ỨNG DỤNG RT-PCR ĐỂ CHẨN ĐOÁN SỚM VIRUS DENGUE

TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Vấn đề chẩn đoán sốt xuất huyết trong thời kỳ đầu của bệnh là
khó, lâm sàng chưa rõ ràng, đòi hỏi cận lâm sàng như Mac-ELISA, kỹ thuật RT-PCR
(reverse transcription–polymerase chain reaction) sẽ chẩn đoán nhanh, nhạy và đặc
hiệu SXH-D, phân loại vi-rút dengue.
Mục tiêu nghiên cứu: Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR phát hiện sớm và chính
xác vi-rút dengue trong máu bệnh nhi sốt xuất huyết giúp bác sĩ lâm sàng xác định
sớm SXH-D.
Phương pháp nghiên cứu: Đây là một nghiên cứu áp dụng kỷ thuật RT-PCR
để xác định virus Dengue trong máu bệnh nhi đang bị bệnh sốt xuất huyết dengue
trong vòng 3 ngày đầu tiên mắc bệnh. 30 ca trẻ bệnh Sốt xuất huyết Dengue đang
nằm theo dõi điều trị trong bệnh viện Nhi đồng Cần thơ đã được chọn v ào nghiên
cứu, năm 2006. Số liệu được phân tích bởi chương trình SPSS để đo lường xác xuất
các biến số.
Kết quả nghiên cứu: đã chỉ rõ Kỷ thuật RT-PCR có khả năng xác định 80%
virus sốt xuất huyết trong vòng 3 ngày đầu mắc bệnh sốt xuất huyết.
- RT-PCR có thể định rõ các typ virus DenI, DenII, DenIII tại Cần Thơ trong
năm 2006.
- RT-PCR có giá trị chẩn đoán nhanh và chính xác Virus Dengue trong sốt
xuất huyết.
Kết luận: Kỷ thuật RT-PCR có khả năng xác định 80% virus sốt xuất huyết
trong vòng 3 ngày đầu mắc bệnh sốt xuất huyết.Do đó có thể dùng phổ cập trên lâm
sàng.
ABSTRACT
USING RT-PCR TEST TO IDENTIFY DENGUE VIRUS IN CHILDREN
OF CASES DENGUE HEMORRHAGIC FEVER DURING EARLY DAYS IN
CANTHO
Pham Hung Luc * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 12 - Supplement of No 4 -
2008: 263 - 267

Background: The diagnosis of Dengue fever during early days is dificulty,
clinical symtoms are not clear, It is required doing some specicial tests to confirm
virus Dengue. As Elisa test,RT-PCR test are necessary.
Objective: To use RT-PCR test to identify Dengue virus in the blood of
patients.
Method: This study is applied RT-PCR technic to identify virus Dengue in
blood of the cases Dengue hemorrhagic fever durring the first 3 day of disease. 30
children of cases Dengue hemorrhagic fever in the Children hospital of Cantho to be
selected in research, in the year 2006. Data was analized by SPSS pragramme to
measure the frequency of variables.
Rresult: This study was showed that RT-PCR technic is capable to determine
80% of cases Dengue Fever Virus durring the first 3 day of disease.
- RT-PCR can identify Dengue type I, type II, Type III at Cantho in the year
2006.
- RT-PCR is a value test to diagnosis Virus Dengue in case of hemorrhagic
fever dengue.
ĐẶT VẤN ĐỀ
*Trường Đại học Y Dược Cần Thơ

Sốt xuất huyết Dengue (SXH-D) do vi-rút dengue thuộc 4 týp (DEN-1, DEN-
2, DEN-3 và DEN-4) và lây truyền qua muỗi Aedes aegypti
(6,16,26)
. Theo báo cáo năm
1999 của Bộ Y tế, SXH-D ở nước ta có tỷ lệ chết/mắc trung bình là 0,23%. Bệnh có
nhiều thể lâm sàng, thể nhẹ có sốt phát ban đến thể nặng có xuất huyết dễ dẫn đến tử
vong nếu không được xử trí tích cực kịp thời.
Về điều trị, chủ yếu là bồi hoàn dịch một cách thận trọng, đủ và đúng. Vì vậy,
việc chẩn đoán sớm và nhanh có ý nghĩa rất lớn với kết quả điều trị và diễn tiến của
bệnh. Vấn đề là những ngày đầu của bệnh khó chẩn đoán là do sốt xuất huyết, lâm
sàng chưa rõ ràng, đòi hỏi cận lâm sàng như Mac-ELISA, sắc ký miễn dịch, kỹ thuật

