thích hợp, nếu
có thể thì nên thay dung dịch đệm bên ngoài nhiều lần để đạt tinh sạch cao. Dung
dịch đệm phía ngoài túi được khuấy liên tục bằng một máy khuấy từ.
Trong quá trình thẩm tích, khi thay đổi nhiệt độ trong một giới hạn nhất
định thì vận tốc khuếch tán sẽ tăng theo sự gia tăng nhiệt độ. Nhưng nếu sự gia
tăng nhiệt độ vượt qua mức cho phép thì protein enzym sẽ bị biến tính do nhiệt độ
cao làm ảnh hưởng đến những mối tương tác giúp cho sự ổn định cấu trúc enzym.
Chính vì vậy, để làm giảm sự biến tính của enzym do nhiệt, người ta thường tiến
hành tinh sạch enzym ở nhiệt độ thấp.
 Cột sắc ký:
Sắc ký trao đổi ion là một phương pháp hiệu quả để chiết tách enzym tinh
khiết. Quá trình phân tách có thể dựa trên sự hấp phụ, trao đổi ion hoặc hiệu ứng
Trang 9
Enzym thực vật
rây phân tử. Nhưng trên thực tế, hầu như các quá trình phân tách đều chịu ảnh
hưởng của cả ba quá trình trên.

Nguyên tắc: cho dung dịch chế phẩm enzym vào trong dung dịch đệm với
cột trao đổi ion đã được cân bằng, tiến hành giải hấp phụ bằng dung dịch điện giải
(gradient muối) với nồng độ tăng dần chảy qua các cột, các ion của dung dịch rửa
sẽ đẩy ra khỏi cột các enzym vừa liên kết với nhựa. Khi đó enzym nào có ái lực
với nhựa kém nhất sẽ dễ bị đẩy ra khỏi nhựa nhất, lần lượt các enzym khác nhau
sẽ được chiết ra khỏi cột theo từng phần chiết khác nhau, trong đó có phần chứa
enzym cần thu với nồng độ cao nhất.
Các chất trao đổi ion có thể được sử dụng là nhựa resin trao đổi ion (đặc
biệt là amberlite IRC-50, XE-64), những dẫn xuất khác nhau của cellulose như
diethylaminoethyl cellulose (DEAE-cellulose), carboxymethyl cellulose (CMC).
Dùng nhựa trao đổi ion chỉ thu được hiệu quả tốt đối với những enzym có trọng
lượng phân tử tương đối nhỏ, có điểm đẳng điện trong vùng kiềm, đồng thời việc
rửa giải những enzym phân tử lớn ra khỏi cột cũng gặp không ít khó khăn. Vì thế
DEAE-cellulose và CMC thường được sử dụng rộng rãi hơn do có khả năng loại
bỏ được các tạp chất acid nucleic.
Quá trình phân tách được tiến hành tuần tự như sau:
- Lấy một thể tích V dung dịch (không quá 1/3 thể tích cột) cho chảy một
lần qua cột để loại muối ra khỏi dung dịch protein.
- Protein chảy ra khỏi cột với một thể tích dung dịch hơi lớn hơn so với
thể tích của nó lúc đưa vào cột.
- Trên các cột chứa sephadex G-75, G-100, G-200 đồng thời xảy ra sự
phân tách từng phần các protein tùy theo phân tử lượng của chúng.
- Ngoài sephadex, tất cả các cột đều cần gradient muối cho việc rửa giải.
Các ion của dung dịch rửa sẽ đẩy ra khỏi nhựa các enzym vừa liên kết
với nhựa. Đẩy protein kết hợp ra bởi các ion khác bằng các cách sau:
o Tăng nồng độ các dung dịch đệm.
o Tăng nồng độ dung dịch NaCl hay KCl thêm vào dung dịch.
o Thay đổi pH của dung dịch tách.
Các phân đoạn có chứa enzym với hoạt tính riêng lớn nhất (là phân đoạn
chứa enzym cần thu) được tập trung lại, loại bỏ muối và làm cô đặc (hoặc làm

khô) bằng cách loại hơi ẩm trong chân không ở nhiệt độ thấp.
Phương pháp sắc kí trao đổi ion được áp dụng rộng rãi khi phân tách hỗn hợp
protein và trong tách riêng những enzym và hormone tinh khiết tới mức tối đa.
Nhờ đó, người ta đã loại được những tạp chất protein nhỏ ra khỏi những chế phẩm
enzym thuần nhất về điện ly.
 Điện di:
Là phương pháp vật lý có giá trị để phân tách các hỗn hợp protein, enzym
và cũng là phương pháp để xác định sự tinh khiết của các chế phẩm protein. Gần
đây, phương pháp này được áp dụng ở những giai đoạn tinh chế enzym cuối cùng.
Trang 10
Enzym thực vật
Nguyên tắc:
Phân tử protein có điện tích tự do chứa nhóm acid, base. Nếu các phân tử
protein enzym không đặt ở những điểm đẳng điện (ở đó tổng điện tích âm bằng
tổng điện tích dương) thì dưới ảnh hưởng của điện trường ngoài, chúng di chuyển
trong điện trường ở những điều kiện nhất định về pH, lực ion và nhiệt độ cũng
khác nhau. Do đó, hỗn hợp protein được phân tách ra thành một số vùng riêng biệt
hoặc những phân đoạn riêng biệt.
Những phân đoạn enzym thu được sẽ được xác định hàm lượng protein,
hoạt độ enzym và biểu diễn trên biểu đồ để thấy rõ.
1.2.2.5.Kết tinh:
Khi enzym đã đạt đến độ tinh khiết phù hợp, nó có thể kết tinh. Tuy nhiên,
kết tinh không có nghĩa là chế phẩm enzym tinh khiết. Hoạt độ riêng của tinh thể
tăng khi các enzym tái kết tinh và quá trình tái kết tinh cần lặp lại nhiều lần cho
đến khi hoạt độ riêng tăng đến một giá trị cao nhất, không tăng được nữa.
Phương pháp kết tinh và tái kết tinh được ứng dụng khi tinh chế enzym như
là một phương pháp phân đoạn protein có giá trị. Vì thế, tốt nhất nên xem quá
trình kết tinh như là một phương pháp cụ thể của quá trình phân đoạn, và được sử
dụng ở những giai đoạn tinh thể cuối cùng.
Sự kết tinh enzym thường được tiến hành từ các dung dịch ammonium

