Thí nghiệm công nghệ protein và enzyme báo cáo thí nghiệm công nghệ protein và enzyme

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (26.25 MB, 88 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNGKHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

THÍ NGHIỆM CƠNG NGHỆ PROTEIN VÀ ENZYMEBÁO CÁO THÍ NGHIỆM CƠNG NGHỆ

PROTEIN VÀ ENZYME

Người hướng dẫn: TS NGUYỄN THỊ CẨM VI

Người thực hiện:

NGUYỄN ĐỖ HOÀNG DUNG – 62000967HUỲNH VÕ TRƯỜNG GIANG – 62000973VÕ ĐÔNG HẢI - 62000980

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2023

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TƠN ĐỨC THẮNGKHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

THÍ NGHIỆM CƠNG NGHỆ PROTEIN VÀ ENZYMEBÁO CÁO THÍ NGHIỆM CƠNG NGHỆ

PROTEIN VÀ ENZYME

Người hướng dẫn: TS NGUYỄN THỊ CẨM VI

Người thực hiện:

NGUYỄN ĐỖ HOÀNG DUNG – 62000967HUỲNH VÕ TRƯỜNG GIANG – 62000973VÕ ĐƠNG HẢI - 62000980

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2023

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

1.2.1. Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm protein casein và whey protein từ sữa bị tươi...4