RT-PCR (reverse transcription–polymerase chain reaction) sẽ chẩn đoán nhanh, nhạy
và đặc hiệu SXH-D, có khả năng phân loại vi-rút dengue. Nghiên cứu này ứng dụng
kỹ thuật RT-PCR phát hiện sớm và chính xác vi-rút dengue trong máu bệnh nhi sốt
xuất huyết giúp bác sĩ lâm sàng xác định sớm SXH-D.
Mục tiêu nghiên cứu
1. Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR để phát hiện sớm vi-rút dengue ở bệnh nhi sốt
xuất.
2. Xác định týp vi-rút dengue bằng kỹ thuật RT-PCR.
Bệnh nhi theo dõi SXH-D
Rút máu
Trích huyết thanh
Kỹ thuật RT-PCR
(ngay sau nhập viện)

Test nhanh
(ngày 5 của bệnh)
Phân loại vi-rút
Dengue
Công thức máu:
- Hematocrite
- Tiểu cầu
- Bạch cầu
- Công thức bạch cầu


Chẩn đoán SXH-D
Thu thập số liệu
Xử lý số liệu
3. Xác
định giá trị của RT-PCR với xét nghiệm chẩn đoán nhanh và chẩn đoán dựa theo tiêu

chuẩn Tổ chức Y tế Thế giới trong việc chẩn đoán sớm bệnh sốt xuất huyết.
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Các bệnh nhi theo dõi SXH-D vào điều trị tại khoa Sốt xuất huyết Bệnh viện
Nhi đồng Cần Thơ từ 01/10/2006 đến 31/12/2006.
* Tiêu chuẩn chọn bệnh: Tuổi 15h, Sốt cao (

39
0
C) từ ngày thứ 1 đến ngày
thứ 3 của bệnh không có tiêu điểm nhiễm trùng. Có dấu dây thắt dương tính hoặc biểu
hiện những dấu xuất huyết.
* Tiêu chuẩn loại trừ: + Những bệnh nhi mắc các bệnh khác như xuất huyết
giảm tiểu cầu, thiếu máu tán, huyết tự miễn, viêm đa khớp dạng thấp, lupus, suy tủy,
leucemie, hemophilie,
+ Sốt 4 ngày kèm hay không kèm dấu xuất huyết.
Nghiên cứu mô tả cắt ngang. Tuy nhiên do kinh phí có hạn không cho phép
nghiên cứu mẫu lớn cho nên chúng tôi chọn cỡ mẫu 30 là cỡ mẫu nhỏ nhất nhưng vẫn
đáp ứng được độ tin cậy trong thống kê số liệu.


















Sơ đồ nghiên cứu:
Phương pháp thu thập số liệu
Tất cả bệnh nhi đúng với tiêu chuẩn chọn bệnh được đưa vào nhóm nghiên
cứu, sẽ được khám và làm các xét nghiệm, theo dõi diễn tiến bệnh cho đến khi ra viện
hay tử vong và được thu thập số liệu theo bộ thu thập số liệu soạn sẵn ở phần phụ lục.
Các xét nghiệm được thực hiện trên mỗi bệnh nhi:
+ Công thức máu: Hematocrite, tiểu cầu, bạch cầu, công thức bạch cầu.
+ Xét nghiệm chẩn đoán nhanh sốt xuất huyết.
+ Kỹ thuật RT-PCR.
Phân tích số liệu
Nhập và phân tích số liệu theo phần mềm SPSS 12.0. Từ đó tính tỷ lệ các bảng
phân phối tần suất hay vẽ biểu đồ. Dùng phép kiểm định

hoặc phép kiểm định
Fisher’s Exact Test ở bảng 2×2. Phân tích, so sánh, diễn giải kết quả.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Từ ngày 01 tháng 10 năm 2006 đến ngày 31 tháng 12 năm 2006, chọn được
30 bệnh nhi đạt điều kiện chọn mẫu, qua theo dõi không có trường hợp nào tử vong.
Bảng 1: Phân bố mẫu nghiên cứu theo tuổi và giới
Nhóm
tuổi
Nam
%
Nữ %


n (%)
< 7
tuổi
3(10) 1(3,3)

4(13,3)
7-11
tuổi
4(13,3)

8(26,7)

12(40)
12-15
tuổi
8(26,7)

6(20) 14(46,7)

Tổng
số
15 15 30
Nhận xét: Trong 30 mẫu nghiên cứu có 15 nam (50%) và 15 nữ (50%).
Nhóm tuổi 12 - 15 tuổi chiếm tỷ lệ cao nhất (46,7%).
Bảng 2: Phân bố mẫu nghiên cứu theo giới và địa dư
Địa
dư
Nam(%)