sulfat. Để thu được những tinh thể tốt, quá trình được tiến hành chậm và từ từ qua
nhiều ngày hoặc tuần. Phương pháp thông thường là thêm từ từ muối vào dung
dịch enzym đậm đặc cho đến khi bắt đầu thấy đục rõ. Có thể thêm dung dịch muối
nồng độ cao từng giọt, từng giọt hoặc thông qua ống mao quản hay màng thẩm
tích ( trong một số trường hợp dung dịch enzym được thẩm tích đối với dung dịch
ammonium sulfate cho tới khi xuất hiện đục), hoặc dung dịch đơn giản được làm
bay hơi chậm. Sau đó, người ta để yên các dung dịch, không khuấy trộn trong vài
ngày ở nhiệt độ lạnh, khi đó những tinh thể enzym sẽ xuất hiện như ý muốn. Khi
thêm nồng độ muối cao, thường enzym kết tủa dưới dạng vô định hình. Ngoài ra
cần thử thực nghiệm nhiều giá trị pH và nhiệt độ để đạt hiệu quả kết tinh. Thay
vào đó, quá trình kết tinh được tiến hành ở những nồng độ muối xác định bằng
cách thay đổi đều đặn và từ từ pH hoặc nhiệt độ. Nếu trước khi kết tinh mà thấy
dung dịch enzym loãng thì cần cô đặc dung dịch trước.
Quá trình kết tinh sẽ dễ dàng hơn nếu một trong những giai đoạn trước đó là
quá trình phân đoạn với dung môi hữu cơ. Những tinh thể lắng xuống đựơc tách
riêng và tái kết tinh nhiều lần, mỗi lần lại đo hoạt độ riêng. Sự tái kết tinh làm đi
làm lại nhiều lần cho tới khi hoạt độ riêng của chế phẩm không tăng lên nữa.
Phối hợp những phương pháp phân đoạn khác nhau khi tinh chế:
Khi tiến hành tinh chế các enzym, trình tự áp dụng các phương pháp phân
đoạn khác nhau phải được xác định. Trình tự hiệu quả nhất được xác định thông
qua thực nghiệm, nhưng cần lưu ý một số điểm sau:
Trang 11
Enzym thực vật
- Quá trình kết tinh là phân đoạn tinh chế sau cùng.
- Quá trình đun nóng nên được tiến hành đầu tiên do khả năng tách riêng
một phần đáng kể các protein không cần thiết, đặc biệt khi chế hoá
những lượng lớn dịch chiết ban đầu.
- Khi sử dụng phép diêm tích phân đoạn bằng ammonium sulphate hoặc
kết tủa bằng các dung môi hữu cơ ở những giai đoạn tinh chế đầu tiên,
khi đó ta có những thể tích dung dịch lớn, cần phải nhanh chóng tách

riêng protein tủa xuống.
- Đôi khi người ta bắt đầu sự hấp phụ âm tính hoặc dương tính trên
aluminum hydroxide hoặc calcium phosphate. Những tủa thu được khi
đó dễ tách bằng cách để lắng cặn hay ly tâm ở tốc độ nhỏ.
- Hoạt tính của enzym có thể giảm trong suốt quá trình thẩm tích do
enzym rất kém bền, các chất bổ trợ bị loại bỏ nhưng nguyên nhân thông
thường nhất (trừ khi sử dụng nước tinh khiết) là do các kim loại ức chế
có trong nước như Cu.
Để có thể loại muối ra khỏi dung dịch, người ta cũng tiến hành thẩm tích.
Cột chứa jela sephadex có thể loại trừ muối một cách nhanh chóng và hoàn toàn
khỏi những thể tích dung dịch lớn. Các phương pháp sử dụng cột thường không
tiện lợi khi áp dụng trong phạm vi sản xuất lớn vì thế nó thích hợp hơn cho những
giai đoạn sau của quá trình tinh chế. So với các phương pháp khác, những phương
pháp sử dụng cột tiêu hao một không gian đáng kể cho việc lắp cột, rửa và rửa giải
cột, đồng thời sự hoà tan enzym trong quá trình rửa giải có thể xảy ra.
Sự đun nóng thường đưa lại kết quả tốt đẹp khi kết tủa những enzym không
có hoạt tính. Tuy nhiên nó lại ức chế đáng kể một số enzym, do đó hoạt tính của
enzym chỉ tăng lên rất ít.
Những phương pháp làm đặc dung dịch protein như thổi không khí từ quạt
máy vào dung dịch đựng trong các túi cellophane, làm đông đặc bằng cách làm
bốc hơi chân không, làm đông khô,… thường gây biến tính enzym. Tốt nhất để cô
đặc dung dịch protein-enzym, ta tiến hành siêu ly tâm hoặc xử lý bằng huyền phù
dextran sephadex khô.
Nếu chế phẩm enzym đã được tinh chế tương đối tốt và chỉ còn chứa một
lượng nhỏ protein không hoạt động thì điện di có thể đưa lại những kết quả mỹ
mãn về mặt làm giàu enzym. Muốn vậy ta cần có enzym với thể tích nhỏ.
Phương pháp sắc kí trao đổi ion trên các ionit cellulose có thể được sử dụng
để chiết xuất sơ bộ các enzym. Từ hỗn hợp protein phức tạp, ta có thể tách riêng
từng phân đoạn protein enzym. Vì thế phương pháp này cùng với sự sử dụng các
chất trao đổi ion khác nhau có thể được sử dụng trước hoặc sau khi điện di.

