Bài giảng thi tuyển công chức
Tiết 1: CÁC BƯỚC CƠ BẢN CỦA KĨ THUẬT DI TRUYỀN
I. Mục tiêu tiết học
Cung cấp cho sinh viên khái niệm và các thao tác cơ bản của kĩ thuật di
truyền (thu nhận gen, tạo vector tái tổ hợp, tạo plasmid, chọn lọc, tạo dòng và biểu
hiện ).
II. Chuẩn bị phương tiện dạy học
Giáo trình, giáo án, sử dụng powerpoint,
III. Các phương pháp dạy học chủ yếu
Thuyết giảng, dạy học dựa trên vấn đề.
IV. Nội dung
1. Khái niệm
Kĩ thuật di truyền là các thao tác tác động lên DNA để chuyển một đoạn
DNA mang một hoặc một cụm gen từ tế bào của loài cho sang tế bào của loài nhận
nhờ thể truyền.
Còn có các tên gọi khác như: Kĩ thuật tái tổ hợp DNA, kĩ thuật gen, thao tác
gen, tạo dòng phân tử.
2. Sơ đồ khái quát
Kĩ thuật di truyền được thực hiện qua nhiều công đoạn phức tạp và tinh vi,
bao gồm các bước chủ yếu sau:
- Bước 1: Nuôi tế bào chủ để tạo vector chuyển gen và nuôi tế bào cho cung
cấp DNA.
- Bước 2: Tách DNA plasmid và DNA tế bào cho.
- Bước 3: Cắt cả hai loại DNA bằng cùng một loại enzyme Restriction
endonuclesae EcoRI tạo các đầu so le cố kết (cohesive ends).
Đoàn Thị Tám
Bài giảng thi tuyển công chức
- Bước 4: Trộn chung DNA plasmid đã bị cắt với đoạn DNA tế bào cho
(người) để chúng gắn vào nhau bằng bắt cặp bổ sung nhờ đầu so le cố kết.
- Bước 5: Thêm enzyme nối ligase tạo liên kết hóa trị thành DNA tái tổ hợp
hoàn chỉnh.

- Bước 6: Biến nạp DNA tái tổ hợp và tế bào nhận ( vi khuẩn E. coli).
- Bước 7: Chọn lọc và tạo dòng vi khuẩn mang gen lạ. Sau khi có dòng sẽ tạo
điều kiện để gen biểu hiện tạo ra sản phẩm.
Hình 1.1. Phương thức cơ bản để tạo dòng gen
Đoàn Thị Tám
RE RE
RE
Cắt DNA ngoại lai và
plasmid vector bằng một
loại RE giống nhau
Plasmid vector
DNA được tạo dòng
Gắn DNA
Plasmid tái tổ hợp
Biến nạp
Tế bào vi khuẩn
Sao chép vi khuẩn
Sao chép vi khuẩn
Nuôi cấy vi khuẩn chứa một lượng lớn tế bào, sinh trưởng qua
đêm ở 37
o
C sẽ sản xuất khoảng 10
9
tế bào/mL
Bài giảng thi tuyển công chức
3. Các kĩ thuật và phương pháp căn bản
3.1. Lai nucleic acid
Công nghệ gen sử dụng các kĩ thuật hóa lí thông dụng như: tách chiết và
tinh sạch DNA, RNA, xác định số lượng và đánh dấu DNA, điện di trên gel, Sử
dụng đặc tính biến chất rồi hồi tính, có thể tiến hành lai DNA với DNA, DNA với

RNA, RNA với RNA.
- Lai trên pha rắn: Thấm Southern blot, thấm Northern blot, phương
pháp dot (điểm) và slot (khe) blot.
- Lai tại chổ (in situ hybridisation): là kiểu lai phân tử, trong trình tự
nucleic acid cần tìm (trình tự đích) nằm ngay trong tế bào hay trong mô.
3.2. Thu nhận gen
3.2.1. Thư viện DNA từ bộ gen
Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi ngay từ buổi đầu của sự phát
triển kĩ thuật tái tổ hợp DNA. Toàn bộ DNA của một sinh vật được cắt đoạn nhỏ
bằng lắc cơ học hay bởi các RE rồi gắn vào các vector tạo dòng, nên tiếng Anh gọi
là phương pháp Shotgun (bắn đạn chài).
Hình 1.2. Xây dựng thư viện genomic DNA
Đoàn Thị Tám
Bài giảng thi tuyển công chức
3.2.2. Tổng hợp gen bằng phương pháp hóa học
Năm 1977, K. Itakura và Boyer đã thành công trong tổng hợp nhân tạo gen
mã hóa hormone somatostatin (chỉ có 14 amino acid) và biểu hiện trong tế bào E.
coli. Phương pháp tổng hợp hóa học gen cũng được sử dụng để tạo ra nòi vi khuẩn
tổng hợp insulin.
Qua các kết quả thu được, các nhà khoa học đã khẳng định rằng: muốn tổng
hợp được gen bằng phương pháp hoá học cần phải biết trình tự của axit amin ở
protein mà gen đó chịu trách nhiệm tổng hợp.
3.2.3. Lập ngân hàng cDNA
Tạo gen từ các mRNA được sử dụng rộng rãi nhờ enzyme phiên mã ngược
(reverse transcriptase). Nó có khả năng tổng hợp nên DNA mạch đơn – cDNA từ
khuôn mRNA hoặc từ một đoạn polyribonucleotide tổng hợp hóa học.
Sử dụng ngân hàng cDNA các các ưu thế sau:
- Các dòng cDNA chứa trình tự mã hóa liên tục của một gen.
- Những tế bào chuyên hóa tạo một số lớn protein một loại và mRNA
tương ứng của protein giàu có đó sẽ dể tách ra để tạo ngân hàng cDNA. Nhờ vậy