Nữ(%)


n(%)
Cần
Thơ
7(23,3) 6(20) 13(43,3)

Hậu
Giang
5(16,7) 6(20) 11(36,7)

V
ĩnh
Long
3(10) 3(10) 6(20)
T
ổng
số
15 15 30
Nhận xét: Ca bệnh ở Cần Thơ chiếm tỷ lệ cao nhất 43,3%, nam 23,3%, nữ
20%.
Kết quả RT-PCR
Bảng 3: Kết quả RT-PCR
RT-PCR (%)
Dương tính

24 (80)
Âm tính 06(20)
Tổng số 30(100)
Nhận xét: Kết quả RT-PCR có 24/30 mẫu huyết thanh dương tính (80%).
Bảng 4: Kết quả RT-PCR phát hiện vi-rút dengue theo số ngày sốt

Số
ngày sốt
Dengue
(+) (%)
Dengue
(-) (%)
n (%)

Ngày
1
1(3,3) 0 1(3,3)

Ngày
2
8(26,7)

0 8(26,7)

Ngày
3
15(50) 6(20) 21(70)

T
ổng
số
24 6 30
Nhận xét: Có 15 mẫu nghiên cứu có kết quả RT-PCR dương tính vào ngày thứ
3 của bệnh (50%), 8 mẫu nghiên cứu dương tính ở ngày thứ 2 của bệnh (26,7%), có 1
trường hợp cho kết quả dương tính vào ngày đầu tiên của bệnh (3,3%).
Bảng 5: Kết quả RT-PCR phát hiện vi-rút dengue theo tuổi và giới của bệnh

nhi
Nam Nữ
Tổn
g số
Nhó
m tuổi
Dengu
e (+)
Dengu
e
(-)
Dengu
e
(+)
Dengu
e
(-)

< 7
tuổi
3 0 0 1 4
7-
11tuổi
3 1 7 1 12
12-
15
tuổi
6 2 5 1 14
Tổng
số

12 3 12 3 30
Ở nhóm tuổi 12 - 15 tuổi có 11 trường hợp RT-PCR dương tính, (6 nam, 5 nữ)
và ở nhóm < 7 tuổi có 3 trường hợp RT-PCR dương tính chỉ gặp ở nam.
Bảng 6: Kết quả RT-PCR và xét nghiệm chẩn đoán nhanh sốt xuất huyết
RT-PCR
Dương
tính
Âm
tính
T
ổng
số
P và Test
n %
n
%
Dương
tính
18
94,7
2
5,3
19
Test
nhanh
Âm
tính
6 60
4
40

10
Tổng số 24 6 29

p = 0,019
Nhận xét: Có 94,7% ca RT-PCR dương tính và test nhanh dương tính, nhưng
chỉ có 60% trường hợp RT-PCR dương tính trong khi test nhanh âm tính. Sự khác
biệt về RT-PCR so với test nhanh có ý nghĩa thống kê (

, p = 0,019).
Kết quả RT-PCR định týp vi-rút Dengue
Bảng 7: Kết quả RT-PCR định týp vi-rút dengue
Týp vi-
rút
dengue
n %
DEN-1 3 12
DEN-2 17 70,8
DEN-3 4 16,7
Nhận xét: Kết quả định týp vi-rút dengue chỉ thu được ba týp (DEN-1, DEN-2
và DEN-3), trong đó DEN-2 chiếm tỷ lệ cao nhất 70,8%.
Bảng 8: Kết quả định týp vi-rút dengue theo giới tính và địa dư
Nam Nữ
Đ
ịa dư
D
EN
-1
D
EN
-2

D
EN
-3
T
ổng
D
EN
-1
D
EN
-2
D
EN
-3
T
ổng
T
ổng số
C
ần Thơ

0

4

0

4
2


4

0

6
1
0
H
ậu
0

3

2

5
0

4

0

4
9
Giang
V
ĩnh
Long
1


0

2

3
0

2

0

2
5
T
ổng số
1

7

4

1
2
2

1
0
0

1

2
2
4
Nhận xét: Týp DEN-3 không gặp ở nữ và ở Cần Thơ, DEN-1 không gặp ở
Hậu Giang.
Bảng 9: Mối liên quan giữa týp vi-rút dengue và phân độ lâm sàng
Phân độ lâm sàng