Ở bất kì giai đoạn tinh chế nào, enzym đều có thể được chiết ra dưới dạng
khô bằng cách đông khô. Thế nhưng, cùng với việc tinh chế loại trừ những chất
lẫn theo, tính dễ hỏng của enzym cũng tăng lên. Các chế phẩm enzym thô có thể
được duy trì khá lâu ở 40
o
C.
Các phương pháp khác:
Trang 12
Enzym thực vật
Ngoài những phương chính kể trên còn có một số phương pháp khác sử
dụng cho từng trường hợp riêng cụ thể và được áp dụng khi các phương pháp nêu
trên không đem lại hiệu quả cao. Có thể kể đến ba phương pháp sau:
+Làm biến tính bởi chloroform: lắc dung dịch enzym với hỗn hợp cồn và
chloroform để tách các protein không hoạt động ra trước.
+Sử dụng các chất gây tủa khác: thêm vào thận trọng một lượng xác định
muối kim loại nặng (Pb) ở giai đoạn đầu để loại bỏ những protein không mong
muốn mà không làm giảm hoạt độ enzym.
+Cô đặc: đối với những trường hợp chất hấp phụ có ái lực cao với enzym
thì nước giải hấp phụ chỉ chứa enzym với nồng độ thấp, do đó nếu ta cô đặc dung
dịch enzym tới một lượng nhỏ hơn sẽ đạt được hiệu quả tinh chế cao hơn. Có thể
sử dụng các cách sau:
- Đông lạnh dung dịch enzym và tách bỏ đá.
- Đặt dung dịch enzym vào ống thẩm tích và để trong dòng không khí ấm.
- Làm đông khô (thường được sử dụng, cô đặc cả enzym và muối).
- Cô đặc dung dịch bằng siêu lọc: muối và nước chảy qua màng lọc, còn
enzym bị giữ lại, sau đó rửa màng lọc thu nhận enzym.
- Thêm sephadex khô vào giúp giữ lại cả muối và nước và làm tăng nồng
độ enzym trong dung dịch.
Trong tất cả các phương pháp phân đoạn enzym (điện di, sắc kí…), cần
phải loại trừ những ion kim loại nặng, chất oxi hóa… độc đối với enzym có trong

dung dịch muối trong nước hoặc những pha rắn bất động bằng cách dùng thuốc
thử tiolic, các chất khử thích hợp (EDTA, mercaptoethanol, unitiol), complexon…
1.3. NHỮNG TIÊU CHUẨN TINH KHIẾT CỦA ENZYM [3]:
Để xác định xem enzym được chiết ra có phải là tinh khiết không hay còn
lẫn các protein không hoạt động khác, ta sử dụng một số phương pháp chủ yếu
dựa trên tính chất vật lý của protein.
- Làm lắng (kết tủa) dung dịch protein trong phần quay phân tích của máy
siêu ly tâm: nếu phát hiện một đỉnh của protein thì đó là protein thuần
nhất, tuy nhiên kết quả không chính xác lắm vì những protein có phân
tử lượng bằng nhau sẽ lắng với tốc độ như nhau và cho cùng một đỉnh.
- Điện di: dung dịch enzym khi được điện di khu vực trong jella tinh bột
hoặc thạch chỉ ra một đỉnh cân đối là enzym thuần khiết, tuy nhiên khi
hàm lượng những protein tạp nhỏ (<1%) thì khó phát hiện ra đúng.
- Xác định hoạt độ riêng, mật độ quang học riêng trong những đỉnh quang
phổ đặc trưng cùng hàm lượng các nhóm ngoại đặc hiệu.
- Kết hợp phân tích điện di và những phản ứng miễn dịch hóa học đặc
hiệu, đặc biệt điện di trên thạch theo grabar. Phương pháp này khá nhạy.
- Định độ hòa tan của enzym theo norchrop: ít nhạy nhưng có triển vọng.
Trang 13
Enzym thực vật
- Thường để xét độ thuần nhất của enzym thì phải dựa trên sự so sánh các
kết quả thu được từ một vài phương pháp khác nhau.
- Cần lưu ý rằng, những chế phẩm enzym càng tinh khiết thì càng dễ
hỏng và khi bảo quản các dung dịch ở 4
o
C đều nhanh chóng mất hoạt
tính. Vì thế, khi tái kết tinh enzym lặp lại, ta thường thấy có sự giảm
hoạt độ riêng vì các tinh thể đã bị ô nhiễm bởi phần enzym bị ức chế.
1.4. ENZYM SẢN XUẤT TỪ THỰC VẬT [3]:
1.4.1.Bromelin [3]:

1.4.1.1.Đặc điểm:
Cấu tạo enzym bromelin: Bromelin là một glycoprotein, mỗi phân tử glycan
gồm 3 manose, 2 glucoamin, 1 xylose và 1 fructose. Sợi hydrate cacbon
này liên kết hoán vị với sợi polypeptide. Trọng lượng phân tử khoảng
33000 Da (lớn gấp 1,5 lần so với papain)
Hình 1.1 : Cấu trúc sợi hydrate carbon của bromelin
Khi phân tích thành phần amino acid ở bromelin thân và bromelin quả thì
tuỳ theo phương pháp thu nhận và phương pháp phân tích mà có thành phần
amino acid thay đổi khác nhau. Bromelin thân có thành phần amino acid thay đổi
trong khoảng 321-144 amino acid và bromelin quả là 283-161 amino acid.
Bromelin thân là một sợi polypeptide có amino acid ở đầu amine là valine và ở
đầu cacbonhydrate là glycin, còn bromelin quả có amino acid ở đầu amine là
alanin.
Trang 14
Enzym thực vật
Bảng 1.1: Thành phần amino acid và những nhóm khác của bromelin.
(mg/100g protein)
Amino acid Thân Quả xanh Quả chín
Aspartic acid 29 – 29,4 29,8 29,8
Glutamic acid 23 23,2 23,4
Glycine 24,6 – 35 32,6 32,2
Alanine 35 – 35,4 23,8 24,4
Valine 21,6 – 22 19,8 20,1
Leucine 10 10 10
Threonine 21 – 21,2 16,4 16,2
Cysteine 28 – 28,2 32,2 32
Methionine 13,6 – 14 13,5 13,8
Proline 14 – 14,2 11,6 12,1
Phenylalanine 8,8 – 9 7,6 8
Tyrosine 20,8 – 21 22,4 22,2