giảm nhẹ đáng kể việc xác định đúng dòng mong muốn từ ngân hàng gen.
3.3. Phương pháp tạo plasmid tái tổ hợp
Bước tiếp theo của kĩ thuật di truyền là gắn các đoạn DNA hay các cDNA
vào vector chuyển gen để tạo nên plasmid có mang gen lạ - plasmid tái tổ hợp
(recombinant plasmid) hay khảm (chimeric). Có nhiều phương pháp gắn các đoạn
DNA vào vector chuyển gen.
3.3.1. Phương pháp đơn giản dùng các đầu cố kết
Vector chuyển gen là DNA vòng tròn và phân tử DNA của bộ gen khác
được cắt bởi cùng một loại RE, tạo nhiều đoạn DNA thẳng có các đầu cố kết. Sau
đó trộn lẫn, các đầu cố kết của 2 loại DNA bổ sung sẽ bắt cặp với nhau và được hàn
Đoàn Thị Tám
Bài giảng thi tuyển công chức
dính bởi enzyme ligase tạo ra plasmid tái tổ hợp. Phương pháp này được sử dụng
rộng rãi để lập ngân hàng gen của một sinh vật.
3.3.2. Phương pháp dùng các đoạn nối (linkers)
Các đoạn oligonucleotide (10-20 nucleotide), được tổng hợp sao cho ở giữa
có trình tự palindrom đặc hiệu đối với một RE, để làm các đoạn nối (linkers).
Ligase DNA của phage T4 sẽ nối các đoạn DNA đó lại với nhau. Phương pháp này
được sử dụng để gắn các cDNA và các đoạn DNA có đầu mút tà vào plasmid.
3.3.3. Phương pháp dùng enzyme terminal transferase
Phương pháp thứ ba này dựa vào khả năng đặc biệt của enzyme terminal
transferase, có thể gắn cùng một loại nucleitide thành chuỗi (homopolymer) vào đầu
mút 3’OH của mạch DNA.
3.4. Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào
Sau khi tạo DNA tái tổ hợp, việc tiếp theo là biến nạp đưa nó vào lại tế bào
chưa mang plasmid. Biến nạp được thực hiện với nhiều cách khác nhau.
3.4.1. Hóa biến nạp
DNA tái tổ hợp được ủ với số lượng lớn tế bào vi khuẩn chưa có plasmid, có
khả năng dung nạp (competent). Xử lí CaCl
2

lạnh, kèm sốc nhiệt (42
0
C trong 2
phút) thì hiệu quả tạo các thể biến nạp (transformants) cao (10
5
-10
6
thể biến
nạp/1mg của DNA siêu xoắn).
3.4.2. Điện biến nạp
Phương pháp này sử dụng dòng điện cao thế cục bộ theo xung (pulse) làm tế
bào hấp thụ DNA. Hiệu quả biến nạp cao, có thể đến 10
9
-10
10
thể biến nạp/1mg
DNA. Tuy nhiên tỉ lệ tế bào chết đáng kể.
3.4.3. Vi tiêm (micro-injection)
Đối với các tế bào động vật có vú, thường là các hợp tử có thể tiêm thẳng
DNA tái tổ hợp vào tế bào. Đây là phương pháp thông dụng có hiệu quả trong
Đoàn Thị Tám
Bài giảng thi tuyển công chức
chuyển gen ở tế bào động vật có vú, tạo các động vật chuyển gen (transgenic
animals).
3.4.4. Bắn DNA vào tế bào
Sử dụng súng bắn DNA, đạn là các hạt kim loại tungsteng hay vàng mang
DNA hoặc RNA, được bắn với tốc độ nhanh và xuyên thủng vách tế bào để đưa
DNA hoặc RNA vào trong. Phương pháp này có nhiều ưu thế và được dùng nhiều
trong tạo các thực vật nhiễm gen (transgenic plants).
Ngoài ra còn nhiều phương pháp khác đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào như:

dùng màng lipid (lipidsome) bao DNA để đưa vào tế bào, các vector virus tự động
thực hiện tải nạp (transduction) đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào với hiệu suất cao.
3.5. Chọn lọc, tạo dòng và sự biểu hiện gen
Công việc tiếp theo là kiểm tra sự hiện diện của gen mong muốn, chon lọc
đúng dòng tế bào như . Khi xác nhận DNA tái tổ hợp đã xâm nhập vào tế bào và
mang đúng gen cần thiết thì cho chúng sinh sản để tạo dòng và tạo điều kiện cho
gen biểu hiện.
3.5.1. Xác định dòng vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp
Trong thí nghiệm tạo plasmid tái tổ hợp, các dòng vi khuẩn mọc lên bao
gồm:
- Tế bào vi khuẩn không nhận được plasmid.
- Tế bào nhận được plasmid không có gen lạ vào.
- Tế bào vi khuẩn nhận được đúng plasmid tái tổ hợp.
Việc xác định đúng các dòng vi khuẩn chứa Plasmid tái tổ hợp phải mất
nhiều công sức. Có 3 hướng chính trong thử nghiệm tách dòng từ thư viện DNA là:
lai nucleic acid, phát hiện kiểu hình và phản ứng miễn nhiễm. Ngoài ra, có phương
pháp mất hoạt tính do xen đoạn chỉ có thể sử dụng đối với các vector có mang 2
hoặc nhiều hơn các gen kháng thuốc.
Đoàn Thị Tám
Bài giảng thi tuyển công chức
3.5.2. Tạo dòng
Sau khi đã chọn lọc xong, tế bào được sinh sản để tạo dòng và cho gen biểu
hiện.
3.5.3. Sự biểu hiện của gen được tạo dòng
Muốn gen tạo dòng có biểu hiện ra protein cần cấu tạo vector có đủ các yếu
tố phiên mã và dịch mã. Các vector này gọi là vector biểu hiện
Vector biểu hiện phải đảm bảo các yếu cầu:
- Số lượng hợp lý bản sao cho mỗi tế bào.
- Promotor biểu hiện.
- Trình tự bám vào ribosome (rbs) và DNA phụ cho dịch mã tốt.

