9/11/2008 BM CNLM, HBKHN 1
Phõn tớch vi sinh vtth
ự
cph
ẩ
m
Chơng II : Kiểm định vi sinh vật thực phẩm
II.1. Chuẩn bị mẫu phân tích vi sinh : Cách
lấy mẫu, vận chuyển, bảo quản mẫu và
chuẩn bị mẫu phân tích
II.2 Các phơng pháp định lợng vi sinh vật
II.3 Phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật
9/11/2008 BM CNLM, HBKHN 2
Lấy mẫu phân tích vi sinh
Cách lấy mẫu :
Bao gói độc lập ( hộp, chai, túi .)
Từ các khối lợng lớn (bia hơi, nớc mắm, thịt . )
+ Sát trùng vị trí lấy mẫu cũng nh dụng cụ chứa mẫu
+ Cho vào các lọ, bỡnh kín có nút kín đã tiệt trùng
+ Ghi đầy đủ các thông số : số bao gói, mẫu, nơi lấy mẫu,
lô hàng sn xuất, ngày lấy mẫu, ký hiệu
Chơng II
Nguyên tắc : 2 điều kiện
ộ tin cậy, đại diện và đủ số lợng
Không bị nhiễm hoặc không có sự phát triển thêm
9/11/2008 BM CNLM, HBKHN 3
Vận chuyển & boqunmẫu
Hạn chế tối đa sự nhiễm tạp và tránh sự phát triển của VSV
Tuỳ SP mà vận chuyển và boqunhợplý
t min (<8h ) & boqunlnh
-Bin is lng, chtlng VSV

- hot ng thay i, khú phỏt hin trờn
mụi trng chnlc
Chơng II
BoqunTo âm( ở trạng thái đóng bng)
9/11/2008 BM CNLM, HBKHN 4
Chunb pha long mu
To dung dch ng nht
Pha loóng mu: Bis ca 10 : 10
-1
, 10
-2
, 10
-3

Dung dịch để pha loãng : Tuỳ theo snphẩm
Thành phần các dung dịch pha long
Hàm lợng (g)
Các chất Nớc sinhlý Dd Ringer Trypton Trypton đệm
Pepton/Trypton 1 20
NaCl 8,5 8,5 8,5 5
KCl 0,25
CaCl
2
0,3
Na
2
HPO
4
9
KH

2
PO
4
1
NaHCO
3
0,2
H
2
O Pha đủ cho 1 lit
Chơng II
9/11/2008 BM CNLM, HBKHN 5
Phõn tớch vi sinh vtth
ự
cph
ẩ
m
Chơng II : Kiểm định vi sinh vật thực phẩm
II.1. Chuẩn bị mẫu phân tích vi sinh : Cách lấy
mẫu, vận chuyển, bảo quản mẫu và chuẩn bị
mẫu phân tích
II.2 Các phơng pháp định lợng vi sinh vật
II.3 Phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật
9/11/2008 BM CNLM, HBKHN 6
S
Cỏc phng phỏp định lợng VSV
Khối lợng
Đo độ đục
đếm trực tiếp
(buồng đếm)

Đếm khuẩn lạc
-Trong/trên mặt thạch
Nuôi cấy trên mt lỏng
Phơng pháp MPN
Màng lọc
Chơng II
Phơng pháp
chuẩn, truyn
thng
Phơng pháp
xác định nhanh
9/11/2008 BM CNLM, HBKHN 7
Phơng pháp đếm khuẩn lạc
" Phát hiện nhng tế bào vi sinh vật còn sống có trong mẫu (Mỗi
khuẩn lạc = một tế bào).
" Phơng pháp chuẩn để xác định tổng số vi sinh vật trong mẫu
Nguyên tắc:
-Cấy chính xác một thể tích mẫu (hoặc dịch pha loãng) vào trong
hoặc lên trên bề mặt môi trờng thạch.
-Từ mỗi độ pha loãng cần cấy lặp lại ít nhất là 2 hộp
-Mỗi mẫu cần làm ít nhất 2 độ pha loãng liên tiếp, 30 - 300 khuẩn
lạc/ hộp.
9/11/2008 BM CNLM, ĐHBKHN 8
§Õm khuÈn l¹c
Trong môi trường thạch
(Plate count)
Trên môi trường thạch
(Surface count)
Pha loãng mẫu
1ml hộp petri