Tryptophan 8 – 8,1 5,6 -
Histidine 1,9 – 2 1,4 1,3
Lysine 22,9 – 23 7,8 8,3
Arginine 11,5 – 12 8,6 9,1
Amid 41,6 – 42 43 43,4
Glucoamine 5,8 – 6 0,2 0,2
Cacbonhydrate 1,46 3,2 3,2
Cấu trúc không gian của bromelin:
Murachi và Busan phân tích cấu trúc bậc 1 của bromelin và nhận thấy cách
sắp xếp amino acid trong phân tử bromelin như sau:
Ser – Val – Lys – Asn – Gln – Asn – Pro – Cys – Gly – Ala – Cys – Tryp –

-Gly – Cys – Lys -
Bromelin là một protease trong tâm hoạt hoạt động có chứa cysteine và hai
sợi polypeptide liên kết với nhau bằng cầu nối –S-S Phân tử có dạng hình cầu do
có cách sắp xếp phức tạp.
Trong phân tử bromelin thân có chứa nhóm sulfhydryl có vai trò chủ yếu
trong hoạt tính xúc tác và trong mỗi phân tử có tất cả 5 cầu nối disulfite. Ngoài ra,
trong phân tử còn có
2
Zn
+
có vai trò trong duy trì cấu trúc không gian của enzym.
Tính chất vật lý:
Bromelin tan ít trong nước và glycerine, nhưng không tan trong dung môi
hữu cơ. Bromelin hoạt động tốt nhất ở vùng pH trung tính, nhiệt độ 70
0
C. Vì tâm
hoạt động của bromelin có chứa nhóm -SH nên dễ dàng bị ức chế bởi chất oxi hóa
Trang 15

Enzym thực vật
như H
2
O
2
, metyl bromua, ion kim loại …và được hoạt hóa bởi chất khử (cystein,
sunfit, bisunfit, cyanid…).
Các nghiên cứu về tính chất vật lý của bromelin thân dứa được Murachi và
cộng sự nghiên cứu và công bố vào năm 1964 như sau:
Bảng 1.2: Những tính chất vật lý của protein thân:
Tính chất vật lý Kí hiệu Giá trị
Hằng số sa lắng S 2.73S
Hằng số khuyếch tán D 7.77 x 10
-7
cm
2
/s
Thể tích riêng phần V 0.743 mL/g
Độ nhớt bên trong [l] 0.039 dl/g
Tỷ số ma sát f/f
0
1.26
Điểm đẳng điện pI 9.55
Sự hấp thu A
1%
cm
ở 280 nm 20.1
Trọng lượng phân tử 33.200
*
32.100

**
35.500
***
*
: tính từ phương pháp sa lắng- khuếch tán
**
: tính từ hằng số sa lắng và độ nhớt bên trong
***
: tính bằng phương pháp Archibald
Tính chất hóa học :
a. Hoạt tính của bromelin:
Hoạt tính phân giải của bromelin:
Bromelin có ba hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase và esterase.
Bromelin thân có nhiều cơ chất tự nhiện và có thể thuỷ phân cả cơ chất tự nhiên
lẫn cơ chất tổng hợp.
Bảng 1.3 : Hoạt tính phân giải casein của bromelin
Cơ chất Hoạt tính phân giải casein (UI/mg)
Bromelin thân Bromelin quả xanh Bromelin quả chín
Casein 7,4 4,0 3,0
Đối với cơ chất là casein, hoạt tính phân giải của bromelin thân cao hơn
bromelin quả xanh và bromelin quả chín.
Trang 16
Enzym thực vật
Bảng 1.4: Hoạt tính phân giải Benzoyl-L-Arginine amide (BAA) của bromelin
Cơ chất Hoạt tính phân giải casein (UI/mg)
Bromelin thân Bromelin quả xanh Bromelin quả chín
BAA 3,7 9,1 7,2
Bảng 1.5: Hằng số Michaelis với các cơ chất tổng hợp khác nhau của
bromelin thân
Cơ chất tổng hợp

BAA BAEE BAEM
1,2 x 10
-3
1,7 x 10
-1
3,2 x 10
-2
BAA: Benzoyl-L-Arginine amide
BAEE : Benzoyl-L-Arginine ethyl ester
BAEM : Benzoyl-L-Arginine methyl ester
Bromelin quả xanh có hoạt tính phân giải BAA cao hơn bromelin thân và
bromelin quả chín.
So với BAA, hằng số xúc tác của bromelin thân trên BAEE cao gấp 140 lần.
b. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính bromelin
Giống như các chất xúc tác sinh học khác, bromelin chịu ảnh hưởng bởi các
yếu tố như cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, ion kim loại,
một số nhóm chức, phương pháp trích ly, phương pháp tinh sạch
o Ảnh hưởng bởi cơ chất :
Trên những loại cơ chất khác nhau thì bromelin có hoạt tính khác nhau.
Nếu cơ chất là hemoglobin thì bromelin mạnh gấp 4 lần papain, với casein tương
đương, với cơ chất như BAA, BAEE thì thấp hơn.
o Ảnh hưởng bởi nhiệt độ:
Nhiệt độ của phản ứng xúc tác chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố: thời gian
tác dụng càng dài thì nhiệt độ sẽ có những thay đổi làm ảnh hưởng đến hoạt tính
của enzym, nồng độ enzym, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzym.
Ở dịch chiết quả (pH 3,5) khi tăng nhiệt độ lên đến 60
o
C thì bromelin vẫn
còn hoạt tính nhưng bromelin tinh khiết nhạy cảm với nhiệt độ. Ở 5
o

