Tp chớ Khoa hc v Phỏt trin 2009: Tp VII, s 1: 10-16 TRNG I HC NễNG NGHIP H NI


10
ĐặC ĐIểM HìNH THáI V HOạT TíNH MộT Số ENZYME NGOạI BO
CủA CáC MẫU NấM SợI PHÂN LậP ĐƯợC TạI H NộI
Morphological Characteristics and Enzymatic Activity of
Some Fungal Isolates Collected in Hanoi
Phan Trng Nht
Khoa Cụng ngh sinh hc, Trng i hc Nụng nghip H Ni
TểM TT
Mi sỏu mu nm si c phõn lp t 30 mu t ly t cỏc t mi cht vựng H Ni. Da vo
cỏc c im hỡnh thỏi nh mu sc, hỡnh dng v kớch thc ca cỏc khun lc cng nh bo t la
chn ra 5 chng c trng, kớ hiu l M
1
, M
6
, M
9
, M
13
v M
16
. Dch lc thụ ca 5 mu nm si t cỏc
mụi trng nuụi lc c th cỏc hot tớnh enzyme ngoi bo nh kitinaza, proteaza v xenlulaza.
Kt qu th nghim cho thy mu nm M
16
cú kh nng sinh enzyme ngoi bo kitinaza cao nht.
Hiu lc dit mi trc tip ca bo t 5 mu nm si cng c xỏc nh l liu lng 0,005 gam
bo t/100 cỏ th mi, c 5 mu nm si u cho hiu lc dit mi t 100% sau 4 ngy thớ nghim.
T khoỏ: Bo t, khun lc, Metarhizium, mi Coptotermes, nm si, tn nm.

SUMMARY
Sixteen fungal isolates were isolated from 30 soil samples collected from dead termite colonies
in Hanoi. Based on morphological characteristics such as colour, shape and dimension of colonies
and spores, five representative isolates designated as M
1
, M
6
, M
9
, M
13
and M
16
were selected. The
filtrates obtained from culture media of these 5 isolates were tested for enzymatic activity of chitinase,
protease and cellulase. The isolate M
16
exhibited the highest activity of chitinase. The ability of direct
control of fungal spores again termites was also tested. The results showed that at a dose of 0.005 g
spores/100 termites individuals of the 5 isolates could exterminate 100% termites after 4 days of
treatment.
Key words: Colony, Coptotermes, fungi, Metarhizium, spore.
1. ĐặT VấN Đề
Từ những năm 80 của thế kỷ XIX, một số
bệnh do nấm sợi gây ra trên côn trùng cánh
cứng hại lúa mỳ v sâu non bọ đầu di hại củ
cải đờng đã đợc nh khoa học Nga
Metsnhicov nghiên cứu v phát hiện. Cho tới
những thập kỷ gần đây, nhiều công trình
nghiên cứu về nấm sợi đã xác định đợc

khoảng 700 loi nấm gây bệnh cho các loại
côn trùng khác nhau. Trong các loi nấm sợi
thì Beauveria v Metarhizium đợc xác định
l mầm bệnh nguy hiểm của hơn 200 loi côn
trùng nh: mối đất, châu chấu, bọ ngô đầu đỏ
ở Mỹ, Đi Loan, Nam Phi, Austraylia (Tsai v
cộng sự, 1992; Nasr v Moein, 1997).
ở Việt Nam, năm 1996, Tạ Kim Chỉnh
khi thử nghiệm nấm sợi Metarhizium trên
mối Coptotermes formosanus cho thấy mối
chết do nấm sau 3 ngy đạt 91,35% ở nồng
độ 18 x 10
7
bt/ml (Tạ Kim Chỉnh, 1996).
Nguyễn Dơng Khuê v cộng sự (1998) tại
Viện Khoa học Lâm nghiệp đã thử nghiệm bo
tử nấm Metarhizium để diệt mối Coptotermes
formosanus trong điều kiện phòng thí nghiệm.
c im hỡnh thỏi v hot tớnh mt s enzyme ngoi bo ...
11
Kết quả cho thấy mối chết 76,2% sau 2 tuần
phun v 94,4 % sau 3 tuần phun. Từ năm
1998 đến năm 2002, Trịnh Văn Hạnh v
cộng sự (2001) ở Trung tâm nghiên cứu
phòng trừ mối đã tuyển chọn đợc nhiều
chủng nấm Metarhizium có khả năng gây
chết mối trong điều kiện phòng thí nghiệm với
hm lợng bo tử thích hợp l 0,005g/100 cá
thể mối. Phạm Thị Thuỳ v cộng sự (2002) đã
sử dụng nấm Metarhizium để phòng trừ bọ