1.2.2. Thuyết minh quy trình...4

1.2.2.1. Quy trình cơng nghệ sản xuất chế phẩm protein casein từ sữa bò tươi

1.3.1.1. Xây dựng đường chuẩn Bradford...12

1.3.1.2. Xác định hàm lượng whey protein trong mẫu...14

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

1.3.2. Xác định hàm lượng protein trong chế phẩm casein bằng phương pháp

Kjehdahl... 15

1.3.2.1. Vơ cơ hóa...15

1.3.2.2. Cất đạm...16

1.3.2.3. Tính hệ số hiệu chuẩn F của dung dịch NaOH...17

1.3.2.4. Xác định hàm lượng N trong mẫu...18

1.3.2.5. Hàm lượng protein tổng có trong mẫu chế phẩm casein...18

BÀI 2. THU NHẬN VÀ TINH SẠCH ENZYME UREASE TỪ ĐẬU NÀNH .19 2.1. Tổng quan...19

2.1.1. Giới thiệu về enzyme urease...19

2.1.2. Hóa chất – Dụng cụ thí nghiệm...20

2.2. Sơ đồ quy trình cơng nghệ...22

2.2.1. Trích ly enzyme urease thô...22

2.2.2. Kết tủa enzyme urease...25

2.3. Kết quả – Bàn luận...28

2.3.1. Phương pháp Nessler...28

2.3.1.2. Xây dựng đường chuẩn theo phương pháp Nessler...28

2.3.1.3. Kết quả...29

2.3.1.4. Dựng đường chuẩn trên máy tính được...30

2.3.2. Hoạt tính của Urease...31

2.3.2.1. Kết quả...32

2.3.3. Cân muối (NH4)2SO4 để bảo hòa...34

2.3.3.1. (NH4) SO24 20% bão hòa với 50 mL dịch Urease thô...34

2.3.3.2. (NH4) SO24 55% bão hịa với 52 mL dịch Urease thơ...34

2.3.4. Hoạt tính urease...35

BÀI 3. THU NHẬN VÀ TINH SẠCH ENZYME BROMELAIN TỪ DỨA...37

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

3.1. Tổng quan...37

3.1.1. Bromelain có trong dứa là gì ?...37

3.1.2. Xác định hoạt tính protease theo phương pháp anson...37

3.2. Sơ đồ quy trình cơng nghệ...38

3.2.1. Quy trình tổng...38

3.2.2. Thuyết minh quy trình thu nhận enzyme bromelain...39

3.2.2.1. Kết tủa bằng ethanol 96o...42

3.2.2.2. Kết tủa bằng muối sulfate amon 70%...44

3.2.3. Tinh sạch protein bằng sắc ký rây phân tử...47

3.3. Kết quả – Bàn luận...50

3.3.1. Dịch dứa thô...50

3.3.1.1. Xác định hàm lượng protein theo Bradford...50

3.3.1.2. Xác định hoạt tính protease theo Anson...51

3.3.1.3. Xác định hoạt tính enzyme trong dịch dứa thô...52

3.3.2. Tủa enzyme bằng (NH4)2SO4 70%...53

3.3.2.1. Xác định hàm lượng protein theo Bradford...53

3.3.2.2. Xác định hoạt tính protease theo Anson...54

3.3.3. Tủa enzyme bằng ethanol...55

3.3.3.1. Xác định hàm lượng protein theo Bradford...55

3.3.3.2. Xác định hoạt tính protease theo Anson...55

3.3.4. Độ tinh sạch enzyme...56

3.3.4.1. Tủa enzyme bằng (NH4)2SO4 70%...56

3.3.4.2. Tủa enzyme bằng ethanol...56

3.3.5. Hiệu suất thu hồi enzyme...57

3.3.6. Kết quả chạy sắc ký...57

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

BÀI 4. THU NHẬN VÀ TINH SẠCH ENZYME INVERTASE TỪ NẤM MEN

4.3.1. Xây dựng đường chuẩn DNS...62

4.3.2. Ảnh hưởng của yếu tố pH đến hoạt tính enzyme invertase...64

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Casein...1

Hình 1.2. Sơ đồ quy trình cơng nghệ sản xuất chế phẩm protein casein và whey protein từ sữa bò tươi...4

Hình 1.3. 100 ml sữa bị tươi...5

Hình 1.4. Gia nhiệt...5

Hình 1.5. Điều chỉnh pH...5

Hình 1.6. Ly tâm 7 phút...6

Hình 1.7. Cân khối lượng sữa + falcon...6

Hình 1.8. Đổ sữa ra falcon đã label...6

Hình 1.9. Lưu trữ trong tủ mát...7

Hình 1.10. Cho whey ra falcon khác...7

Hình 1.11. Sau ly tâm...7

Hình 1.12. Rửa tủa bằng nước...8

Hình 1.13. Rửa tủa bằng ether ethylic...9

Hình 1.14. Rửa tủa bằng ethanol 96%...9

Hình 1.15. Khối lượng sau khi sấy...10

Hình 1.16. Casein trước khi sấy...10

Hình 1.17. Đem sấy...10

Hình 1.18. Dùng đũa làm nhuyễn casein...10

Hình 1.19. Lấy lactose serum ra khỏi tủ lạnh...11

Hình 1.20. Pha lỗng 50 lần...11

Hình 1.21. Dựng đường chuẩn...12

Hình 1.22. Thuốc thử Bradford...12

Hình 1.23. Phương trình đường chuẩn Bradford...13

Hình 1.24. OD của whey protein...14

Hình 1.25. Hệ thống Kjeldahl...15

Hình 1.26. Hệ thống cất đạm...16

Hình 1.27. Chuẩn độ...17

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

Hình 2.1. Sơ đồ quy trình cơng nghệ Trích ly enzyme urease thơ...22

Hình 2.2. Bột đậu nành xay để khơ...22

Hình 3.13. Kết tủa bằng muối sulfate amon 70%...45

Hình 3.14. Ly tâm thu tủa...46

Hình 3.15. Thẩm tích...46

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Quy trình cơng nghệ sản xuất chế phẩm protein casein từ sữa bò tươi...4