C, pH 6,1 thì
enzym bị mất 50% hoạt tính trong vòng 20 phút.
Quá trình đông khô làm mất 27% hoạt tính.
o Ảnh hưởng của pH:
pH là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzym.
pH tối thích của bromelin không ổn định mà tuỳ thuộc nhiệt độ, thời gian phản
Trang 17
Enzym thực vật
ứng, bản chất và nồng độ cơ chất, độ tinh sạch của enzym, bản chất dung dịch
đệm, sự hiện diện của chất tăng hoạt.
Khi thu nhận bromelin thân, nếu dùng tác nhân kết tủa là amonium sulfate
hoặc molypdenum carbonate thì enzym có hoạt tính cao nhất ở pH 4,8 và ổn định
ở pH 4,6 – 5,4. Bromelin thân đã được tinh sạch một phần có hoạt tính cao nhất ở
pH 6,0 và pH 8,0 ổn định ở pH 3,5 – 5,6 với nhiệt độ 63
o
C. Enzym bromelin đã
tinh sạch chỉ còn lại 60-70% hoạt tính. Enzym bromelin có biên độ pH rộng (3-10)
nhưng pH tối thích của enzym là 5-8 tuỳ thuộc vào cơ chất.
o Ảnh hưởng bởi ion kim loại:
Các ion kim loại có ảnh hưởng đến hoạt tính enzym do chúng thường gắn
vào trung tâm hoạt động của enzyme. Muối thuỷ ngân có ảnh hưởng quan trọng
đến hoạt tính của enzym bromelin và mức độ kiềm hãm thay đổi tuỳ thuộc nồng
độ muối. Ngoài ra còn có những chất có tác động ức chế bromelin do chúng kết
hợp với nhóm -SH của trung tâm phản ứng của enzyme.
o Ảnh hưởng của trạng thái và điều kiện bảo quản:
Bảng 1.6: Ảnh hưởng của trạng thái và điều kiện bảo quản trên hoạt
tính của bromelin
Điều kiện bảo quản Hoạt tính (UI/mg protein)
Dịch chiết Đông khô
Nguyên liệu tươi 1600 1150

Bảo quản ở 4
o
C trong 5 ngày 830 630
Sấy khô ở 4
o
C 1880 1360
1.4.1.2.Sản xuất:
a. Nguồn nguyên liệu :
Cây dứa (Ananas comusus) thuộc lớp đơn tử diệp, họ Bromecliaceae có
nguồn gốc từ Nam Mỹ.
Dứa là một cây thảo lâu năm. sau khi thu hoạch quả, các mầm nách ở thân
tiếp tục phát triển nhưng cho quả bé hơn quả trước.
Các bộ phận của cây gồm có:
- Thân, trục của cây; thường gọi là gốc.
- Lá xếp hình hoa thị trên thân theo một kiểu phân bố nhất định.
- Rễ thường là rễ bất định và mọc ngang mặt đất.
- Cán quả hay cuống mang quả kép bên trên có một phần chồi ngọn.
- Chồi có nhiều kiểu kèm theo vị trí đính trên cây:
+ Chồi ngọn
+ Chồi thân: phát triển từ mầm nách trên thân
Trang 18
Enzym thực vật
+ Chồi ngầm: phát sinh từ phần dưới đất của thân hoặc của cổ rễ.
+ Chồi cuống: phát triển từ mầm nách trên cuống.
+ Chồi nách: là chồi trung gian giữa chồi thân và chồi cuống.
Dứa là một loại quả rất được ưa thích ở tất cả các nước nhiệt đới, thịt nhiều
nước, vị thơm ngon, hơi chua, giải khát rất tốt. Dứa thường được dùng dưới dạng
nước uống, thức ăn tráng miệng hoặc ăn trộn với các loại rau quả khác. Một cốc
nước dứa ( khoảng 150ml) đem lại cho cơ thể trung bình 150 calo.
Hiện nay, ở nước ta loại dứa được trồng nhiều nhất là Ananas comusus

được sử dụng như thực phẩm tươi, đóng hộp, nguồn thu nhận enzym và ngoài ra
còn được sử dụng trong một số lĩnh vực khác như dược phẩm, mỹ phẩm, … Phần
thân, chồi và lá sau khi thu hoạch quả có thể được sử dụng để thu nhận enzym
bromelin, làm giấy, lấy sợi hoặc làm phân bón.
Theo các tài liệu nghiên cứu khoa học, cho kết luận chính xác rằng hàm
lượng bromelin chứa trong thân và chồi dứa lớn hơn nhiều so với trong quả. Do
đó, xu hướng hiện nay là nghiên cứu thu nhận bromelin từ đọt dứa.
b. Quy trình sản xuất:
o Phá vỡ tế bào
- Quả, thân hoặc chồi dứa được xay nhuyễn để phá vỡ tế bào mô dứa.
- Ta có thể dùng phương pháp đồng hóa để vừa phá vỡ tế bào vừa giảm
độ nhớt của dịch chiết.
o Thu dịch enzym thô
Tiến hành: quả dứa hoặc thân được xay nhuyễn, vắt kỹ, lọc bỏ bã và thu
dịch lọc, ly tâm dịch lọc với tốc độ 6000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ chất
xơ sẽ thu được dịch chiết có chứa bromelin.
o Tách enzym
Ta có thể sử dụng các phương pháp:
Phương pháp kết tủa
Tủa bằng acetone: thêm 1 thể tích acetone 99,5
o
(đã được làm lạnh) hoặc
20% vào một thể tích dung dịch nước dứa sau ly tâm (cũng được làm lạnh). Để
yên trong 1 giờ ở nhiệt độ 0-4
o
C. Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 6000 vòng/phút trong
5 phút, loại bỏ tủa. Thêm hai thể tích acetone lạnh vào, để 1 giờ ở 0-4
o
C, ly tâm
thu tủa và rửa tủa bằng acetone lạnh.

