phân loại vi sinh vật bằng sinh học phân tử (tt) ppsx
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (204.01 KB, 10 trang )
2.2. Lai ADN
· Đánh dấu gián tiếp:
Đánh dấu gián tiếp được thực
hiện theo 3 bước: thực hiện phép
lai giữa mẫu dò và mẫu ADN đích,
phản ứng giữa nhóm chức năng và
protein bám đặc hiệu với nhóm
chức tín hiệu thông báo (reporter)
và cuối cùng là tạo ra tín hiệu từ
nhóm chức tín hiệu.
Bảng 1.5. Liệt kê một số hệ thống
đánh dấu gián tiếp.
Nhóm chức năng bám
protein
Nhóm tín
hiệu
(reporter)
Tài li
d
Biotin-dUTP/steptavidin
Digoxigenein-
dUTP/antidigoxigenein
Sulphone/antisulphone
Alkaline
phosphatase
Alkaline
phosphatase
Leary et
al (1982)
Kessler
et al
Dinitrophenyl/antinitrophenyl
Poly(dA)/poly(dT)
Acetyllaminofluorene/anti-
acetylaminofluorene
Europium
chelate
Piruvate
kinase
Horseradish
peroxidase
Alkaline
phosphatase
(1990)
Syvanen
e
(1986)
Leller et
al (1990)
Morrisey
&
Collins
(1989)
Tchen et
al (1984)
Mặc dù có nhiều hệ thống đánh
dấu và phát hiện tín hiệu nhưng
kinh nghiệm cho thấy hệ thống
biotin và digoxidenin cho độ nhạy
cao hơn cả. Hai hệ thống này có thể
phát hiện tới mức dưới picrogam
acid nucleic. Trong trường hợp với
biotin thì đôi khi có mức độ nhiễu
nền cao do biotin có mặt trong các
sinh phẩm, còn đối với
digoxigenein thì có thể không gặp
khó khăn này.
+ Đánh dấu phóng xạ và ghi
phóng xạ:
Phương pháp đánh dấu phóng
xạ là phương pháp được dùng phổ
biến trong các phòng thí nghiệm lai
ADN với các thành phần đánh dấu
là
32
P và
35
S. Kết quả của phép lai
giữa mẫu dò và ADN đích được
phát hiện trên X-phim hoặc nhấp
nháy lỏng. Ưu điểm nổi bật của
phương pháp đánh dấu phóng xạ là
độ nhạy có thể đạt tới dưới mức
picrogam ADN đích. Hạn chế của
phương pháp này là không đạt
được sự thích hợp cần thiết cho các
thí nghiệm chẩn đoán liên quan tới
xác định mẫu vi sinh vật, ví dụ thời
gian bán huỷ mẫu dò ngắn, nguy
hiểm cho người sử dụng và cần yêu
cầu an toàn nghiêm ngặt cho phòng
thí nghiệm và cá nhân sử dụng
cũng như việc quản lý chất thải.
Xuất phát từ thực tế trên mà
càng ngày người ta càng quan tâm
đến các phương pháp đánh dấu phi
phóng xạ. Mục tiêu là đạt được một
hệ thống đánh dấu có độ nhạy
tương đương với phương pháp
dùng chất phóng xạ. Bảng dưới đây
liệt kê các yêu cầu lý tưởng cho
phương pháp đánh dấu mẫu dò:
1, Dễ gắn với acid nucleic
theo phương pháp đơn giản và có
độ lặp lại cao.
2, Bền trong điều kiện lai và
bảo quản.
3, Không bị ảnh hưởng và
làm ảnh hưởng đến phản ứng lai.
4, Có thể thực hiện với điều
kiện phản ứng lai trong dịch thể
(liquid phase) hay có chất mang
(solid phase).
5, Phương pháp phát hiện
nhạy và đơn giản.
6, Dễ bị loại bỏ sau phản ứng
lai.
7, Dễ phân biệt giữa mẫu lai
và mẫu chưa lai trong cùng điều
kiện.
8, Có thể ứng dụng với hệ
thống tự động hoá.
Tuy nhiên, nếu theo các yêu
cầu lý tưởng trên thì chưa có hệ
thống đánh dấu phi phóng xạ nào
thoả mãn.
Hiện nay, có nhiều hệ thống
đánh dấu phi phóng xạ đạt độ nhạy
cao và đó là lý do các phương pháp
này đang được ứng dụng rộng rãi
đặc biệt là phương pháp dựa trên
các enzym như Alkaline
phosphatase, Horseradisk
peroxidase. Tuy nhiên phương
pháp sử dụng các chất phóng xạ
hiện tại vẫn đang được dùng cho
một số phòng thí nghiệm đặc biệt.
· Chiến lược đánh dấu với
chất phi phóng xạ.
Có 3 phương pháp đánh dấu
phi phóng xạ:
1, Dùng cơ chất hoá phát xạ
và sinh phát xạ, trong trường hợp
này thì cả cơ chất hoá và sinh phát
quang đều tạo ra các bức xạ ánh
sáng và sau đó là phương pháp phát
hiện bức xạ này.
* Với nguồn cơ chất hoá phát
quang có loại như AMPPD
(Bronstein, Edward & Voyta, 1989)
có thể được dùng trực tiếp như là
cơ chất cho enzym Alkaline
phosphatase trong phép lai ADN
đạt độ nhạy cao trong thời gian
ngắn (Bronstein et al., 1990).
* Phương pháp phát xạ sử
dụng enzym Alkaline phosphatase
trên cơ sở giải phóng D-luciferin từ
cơ chất, ví dụ D-luciferin-O-
phosphate (Miska và Geiger.,
1987). Hai phương pháp này tương
đối nhạy và đang được sử dụng
rộng rãi.
Vietsciences- Dương Văn Hợp,
Nguyễn Lân Dũng