Đổ mt thạch hộppetri
Nuôi cấytrongtủấm
Trộntheokỹ thuật
Pha loãng mẫu
Đổ mt thạch hộppetri
0,05-0,1ml hộppetri
Trang đều trên bề mặt
Nuôi cấytrongtủấm
Ch−¬ng II
9/11/2008 BM CNLM, HBKHN 9
Tớnh ktqu
Quan sát và đếm số lợng khuẩn lạc mọc trên đĩa (30-300).
Tính tổng số VSV theo công thức :
Chơng II
vfnn
C
N
.) 1,0(
121
+

=

C -tổngsốkhuẩnlạc đếmđợc trên tất c các đĩa
n
1
- số đĩa đếm ở nồng độ pha long thứ 1
n
2
- số đĩa đếm ở nồng độ pha long thứ 2

f
1
-Hệsốphalong của đĩa đếm thứ 1
v - thể tích mẫu cấy vào mỗi hộp petri
9/11/2008 BM CNLM, ĐHBKHN 10
KhuÈn lạc
9/11/2008 BM CNLM, ĐHBKHN 11
Nuôi cấytrênmôitrường lỏng
Cã 2 kh¶ n¨ng : cã VSV sèng (+) vµ kh«ng cã VSV (-)
2. + + + -
3. + + - -
1. + + + +
1 ml (g)
1 ml 1 ml
10
-0
10
-1
10
-2
10
-3
" N ≥ 10
3
tế bào/ml (g)
" 10
2
≤ N < 10
3
" 10 ≤ N < 10

2
4. + - - -
" N < 10
9/11/2008 BM CNLM, ĐHBKHN 12
Nuôi cấytrênmôitrường lỏng
1 ml (g) 1 ml
1 ml
" N < 10 tế bào /ml
LÊy 10 èng, mçi èng 10 ml mÉu ph©n tÝch
• C¶ 10 èng (-)
" N < 1 tế bào/ 100 ml
• Cã 6 èng (+)
" N = 6 tế bào/ 100 ml
….
10 ống
Ống 1 2 10
9/11/2008 BM CNLM, HBKHN 13
Phơng pháp đếm số có xác suất lớn nhất
Nguyên tắc :
Vi sinh vật đợc nuôi cấy trong môi trờng lỏng và có kh nng thể
hiện các đặc tính lên men (đục, đổi mầu, sinh khí, mùi)
Pha loãng mẫu liên tiếp theo bội số của 10 cho tới khi kq (-)
Mỗi độ pha loãng cần nuôi cấy 3 ống lặp lại
Kiểm tra vi sinh vật có phát triển hay không, tínhsốốngcókq(+)
Xửlýsốliệutheobng Mac Grady, và từ đấy tính ra số lợng
VSV
(MPN : Most Probable Number )
Chơng II
(Most Probable Number) còn đợc gọi là phơng pháp pha loãng tới hạn,
thờng dùng để đánh giá số lợng vi sinh vật theo lợng vi sinh vật có xác

suất lớn nhất có thể có trong mẫu.
9/11/2008 BM CNLM, ĐHBKHN 14
MPN : Các bướcthựchiện
Chuẩnbị và pha loãng mẫu
Đưamẫu vào các ống nghiệm
(Nhiều độ pha loãng, mỗi độ ít nhất3 ống)
Nuôi cấytrongmôitrường lỏng
Tính kếtquả
Xác định chỉ số MPN
Tra bảng Mac Grady
Ch−¬ng II
9/11/2008 BM CNLM, HBKHN 15
Nuôi cy trong môi trng lng đặc hiệu cho VSV
01233
+ - -+ + -+ + ++ + +
10
-4
10
-3
10
-2
10
-1
10
-0
Xácđịnhsốđặctrng (3 số biểu thị số ống dơng tính) : 332 ; 321 ; 210
Số đầu (bên trái): chỉ số ống nghiệm dơng tính ở độ pha loãng thấp nhất
Hai số tiếp : chỉ số ống nghiệm dơng tính của 2 độ pha loãng tiếp theo.
Chơng II
9/11/2008 BM CNLM, HBKHN 16

