KHẢO SÁT CƠ CHẾ DI TRUYỀN CỦA BỆNH TEO CƠ TỦY SỐNG
TÝP I (WERDNIG-HOFFMANN)

TÓM TẮT
Mục tiêu: Xác định tỉ lệ gen SMN1/SMN2 ở người lành mang gen bệnh
Werdnig-Hoffmann.
Phương pháp: Chúng tôi dùng phản ứng khuếch đại cạnh tranh tạo ra các
sản phẩm PCR của SMN1 và SMN2. Sau đó, làm đứt đoạn sản phẩm PCR
của gen SMN bằng men Hinfl. Sản phẩm thu được sẽ được chạy điện di trên
gel, rồi scan bằng máy ảnh Polaroid dưới tia cực tím, và phân tích đậm độ
(phần mềm 1.16/ppc NIH Image) đối với hai dãi band 101 bp (SMN2) và 78
bp (SMN1). Tỉ lệ gen SMN1/SMN2 được xác định dựa trên tỉ lệ đậm độ của
đoạn 78 bp/101 bp.
Kết quả: 11 (73,3%) người có tỉ lệ SMN1/SMN2 là 0,5 và 1; bốn người còn
lại (26,7%) có tỉ lệ là 1/3.
Kết luận: Kết quả này hỗ trợ cho quan điểm cho rằng mất đoạn (deletion)
chứ không phải chuyển đổi đoạn (conversion) là cơ chế di truyền chính
trong bệnh Werdnig-Hoffmann.

ABSTRACT
Objective: To determine the SMN1/SMN2 ratios of carriers of Werdnig-
Hoffmann disease.
Methods: We used competitive PCR to amplified SMN1 and SMN2 gene
products. The PCR products were digested by Hinfl. The samples were run
on gel, and scanned by Polaroid camera under UV-light. Densitometric
analysis was performed on the two bands that correspond to the 101 bp
fragment of SMN2 and the 78 bp fragment of SMN1. The SMN1/SMN2
copy ratio was determined based on the 78 bp/101 bp ratio obtained from
densitometric analysis.
Results: We found that the SMN1/SMN2 ratio was 0.5 or 1 in 11 (73.3%)
carriers; the remaining 4 (26.7%) carriers had an SMN1/SMN2 ratio of 1/3.

Conclusion: The finding supports the idea that deletion rather than
conversion is the main genetic event in Werdnig-Hoffmann disease.

MỞ ĐẦU
Bệnh teo cơ tủy sống (SMA) là bệnh di truyền gen lặn trên nhiễm sắc thể
thường, đặc trưng bởi sự yếu liệt và teo các cơ tiến triển do sự thoái hóa của các
tế bào vận động ở sừng trước tủy sống. SMA gồm 3 thể lâm sàng, phân loại
được dựa trên thời điểm khởi phát và mức độ trầm trọng của biểu hiện lâm
sàng
(13)
. Bệnh nhân SMA type I (còn gọi là bệnh Werdnig-Hoffmann) không
thể ngồi được nếu không được giúp đỡ, trong khi bệnh nhân SMA type III
(bệnh Kugelberg-Welander) thì có thể đi được. SMA type II là thể trung gian
với sự yếu cơ tiến triển chậm hơn SMA type I. Tần số mắc của SMA là 1 trên
10.000 lần sinh, với tần số người lành mang gen bệnh là 1/50
(15)
. Gen SMN là
gen gây bệnh SMA và được xác định là nằm trên nhiễm sắc thể 5q13
(1,12)
.
Không liên quan đến mức độ trầm trọng của bệnh, 90-98% các bệnh nhân
SMA có sự mất đồng hợp tử của SMN1, do mất exon 7 hoặc 8 hoặc cả
hai
(6,10,16,22)
. Phần lớn bệnh nhân người Trung Quốc, Hàn Quốc và Nhật có sự
mất đồng hợp tử của exon 7 và 8 của gen SMN1
(2,8,18)
. Gen protein ức chế sự tự
chết tế bào thần kinh (neuronal apoptosis inhibitory protein: NAIP) là gen nằm
gần với gen SMN. Chúng bị mất đoạn trong 50% bệnh nhân bị SMA type I