dừa (Brontispa sp.) ở Bến Tre v kết quả cho
thấy khả năng phòng trừ đạt 78% sau 7 ngy
phun.
Mục đích nghiên cứu ny l tiến hnh
phân lập các nấm sợi từ các mẫu đất thu
đợc tại vùng H Nội, phân tích các đặc
điểm hình thái v hoạt tính enzyme ngoại
bo của chúng. Sau đó thử nghiệm khả năng
gây bệnh cho một số loi côn trùng gây hại
trong nông nghiệp nhằm cung cấp một
nguồn thuốc sinh học phục vụ công tác trồng
rau sạch nói chung v bảo vệ cây trồng trong
tơng lai.
2.

VậT

LIệU

V

PHƯƠNG

PHáP


NGHIÊN

CứU


2.1. Vật liệu nghiên cứu
30 mẫu đất đợc thu thập tại các điểm
trên địa bn H Nội.
Môi trờng Czapek_Dox: C
12
H
22
O
11
: 30,0 g,
NaNO
3
: 2,0 g, C
3
H
7
MgO
6
P: 0,5 g, KCl: 0,5 g,
K
2
SO
4
: 0,35 g, FeSO
4
.7H
2
O: 0,01 g,
C
11

H
12
Cl
2
N
2
O
5
: 0,5 g, Thạch: 15,0 g, pH: 6,8 0,2.
Môi trờng Sauboraud: Pepton cazein:
5,0 g, Pepton thịt: 5,0 g, Đờng glucoza: 40,0 g,
Chất kháng sinh chloramphenicol: 0,5 g,
Thạch: 15,0 g, pH: 5,6 0,2.
2.2. Phơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phân lập nấm sợi từ các mẫu đất
Các mẫu nấm sợi đợc phân lập trên
môi trờng Sauboraud v Czapek - Dox, có
bổ sung chất kháng sinh chloramphenicol, để
ngăn không cho các loại vi khuẩn phát triển,
theo phơng pháp pha loãng (Nguyễn Lân
Dũng v cộng sự, 1978).
2.2.2. Phơng pháp xác định số lợng bo
tử trần bằng đếm trực tiếp dới
kính hiển vi
Số lợng bo tử trần của các mẫu nấm
sợi đợc xác định theo hai phơng pháp đếm
l phơng pháp đếm trực tiếp v phơng
pháp đếm khuẩn lạc. Đếm số lợng bo tử
trên buồng đếm hồng cầu có 25 ô lớn, khoảng
trống giữa phiến kính v lá kính có chiều cao

0,02 mm, tổng diện tích l 1 mm
2
, tổng thể
tích l 0,02 mm
3
. Nh vậy 1 cm
3
(1 ml) sẽ ứng
với 5 x 10
4
lần thể tích buồng đếm. Đếm số
lợng bo tử có trong vi ô lớn, tính giá trị
trung bình (a), gọi K l độ pha loãng. Khi đó
số lợng bo tử đợc xác định theo công thức
sau:
Số bo tử/ml = a ì 25 ì 5 ì 10
4
ì 1/K
2.2.3. Phơng pháp xác định số lợng bo
tử trần bằng đếm số khuẩn lạc trên
đĩa thạch
Để xác định tổng số tế bo có trong một
đơn vị thể tích ngời ta thờng dùng thuật
ngữ Đơn vị hình thnh khuẩn lạc trong một
đơn vị thể tích (CFU/v - Conoly Forming
Unit/v). Trừ những đĩa khuẩn lạc dầy đặc
không đếm đợc chỉ lấy các đĩa m khuẩn
lạc có đơn vị đo trong khoảng 30 CFU - 300
CFU.
Từ số khuẩn lạc trên đĩa có thể suy ra số

tế bo (CFU) có trong mẫu vật theo công
thức dới đây, trong đó a: số khuẩn lạc trung
bình; V: thể tích dịch pha loãng; K: độ pha
loãng của dịch cấy.
CFU/ml = a ì 1/K ì 1/v
2.2.4. Phơng pháp chiết tách v thử hoạt
tính enzyme ngoại bo
Các enzyme ngoại bo đợc thử hoạt
tính theo phơng pháp khuếch tán trên đĩa
thạch. Hoạt tính phân giải cơ chất đợc tính
bằng hiệu số D - d (mm) trong đó D l đờng
Phan Trng Nht
12
kính vòng phân giải (mm) v d l đờng kính
lỗ khoan (mm).
2.2.5. Phơng pháp thử khả năng diệt mối
trực tiếp của các mẫu nấm sợi
Sau khi tuyển chọn, xác định các đặc
điểm hình thái, số lợng bo tử v hoạt tính
của các enzyme ngoại bo của 5 mẫu nấm
sợi, chúng tôi tiến hnh thử khả năng diệt
mối trực tiếp của 5 mẫu nấm sợi ny. Thí
nghiệm đợc tiến hnh trên đĩa petri với 100
cá thể mối (90% mối thợ, 10% mối lính) nuôi
trên giấy lọc. Rắc 0,005g bo tử của từng
chủng lên từng đĩa thí nghiệm. Hm lợng
ny theo các nghiên cứu trớc (Tạ Kim
Chỉnh, 1999; Trịnh Văn Hạnh v cộng sự,
2001) đã chỉ ra l thích hợp nhất khi thử
trực tiếp trên 100 cá thể mối. Mối thí nghiệm