Bảng 1.2. Quy trình cơng nghệ sản xuất chế phẩm lactose serum...11

Bảng 1.3. OD của đường chuẩn Bradford...13

Bảng 1.4. Kết quả OD của whey protein...14

Bảng 2.1. Các đặc tính enzyme urease...19

Bảng 2.2. Thuyết minh quy trình cơng nghệ...22

Bảng 2.3. Thuyết minh quy trình cơng nghệ tạo kết tủa urease...25

Bảng 2.4. Dựng đường chuẩn theo phương pháp Nessler...28

Bảng 2.5. Kết quả đo OD...29

Bảng 2.6. Hoạt tính của Urease...31

Bảng 3.1. Sơ đồ quy trình cơng nghệ...39

Bảng 3.2. Kết tủa bằng ethanol 96o...42

Bảng 3. 3. Kết tủa bằng muối sulfate amon 70%...45

Bảng 3.4. Tinh sạch protein bằng sắc ký rây phân tử...47

Bảng 3.5. Mẫu thật...57

Bảng 3.6. Mẫu trắng...58

Bảng 5.1. Thuyết minh các bước thực hiện...68

Bảng 5.2. Kết quả đo OD Mẫu...71

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

NỘI DUNG

BÀI 1. THU NHẬN CHẾ PHẨM CASEIN VÀ WHEY PROTEIN TỪ SỮA BÒ1.1. Tổng quan

1.1.1. Giới thiệu về casein trong sữa

Sữa có chứa hàng trăm loại protein nhưng hầu hết trong số này chỉ chiếm một lượng rất nhỏ. Protein có thể được phân loại theo nhiều cách dựa vào tính chất hóa học hay vật lý, và chức năng sinh học của chúng. Thông thường, người ta phân loại protein sữa thành casein (khơng hịa tan) , whey protein (hịa tan) và các protein thiểu số.

Trong sữa bò casein chiếm gần 80% tổng số protein (khoảng 26 g trong 1 lít sữa). Casein được chia làm bốn nhóm phụ: α , α , β và κ-casein. Cả bốn nhóm nàys1s2

đều có cấu trúc khơng đồng nhất.

Hình 1.1. Casein

Điểm chung giữa casein α và β là các amino acid được este hóa bởi phosphoric acid. Acid phosphoric này liên kết với calci (có chứa nhiều trong sữa) để hình thành các

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

liên kết nội phân tử và ngoại phân tử. Điều này khiến casein dễ dàng tạo chuỗi polymer có chứa một vài loại casein giống hay khác nhau.

Do có nhiều nhóm phosphate và những nhóm kỵ nước trong phân tử casein, các phân tử polymer được hình thành từ casein rất đặc biệt và bền. Những phân tử này được cấu tạo từ hàng trăm và hàng nghìn những phân tử đơn lẻ và hình thành nên dung dịch keo, tạo nên màu trắng của sữa. Những phức chất này được gọi là các micelle casein.

1.1.2. Các dạng chế phẩm protein1.1.2.1. Protein concentrate

Protein concentrate là một loại chế phẩm protein có hàm lượng protein tối thiểu là 65%. Chế phẩm chứa nhiều chất xơ, giàu protein và amino acid được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như là thực phẩm chức năng, bổ sung trong các lọai ngũ cốc, bánh ngọt, sản phẩm ăn chay, thức ăn gia súc làm gia tăng giá trị dinh dưỡng của sản phẩm.

Protein concentrate có nhiều dạng: hạt, sệt, hoặc bột mịn.

1.1.2.2. Protein Isolate

Giống chế phẩm trên nhưng chứa hàm lượng protein thực vật rất cao 90%. Nó chứa hầu hết các amino acid cần thiết cho sự phát triển mặt khác nó chứa lượng chất béo rất thấp, giúp ngăn ngừa chứng loãng xương, ung thư, các triệu chứng thời kì mãn kinh.

So sánh giữa casein và whey protein trong sữa.

Casein và whey là hai loại protein có trong sữa bò, chiếm lần lượt 80% và 20% protein từ sữa. Cả hai đều là protein chất lượng cao, vì có chứa tất cả các axit amin thiết yếu, mà cơ thể khơng thể tự sản xuất. Ngồi ra, hai loại protein này còn được cho là dễ tiêu hóa và hấp thu trong hệ tiêu hóa của cơ thể người.

Ngoài ra, cả casein và whey đều là sản phẩm phụ của sản xuất phô mai.

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

Trong q trình làm phơ mai, các enzyme hoặc axit đặc biệt được thêm vào sữa nóng. Các enzyme hoặc axit này làm cho casein trong sữa đông lại, hoặc chuyển sang trạng thái rắn, tách ra khỏi chất lỏng.

Chất lỏng này là protein whey, sau đó được rửa và sấy khô thành dạng bột để sử dụng trong các sản phẩm thực phẩm hoặc thực phẩm bổ sung. Phần sữa đơng casein có thể được rửa và sấy khô để tạo ra bột protein hoặc thêm vào các sản phẩm sữa, chẳng hạn như phơ mai.