(17)
.
Tần suất bị mất gen NAIP trong bệnh SMA thể nhẹ xảy ra ít hơn so với trong
bệnh SMA type I, điều này có lẽ phản ảnh mức độ rộng của sự mất đoạn trên
nhiễm sắc thể SMA
(21,25)
. Gen SMN là gen cần cho sự tồn tại và sống còn của
các tế bào thần kinh vận động tủy sống. Gen SMN gồm hai gen khá giống nhau,
đó là SMN1 và SMN2 trên nhiễm sắc thể 5q13. Cả hai gen đều có độ dài
khoảng 20 kb nhưng chỉ khác nhau có 5 nucleotide. Ở bệnh nhân bị SMA, có ít
nhất một gen SMN2 còn sót lại. Người bình thường có một gen SMN1 và một
gen SMN2 trên mỗi nhiễm sắc thể, do đó, tỉ lệ SMN1/SMN2 là 1. Tỉ lệ gen
SMN1/SMN2 ở cha mẹ của bệnh nhân đã được sử dụng để phân tích vai trò của
số gen SMN2 trên độ nặng của bệnh SMA. McAndrew và cs, và Velasco và cs
nhận thấy rằng ở người Tây Ban Nha, Mỹ và Canada thì cha mẹ của bệnh nhân
bị SMA type II và III có tỉ lệ SMN1/SMN2 nhỏ hơn so với cha mẹ của bệnh
nhân SMA type I
(11,22)
. Tuy nhiên, Schwartz và cs
(20)
lại không ghi nhận hiện
tượng này trong gia đình bệnh nhân người Scandinavi. Ngược lại, Nishio và cs
lại ghi nhận tỉ lệ SMN1/SMN2 bằng 2 ở hai trong số bốn người lành mang gen
bệnh, họ là cha mẹ của hai bệnh nhi người Nhật bị SMA type I
(14)
. Tác giả tiên
đoán rằng tần suất tỉ lệ SMN1/SMN2 là 2 ở người lành mang gen bệnh trong
dân Nhật cao hơn so với dân phương Tây
(14)
. Chúng tôi muốn tìm hiểu liệu tiên

đoán này có đúng không. Do đó, chúng tôi tiến hành xác định tỉ lệ
SMN1/SMN2 trên 15 người Nhật là người lành mang gen bệnh SMA type I. Để
xác định tỉ lệ SMN1/SMN2, điều quan trọng là phải phân biệt được hai loại gen
này. Chúng tôi dùng phản ứng khuếch đại cạnh tranh (competitive polymerase
chain reaction: competitive PCR) bằng cách dùng mồi ghép cặp sai (mismatch
primer) để tạo nên các vị trí hạn chế khác nhau (restriction site) (xem thêm
phần Đối Tượng và Phương Pháp Nghiên Cứu) trên gen SMN1 và SMN2. Điều
này cho phép chúng tôi phân biệt được SMN1 với SMN2, qua đó xác định được
tỉ lệ SMN1/SMN2.

ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng là 14 cha mẹ và 1 người em ruột bình thường về lâm sàng của 7 gia
đình với 9 bệnh nhân bị SMA type I. Bảy gia đình này không có mối liên hệ
huyết thống với nhau. Tất cả 9 bệnh nhân đều được xếp loại là SMA type I theo
tuổi khởi phát và mốc vận động đạt được của trẻ dựa trên tiêu chuẩn của
International SMA Consortium
(13)
. Tất cả bệnh nhân đều có đồng hợp tử mất
đoạn exon 7 và 8
(18)
. Phân tích haplotype của tất cả các bệnh nhân và thành viên
trong gia đình cho thấy tất cả 14 cha mẹ và 1 người em ruột đều là người lành
mang gen bệnh (xem them chi tiết trong tài liệu tham khảo 3). Ngoài ra, nhóm
chứng gồm 19 người tình nguyện bình thường cũng tham gia trong nghiên cứu
này.
Phương pháp xác định tỉ lệ gen SMN1/SMN2
Chúng tôi dùng phản ứng khuếch đại cạnh tranh (competitive PCR: PCR cạnh
tranh) dựa trên mồi SMN ghép cặp sai như đã được mô tả bởi Wirth và cs
(25)