ở các lô đối chứng không rắc bo tử m rắc
bột đất. Theo dõi sự hoạt động của các cá thể
mối theo từng ngy.
3. KếT QUả V THảO LUậN
3.1. Phân lập, tuyển chọn các mẫu nấm sợi
16 mẫu nấm sợi thu đợc từ phân lập 30
mẫu đất của các tổ mối chết trên địa bn H
Nội. Các tản nấm có các mu sắc khác nhau
nh trắng, xanh, vng, đen nâu v xanh lục.
Từ đó, 5 mẫu đại diện đợc chọn để tiến
hnh các thí nghiệm tiếp theo. Năm mẫu
ny đợc ký hiệu l M
1
, M
6,
M
9,
M
13
v M
16
.
3.2. Đặc điểm nuôi cấy v hình thái của
5 mẫu nấm sợi (Bảng 1)
Cả năm mẫu nấm sợi M1, M6, M9, M13,
M16 đều có hình dạng bo tử hình elip.
Hình dạng bo tử của cả 5 mẫu nấm sợi ny
đều giống với hình dạng bo tử của nấm
Metarhizium (Ine, 1999; Kimberly, 2004).
Kết quả quan sát mu sắc tản nấm

cũng cho thấy sự tơng đồng với mu sắc có
thể có của tản nấm Metarhizium (Tạ Kim
Chỉnh, 1996; Ine, 1999). Mu sắc mặt sau
của tản nấm có mu vng nâu, trắng ng
hay xanh vng, các đặc điểm không thấy mô
tả ở các ti liệu nghiên cứu về Metarhizium.
Ngoi ra, ba mẫu M
1
, M
6
, M
9
có những đặc
điểm gần giống với nhau về mu sắc tản
nấm, tốc độ sinh trởng. Bo tử của 3 mẫu
ny đều có bề mặt nhăn, song mu sắc của
chúng lại khác nhau. Mặt khác, hai mẫu
M
13
, M
16
lại có bề mặt bo tử mịn v mu
sắc bo tử giống nhau, khác 3 mẫu đầu tiên.
Kích thớc tản nấm đo đợc sau 10 ngy
nuôi cấy của các mẫu M
1
, M
6
v M
16

đạt cao
nhất (8,0 cm), sau l mẫu M
9
(7,9 cm), v
thấp nhất l mẫu M
13
(7,2 cm). Hình ảnh
của tản nấm của các mẫu nấm sợi đợc mô
tả rõ ở hình 1.
Bảng 1. Đặc điểm nuôi cấy v hình thái của 5 mẫu nấm sợi

c im nuụi cy
(trong 10 ngy)
c im hỡnh thỏi bo t trn
(sau 4 ngy)
Mu
Mu sc
tn nm
Mu sc mt sau
tn nm
Tc
sinh trng
ng kớnh
tn nm (cm)
B mt bo t
Mu sc
bo t trn
M
1
Nõu en Vng nõu Mc nhanh 8,0 Nhn Vng rm

M
6
Nõu en Vng nõu Mc chm 8,0 Nhn Vng nht
M
9
en Vng nõu Mc chm 7,9 Nhn Nõu sm
M
13
Xanh rờu Trng ng Mc nhanh 7,2 Mn Xanh xỏm
M
16
Xanh sm Xanh vng Mc chm 8,0 Mn Xanh xỏm
c im hỡnh thỏi v hot tớnh mt s enzyme ngoi bo ...
13












Hình 1. Tản nấm của 5 mẫu nấm sợi M1 (a), M6 (b), M9 (c), M13 (d) v M16 (e)
sau 10 ngy nuôi cấy v hình dạng bo tử của mẫu nấm sợi M16 (f)
3.3. Xác định số lợng bo tử trần của 5
mẫu nấm sợi