1.1.3. Dụng cụ - Hóa chất

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

1.2. Sơ đồ quy trình cơng nghệ sản xuất chế phẩm protein casein và whey proteintừ sữa bò tươi

1.2.1. Sơ đồ quy trình cơng nghệ sản xuất chế phẩm protein casein và whey protein từ sữa bị tươi

Hình 1.2. Sơ đồ quy trình cơng nghệ sản xuất chế phẩm protein casein và whey

protein từ sữa bò tươi

1.2.2. Thuyết minh quy trình

1.2.2.1. Quy trình cơng nghệ sản xuất chế phẩm protein casein từ sữa bị tươi Bảng 1.1. Quy trình cơng nghệ sản xuất chế phẩm protein casein từ sữa bò tươi

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

Các bước thực hiệnHình ảnh

Bước 1. Chuẩn bị nguyên liệu

- Lấy 100 ml sữa bò tươi cho vào becher đã label và bọc màng bọc thực phẩm.

Hình 1.3. 100 ml sữa bò tươi

Bước 2. Gia nhiệt

- Gia nhiệt đến 40 C trong bể o

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

Bước 4. Ly tâm

- Đổ sữa đã chỉnh pH vào 2 ống falcon, điều chỉnh cho khối lượng bằng nhau. - Cho vào máy ly tâm. - Ly tâm 6000 rpm trong 7 phút.

Lưu ý: Label falcon cả ống và nắp, sau đó đi cân trước đi cho sữa vào để biết khối lượng falcon ban đầu.

Hình 1.8. Đổ sữa ra falcon đã label

Hình 1.7. Cân khối lượng sữa + falcon

Hình 1.6. Ly tâm 7 phút

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

Bước 5. Thu dịch whey

- Sau khi ly tâm xong, đổ dịch whey (phần lỏng bên trên) vào 2 falcon mới đã rửa sạch và label.

- Đem cất 2 falcon chứa dịch whey vào tủ lạnh ngăn mát.

Hình 1.9. Lưu trữ trong tủ mát

</div>Trang 18<div class="page_container" data-page="18">

Bước 6. Rửa tủa

- Đem phần casein kết tủa bên dưới falcon đi rửa tủa. - Rửa lần lượt với nước, ethanol 95% và ether ethylic.

+ Rửa lần 1 với nước: cho nước vào falcon và đem đi ly tâm 6000 rpm – 7 phút.

+ Rửa lần 2 với ethanol 96%: làm tương tự như rửa với nước.

+ Rửa lần 3 với ether ethylic: làm tương tự như rửa với nước.

Lưu ý: Sau mỗi lần ly tâm đều đổ bỏ phần lỏng bên trên rồi mới cho chất rửa tủa mới vào.

Hình 1.12. Rửa tủa bằng nước

</div>Trang 19<div class="page_container" data-page="19">

Hình 1.14. Rửa tủa bằng ethanol 96%

Hình 1.13. Rửa tủa bằng ether ethylic

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

Bước 7. Sấy khô

- Đổ phần casein đã kết tủa sau 3 lần rửa tủa ra đĩa petri. - Dùng đũa thủy tinh làm nhuyễn casein.

- Đem cân lấy khối lượng trước sấy.

- Đưa đĩa petri chứa casein vào tủ sấy vào sấy ở nhiệt độ 50oC trong 4 tiếng.

- Sau 4 tiếng, đem ra cân lấy khối lượng sau sấy.

Hình 1.18. Dùng đũa làm nhuyễn casein

Hình 1.16. Casein trước khi sấy

Hình 1.17. Đem sấy

Hình 1.15. Khối lượng sau khi sấy

</div>Trang 21<div class="page_container" data-page="21">

1.2.2.2. Quy trình cơng nghệ sản xuất chế phẩm lactose serumBảng 1.2. Quy trình cơng nghệ sản xuất chế phẩm lactose serum

Hình 1.19. Lấy lactose serum ra khỏi tủ lạnh

Bước 2. Pha loãng 50 lần

- Hút 2 ml whey cho vào bình định mức.

- Định mức lên 100 ml bằng nước cất.

