CHƯƠNG EMZYME GIỚI HẠN
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (594.15 KB, 26 trang )
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SÀI GÒN
KHOA SƯ PHẠM KHTN
LỚP DSI121 – KHÓA 12
Chương X: Các enzyme giới hạn
Thành viên thực hiện
1. Trần Thị Nụ
2. Nguyễn Thị Thanh Nga
3. Đào Thị Thu Hà
4. Phạm Thị Kim Xuyến
1
2
NỘI DUNG
1. KHÁI NiỆM
2. HiỆN TƯỢNG
GiỚI HẠN
3. CÁCH GỌI TÊN
4. CÁC LOẠI
EMZYME
4.1. Trình tự nhận
biết
4.2. Các kiểu cắt
4.3. Ứng dụng
4.4. Điều kiện hoạt
động của RE
Clip về RE trong qúa
trình sao chép của
VK
3
Enzyme cắt giới hạn (RE) là gì?
1. KHÁI NiỆM
4
Enzyme cắt giới hạn (restriction endonuclease) hay
gọi tắt là enzyme giới hạn (restrictase) là loại
enzyme có khả năng nhận biết đoạn trình tự
nucleotide đặc hiệu trên các phân tử DNA và cắt
cả hai sợi DNA bổ sung tại các vị trí đặc thù.
1. KHÁI NiỆM
Hamilton Smith là người đầu tiên
tách được loại enzyme này từ vi
khuẩn Haemophilus influenzae Rd
và đặt tên nó là HindII.
5
2. HiỆN TƯỢNG GiỚI HẠN
Lịch sử phát hiện
6
7
Hệ thống hạn chế cải biên
-
Sự hạn chế thực hiện nhờ hoạt động của các RE. Đó
chính là các endodesoxyribonuclease đặc biệt có thể
nhận biết một trình tự nucleotid đặc hiệu trong chuỗi
AND sợi đôi và cắt cả hai sợi đó.
- Sự cải biên là sự thay đổi DNA của bản thân tế bào theo
con đường đặc biệt của mỗi loài, khiến DNA khác với
DNA của loài khác và không phải là cơ chất của enzyme
cắt hạn chế. Nhờ đó mà DNA của tế bào chủ được bảo vệ.
Sự cải biên được thực hiện nhờ quá trình methyl hóa
(methylase) có trong tế bào vi khuẩn.
8
3. CÁCH GỌI TÊN CỦA ENZYME GiỚI HẠN
- Chữ cái đầu (viết hoa) là chữ đầu của tên
giống của vi khuẩn từ đó enzyme được li trích.
- Chữ thứ 2 và thứ 3 (viết thường) là chữ đầu
tên loài của vi sinh vật.
- Đôi khi có chữ thứ 4 chỉ chủng sinh vật.
- Chữ số la mã chỉ thứ tự RE được phát hiện
(có thể có nhiều RE được phát hiện từ một
chủng).
Ví dụ:
EcoRI - được xác định đầu tiên ở E.Coli chủng RY
13
EcoRV - là enzyme thứ 5 cũng đã được xác định ở
E.Coli.
TaqI: RE thứ nhất được tìm thấy ở vi khuẩn Thermus
aquaticus.
HpaI, HpaII, BamHI.