Tủa bằng ethanol: làm lạnh dung dịch nước dứa sau ly tâm, cho ethanol 96
0
vào theo tỷ lệ nước dứa : cồn = 4:1, trộn đều, để ở nhiệt độ 0
o
C trong 3-4 giờ. Ly
tâm hỗn hợp ở 6000 vòng/phút trong 5 phút. Rửa tủa bằng acetone và thu tủa.
Tủa bằng ammonium sulphate: chuẩn bị 1 lít dung dịch nước dứa sau ly
tâm, cho từ từ 532g ammonium sulphate vào và khuấy đều (dung dịch đạt bão hòa
là 70%). Để yên ở nhiệt độ phòng 10-15 phút, sau đó ly tâm với tốc độ 6000 vòng/
phút trong 5 phút để thu nhận tủa.
Phương pháp hấp phụ:
Có thể sử dung kaolin hay betonite để hấp phụ bromelin.
Trang 19
Enzym thực vật
Cấu tạo kaolin: kaolin có cấu tạo thành từng lớp và có độ phân tán cao, do
đó chúng có tính dẻo đặc biệt và có khả năng tạo hình kết dính. Một tính chất quan
trọng là kaolin có độ phân tán cao nên có tính hấp phụ tốt. Kích thước hạt nhỏ hơn
1µm do đó diện tích tiếp xúc tăng lên rất nhiều. Một lý do khác dẫn đến khả năng
hấp phụ của kaolin cao là do trên bề mặt kaolin có chứa rất nhiều ion OH
-
và O
2-
,
những ion này có khả năng liên kết tương đối bền vững với các chất bị hấp phụ.
Tiến hành: cho kaolin khô (hoặc đã ngâm cho trương nở) vào dung dịch
nước dứa sau ly tâm với tỉ lệ 25mg kaolin/ml dung dịch nước dứa. Khuấy đều
bằng máy khuấy từ, sau đó ly tâm để thu tủa. Tủa thu được gọi là bromelin-kaolin.
Phương pháp siêu lọc:
Dung dịch sau ly tâm được cho qua màng siêu lọc có kích thước 0,45µm,
trong quá trình này thêm nước cất vào để tinh sạch và thu được dung dịch cô đặc.

Thu nhận tủa bằng cách sử dụng acetone hoặc sấy thăng hoa dung dịch cô đặc.
Để tăng khả năng tinh sạch, ta có thể tiến hành theo kiểu lọc lô và lọc thể
tích không đổi.
Phương pháp sử dụng CMC:
Phương pháp tách bromelin bằng CMC cho phép thu được bromelin ở dạng
bột trắng có hoạt tính cao, thời gian nhanh và đơn giản hơn các phương pháp khác.
CMC vải màn được tẩm ướt bằng dung dịch đệm phosphat 0,005M, pH 6,1,
sau đó cho dịch chiết dứa vào, thỉnh thoảng khuấy trộn. Sau 2 giờ lấy ra vắt kiệt,
vẩy sạch chất bẩn bám vào CMC. Rửa protein bằng đệm phosphat 0,05M, pH 7,1,
và NaCl 0,5M khuấy trộn 3-4 lần. Sau hai giờ lấy ra vắt kiệt thì thu được dung
dịch đậm đặc chứa bromelin. Tiếp tục hấp phụ lần thứ 2 như lần thứ nhất. Sau đó
gộp các dịch chiết lại và tủa bằng acetone hay cồn lạnh để tách lấy enzym.
Với phương pháp này hiệu suất thu đạt 0,1% so với chồi dứa tươi và có
hoạt tính 24nk/mg chế phẩm enzym. So với tủa (NH
4
)
2
SO
4
thì độ sạch của chế
phẩm enzym cao gấp 2 lần, thời gian nhanh hơn và tiến hành thuận lợi.
Tủa thu được sau đó đem sấy chân không ở nhiệt độ 40
o
C để thu nhận chế
phẩm enzym.
o Phương Pháp Tinh Sạch Bromelin :
Enzym bromelin được tinh sạch bằng phương pháp thẩm tích, lọc qua
sephadex, phương pháp sắc kí.
Tinh sạch bằng phương pháp thẩm tích:
Tiến hành:

+ Cân 1g protein thô
+ Dung dịch đệm: 10ml dung dịch sodium phosphate 0,03M, pH 7,2
+ Tiến hành thẩm tích trong 6 giờ và cứ sau 2 giờ thay dung dịch đệm bên
ngoài 1 lần. Dung dịch đệm phía ngoài túi được khuấy liên tục bằng máy
khuấy từ. Enzym sẽ bị giữ lại trong túi cellophane.
Tinh sạch bằng cách lọc qua sephadex:
Tinh sạch bằng cách lọc qua sephadex G-50:
Cân 100 mg enzym thô hòa tan vào trong 1mL dung dịch đệm sodium
phosphate 0,03M, pH 7,2. Khi enzym đã hòa tan hoàn toàn thì cho hỗn hợp enzym
từ từ vào cột. Cho dung môi phân ly enzym qua cột và điều chỉnh tốc độ chảy
Trang 20
Enzym thực vật
khoảng 2mL trong 7 phút. Loại bỏ 5 mL đầu tiên rồi mới bắt đầu thu dịch enzym.
Dịch enzym được thu đến khi dùng Ba(NO
3
)
2
để thử (NH
4
)
2
SO
4
và thấy có xuất
hiện kết tủa trắng thì ngừng quá trình thu dịch enzym. Dịch enzym thu nhận được
làm đông khô. Quá trình lọc enzym nên được tiến hành trong điều kiện nhiệt độ
thấp để giảm thiểu sự biến tính protein. Thời gian tiến hành khoảng 1 giờ.
Tinh sạch bằng cách lọc qua sephadex G-100:
Cân 100 gam enzym thô hòa vào 1mL dung dịch đệm như trên rồi cho vào
cột. Chỉnh cho tốc độ của dung môi phân ly enzym là 1mL/phút. Thu từng phân