Kết quả của phơng pháp đếm khuẩn
lạc đợc quan tâm nhiều hơn vì phơng pháp
ny xác định đợc số bo tử sống m khả
năng ký sinh gây bệnh của nấm sợi phụ
thuộc vo khả năng nảy mầm của bo tử
sống. Số lợng bo tử của các mẫu nấm sợi
rất khác nhau: chủng M
16
l chủng có số bo
tử lớn nhất, thứ hai l chủng M
9
còn chủng
có số lợng bo tử ít nhất l chủng M
6
(Bảng
2). Tuy nhiên, số lợng bo tử ở cả 5 chủng
đều dao động trong khoảng từ 77x 10
8
đến
312 x 10
8
bo tử/g. Sự sai khác về số lợng
bo tử có thể l do sự khác nhau về khả
năng sinh bo tử giữa chúng.
3.4. Khả năng hình thnh một số enzyme
ngoại bo của 5 mẫu nấm sợi
Khả năng sinh enzyme ngoại bo l một
trong các yếu tố quan trọng quyết định đến
khả năng gây bệnh của nấm sợi trên các đối
tợng côn trùng khác nhau.

Sau 3 ngy nuôi cấy, khả năng sinh các
enzyme ngoại bo kitinaza, proteaza v
xenlulaza của năm mẫu nấm sợi thể hiện rõ
(Bảng 3). Cả 5 chủng nấm sợi đều sinh ra 3
loại enzyme ngoại bo (kitinaza, proteaza,
cellulaza) với hoạt tính khác nhau. Kitinaza
đợc sinh ra nhiều nhất ở cả năm mẫu nấm
sợi. Vòng phân giải đo đợc cao nhất ở mẫu
M
16
v thấp nhất ở mẫu M
1
v M
9
. Sự khác
nhau ny có thể đợc giải thích l do các
mẫu nấm sợi ny đợc phân lập tại các
nguồn mẫu khác nhau nên có các điều kiện
ngoại cảnh khác nhau ảnh hởng đến khả
năng sinh enzyme ngoại bo, nhng sự khác
nhau ny không phải l quá nhiều. Kitinaza
đợc sinh ra nhiều hơn proteaza v
xenlulaza có thể l do các mẫu nấm sợi ny
đều đợc phân lập từ mẫu đất lấy tại tổ mối
chết nên khả năng sinh enzyme ny l cao
nhất. Proteaza cũng đợc sinh ra ở cả 5 mẫu
nấm với hoạt tính gần nh l tơng đơng
nhau, không có sự khác biệt nhiều ở các mẫu
nấm khác nhau. Điều ny có thể đợc giải
thích l enzyme proteaza chỉ đợc sinh ra

sau khi sợi nấm đã xuyên đợc qua cơ thể
côn trùng rồi, khi đó proteaza đợc sinh ra
để phân huỷ các cơ quan nội tạng của côn
trùng với thnh phần chủ yếu l proteaza.
Xenlulaza đợc sinh ra có sự khác nhau rõ
rệt giữa các mẫu nấm. Cao nhất vẫn l ở
mẫu M
16
v thấp nhất l ở mẫu M
13
. Các thử
nghiệm đo hoạt tính của enzyme ngoại bo
mới chỉ đợc thực hiện từ dịch nuôi cấy thô
nên mới chỉ xác định đợc khả năng sinh
enzyme ngoại bo một cách tơng đối, để có
các kết luận chính xác v cụ thể hơn thì cần
phải tinh sạch v xác định đơn vị hoạt động
của từng enzyme ny.
Phan Trọng Nhật
14
B¶ng 2. Sè l−îng bμo tö cña 5 mÉu nÊm sîi
Số lượng bào tử/gam x 10
8

Mẫu
Phương pháp đếm khuẩn lạc Phương pháp đếm trực tiếp
M
1

102 ± 28 130 ± 36

M
6

77 ± 21 96 ± 25
M
9

268± 36 290± 38
M
13

126 ± 47 159 ± 52
M
16

312 ± 29 373 ± 34
B¶ng 3. Ho¹t tÝnh mét sè enzyme ngo¹i bμo cña 5 mÉu nÊm sîi
Hoạt tính enzyme ngoại bào (mm)
Mẫu
Kitinaza Proteaza Xenlulaza
M
1

11 10 5
M
6

12 12 5
M
9


11 12 6
M
13

12 12 4
M
16

13 12 10





















0
20
40
60
80
100
Tỷ lệ (%) mối chết
1234
Ngày
Hiệu lực diệt mối của 5 mẫu nấm sợi
M1
M6
M9
M13
M16
ĐC
H×nh 2. HiÖu lùc diÖt mèi cña 5 mÉu nÊm sîi