- Sự ổn định lâu dài.
- Tránh sự thủy giải protein (proteolysis) do các enzyme trong tế bào.
Kĩ thuật tái tổ hợp DNA phải qua nhiều bước phức tạp mới tạo được dòng tế
bào như mong muốn và nó giúp giải quyết có hệ thống nhiều vấn đề từ gen đến sự
biểu hiện của chúng thành các phân tử protein.
Đoàn Thị Tám
Bài giảng thi tuyển công chức
Tiết 2: KỸ THUẬT PCR
I. Mục tiêu tiết học
Cung cấp cho sinh viên những kiến thức cơ bản của kĩ thuật PCR (khái niệm,
nguyên tắc, thành phần, ứng dụng, ).
II. Chuẩn bị phương tiện dạy học
Giáo trình, giáo án, sử dụng powerpoint,
III. Các phương pháp dạy học chủ yếu
Thuyết giảng, dạy học dựa trên vấn đề.
IV. Nội dung
1. Khái niệm
PCR (polymerase chain reaction) là kĩ thuật khuếch một đoạn trình tự DNA
đặc hiệu in vitro do sự xúc tác của enzyme DNA polymerase.
Được Kary Mullis cùng cộng sự phát minh năm 1985, đã đưa lại một cuộc
cách mạng trong di truyền học phân tử.
Thực chất đây là phương pháp tạo dòng invitro, không cần đến sự hiện diện
của tế bào và dựa trên nguyên tắc sau.
2. Nguyên tắc thực hiện
Nguyên tắc của phương pháp là tạo lượng lớn các đoạn DNA đặc thù từ
DNA khuôn dựa trên cơ sở hoạt động của DNA-polymerase để tổng hợp sợi mới bổ
sung.
Quá trình này được thực hiện nhờ các chu trình nhiệt lặp lại gồm: đun nóng
(95
0

C), làm nguội (37-65
0
C) và ủ dài ở 72
0
C. Trong dung dịch có các primer (đoạn
mồi) P1 và P2, mỗi loại sẽ bắt cặp bổ sung với một mạch đơn tương ứng. Từ 1
Đoàn Thị Tám
Bài giảng thi tuyển công chức
mạch kép DNA sau phản ứng sẽ thành 2 mạch DNA kép và có thể thực hiện chu
trình khuếch đại mới theo cấp số nhân.
Hình 2.1. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Phản ứng được thực hiện trong ống nghiệm plastic nhỏ, có mẫu DNA, primer
và DNA polymerase, được gắn vào hệ thống nung nóng có điều chỉnh theo chu kì
nung nóng và làm nguội theo chương tình định sẵn gọi là thermocycler, đây chính
là máy PCR.
3. Các cấu phần của phản ứng
Trong các ống plastid nhỏ có các thành phần chủ yếu sau:
3.1. DNA mẫu (DNA template)
Ðây là mẫu DNA sinh học mà chúng ta muốn khuyếch đại. Phản ứng PCR
tối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch nhưng phản ứng PCR vẫn cho kết quả tốt với
DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào. Lượng mẫu DNA sử dụng có khuynh
hướng giảm khi sử dụng các enzyme DNA polymerase cho hiệu quả cao. Lượng
Đoàn Thị Tám
Bài giảng thi tuyển công chức
DNA mẫu nếu cao quá phản ứng PCR sẽ không xảy ra. PCR còn cho phép khuyếch
đại cả những mẫu DNA không được bảo quản tốt, các mẫu DNA đã bị phân hủy
từng phần như ở các vết máu để lâu ngày, tinh dịch đã khô, tóc, móng tay của người
chết
3.2. Mồi (primer)
Mồi là những đoạn DNA sợi đơn ngắn và cần thiết cho việc xúc tiến phản