đoạn enzym (mỗi phân đoạn là 3mL) và đo độ hấp thu OD ở bước sóng 280nm.
Tính trọng lượng phân tử bromelin theo công thức:
o
e
V
V
M 847.0941.5lg
−=
V
o
= 40%V
t
(V
t
là thể tích tổng cộng của cột)
V
e
: thể tích dung môi phân ly enzym được tính từ lúc cho mẫu vào đến khi
thu nhận mẫu.
Tinh sạch bằng phương pháp sắc ký:
Bromelin thân cho chạy sắc ký trên Duolite CS101 ở pH 6,05 cho hai phân
đoạn khác nhau về điện tích với hoạt tính xúc tác phân giải BAEE, casein và
glucagon.
Sắc ký bromelin thân trên Bio Rex ở pH 6,1 sẽ thu được 5 phân đoạn khác
nhau về thành phần amino acid. Khi sắc ký trên sephadex G-75 ở pH 7 cũng nhận
được 5 thành phần có hoạt tính enzym.
Bromelin thân và bromelin quả thô được cho chạy sắc ký gel trên sephadex
G-75, tiếp theo sử dụng phương pháp sắc ký trao đổi ion trên sulfoethyl sephadex
chỉ cho một phân đoạn đơn có hoạt tính phân giải protein. Còn nếu sắc ký hoán vị
gel ở pH 7 rồi sau đó sắc ký trên sulfoethyl sephadex cho thấy có sự hiện diện của

hai protease riêng biệt được đặt tên là bromelin II và bromelin III, hai protease này
có tốc độ di chuyển khác nhau khi điện di trên polyacrylamide ở pH 9,5.
Bromelin thân khi dùng sắc ký gel trên sephadex G-50 và sắc ký trao đổi
ion trên DEAE- cellulose thì thấy có 1 thành phần chính và 5 thành phần phụ.
Bromelin quả khi dùng sắc ký trên DEAE–cellulose và sulfoethyl sephadex
thì thấy có 1 thành phần chính và 2 thành phần phụ.
1.4.1.3. Ứng dụng [2],[3],[4]:
a. Thủy phân Protein:
Các enzym thương mại có mức độ ứng dụng rất đa dạng và hiệu quả trong
lĩnh vực y dược và công nghiệp .Trong công nghệ thực phẩm, protease là công cụ
xác định cấu tạo, khả năng hòa tan và những tính chất khác của thịt cá. Bromelin
còn dùng để biến đổi protein thịt cá thành dịch thủy phân giàu acid amin phù hợp
cho sự tiêu hóa của người hay làm thức ăn cho gia súc.
Protease thương mại được sử dụng để làm mềm thịt, sản xuất chế phẩm
protein cá bằng protease hòa tan và sản xuất enzym cố định. Hiện nay việc nghiên
cứu triển khai quá trình sản xuất các chế phẩm thủy phân cá bằng enzym là mối
Trang 21
Enzym thực vật
quan tâm chung nhằm tận dụng được nhiều hơn những thủy hải sản chưa được sử
dụng trực tiếp làm thức ăn cho người.
Việc sản xuất chế phẩm protease dùng trực tiếp cho người cho người còn
gặp khó khăn do:
a) Sự phân giải nhanh của enzym đưa đến sự hình thành các peptid có vị
đắng trong dịch thủy phân.
b) Protease sấy khô mất nhiều tính chất, chức năng.
c) Sự tạo nhũ tương của sản phẩm có giá trị dinh dưỡng nhưng mùi vị
không hợp.
Tuy vậy thủy phân protein bằng enzym có một triển vọng lớn. Nhiều vấn đề
đang tiếp tục được nghiên cứu giải quyết và người ta có nhiều căn cứ để tin tưởng
rằng quá trình sinh học này sẽ đưa đến những thành công trong việc chế tạo các

sản phẩm protein từ phế liệu thịt cá.
Việc lựa chọn enzym và các điều kiện thủy phân thích hợp là vấn đề cần
thiết. Việc xử lí protease cho thịt cá có liên quan một phần đến bản chất phức tạp
của cơ chất. Tiến trình của phản ứng enzym không phải luôn dễ điều khiển để cho
ra sản phẩm với tính chất đặc biệt mà ta đang đợi. Hiện nay các protease đang
được chú ý sử dụng là papain, bromelin, ficin và enzym có nguồn gốc vi sinh vật.
Enzym bromelin thương mại là hỗn hợp gồm các protease và một lượng
nhỏ photphatase, cellulase. Vì bromelin có phổ tác dụng rộng như papain nên ngày
càng được sử dụng nhiều thay cho papain. Trong chế biến thủy sản và trong y
dược, đặc biệt trong thủy phân protein cá, sự làm mềm thịt, thủy phân gan bò.
• Thủy phân protein cá
Việc sử dụng protease để sản xuất chế phẩm cá đậm đặc là phương pháp
biến đổi những loại cá rẻ tiền, những thành phần không ngon của cá thành chế
phẩm đậm đặc có tính chất chức năng tốt hơn bột cá cổ truyền.
Trong những quá trình cổ điển, người ta lợi dụng enzym vi sinh vật thủy
phân có sẵn trong cá để phân giải protein một cách chậm chạp trong thời gian dài
và nhiệt độ thích hợp.
Ngày nay enzym được sử dụng trong quá trình thủy phân với những đặc
điểm thỏa mãn cho sản xuất công nghiệp. Cần phải lựa chọn những điều kiện để
ngăn ngừa hoạt động của vi khuẩn phân giải. Enzym bromelin có t
op
= 70
0
C, ở
nhiệt độ này loại trừ sự tồn tại của hầu hết vi khuẩn phân giải.
Sản phẩm phân giải có phân tử lượng trung bình tương đối thấp. Tùy theo
điều kiện thủy phân mà sử dụng một hay nhiều loại enzym. Sản xuất dịch thủy
phân protein cá bằng enzym thực vật để thêm vào nước mắm cổ truyền có những
ưu điểm to lớn:
+ Cho phép tăng thể tích thu hồi mà không làm thay đổi giá trị dinh dưỡng