Hình 1.20. Pha loãng 50 lần

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

Bước 3. Dựng đường chuẩn

theo phương pháp Bradford

Hình 1.21. Dựng đường chuẩn

1.3. Kết quả – Bàn luận

1.3.1. Xác định hàm lượng protein trong chế phẩm whey protein bằng phươngpháp Bradford.

1.3.1.1. Xây dựng đường chuẩn Bradford.

Sử dụng dung dịch protein chuẩn là albumin tinh khiết đã biết trước nồng độ và thuốc thử Bradford, đo mật độ quang ở bước sóng 595 nm.

Hình 1.22. Thuốc thử Bradford

</div>Trang 23<div class="page_container" data-page="23">

Bảng 1.3. OD của đường chuẩn Bradford

Hình 1.23. Phương trình đường chuẩn Bradford

</div>Trang 24<div class="page_container" data-page="24">

1.3.1.2. Xác định hàm lượng whey protein trong mẫu.

Hút 0.1 mL dung dịch mẫu whey protein sau khi pha lỗng 50 lần trong bình định mức vào ống nghiệm, thêm nước cất để được 1 mL. Sau đó thêm 5 mL thuốc thử Bradford, lắc đều, để ổn định 15 phút. Đo mật độ quang của mẫu thí nghiệm. Làm tương tự với 3 mẫu và tính giá trị trung bình.

Hình 1.24. OD của whey protein

Bảng 1.4. Kết quả OD của whey protein

Mật độ quang

- Giá trị OD trung bình của mẫu: 0.6326

-Giá trị ∆OD trung bình của mẫu: ∆OD = OD - 0.6326 = 0.05360

</div>Trang 25<div class="page_container" data-page="25">

Hàm lượng protein tổng:

𝑃𝑡 = 𝑃 × 𝑉 = 7.83 × 72 = 563.76 (𝑚𝑔)

Hiệu suất thu hồi:

- Hàm lượng protein có trong 100 mL sữa tươi lý thuyết: 3,1g

- Hàm lượng whey có trong 100 mL sữa tươi lý thuyết: 3,1 x 20% x 1000 = 620 mg Hiệu suất thu hồi: 𝐻 = 𝑃𝑡 𝑡ℎự𝑐 𝑡ế

× 100% = 563.76 × 100% = 90.9%

Kết luận: chế phẩm whey protein thu được thuộc loại isolate.

1.3.2. Xác định hàm lượng protein trong chế phẩm casein bằng phương phápKjehdahl.

1.3.2.1. Vơ cơ hóa.

Hình 1.25. Hệ thống Kjeldahl

- Cho mẫu vào bình Kjeldahl: cân 0.3g mẫu. Thêm 10 mL H2SO4 đđ và 0,5 g xúc tác. - Đặt bình Kjeldahl vào máy vơ cơ hóa, sau khoảng 2 giờ 30 phút gia nhiệt và 30 phút làm nguội, đem mẫu vào hệ thống cất đạm.

</div>Trang 26<div class="page_container" data-page="26">

- Lắp bình chứa dung dịch đã vơ cơ hoá vào hệ thống cất đạm. Kiểm tra lượng NaOH trong bình, mở sinh hàn nước, khởi động quá trình cất đạm. Quá trình cất đạm kết thúc sau khoảng 15 phút.

Hình 1.26. Hệ thống cất đạm

- Tráng vịi bằng nước cất và lấy erlen chứa H2SO4 0,1 N thừa ra, thay vào một erlen trống. Bật chế độ rửa hệ thống.

- Định phân lượng H2SO4 0,1N thừa bằng dung dịch chuẩn NaOH 0,1 N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt.

</div>Trang 27<div class="page_container" data-page="27">

Hình 1.27. Chuẩn độ

- Thực hiện tương tự với mẫu trắng thay H2SO4 bằng nước cất vào erlen và thay bình Kjeldahl trống, chuẩn độ bằng NaOH 0,1 N để trừ hao tính acid của nước cất ở phịng thí nghiệm.

Kết quả thu được: - Mẫu trắng: 0.2 mL NaOH - Mẫu cất đạm: 10.1 mL NaOH

1.3.2.3. Tính hệ số hiệu chuẩn F của dung dịch NaOH.

- Dung dịch NaOH nếu để một thời gian dài tiếp xúc với khơng khí sẽ hấp thụ CO2, tạo thành Na2CO3, làm giảm đi nồng độ của NaOH nên cần phải tính hệ số hiệu chuẩn.