ứng dây chuyền tổng hợp DNA . Chúng nhận ra phần DNA cần được nhân lên, bắt
cặp bổ sung với một đầu của DNA mẫu và tạo ra vị trí bắt đầu tái bản. Các mồi này
có chiều ngược nhau,bao gồm một mồi xuôi (forward primer) và một mồi ngược
(reverse primer). Mồi là yếu tố quan trọng nhất của phản ứng PCR, quyết định hiệu
quả của phản ứng. Do đó việc thiết kế mồi cần được tuân thủ một số nguyên tắc
nhất định:
- Cả hai mồi trong một phản ứng PCR phải có nhiệt độ nóng chảy (Tm)
gần như nhau bởi vì chúng được ủ ở cùng một nhiệt độ.
- Kích thước tối thiểu của mồi là 18 base (thông thường là 18-24 base)
- để quá trình lai xảy ra tốt hơn.Mồi phải đặc hiệu có nghĩa là nó phải đặc
trưng cho trình tự DNA cần được khuyếch đại, một mồi chỉ bám vào một vị trí nhất
định trên gen.
- Không có nút cài tóc (hairpin loop): trong mỗi một mồi cần tránh trình tự
đối xứng bậc hai (palindromic sequences) có thể làm tăng cấu trúc sợi bên trong ổn
định do đó hạn chế việc mồi bám vào DNA mẫu.
- Trật tự các base cũng ảnh hưởng đến sự ổn định việc bám của mồi dưới
nhiệt độ cao. Hai trong ba base ở đầu 3’ của mồi nên là G hoặc C, vì G và C có 3
liên kết hydro do đó sự polymer hoá sẽ tốt hơn.
Đoàn Thị Tám
Bài giảng thi tuyển công chức
Khoảng cách tối ưu giữa hai mồi: đây là một ứng dụng rất đặc trưng, nhưng
đối với phần lớn các thử nghiệm PCR chẩn đoán,tốt nhất khoảng cách giữa hai mồi
khi đã bám vào DNA khuôn là150-500 base.
3.3. Enzyme polymerase chịu nhiệt
Vào thập niên 1960, nhà Vi sinh vật học Thomas Brock đã đến Công viên
Quốc gia Yellowstone (Bang Wyoming, Mỹ) để nghiên cứu các vi sinh vật ưa nhiệt
sống trong suối nước nóng 80-95
0
C. Ông đã phát hiện một loài vi khuẩn phát triển
mạnh ở nhiệt độ cao, có tên là Thermus aquaticus. Hai mươi năm sau, các nhà khoa

học của tập đoàn Cetus (Tập đoàn Công nghệ Sinh học California) đã nhận thấy
rằng DNA polymerase từ Thermus aquaticus (Tagpolymerase) có khả năng giải
quyết vấn đề của enzyme biến tính sau mỗi chu kỳ. DNA polymerase chịu nhiệt sử
dụng cho phản ứng PCR lần đầu tiên được bán trên thị trường là Tag-polymerase.
Từ đó đến nay, một số vi sinh vật chịu nhiệt khác đã được khám phá và người ta đã
tách chiết thêm được các DNA polymerase chịu nhiệt để sử dụng cho phản ứng
PCR như Vent- polymerase (Tlipolymerase), Pfu- polymerase, rTth,
3.4. Các loại nucleotid
Trong phản ứng PCR, bốn loại nucleotid thường được sử dụng ở dạng
deoxynucleotid: dATP, dCTP, dGTP, dTTP với nồng độ cân bằng trong một phản
ứng (200μM/loại nucleotid).
3.5. Nước
Nước sử dụng cho phản ứng PCR phải thật tinh khiết, không chứa ion nào,
không chứa DNAase, RNAase, enzyme cắt hạn chế Nói cách khác là không chứa
bất kỳ một thành phần nào khác.
3.6. Dung dịch đệm
Dung dịch đệm 10X (100mM KCl, 100mM (NH
4
)
2
SO
4
, 200mM Tris-HCl pH
8.8, 20mM MgSO
4
, 1% (w/v) Triton X-100).
Đoàn Thị Tám
Bài giảng thi tuyển công chức
3.7. Ion Mg
2+

Nồng độ ion Mg
2+
cũng là một yếu tố ảnh hưởng mạnh đến phản ứng PCR và
nó tuỳ thuộc vào từng phản ứng. Nồng độ ion Mg
2+
tối ưu là 150-200 μM. Người ta
thấy rằng nếu nồng độ DNA quá cao thì enzyme polymerase sẽ gây ra nhiều lỗi
hơn.
4. Giá trị sử dụng
So sánh giữa phương pháp PCR và phương pháp tạo dòng của kĩ thuật tái tổ
hợp DNA để thấy được ưu thế của kĩ thuật này.
Đặc điểm Phương pháp PCR Phương pháp tạo dòng
Thời gian để khuếch
đại một trình tự DNA
được quan tâm
Chỉ mất 3 giờ Cả tuần hoặc lâu hơn
Mức độ và chi phí
thực hiện
Đơn giản, ít tốn kém Phức tạp, tốn kém
Độ tinh sạch của mẫu Không cần cao Cần tương đối tinh
khiết
Bảng 2.1. So sánh giữa phương pháp PCR và phương pháp tạo dòng của kĩ
thuật tái tổ hợp DNA
5. Sự hoàn thiện nhanh và mở rộng ứng dụng của PCR
Từ khi ra đời đến nay, PCR có vai trò cách mạng trong nhiều lĩnh vực nghiên
cứu và ứng dụng khác nhau như chẩn đoán nhanh giải kí tự chuỗi bộ gen, gây đột
biến điểm định hướng,
Do dể thực hiện, đơn giản và có nhiều ứng dụng rộng rãi, nên PCR được
hoàn thiện không ngừng. Trong một thời gian ngắn, nhiều biến dạng PCR mới ra
đời.