.
Mồi ghép cặp sai sẽ tạo ra các vị trí hạn chế HinfI khác nhau trên SMN1 và
SMN2. Mồi theo chiều xuôi (forward primer) là mồi ghép cặp sai được thiết kế
dựa trên trình tự các nucleotid của SMN1 exon 7 (SMN7F: 5’-
CTTCCTTTTATTTTCCTTACAGGGATT-3’), và mồi ngược (reverse
primer) trên intron 7 (SMN7R: 5’-TCCACAAACCATAAAGTTTTAC-3’).
Sản phẩm PCR của gen SMN sẽ có chiều dài là 135 bp. Phản ứng PCR cạnh
tranh được thực hiện trong 20 µl hỗn hợp phản ứng, bao gồm 30 ng DNA của
bộ gen (genomic DNA), 1 x Perkin-Elmer dung dịch đệm PCR, 200 µM của
dNTP, 0,6 U Taq polymerase (Perkin-Elmer), và 10 pmol cho mỗi mồi SMN7F
và SMN7R. Các điều kiện tiến hành phản ứng theo chu kỳ được thực hiện như
đã được mô tả bởi Wirth và cs
(25)
với một chút thay đổi, là mẫu của chúng tôi
được khuếch đại với 35 chu kỳ.


Hình 1. Sản phẩm PCR sau khi được ủ với men HinfI và điện di trên gel
polyacrylamide 16%. Hai dải band trên cùng, tương ứng với đoạn 101 bp của
SMN2 và đoạn 78 bp của SMN1. Tỉ lệ gen SMN1/SMN2 được xác định dựa
trên tỉ lệ đậm độ của đoạn 78 bp/101 bp. Chúng ta thấy ở người lành mang gen
bệnh vẫn còn đủ gen SMN1 và SMN2, như ở người cha (F) và mẹ (M). Trong
khi bệnh nhân (P) thì không có gen SMN1 nhưng vẫn còn gen SMN2.

Sau khi có sản phẩm PCR của SMN, chúng tôi ủ 10 µl sản phẩm PCR với 15 U
men HinfI (Toyobo) ở nhiệt độ 37°C trong 3 giờ, để làm đứt đoạn gen SMN.
Do sản phẩm PCR của SMN2 chỉ có một vị trí hạn chế HinfI nên chúng sẽ bị
cắt thành hai đoạn với chiều dài là 101 và 34 bp, trong khi sản phẩm PCR của
SMN1 có hai vị trí hạn chế HinfI nên chúng sẽ bị cắt thành ba đoạn có chiều dài
là 78, 34, và 23 bp. Sau đó các sản phẩm này sẽ được chạy điện di trên gel

polyacrylamide 16% ở điện thế 100 V trong 3 giờ, rồi được nhuộm bằng
ethidium bromide, rồi scan gel đó bằng máy ảnh Polaroid dưới tia cực tím, và
phân tích đậm độ bằng phần mềm 1.16/ppc NIH Image. Phân tích đậm độ được
thực hiện đối với hai dải band trên cùng, tương ứng với đoạn 101 bp của SMN2
và đoạn 78 bp của SMN1 (Hình 1). Tỉ lệ gen SMN1/SMN2 được xác định dựa
trên tỉ lệ đậm độ của đoạn 78 bp/101 bp.
Để kiểm tra tính khả thi của việc xác định tỉ lệ gen SMN1/SMN2 bằng phân tích
tỉ lệ đậm độ, chúng tôi xác lập khoảng chuẩn về tỉ lệ đậm độ bằng cách xử dụng
các hỗn hợp biết trước với tỉ lệ SMN1/SMN2 khác nhau. Gen SMN1 và SMN2
được khuếch đại bằng hai phản ứng PCR riêng rẻ. Một PCR để khuếch đại
SMN1 từ một bệnh nhân với một bệnh lý thần kinh khác, người này chỉ có
SMN1 mà không có SMN2. Trong khi SMN2 được khuếch đại từ mẫu của một
bệnh nhân SMA, người này không có gen SMN1 nhưng còn SMN2. Sản phẩm
của hai PCR này được làm tinh khiết bằng gel agarose với bộ kit chiết xuất
ADN Supre
TM
-02 và -01 (Takara-Biochemicals). Các khuôn mẫu (template)
pha trộn 9000 bản sao (copies) SMN1 với số lượng khác nhau của SMN2 để tạo
các tỉ lệ SMN1/SMN2 khác nhau là 2, 1, 0,5 và 1/3. Phản ứng PCR cạnh tranh
với các tỉ lệ SMN1/SMN2 khác nhau này được tiến hành tương tự như đã nêu ở
trên.