- Lấy 10 mL H2SO4 0,1 N chuẩn cho vào erlen, định phân bằng NaOH 0,1 N. Thực hiện ba lần và tính giá trị trung bình.

- Tính nồng độ thực tế của dung dịch NaOH đem định phân. - F là tỉ số giữa nồng độ thực tế và nồng độ lý thuyết của NaOH. Kết quả: Cả ba lần đều tốn 10,4 mL dung dịch NaOH 0,1 N.

𝐶𝑁𝑎𝑂𝐻𝑡𝑡 =10 × 0.1 = 0.096 𝑁 10.4

</div>Trang 28<div class="page_container" data-page="28">

1.3.2.4. Xác định hàm lượng N trong mẫu.

Hàm lượng N trong mẫu được tính theo cơng thức:

b: số mL NaOH 0,1 N tiêu tốn khi chuẩn độ H2SO4 thừa m: số gram mẫu đem vơ cơ hố

0,0014: lượng gram nitơ ứng với 1 mL H2SO4 0,1 N

</div>Trang 29<div class="page_container" data-page="29">

BÀI 2. THU NHẬN VÀ TINH SẠCH ENZYME UREASE TỪ ĐẬU NÀNH2.1. Tổng quan

2.1.1. Giới thiệu về enzyme urease

Urease là enzyme thuộc nhóm enzyme thuỷ phân (hydrolase), phân nhóm amidase. Urease có số hiệu phân loại quốc tế là EC 3.5.1.5. Tên hệ thống là: Carbamate amide hydrolase. Trong đó: số 3 chỉ nhóm chính – hydrolase, số 5 chỉ nhóm phụ enzyme tác dụng lên liên kết C - N khác liên kết peptide, số 1 chỉ phân nhóm phụ cắt các amide thẳng (amide hyrolase), số 5 chỉ số thứ tự của urease trong phân nhóm phụ.

Bảng 2.1. Các đặc tính enzyme urease

Trong tự nhiên có hơn 200 lồi vi khuẩn có khả năng tổng hợp enzyme urease như

H. pylori, Klebsiella aerogenses, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica, Bacilluspasterurii, Escherchia coli…. Enzyme urease cũng có ở dịch tiêu hố của các động vật

như trâu, bị, dê, chó.

Enzyme urease cịn có nhiều trong các cây bậc cao, đặc biệt là các cây thuộc họ đậu như đậu rựa (Canavalia ensiformis, jack bean), đậu nành (Glycine hispida)…

</div>Trang 30<div class="page_container" data-page="30">

Urease xúc tác cho phản ứng thuỷ phân urea, tạo thành khí carbonic và amoniac theo phương trình sau:

Lợi dụng tính chất đặc hiệu của urease, người ta ứng dụng urease trong việc nhận biết sự có mặt của ure trong thực phẩm, nước giải khát lên men và trong sữa.

2.1.2. Hóa chất – Dụng cụ thí nghiệm

</div>Trang 31<div class="page_container" data-page="31">

Ghi chú:

- Dung dịch NH Cl chứa 10 μg NH3/mL: cân 78,7 mg NH Cl định mức đến 50 ml 44

bằng nước cất, sau đó lấy 2ml dung dịch này định mức lên 100ml. - Cách pha thuốc thử Nessler:

KI: 35 g pha trong 100 ml nước cất. HgCl2: 17 g pha trong 300 ml nước cất.

Dung dịch NaOH 20%: 200g pha trong 1000 ml nước cất.

Cho KI vào bình định mức 1000 ml, đổ từ từ HgCl vào đến khi kết tủa khơng2

tan hết thì dừng, dùng dung dịch NaOH 20% định mức đến 1000 ml, cho tiếp 1-2 ml giọt HgCl tạo kết tủa đỏ. Cho dung dịch vào một lọ màu tối, để dung dịch lắng trong2

qua đêm, rồi đem lọc qua bông thủy tinh, bảo quản trong lọ tối. - Đệm phosphate 1/15M pH 7:

11.866 g Na2HPO4.2H O định mức đến 1l bằng nước cất (A).2

9.1993 g NaH2PO .H O định mức đến 1l bằng nước cất (B).42

Trộn 305 ml A và 195 ml B, rồi định mức đến 1000 mL bằng nước cất.