Đ
ộ I+II
%
Đ
ộ III
%
n

%
Tý
p vi-
rút
DEN
-1
3
12,
5
0 0 3

12,
5
DEN

-2
13

54,
1
4
16,
7
1
7
70,
8
dengue
DEN
-3
4
16,
7
0 0 4

16,
7
Tổng số 20

83,
3
4
16,
7
2

4
100

Nhận xét: Có 4 trường hợp SXH-D độ III (16,7%) đều là DEN-2.
Chẩn đoán SXH-D theo tổ chức y tế thế giới
Bảng 10: Chẩn đoán SXH-D (WHO)
SXH-D (WHO) (%)
Có
bệnh
24 80
Không
06 20
bệnh
Tổng
số
30 100
Nhận xét: Có 24/30 (80%) chẩn đoán SXH-D theo WHO.
Bảng 11: Số ngày chẩn đoán SXH-D theo WHO
Chẩn đoán SXH-
D
(WHO) (%)
Ngày
3
13 54,1
Ngày
4
9 37,5
Ngày
5
1 4,2

Ngày
6
1 4,2
Tổng
số
24 100
Nhận xét: Có 13 trường hợp (54,1%) được chẩn đoán vào ngày 3 và 1 trường
hợp (4,2%) được chẩn đoán vào ngày 5, ngày 6.
BÀN LUẬN
Test RT-PCR khảo sát 30 mẫu huyết thanh của những bệnh nhi theo dõi sốt
xuất huyết ghi nhận được 24 trường hợp RT-PCR cho kết quả dương tính, 80% (Bảng
3). Kết quả này tương đối phù hợp với một số tác giả khác như: Hồ Minh Châu 80%,
Đỗ Quang Hà 77%, Nguyễn Trung Lập 63%.
Kết quả dương tính trong 3 ngày đầu của bệnh (Bảng 3.4), và ngày đầu tiên
của bệnh.cho thấy được thế mạnh của RT-PCR trong việc chẩn đoán sớm bệnh.Trong
các ca RT-PCR cho kết quả dương tính thì test nhanh chẩn đoán sốt xuất huyết là
18/29 (62%)
Trong nghiên cứu này, chúng tôi dựa vào RT-PCR và test nhanh, nhằm để so
sánh mức độ phù hợp giữa hai xét nghiệm này trong chẩn đoán SXH. Kết quả khác
biệt giữa hai xét nghiệm là có ý nghĩa (p = 0,01). Điều này có nghĩa là RT-PCR cho
kết quả chẩn đoán bệnh chính xác, còn test nhanh chẩn đoán sốt xuất huyết chỉ giúp
gợi ý chẩn đoán, phải kết hợp thêm với lâm sàng thì không bỏ sót những trường hợp
mà test nhanh cho kết quả dương tính giả, âm tính giả.
RT-PCR định týp vi-rút Dengue
Kết quả cho thấy týp vi-rút dengueI là 70,8%, týp vi-rút dengueII (12,5%) và
týp vi-rút dengue III (16,7%). Tuy nhiên, không phát hiện týp vi-rút dengue 4 trong
thời điểm này (Bảng 7). Cần Thơ (8DEN-2, 2DEN-1), Hậu Giang (7DEN-2, 2DEN-
3) và Vĩnh Long (1DEN-1, 2DEN-2, 2DEN-3).
KẾT LUẬN
- Kỹ thuật RT-PCR có thể chẩn đoán xác định sớm SXH-D trong 3 ngày đầu

của bệnh.
- Kỹ thuật RT-PCR định týp vi-rút dengue trong quý IV năm 2006 cho kết quả
sau: týp vi-rút dengue 2 là týp chủ yếu (70,8%), týp vi-rút dengue 1 chiếm 12,5%, týp
vi-rút dengue 3 chiếm 16,7%, không có xuất hiện týp vi-rút dengue 4 ở thời điểm lấy
mẫu, tập trung ở 3 tỉnh Cần Thơ, Hậu Giang, Vĩnh Long, bốn trường hợp SXH-D độ
III đều rơi vào týp vi-rút dengue 2 (16,7%).
- Chẩn đoán giữa RT-PCR với WHO là phù hợp.
- Sự khác biệt giữa RT-PCR với test nhanh trong chẩn đoán SXH-D là RT-
PCR cho kết quả chẩn đoán bệnh chính xác, còn test nhanh chẩn đoán sốt xuất chỉ
giúp gợi ý chẩn đoán.
- Kỹ thuật RT-PCR có giá trị tốt để chẩn đoán, định týp vi-rút, mở rộng nghiên
cứu về gen và phả hệ của vi-rút dengue trong tương lai.