KẾT QUẢ
Để kiểm tra tính khả thi của việc xác định tỉ lệ gen SMN1/SMN2 bằng tỉ lệ đậm
độ, chúng tôi xác lập khoảng chuẩn và đường biểu diễn về tỉ lệ đậm độ bằng
cách dùng các hỗn hợp khuôn mẫu với tỉ lệ SMN1/SMN2 khác nhau đã được
biết trước. Chúng tôi thấy có mối tương quan dương tính rõ rệt giữa tỉ lể phân
tử (tỉ lệ khuôn mẫu SMN1/SMN2) và tỉ lệ sản phẩm PCR (tỉ lệ đậm độ
SMN1/SMN2) trong khoảng 0-2 (Hình 2), với hệ số tương quan là r = 0,959.
Điều này chứng tỏ rằng tỉ lệ gen SMN1/SMN2 có thể được xác định bằng cách

phân tích đậm độ của các sản phẩm PCR.
Sau đó, chúng tôi đã tiến hành xác định tỉ lệ gen SMN1/SMN2 của 15 người
lành mang gen bệnh và 19 người chứng bình thường. Tỉ lệ SMN1/SMN2 của
mỗi người rơi vào một trong bốn nhóm là 1/3, 0,5, 1 và 2, mà không có trùng
lắp. Điều đó chứng tỏ một cách tương ứng rằng số gen SMN1 là 1/3, phân nửa,
bằng hoặc gấp đôi số gen của SMN2. Bốn người lành mang gen bệnh (26,7%)
có tỉ lệ là 1/3, sáu người (40%, trong đó có người em) có tỉ lệ là 0,5, và năm
người (33,3%) có tỉ lệ là 1 (Bảng 1 và Bảng 2).


Tỉ lệSMN1/SMN2


Hình 2. Đường biểu diễn chuẩn PCR cạnh tranh. Trục hoành là tỉ lệ các hỗn
hợp khuôn mẫu với tỉ lệ SMN1/SMN2 khác nhau đã được biết trước (1/3, 0,5,
1 và 2). Trục tung là tỉ lệ đậm độ của sản phẩm PCR cạnh tranh từ các khuôn
mẫu với tỉ lệ SMN1/SMN2 khác nhau. Hệ số tương quan r là 0,959.

Không có người lành mang gen bệnh nào có tỉ lệ là 2 hoặc không có gen
SMN2. Ở nhóm chứng, 2 người (10,5%), 12 người (63,2%) và 5 người (26,3%)
có tỉ lệ tương ứng là 0,5, 1 và 2. Không có người chứng nào có tỉ lệ là 1/3.
Bảng 1. Tỉ lệ SMN1/SMN2 của người lành mang gen bệnh SMA type I
(NLMGB SMA I) và người chứng bình thường (NCBT)
T
ỉ lệ
SMN1/SMN2

Phạm
vi t
ỉ lệ

đậm
độ
NLMGB
SMA I
NCBT
1/3 0,86 –
0.90
4 (26,7)* 0
0,5 0,98 –
1,04
6 (40.0) 2 (10,5)

1 1,06 –
1,15
5 (33,3) 12
(63,2)
2 1,17 –
1,25
0 5 (26,3)

Tổng cộng 15 19
* Số trong ngoặc đơn là giá trị phần trăm.

Bảng 2. Phân bố của tỉ lệ SMN1/SMN2 trên người lành mang gen bệnh SMA
type I (NLMGB SMA I); F: cha; M: mẹ và S: em;
NLMGB
SMA I
SMN1/SMN2

Gia

đình thứ

1/3 0,5 1
1 M F
2 M, S F
3 F, M
4 F M
5 F, M
6 F, M
7 F, M

BÀN LUẬN
Bệnh nhân SMA có nhiều kiểu hình lâm sàng khác nhau, từ thể nhẹ cho đến thể
nặng. Tất cả các thể đều có sự mất gen SMN1 đồng hợp tử, nhưng không có đột
biến chuyên biệt nào trên gen SMN1 có thể giải thích cho các thể lâm sàng khác
nhau
(1,6,10,12)
. Nghiên cứu của Wirth và cs cho thấy rằng kích thước của sự mất
đoạn liên quan đến độ nặng của bệnh
(24)
, bởi vì một số gen lân cận của SMN1
được xem là có vai trò bù trừ và điều chỉnh thể lâm sàng của SMA, ví dụ như
gen SARF1 và btfp44
(19)
. Do đó, mất đoạn càng rộng thì thể lâm sàng càng
nặng. Gen SMN2 là gen nằm gần với SMN1 trên vùng SMA của nhiễm sắc thể
5q13, và giống gần như hoàn toàn với SMN1. Có nhiều protein xuất phát từ gen
SMN2, do có sự kết nối ở những vị trí khác nhau trong quá trình giải mã
(4,5)