Chọn số đặc trng với 3 ống lặp lại
010
00
010
220
01
022
211
0
112
2
222
0
222
2
b - Không có độ
pha loãng nào có 3
ống dơng tính
301
00
103
321
00
123
320
0
023
3
310
0

13
33
333`333
33
a -Cóítnhấtmột
độ pha loãng có 3
ống dơng tính
10
-5
10
-4
10
-3
10
-2
10
-1
Số đặc
trng
Số ống dơng tính cho mỗi độ pha loãng
Các trờng hợp
9/11/2008 BM CNLM, HBKHN 17
Tính kết quả pp MPN
Xác định chỉ số MPN:
Từsốđặctrng, tra bảng Mac Grady A để tim chỉ số
MPN.
Chơng III
9/11/2008 BM CNLM, ĐHBKHN 18
Bảng Mac Grady
2 èng 3 èng 5 èng

Số
đặc
trư
ng
M
P
N
Số
đặc
trư
ng
M
P
N
Số
đặc
trưn
g
M
P
N
Số
đặc
trư
ng
M
P
N
Số
đặc

trưn
g
M
P
N
Số
đặc
trưn
g
M
P
N
Số
đặc
trư
ng
M
P
N
000
001
010
011
020
100
101
110
111
120
121

200
201
210
211
212
220
221
222
0,0
0,5
0,5
0,9
0,9
0,6
1,2
1,3
2,0
2,0
3,0
2,5
5
6
13
20
25
70
11
0
000
001

010
011
020
100
101
102
110
111
120
121
130
200
201
202
210
211
212
220
0
0,3
0,3
0,6
0,6
0,4
0,7
1,1
0,7
1,1
1,1
1,5

1,6
0,9
1,4
2,0
1,5
2
3
2
221
222
223
230
231
232
300
301
302
310
311
312
313
320
321
322
323
330
331
332
333
3

3,5
4
3
3,5
4
2,5
4,0
6,5
4,5
7,5
11
16
9,5
15
20
30
25
45
110
140
000
001
002
010
011
012
020
021
030
100

101
102
103
110
111
112
120
121
122
130
131
140
0,0
0,2
0,4
0,2
0,4
0,6
0,4
0,6
0,6
0,2
0,4
0,6
0,8
0,4
0,6
0,8
0,6
0,8

1,0
0,8
1,0
1,1
203
210
211
212
220
221
222
230
231
240
300
301
302
310
311
312
313
320
321
322
330
331
1,2
0,7
0,9
1,2

0,9
1,2
1,4
1,2
1,4
1,4
0,8
1,1
1,4
1,1
1,4
1,7
2,0
1,4
1,7
2,0
1,7
2,0
400
401
402
403
410
411
412
420
421
422
430
431

432
440
441
450
451
500
501
502
503
504
1,3
1,7
2,0
2,5
1,7
2,0
2,5
2,0
2,5
3,0
2,5
3,0
4,0
3,5
4,0
4,0
5,0
2,5
3,0
4,0

6,0
7,5
513
520
521
522
523
524
525
530
531
532
533
534
535
540
541
542
543
544
545
550
551
552
8,5
5,0
7,0
9,5
12
15

17
8,0
11
14
17
20
25
13
17
25
30
35
45
25
35
60
9/11/2008 BM CNLM, HBKHN 19
Tính kết quả pp MPN
Lợng tế bào sống có trong 1g (1 ml) mẫu ban đầu đợc tính
theo công thức sau :
nhất thấp loãng pha dộ trị Giá
MPN sốChỉ
N =
Chơng II
9/11/2008 BM CNLM, HBKHN 20
V
í dụ cách tính
01133Số ống dơng tính
33333Số ống đã cấy cho mỗi độ pha loãng
10