Đoàn Thị Tám
Bài giảng thi tuyển công chức
-RT-PCR (reverse transcriptase PCR) là kĩ thuật là RNA có thể được dùng
làm khuôn mẫu cho sự khuếch đại PCR sau khi chuyển đổi thành c-DNA, còn gọi
RNA-PCR hay RT-PCR. RT-PCR nhạy hơn các phương pháp khác dùng cho sự
phân tích RNA.
-PT-PCR cạnh tranh (Competitive RT-PCR) là kĩ thuật thường được dùng
trong định lượng các loại mRNA chuyên biệt.
-Real-Time PCR là phương pháp có thể giúp phát hiện những sản phẩm PCR
tích luỹ được tại thời điểm thực tế trong quá trình khuếch đại gen. Nhờ vậy, giúp
đánh giá sự tích luỹ sản phẩm và định hướng qPCR (quantitative PCR – là PCR
định lượng).
-PCR-ELISA (enzyme linked immunoassay) là sự kết hợp với miễn dicjk
trong chẩn đoán.
Đoàn Thị Tám
Bài giảng thi tuyển công chức
Tiết 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
I. Mục tiêu tiết học
Cung cấp cho sinh viên những kiến thức cơ bản về đặc điểm, kĩ thuật, môi
trường nuôi cấy và ứng dụng của nuôi cấy tế bào động vật.
II. Chuẩn bị phương tiện dạy học
Giáo trình, giáo án, sử dụng powerpoint,
III. Các phương pháp dạy học chủ yếu
Thuyết giảng, dạy học dựa trên vấn đề.
IV. Nội dung
1. Những khó khăn trong nuôi cấy tế bào động vật có vú
Nuôi cấy tế bào động vật có vú và người khó khăn rất nhiều so với nuôi tế
bào vi sinh vật.
1.1. Sinh sản rất chậm
Tế bào động vật có vú cần 15 đến 40 giờ để tăng gấp đôi số lượng. Quá trình

sản xuất thì đòi hỏi nhiều ngày thậm chí vài tuần.
1.2. Rất nhạy cảm
Tế bào động vật có vú chỉ chịu đựng được nhiệt độ trong giới hạn rất hẹp
giữa 35 – 39
0
C, đòi hỏi sự cung cấp oxy ổn định và nhạy cảm hơn với khuấy động
nước.
Xét về gốc độ kinh tế, sự hoàn thiện kĩ thuật nuôi cấy tế bào động vật và chủ
động sử dụng chúng trong công nghiệp là vấn đề không đơn giản.
Đoàn Thị Tám
Bài giảng thi tuyển công chức
2. Phương pháp xác định các tế bào để nuôi
Mô được tách trong điều kiện vô trùng đem xử lí với enzyme protease,
thường là trypsin, để cắt mô tách các tế bào rời nhau ra, dịch tế bào được cấy vào
bình thủy tinh hay bình nhựa có đáy phẳng rộng chứa môi trường dinh dưỡng lỏng
thích hợp cho sự phát triển của tế bào. Các tế bào sau khi trải qua pha lag sẽ bám
vào đấy bình chứa và bắt đầu nguyên phân.
- Dòng sơ cấp (primary culture) là dòng tế bào nuôi được bắt nguồn trực tiếp
từ mô đã biệt hóa. Các dòng nuôi sơ cấp có thể tách khỏi bình bằng xử lí với trypsin
hay EDTA. Chúng có thể được dùng để tạo dòng nuôi thứ cấp (secondary cultures)
bằng cách đưa vào môi trường dinh dưỡng với nồng độ cao. Các dòng tế bào không
phải tồn tại vô hạn mà chúng phân chia chỉ một số lần nhất định trước khi tốc độ
tăng trưởng của chúng giảm và chết. Ví dụ, các tế bào người chỉ phân chia 50-100
lần trước khi chết.
- Lớp đơn (monolayer) là các tế bào phân chia nhanh chóng lấp kín đáy
bình. Việc tạo thành lớp đơn là biểu hiện đặc biệt của các tế bào bình thường do
tính kiềm hãm tiếp xúc (contact inhibition).
Ngoài phương pháp thông dụng trên có thể nuôi các mãnh của các cơ quan
cơ thể, các phôi nguyên vẹn, các mô được cắt mãnh hoặc nghiền nhỏ.
Để nhân các dòng tế bào sơ cấp là sử dụng các mô của phôi như mô cơ- da,

thận, phổi, vì chúng có hoạt tính hấp thu dinh dưỡng mạnh khi tách khỏi cơ thể và
bộ gen của chúng tương đối ổn định trong quá trình nuôi.
3. Các dòng tế bào liên tục (continuous cell lines)
Không phải tất cả các tế bào cơ thể động vật đều cho các dòng sơ cấp mà các
thế hệ thứ cấp của chúng đều chết. Phần lớn các tế bào chuột đều chết sau khi phân
chia 30 – 50 lần, nhưng một số ít tế bào đã biến đổi hình thái, tăng trưởng nhanh
Đoàn Thị Tám
Bài giảng thi tuyển công chức
hơn và có khả năng bắt đầu dòng nuôi từ một số lượng ít tế bào. Chúng có sự tồn
tại vô hạn gọi là các dòng tế bào (cell lines).
Trong quá trình cấy chuyền, hàng loạt dòng tế bào chịu biến đổi rất mạnh.
Mô ung thư là các dòng tế bào bị biến đổi (transformed).
Các tế bào ung thư thường ở dạng đa bội lệch (aneuploid), ngoài ra còn có
các biến đổi kiểu gen khác.
Vì vậy, các dòng tế bào luôn được giữ ở trạng thái đông lạnh.
4. Môi trường dinh dưỡng và cách pha chế
4.1. Môi trường nuôi tự nhiên
Do sự phức tạp của môi trường dinh dưỡng nuôi tế bào động vật có vú nên
có thể dùng ngay các môi trường tự nhiên như: các cục máu đông, dịch huyết tương,
nước ối bào thai, dịch chiết phôi,
4.2. Môi trường nuôi tổng hợp
Thành phần không thể thiếu là huyết tương của máu (5 – 10%), dung dịch
sinh lí gồm hỗn hợp các muối vô cơ để duy trì Ph, áp suất thẩm thấu và cung cấp
chất vô cơ.
4.3. Các thành phần căn bản của môi trường
Nhu cầu dinh dưỡng của tế bào động vật rất phức tạp. Môi trường dinh
dưỡng phải thỏa mãn các điều kiện:
- Có đủ các ion vô cơ căn bản (Na, Ca, K, ).
- Áp suất thẩm thấu phải chính xác.
- pH phải chính xác (7 – 7,3).