9
3. CÁCH GỌI TÊN CỦA ENZYME GiỚI HẠN
10
4. CÁC LOẠI ENZYME GiỚI HẠN
Đặc điểm Loại I Loại II Loại III
Điểm cắt
Xa điểm nhận
biết hơn 1000
bp
Nằm trong
điểm nhận
biết
Nằm ngoài điểm
nhận biết
Khả năng methyl hoá
gốc Adenine
Có Không Có
Điều kiện để cắt
ATP, Mg++,
S-AdoMet
Mg++ hoặc
Mn++
Mg++, S-AdoMet
Cấu trúc của enzyme
(số chuỗi
polypeptide)
Khác nhau Giống nhau Khác nhau
VD
EcoB:
TGANBTGCT
EcoRI:
GAATTC
EcoP1: AGACC
Enzyme giới hạn loại II được sử dụng chủ yếu vì nó
cắt tại vị trí giới hạn. Thường cắt ở trình tự chiều xuôi –
ngược như nhau. VD: EcoRI
4. Các loại enzyme giới hạn
11
Các RE loại II
Trình tự
nhân
biết
Các kiểu
cắt
Ứng
dụng
Điều
kiện
hoạt
động
12
4.1. Trình tự nhận biết
13
Isoschizomers
4.1. Trình tự nhận biết
14
MboI
neoschizomers
4.1. Trình tự nhận biết
15
ENZYME NGUỒN TRÌNH TỰ NHẬN BIẾT VÀ VỊ TRÍ CẮT
AluI Athrobacter lutues
5’ A G C T 3’
3’ T C G A 5’
BalI Brevibaterium
5’ T G G C C A 3’
3’ A C C G G T 5’
BamHI
Bacillus
amyloliquefaciens
5’ G G A T C C 3’
3’ C C T A G G 5’
EcoRI Escherichia coli
5’ G A A T T C 3’
3’ C T T A A G 5’
HaeIII
Haemophylus
aegypticus
5’ G G C C 3’
3’ C C G G 5’
HindIII
Haemophylus
influenzae
5’ A A G C T T 3’
3’ T T C G A A 5’
Sau3A Staphylococcus aureus
5’ G A T C 3’
3’ C T A G 5’
TaqI Thermus aquaticus
5’ T C G A 3’
3’ A G C T 5’
Nguồn, trình tự nhận biết và vị trí cắt của một số enzyme giới hạn:
16
Cắt tạo
đầu bằng
(blunt ends)
Cắt tạo
đầu so le
hay đầu dính
(cohesive
ends)
4.2. Các kiểu cắt của các RE loại II
17
SmaI
Cắt tạo đầu bằng (blunt ends)
Một số RE cắt 2 mạch DNA tại cùng 1 điểm
2 đầu bằng không có khả năng tự kết hợp trở lại
T4 ligase.
Vd: HpaI
5´
3´
3´
5´
18
Vd: EcoRI
5´ C TGCAG 3
´
3´ G ACGT C 5´
Cắt tạo đầu so le hay đầu dính (cohesive ends)
Một số RE vị trí cắt lệch nhau trên 2 mạch DNA.
Các đầu dính bổ sung có thể bắt cặp trở lại tái tổ
hợp di truyền in vitro.
PstI
19
Cắt tạo đầu bằng
- Cắt cả 2 mạch DNA ở
cùng 1 vị trí.
- Không có khả năng tự
kết hợp lại mà phải
dùng enzyme nối.
Cắt tạo đầu so le
- Cắt 2 mạch DNA vị trí
lệch nhau.
- Trình tự nu hoàn toàn bổ
sung cho nhau
có thể tự nối với nhau.
20
•
Có ý nghĩa quyết định trong sự phát triển của sinh
học phân tử eukaryote.
•
Sử dụng chủ yếu trong phương pháp tạo dòng.
•
Ngoài ra, sử dụng vào lập bản đồ giới hạn, phân tích
so sánh bộ gen ở các loài khác nhau.
4.3. Ứng dụng
21
- Dung dịch đệm phù hợp và ở nhiệt độ, pH nhất
định…
- Đa số các enzyme có độ hoạt động từ 1 đến 100
đơn vị trên µl.
- Trong thực tế, cần phải tăng nồng độ của enzyme
từ 5 đến 10 lần so với cách tính đơn vị chỉ định.
4.4. Điều kiện hoạt động của RE
22
Điều kiện để phản ứng cắt tối ưu:
- Có ion Mg làm xúc tác
- Nhiệt độ 37°C
- pH = 7,2-7,8
- Thời gian phản ứng từ 1 đến 2 giờ
4.4. Điều kiện hoạt động của RE
23
- Phản ứng của RE thực hiện trong một thể tích
càng nhỏ càng tốt.
- Các RE bị ức chế trong các điều kện: Nồng độ
EDTA quá cao hoặc sự có mặt của phenol.
4.4. Điều kiện hoạt động của RE
24
25
TÀI LiỆU THAM KHẢO
1. Hồ Huỳnh Thùy Dương- “Sinh học phân tử”- Nhà xuất
bản giáo dục.
2. Một số trang web tham khảo:
/>dna-cua-enzyme-goi-han.htm
/>h-hoc-phan-tu.htm?page=4
http://
daibio.com.vn/cong-nghe-dna-tai-to-hop/su-dung-enzym-gioi-han-tr
ong-phan-tich-adn.daibio
/>http://
users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/R/RestrictionEnz
ymes.html
/>0ee91ddc
/> />