Trong số đó, chủ yếu là protein không có các axit amin được mã hóa bởi exon
7, một số lượng nhỏ là protein với chiều dài đầy đủ giống hoàn toàn với protein
của SMN1, và một số protein khác với các tỉ lệ khác nhau. Chính lượng nhỏ
protein có chiều dài đầy đủ này có vai trò bù trừ quan trọng khi bị mất gen
SMN1
(4,23)
. Ngoài ra, Hsieh-Li và cs đã chứng minh rằng có sự tương quan
mạnh mẽ giữa số lượng gen SMN2 và thể lâm sàng của SMA ở chuột
(7)
. Nghiên
cứu của chúng tôi cũng cho thấy rằng những bệnh nhân bị SMA type I có tần
suất mất đoạn vùng SMA rộng trên 5q13
(3,9)
. Tất cả những điều này chứng tỏ
rằng có sự mất kèm theo của các gen bù trừ lân cận trên bệnh SMA type I. Nếu
một người lành mang gen bệnh SMA type I có mất đoạn rộng, mất cả SMN1 và
SMN2 trên nhiễm sắc thể bệnh, thì tỉ lệ SMN1/SMN2 của họ vẫn là 1/1 do họ có
một SMN1 và một SMN2 trên nhiễm sắc thể bình thường. Một người lành
mang gen bệnh có tỉ lệ SMN1/SMN2 là 1:2 là do nhiễm sắc thể bệnh chỉ bị mất
đoạn ngắn chứa SMN1. Vì phần lớn các bệnh nhân SMA type I trong lô nghiên
cứu của chúng tôi có mất đoạn rộng
(3,9)
, chúng tôi mong đợi tỉ lệ SMN1/SMN2
không lớn hơn 1 trong phần lớn các người lành mang gen bệnh. Kết quả nghiên
cứu cho thấy tất cả người lành mang gen bệnh trong nghiên cứu này đều có tỉ lệ
nhỏ hơn hoặc bằng 1. Mặc dù Nishio và cs cho rằng tỉ lệ SMN1/SMN2 là 2 ở
bệnh nhân SMA type I là đặc trưng của bệnh SMA ở người Nhật
(14)
, kết quả
nghiên cứu của chúng tôi không ủng hộ nhận xét này. Ngược lại, kết quả này

phù hợp với các kết quả nghiên cứu được thực hiện ở các nước phương Tây.
Velasco và cs nhận thấy rằng không có người nào trong 112 cha mẹ của bệnh
nhận SMA type I người Tây Ban Nha có tỉ lệ SMN1/SMN2 là 2
(22)
. Schwartz và
cs cũng không ghi nhận một trường hợp nào có tỉ lệ là 2 trong 60 cha mẹ của
bệnh nhân người Scandinavi
(20)
. McAndrew và cs chỉ ghi nhận 1 trường hợp
(1,3%) trong tổng số 79 cha mẹ có tỉ lệ SMN1/SMN2 là 2 ở người Mỹ và
Canada
(11)
. Nghiên cứu của chúng tôi không ghi nhận một trường hợp nào có tỉ
lệ SMN1/SMN2 là 2.
Để kết luận, mặc dù đã có nghiên cứu cho rằng cơ sở di truyền học của bệnh
SMA ở bệnh nhân người Nhật khác với người phương Tây, kết quả nghiên cứu
của chúng tôi cho thấy tỉ lệ SMN1/SMN2 ở người lành Nhật mang gen bệnh
SMA type I phù hợp với kết quả nghiên cứu được thực hiện ở người phương
Tây. Kết quả này cũng hổ trợ cho quan điểm cho rằng mất đoạn chứ không
phải chuyển đổi đoạn là cơ chế di truyền chính trong bệnh SMA type I.