</div>Trang 32<div class="page_container" data-page="32">

2.2. Sơ đồ quy trình cơng nghệ2.2.1. Trích ly enzyme urease thơ.

Hình 2.1. Sơ đồ quy trình cơng nghệ Trích ly enzyme urease thơ

Bảng 2.2. Thuyết minh quy trình công nghệ

Bước 1.

- Chuẩn bị bột đậu nành xay nhỏ, trích ly loại lipid bằng Ete dầu hỏa với tỉ lệ 1g bột: 2mL Ete, để khơ.

Hình 2.2. Bột đậu nành xay để khô

</div>Trang 33<div class="page_container" data-page="33">

- Sau 12 giờ trích ly, lấy mẫu ra và cho vào

</div>Trang 35<div class="page_container" data-page="35">

2.2.2. Kết tủa enzyme urease.

Hình 2.7. Sơ đồ quy trình kết tủa enzyme urease

Bảng 2.3. Thuyết minh quy trình cơng nghệ tạo kết tủa urease

Bước 1.

- Cân chính xác 5,7g (NH SO4)24 cho vào cốc chứa 50 mL dịch urease thô để tủa (NH SO4)24 20% bão hòa, để yên 30 phút ở nhiệt độ phòng. - Lưu ý cho muối vào từ từ và

khuấy nhẹ để làm tan muối vì Hình 2.8. Cân muối

</div>Trang 36<div class="page_container" data-page="36">

enzyme rất nhạy cảm với tác động mạnh.

- Bước này giúp kết tủa tạp chất còn được gọi là kết tủa âm.

Bước 2.

- Đem mẫu cho vào 2 falcon, cân bằng khối lượng sau đó ly tâm, thu dịch và bỏ tủa, thể tích dung dịch thu được lúc này là 52 mL vì có cho thêm lượng nhiệt độ phòng. Bước này

giúp kết tủa enzyme urease. Hình 2.10. Tủa mẫu bằng (NH4)2SO4 55%

</div>Trang 37<div class="page_container" data-page="37">

Bước 4.

- Cho mẫu và 2 falcon, cân bằng khối lượng và đem đi ly tâm. Sau khi ly tâm xong bỏ dịch và thu tủa urease.

Hình 2.11. Thu tủa ureaseBước 5.

- Hịa tan tủa: sử dụng một lượng nhỏ dung dịch đệm phosphate 1/15M pH 7 có chứa EDTA và Cystein để hòa tan tủa urease.

Bước 6.

- Thẩm tích: tủa sau khi được hịa tan thì cho vào túi cellophane. Cho túi vào cốc và cho thêm dung dịch đệm phosphate 1/15M pH 7 có chứa EDTA và Cystein vào cốc đến khi vượt qua mức nước trong túi. Để cốc vào tủ lạnh 4 C, thay đệm sau mỗi 1o

giờ và thực hiện thay 2 lần.

Hình 2.12. Thẩm tích

</div>Trang 38<div class="page_container" data-page="38">

Bước 7.

- Đo thể tích thu được sau thẩm tích là 5 mL, lấy 2 mL pha lỗng 50 lần và phân tích hàm lượng protein của mẫu.

Hình 2.13. Pha loãng

2.3. Kết quả – Bàn luận2.3.1. Phương pháp Nessler

2.3.1.2. Xây dựng đường chuẩn theo phương pháp Nessler

Lấy 6 ống nghiệm, đánh số từ 0 – 5. Cho vào mỗi ống thí nghiệm các dung dịch

Sau khi cho hết các dung dịch vào các ống nghiệm thì lần lượt lắc nhẹ cho đều và đợi 15 phút. Sau 15 phút sẽ đem đi đo mật độ quang tại bước sóng 490 nm.

</div>Trang 40<div class="page_container" data-page="40">

2.3.1.4. Dựng đường chuẩn trên máy tính được

Hình 2.14. Kết quả dựng đường chuẩn Nessler

Lưu ý : Với R > 992

Nên R2 = 0.9915 được chấp nhận với y = 0.0821x – 0.1078

</div>