- Nguồn năng lượng lấy từ glucose.
- Có phenol để dể theo dõi pH.
- Chứa 5 – 10% huyết thanh bò con.
Đoàn Thị Tám
Bài giảng thi tuyển công chức
- Duy trì nồng độ CO
2
(5%) ở một áp suất hợp lí.
- Thêm chất kháng vi khuẩn và nấm.
4.5. Thiết bị nuôi:
- Ở quy mô nhỏ dùng bình Roux và bình trụ.
- Quy mô công nghiệp dùng bi trong bioreactor, bioreactor túi plastic
dùng nuôi tế bào côn trùng.
5. Quy trình khái quát và cách xử lí thu các loại sản phẩm
Quá trình sản xuất công nghiệp gồm: Dòng sơ cấp→Nhân giống→Sản xuất
lớn→Sản phẩm→Ứng dụng.
6. Các ứng dụng của nuôi tế bào động vật
Nuôi cấy tế bào động vật ngày càng được phát triển vì nó tạo ra nhiều sản
phẩm thiết yếu trong y dược.
6.1. Sản xuất vaccine virus
Một số vaccine chủ yếu đã được sản xuất:
- Vaccine chống bệnh bại liệt, viêm gan virus B.
- Vaccine chống bệnh quai bị, bệnh sởi, bệnh dại.
- Vaccine chống 1 loại virus gây bệnh sán lá ở động vật.
- Vaccine chống lở mồm, long móng ở gia súc.
6.2. Sản xuất các protein
Như interferon, kháng thể và các hormone dùng trị liệu.
6.3. Các protein trị liệu
Như các α-, β-interferon thymosin, interleukine, plasmanogen, activator (t-
pA) do tế bào sản xuất ra có hoạt tính tốt.

6.4. Sản xuất các protein tái tổ hợp
Đoàn Thị Tám
Bài giảng thi tuyển công chức
Như tpA, các nhân tố máu VIII và IX, erythropoietine,
6.5. Các chế phẩm miễn dịch
Chủ yếu là các kháng thể đơn dòng, dùng chẩn đoán bệnh, thuốc hướng đúng
mục tiêu chữa trị và dùng trong nghiên cứu.
6.6. Các hormone
Như hormone tăng trưởng của người, prolactin.
6.7. Sản xuất virus diệt côn trùng
Nuôi tế bào côn trùng và cho nhiễm virus rồi thu chế phẩm.
6.8. Liệu pháp tế bào
Đặc biệt, gần đây các tế bào gốc được nuôi để dùng trong liệu pháp tế bào,
nhằm đưa tế bào bình thường thay thế cho tế bào bệnh.
Đoàn Thị Tám
Bài giảng thi tuyển công chức
Tiết 4 NHÂN BẢN VÔ TÍNH TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
I. Mục tiêu tiết học
Cung cấp cho sinh viên khái niệm, kỹ thuật, ứng dụng của nhân bản vô tính
tế bào động vật
II. Chuẩn bị phương tiện dạy học
Giáo trình, giáo án, sử dụng powerpoint,
III. Các phương pháp dạy học chủ yếu
Thuyết giảng, dạy học dựa trên vấn đề, Tổ chức học tập theo nhóm.
IV. Nội dung
1. Khái niệm
Nhân bản (cloning) là tạo ra “bản sao” của một tế bào hoặc một sinh vật. Các
“bản sao” được tạo ra bằng kỹ thuật cloning được gọi là các clone, các clone này
giống y hệt nhau về mặt di truyền.
Nhân bản vô tính tế bào động vật (tạo dòng vô tính động vật) là quá trình tạo