+ Thay thế các loại cá được dùng trong sản xuất nước mắm hiện nay bằng các loại
cá có giá trị thương phẩm kém hơn
Trang 22
Enzym thực vật
+ Rút ngắn được quy trình sản xuất cổ truyền để rút ngắn quá trình lên men, người
ta cho bromelin vào khối chượp, nhờ hoạt động của bromelin protein của cá được
thủy phân nhanh hơn, để tránh biến tính bromelin, thay vì cho muối một lần trong
lên men, người ta cho muối vào nhiều lần. Theo cách này ta có thể sản xuất nước
mắm khoảng từ 5 – 7 tháng thay vì chín tháng hay hơn một năm.
+ Gia tăng sự chuyển lượng protein không hòa tan thành protein hòa tan.
• Sự làm mềm thịt
Chỉ cần một phần bromelin là có khả năng thủy phân 1.000 phần thịt, tương
tự như papain. Các enzym được rải lên thịt dưới dạng bột hoặc được ngâm trong
dung dịch enzym hoặc tiêm dung dịch enzym vào thịt.
Thủy phân gan bò: bromelin dùng để thủy phân gan bò làm cao gan, thuốc
bổ. Gan bò được xử lí bằng chế phẩm bromelin trong thời gian 10 giờ ở nhiệt độ
55
0
C, sau đó xử lí nhiệt 100
o
C trong vòng 3 - 5 phút. Dịch thủy phân được tách lọc
và đông khô.
b. Sử dụng trong quá trình đông tụ sữa:
Thông thường để chế biến các sản phẩm từ sữa người ta dùng renin. Renin
là loại enzym được sử dụng làm đông tụ sữa truyền thống. Tuy nhiên lượng renin
sản xuất chưa đáp ứng đủ yêu cầu thực tế. Gần đây sử dụng enzym thực vật trong
chế biến sữa đang được phát triển, trong đó bromelin chồi dứa đang được quan
tâm sử dụng vào mục đích này.
c. Sử dụng bromelin thu nhận chất ức chế protease:
Trong tế bào cơ quan động thực vật tồn tại các chất ức chế enzym, trong đó

có các chất ức chế protease. Các chất ức chế trong tế bào thường có bản chất
protein như enzym. Hiện nay trong công nghiệp và y tế thường sử dụng rộng rãi
các chất ức chế này. Chế phẩm bromelin được sử dụng để thu nhận các chất ức
chế các chất ức chế protein có chứa nhóm –SH. Bromelin được tinh sạch sau đó
được cố định trong gel sepharose. Dịch nghiền đầu và lõi dứa sau khi lọc và li tâm
được cho qua cột chứa bromelin cố định, trước tiên trong dung dịch đệm phosphat,
pH = 4,6 sau đó pH = 7,6 - 7,8, khi đó xảy ra quá trình liên kết giữa bromelin và
chất ức chế của chúng có mặt trong dịch nghiền nói trên , sau đó thu hồi chất ức
chế bằng dung dịch 0,01M NaOH có chứa 0,1M NaCl, pH = 11,5 - 12. Bằng
phương pháp này sẽ thu được chất ức chế protein ở dạng tinh sạch, chất ức chế
này tác động mạnh lên enzym như papain, ficin.
d. Các lĩnh vực ứng dụng khác:
Nhờ tác dụng làm dễ tiêu hóa protein, bromelin được điều chế với vài chất
khác để bổ sung hay điều trị sự thiếu protease tiêu hóa tự nhiên. Những dược
phẩm này chứa bromelin và các enzym khác như lipase, amilase, những chất bổ
hay vitamin.
Bromelin cũng có thể giúp giảm triệu chứng của bệnh hen, đau thắt ngực,
viêm phế quản. Bromelin làm tăng hệ miễn dịch, ức chế quá trình viêm, làm giảm
phù nề và tụ huyết, bôi lên nơi tổn thương (vết thương, vết bỏng, vết mổ) làm sạch
các mô hoại tử, mau lành sẹo. Những nghiên cứu mới gần đây cho thấy, bromelin
Trang 23
Enzym thực vật
có tác dụng làm giảm hiện tượng sưng phồng, bầm giập và đau đớn đối với những
sản phụ trải qua các phẩu thuật nhỏ trong khi sinh. Bromelin phối hợp với thuốc
kháng sinh trong điều trị một số bệnh nhiễm khuẩn sẽ làm tăng hiệu quả kháng
sinh, phối hợp với một số thuốc điều trị hen (theophylllin, ephedrine…) làm tăng
tác dụng chống hen. Mới đây, một nghiên cứu đăng trên tạp chí Anh cho biết, qua
thử nghiệm trên chuột, các nhà khoa học đã nhận thấy rằng bromelin làm giảm
hơn 50% dấu hiệu viêm phổi đối với bệnh hen, hàm lượng càng cao thì hiệu quả
càng được cải thiện.

Ngoài ra, bromelin còn giúp giảm triệu chứng sổ mũi, giúp mau lành những
vết thương nhỏ, đặc biệt là căng nhức cơ, bong gân.
Bromelin còn có tác dụng làm giảm di căn của bệnh ung thư, liều dùng 200
– 300 mg/kg thể trọng kết hợp với hóa trị hay xạ trị. Trong công nghiệp dược
phẩm, nhiều hãng dược phẩm ở châu Âu đã đưa bromelin vào trong thành phần
thuốc, nó thường được bào chế chung với nhiều chất khác. Ở Mỹ, MỹLatinh và
Anh có thuốc Aranas do hãng W.H Roser điều chế tại Philadel.
Từ thịt quả dứa xay hoặc giã nát, người ta còn dùng làm mặt nạ (đắp lên
mặt) nhằm lột nhẹ lớp tế bào sừng phía ngoài, bộc lộ lớp da non bên trong mịn
màng hơn và trắng hơn.
1.4.1.4. Sản phẩm thương mại:
Hình 1.2: Chất chiết từ lá và thân dứa (Ananas comosus) với hàm lượng
bromelain cao, được sản xuất dưới dạng viên nén, chứa 200mg bromelin/viên.
Trang 24
Enzym thực vật
Hình 1.3 : Chế phẩm bromelin có hoạt lực cao (1200gdu/g hay 1800mcu/g)
Hình 1.4: Bột bromelin bổ sung vào thức ăn cho gia súc
Hình 1.5: Quercetin & Bromelain - Thuốc giúp bệnh thống phong
Dược phẩm này bao gồm tinh chất quả dứa Bromelain và dược thảo
Quercetin, một chất “flavonoid” có công dụng chống oxít hóa rất mạnh, giúp bồi
bổ tim, phòng ngừa tai biến mạch máu não, phòng ngừa ung thư. Quercetin có
nhiều trong rượu vang đỏ, quả bưởi, hành tây, quả táo và trà đen.
Thuốc có thể giúp các bệnh sau đây:
• Bệnh thống phong (Gout): giúp ngăn ngừa cơ thể sản xuất ra uric acid,
giảm đau và chống viêm.
Trang 25