-5
10
-4
10
-3
10
-2
10
-1
Độ pha loãng mẫu phân tích
Xácđịnhsốlợng tế bào trong một sản phẩm rắn và kết quả :
Nh vậy số đặc trng là 311 với độ pha loãng thấp nhất 10
-2
Tra bảng số đặc trng 311 tơng ứng với chỉ số MPN là 7,5
Vậy số lợng tế bào sống có chứa trong 1 g mẫu ban đầu :
750
10
5,7
2
===

nhấtthấp loãngpha dộ trị Giá
MPNsố Chỉ
N(tb/g)
9/11/2008 BM CNLM, HBKHN 21
V
í dụ cách tính
Từ bảng tra đợc P = 0,95 là 2 và 28
Vậy số lợng tế bào sống có chứa trong 1 g mẫu ban đầu sẽ
nằm trong khoảng 200 và 2800 vi tin cy95%

Từ bảng tra đợc P = 0,99 là 2 và 37
Vậy số lợng tế bào sống có chứa trong 1 g mẫu ban đầu sẽ
nằm trong khoảng 200 và 3700 vi tin cy99 %
Để xác định giới hạn tin cậy, cần tra bảng.
Trong ví dụ trên, số lợng ống nghiệm cấy lặp lại là 3, hệ số
pha loãng cao nhất cho chỉ số MPN 311 là 10
-2
.
9/11/2008 BM CNLM, ĐHBKHN 22
B¶ng Mac Grady 2
>110
333
8,00,56,30,82,1
220
6402048030110
332
7,70,56,10,82,0
211
320102402050
331
6,50,35,00,51,5
210
190<101401020
330
6,20,34,80,51,4
201
998801229
323
5,00,13,80,20,9
200

82564821
322
5,20,44,20,61,6
130
65351515
321
5,10,44,10,61,5
121
5223939
320
4,40,23,50,41,1
120
45235412
312
4,30,23,4
0,41,1
111
3722827,5
311
3,60,12,80,20,7
110
2912124
310
3,50,12,70,20,7
101
2912326
302
2,8<0,12,10,10,4
100
2311814

301
2,90,12,30,20,6
020
17,70,412,90,72,3
300
2,3<0,11,7<0,10,3
010
9,70,87,81,22,9
230
2,3<0,11,7<0,10,3
001
9,30,77,51,12,8
221
<0,3
000
99%95 %99%95%
Dé tin cËy
MPN
Sè
®Æc
tr−ng
Dé tin cËy
MPN
Sè ®Æc
tr−ng
9/11/2008 BM CNLM, HBKHN 23
Phõn tớch vi sinh vtth
ự
cph
ẩ

m
Chơng II : Kiểm định vi sinh vật thực phẩm
II.1. Chuẩn bị mẫu phân tích vi sinh : Cách
lấy mẫu, vận chuyển, bảo quản mẫu và
chuẩn bị mẫu phân tích
II.2 Các phơng pháp định lợng vi sinh vật
II.3 Phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật
9/11/2008 BM CNLM, HBKHN 24
1. ịnh lợng tổng số vi sinh vật
Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí, a ấm có trong SPTP để
đánh giá mức độ nhiễm tạp, tinh trạng vệ sinh, điều kiệnboqun
và dựđoán kh nng h hỏng của nphẩm
1. Nguyên tắc:
- Nuôi cấy môi trờng thạch dinh dỡng, 301
0
C, hiếu khí, 4872 giờ
- ếm tất c số khuẩn lạc mọc trên đó ẻ số lợng tế bào sống có trong
mẫu phân tích.
Tổng số VSV = VSV tồntại và phát triển đợctrênmôi trờng
dinh dỡng chung, ở 30
0
C, 24 - 72 giờ.
Chơng II
Phơng pháp chuẩn : kỹ thuật mkhunlc
9/11/2008 BM CNLM, ĐHBKHN 25
Quy trinh ph©n tÝch VSV tổng số
Chuẩnbị và pha lo∙ng mẫu
Nu«i cÊy trªn / trong m«i tr−êng th¹ch
(30
o

C, 24-72 h).
Quan s¸t vµ ®ếmkhuẩnlạc
.v).f0,1n + (n
C
121
∑
N (khuÈn l¹c/g, ml) =
VSV tổng số
TGA (Trypton Glucoza Agar)
Trypton(pepton) 5 g;
 Glucoza 4 g;
 Cao nÊm men 2,5 g;
 Th¹ch 15 g;
Số KL : 30-300
$
1 lit