ra một tập hợp các cơ thể giống hệt nhau về mặt di truyền và giống bố (mẹ) ban đầu
bằng phương thức sinh sản vô tính.
Lịch sử nhân bản
1959 - Thỏ ra đời bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm.
1968 - Edwards và Bavister thụ tinh trứng người trên in vitro.
1979 - Karl Illmensee công bố nhân bản được ba con chuột từ một phôi ban
đầu.
1984 - Steen Willadsen nhân bản thành công cừu từ các tế bào phôi bằng kỹ
thuật chuyển nhân tế bào phôi.
Đoàn Thị Tám
Bài giảng thi tuyển công chức
1986 - Steen Willadsen nhân bản một con bò từ các tế bào phôi một tuần tuổi
đã biệt hóa.
1993 - Bò được tạo ra bằng cách chuyển nhân từ các tế bào phôi nuôi cấy
1996 - Ian Wilmut và Keith Campbell ở viện Roslin, Scotland nhân bản
thành công cừu Dolly từ các tế bào tuyến vú của một con cừu mẹ.
1998 - Ryuzo Yanagimachi, Toni Perry, và Teruhiko Wakayama ở đại học
Hawaii công bố đã nhân bản thành công 50 chuột từ các tế bào đã trưởng thành. Kỹ
thuật nhân bản mới này do Wakayama phát triển và được chứng minh là hiệu quả
hơn phương pháp dùng nhân bản cừu Dolly.
1999 - Khỉ Rhesus cái Tetra được nhân bản bằng phân chia các tế bào phôi
sớm
2002 - Thỏ và mèo được nhân bản từ các tế bào trưởng thành.
2003 - Cừu Dolly chết ngày 14 tháng 2 năm 2003 vì bệnh phổi và khớp trầm trọng
khi được 6 tuổi trong khi một con cừu bình thường sống được 12 năm. Việc nhân
bản vấp phải vấn đề lão hóa
Đến nay - Nhiều cá nhân và tổ chức gia tăng nghiên cứu nhằm tạo dòng tế bào gốc
“cá thể hóa” bằng kỹ thuật chuyển nhân tế bào thân của người trưởng thành. Điều
này mở ra tương lai hứa hẹn của nhân bản trị liệu (mục đích sản xuất ra các tế bào
gốc phôi cá thể hóa) nhưng cũng làm hiện hữu nguy cơ xuất hiện các nghiên cứu

nhằm nhân bản vô tính người. Nhiều tranh cãi về vấn đề đạo đức y sinh học và tôn
giáo liên quan đến nghiên cứu tế bào gốc và nhân bản, một số nước cấm, một số
nước cho phép.
2. Kỹ thuật nhân bản vô tính động vật
Nhân bản vô tính người và động vật được thực hiện dựa trên kỹ thuật
chuyển nhân tế bào thân. Quy trình này bắt đầu bằng việc thay thế nhân đơn bội của
một tế bào trứng bằng nhân lưỡng bội lấy từ một tế bào thân của cá thể hoặc phôi
Đoàn Thị Tám
Bài giảng thi tuyển công chức
sẽ được nhân bản. Trứng này sau đó được kích thích cho phép phân chia hình thành
blastocyst. Sau đó cấy blastocyst này vào tử cung của một “mẹ nuôi” cho phát triển
thành thai và cho ra đời một cá thể. Cá thể này sẽ là một “bản sao” của cá thể đã
cho nhân tế bào. DNA trong nhân tế bào của cá thể “bản sao” được thừa hưởng chỉ
từ một bố/mẹ (bản gốc) duy nhất. Cho tới nay có hai kỹ thuật chuyển nhân được
dùng trong nhân bản vô tính động vật:
2.1. Kỹ thuật Roslin (1996)
Do Ian Wilmut và Keith Campbell ở viện Roslin (Scotland) dùng để nhân
bản cừu Dolly.
Hình 4.1. Sơ đồ nhân bản vô tính cừu Dolly
Đầu tiên một tế bào (tế bào cho thông tin di truyền) được lấy ra từ tuyến vú
của một cừu mẹ. Tế bào này sau đó được nuôi cấy nhân lên trên in vitro nhằm tạo ra
nhiều bản sao nhân tế bào. Sau đó một tế bào được lấy ra khỏi nuôi cấy và đồng bộ
hóa chu trình tế bào (synchronizing cell cycles) bằng cách để đói trong môi trường
thiếu dinh dưỡng (lượng chất dinh dưỡng chỉ vừa đủ giữ cho tế bào không chết).
Đoàn Thị Tám
Bài giảng thi tuyển công chức
Trong điều kiện này tế bào tắt tất cả các gen hoạt động tế và chuyển vào pha ngủ
G
0
. Loại bỏ nhân của tế bào trứng chưa thụ tinh lấy từ một cừu “mẹ nuôi”, đặt tế

bào trứng này sát vách tế bào cho (đã đưa về pha G
0
). Sau khi rút nhân trứng từ 1
đến 8 tiếng, cho một dòng điện chạy qua hai tế bào này, shock có tác dụng hòa tế
bào trứng (đã bỏ nhân) và tế bào cho nhân với nhau, đồng thời khởi động tế bào
mới tạo thành phát triển thành phôi. Nếu phôi đó sống, nó được cho phát triển trong
khoảng 6 ngày và cuối cùng được đặt vào tử cung “mẹ nuôi” cho phát triển thành
thai và sinh sản như bình thường.
2.2. Kỹ thuật Honolulu
Kỹ thuật này được Teruhiko Wakayama và Ryuzo Yanagimachi ở đại học
tổng hợp Hawai giới thiệu năm 1998. Wakayama thực hiện đồng bộ hóa chu trình tế
bào bằng phương pháp khác với Wilmut. Wilmut dùng tế bào tuyến vú, một tế bào
phải được đưa vào giai đoạn G
0
. Wakayama ban đầu dùng ba loại tế bào: các tế bào tế
bào lát ống tinh hoàn (Sertoli), các tế bào não, và các tế bào gò trứng (cumulus cells).
Bình thường trong cơ thể cả hai loại tế bào Sertoli và tế bào não đã được duy trì ở pha
G
0
và các tế bào gò trứng hầu như luôn ở pha G
0
hoặc G
1
(trạng thái ngủ hay tình trạng
ẩn dật).
Kỹ thuật Roslin Kỹ thuật Honolulu
Tế bào cho:
- Là tế bào tuyến vú, cần được đưa về
giai đoạn G
0

.
- Được nuôi cấy nhân lên ngoài cơ
thể
Tế bào cho:
- Là tế bào tự nhiên đã ở trạng thái
ngủ (giai đoạn G
0
hoặc G
1
): các tế
bào cumulus, tế bào não, tế bào
sertoli
- Dùng ngay, không nuôi cấy ngoài
cơ thể
Đưa nhân tế bào cho vào tế bào
nhận bằng shock điện
Đưa nhân tế bào cho vào tế bào
nhận bằng tiêm trực tiếp
Đồng thời với nhận nhân trứng
được dòng điện hoạt hóa luôn.
Trứng sau nhận nhân (“thụ tinh”)
được để yên (không có kích thích
Đoàn Thị Tám
Bài giảng thi tuyển công chức
nào khác) 5-6 giờ để cho phép chấp
nhận nhận mới và có thời gian tái
lập trình nhân tế bào
Hoạt hóa tế bào phân chia phát
triển thành phôi bằng shock điện
Hoạt hóa tế bào phân chia phát triển

thành phôi bằng ủ trong môi trường
hóa học có chứa cytochalasin B.
Tỷ lệ nhân bản thành công cừu
Dolly thấp (1 trong số 277 lần
làm)
Tỷ lệ nhân bản thành công trên
chuột rất cao (3 trong số mỗi 100
lần làm)
Bảng 4.1. Một số khác biệt giữa kỹ thuật Roslin và Honolulu
3. Ưu thế và bất lợi của nhân bản vô tính động vật
So với nhân bản phôi đơn thuần, số “bản sao” có thể tạo ra bằng nhân bản vô
tính nhiều hơn. Về lý thuyết, số lần một cá thể có thể nhân bản chỉ bị hạn chế bởi số
lượng trứng có thể chấp nhận nhân chuyển vào và số lượng cơ thể “mẹ nuôi” có sẵn
để cấy phôi vô tính đã tạo nên. Tuy nhiên, nhân bản phôi đơn thuần từ một phôi thụ
tinh nhân tạo dễ làm hơn, tỷ lệ phôi sống và phát triển đạt hầu như 100 phần trăm,
trong khi đó để nhân bản vô tính cừu Dolly người ta đã thất bại trên 276 lần nhân
bản. Với những thành tựu của nhân bản vô tính, trong tương lai việc phục hồi được
một số động vật đã tuyệt chủng là khả năng có thể. Nhân bản động vật cũng có
tiềm năng to lớn trong ngành công nghiệp chăn nuôi, cho phép nhân bản các vật
nuôi mang các đặc tính quý báu (lợn siêu nạc, bò siêu sữa…).
Năm 2003 cừu Dolly chết do các căn bệnh của tuổi già (viêm khớp và viêm phổi
nặng) khi nó được 6 tuổi, trong khi tuổi thọ của một cừu bình thường trung bình là 12.
Các nhà khoa học nhận thấy rằng các tế bào cừu Dolly già hơn tuổi của nó đến 6 tuổi.
Cừu Dolly được tạo ra từ một con cừu 6 tuổi, như vậy khi được sinh ra, bộ gen của cừu
Dolly đã không đặt lại đồng hồ sinh học về 0 mà vẫn ghi nhớ tuổi của nó trước đây. Như
vậy về gen, cừu Dolly là một chú cừu 6 tuổi được sinh ra. Hiện tại nhân bản vô tính đang
phải đối mặt với vấn đề lão hóa. Trong khi đó nhân bản từ phôi không gặp phải vấn đề
này.
Đoàn Thị Tám
Bài giảng thi tuyển công chức

4. Các ứng dụng
Thành công của tạo dòng vô tính ở động vật có vú mở ra nhiều ứng dụng trong chăn
nuôi.
- Nhân bản các vật nuôi kỉ lục trong sản xuất
- Nhân giống các động vật chuyển gen.
- Bảo tồn nguồn gen và những động vật quý hiếm.
Đoàn Thị Tám
Bài giảng thi tuyển công chức
Tiết 5 TẾ BÀO GỐC
I. Mục tiêu tiết học
Cung cấp cho sinh viên khái niệm cơ bản và các ứng dụng của tế bào gốc.
II. Chuẩn bị phương tiện dạy học
Giáo trình, giáo án, sử dụng powerpoint,
III. Các phương pháp dạy học chủ yếu
Thuyết giảng, dạy học dựa trên vấn đề, tổ chức học tập theo nhóm.
IV. Nội dung
1. Tế bào gốc (stem cell)
1.1. Khái niệm
Tế bào gốc (stem cell) là các tế bào chưa biệt hóa, có thể tự tái tạo (self
renew) và phân chia nhiều lần. Trong những điều kiện sinh lí nhất định, tế bào gốc
có thể cảm ứng biệt hóa thành các tế bào có chức năng chuyên biệt như tế bào cơ
tim, tế bào tuyến tụy, tế bào bào da, tế bào máu, tế bào thần kinh…
1.2. Lịch sử nghiên cứu tế bào gốc
1945- Phát hiện ra tế bào gốc tạo máu.
Thập kỷ 1960 - Xác định được các tế bào carcinoma phôi chuột là một
loại tế bào gốc, khám phá ra trong não trưởng thành có chứa các tế bào gốc có thể
biệt hóa thanh các tế bào thần kinh.
1981 - Evans và Kaufman và Martin phân lập được tế bào gốc phôi từ
khối tế bào bên trong của phôi túi (blastocyst) chuột.
1995-1996 – Tế bào gốc phôi linh trưởng có nhân lưỡng bội bình thường

được phân lập từ khối tế bào bên trong của phôi túi và duy trì trên in vitro.
Đoàn Thị Tám