LƯƠNG ĐỨC PHẨM

SẢN XUẤT VÀ SỬ DỤNG
CHÊ PHẨM SINH HỌC TRONG NỒNG NGHIỆP

NHÀ XUẤT BẢN GIÁO DỤC VIỆT NAM


Cõng ty cổ phần Sách Đại học - Dạy nghể, Nhà xuất bản Giáo dục Việt Nam giữ quyển công bố tác phẩm
1 9 6 - 2 0 1 1 /C X B /

4-140 /GD

M ã số: 7K884Y1-DAI


LỜI NĨI ĐẦU
Với mục đích làm tăng năng suất cây trổng, vật nuôi, tạo cho một nền
sản xuất nông nghiệp sạch và bền vững, các chế phẩm sinh học ngày càng
được quan tâm và đưa vào sử dụng trong trồng trọt, chăn nuôi và nuôi trồng
thủy sản. Nội dung của vấn đề này là sử dụng các vi sinh vật có ích hoặc
những hoạt chất sinh học do chúng tạo ra giúp cho các đối tượng nông
nghiệp nâng cao được khả năng đồng hóa và trao đổi chất, nâng cao tính để
kháng với bệnh tật, tạo ra những điều kiện sống của cây trổng và vật ni hài
hịa với thiên nhiên. Ngồi ra, có thể sử dụng các hợp chất hữu cơ tự nhiên
làm chế phẩm cân đối dinh dưỡng hoặc làm phân bón hữu cơ thân thiện với
mơi trường.
Quyển sách gồm hai phần: C á c c h ê p h ẩ m s ìn h h ọ c . d ù n g tro n g
trổ n g trọ t và C á c c h ế p h ẩ m s in h h ọ c d ù n g tro n g c h ă n n u ô i, n u ô i trồ n g
th ủ y sản.

Trên cơ sở là các bài giảng chuyên đề của các lớp cao học sinh học
cùng với 2 quyển sách của tác giả về một phẩn của vấn đề này được biên
soạn lại. Đối tượng của sách phục vụ cho những ai quan tâm đến việc sử
dụng các chế phẩm sinh học, đặc biệt là từ vi sinh vật, vào sản xuất nông
nghiệp. Sách cũng giúp cho sinh viên những năm cuối và học viên cao học
các trường cao đẳng Và đại học thuộc chuyên ngành Công nghệ sinh học,
Công nghệ thực phẩm, Công nghệ sau thu hoạch của các trường nơng
nghiệp cũng như kinh tế có liên quan.
Việc sử dụng các chế phẩm sinh học trong nông nghiệp hiện nay rất đa
dạng và phong phú nên sách chưa thể đáp ứng hết được nhu cầu của các
bạn đọc. Tác giả và Nhà xuất bản hoan nghênh các ý kiến đóng góp bổ sung
của bạn đọc. TVlọi ý kiến đóng góp xin gửi về Cơng ty c ổ phần sách Đại học
- Dạy nghề, Nhà xuất bản Giáo dục Việt Nam, 25 Hàn Thuyên, Hà Nội, ĐT
(043)8264974 .
Xin chân thành cảm ơn.
Tác giả
PGS. TS. Lương Đức Phẩm

3


Phần thứ nhâ't

CÁC CHẾ PHẨM SINH HỌC
DÙNG TRONG TRỒNG TRỌT
Chương 1

PHÂN BĨN VI SINH VẬT
Có lẽ th u ậ t ngữ "phân bón vi sinh vật" dùng ở đây chưa đúng vối ý nghĩa thực

của lĩnh vực này. Đ ây là các ch ế phẩm vi sinh v ật (gồm các tế bào sống có hoặc
khơng có c h ất m ang) dùng làm phân bón cho cây và làm tà n g độ phì của đ ấ t cũng
như cung cấp cho cây trồ n g các c h ất dinh dưỡng dễ tiêu hố kích thích sin h trưởng.
Việc th u hoạch sinh khối thực vật hàng năm lấy đi của đ ất nhiều nitơ. Q uá trìn h bổ
sung nitơ xảy ra trong tự nhiên quá chậm không đáp ứng được n h u cầu sản xuất ổn
định trong trường hợp th âm canh nông nghiệp. Sự thiếu h ụ t đó bấy lâu nay được bù đắp
bàng cách bón phân đạm loại phân hố học cho cây trồng. Việc làm này đã góp phần
tăng năng su ất cho cây trồng, song cũng để lại cho đ ất nhiều h ậu quả: đất bị chua dần,
độ rắn cơ lý tăng dần,... làm cho đất bạc m àu và điều nguy hiểm hơn là các chất dư thừa
của phân hố học tích tụ lại ở trong đất hoặc th ải vào nguồn nước làm cho đất, nước bị ô
nhiễm, ảnh hưỏng xâu tới hệ sinh thái và môi trường sơng.
Vi sinh v ật đóng vai trị quan trọng trong việc chuyến hoá v ậ t c h ất ở trong đ ất
và ảnh hưởng râ't lớn đến hấp th u dinh dưỡng ở thực vật. Các nhóm vi sin h v ật có vai
trị lớn trong vấn đề này là: các vi sinh v ậ t sông tự do tro n g đ ấ t và sông cộng sinh với
cây họ Đ ậu có k h ả n ăn g cơ" định đạm của khơng khí. C húng được chú ý đến râ"t sớm
và từ chúng được sản x u ấ t ra các chế phẩm làm p h â n bón để làm tă n g nguồn đạm
tiêu hố cho cây trồng. Ngồi ra, người ta cịn chú ý đến nhóm vi k h u ẩ n p h ân giải
hợp chất phospho hữ u cơ, vô cơ, nhóm vi nấm , nhóm vi sin h sơng hội sin h ở lá, ở biếu
bì thực vật, nhóm tảo lam , nhóm tảo sơng với bèo hoa d âu ,... đều có th ể dùng để sản
xuất phân bón vi sinh v ậ t hay là p h ân bón sinh học.
Các loại p h â n bón sinh học hiện nay được dùng tro n g trồ n g trọ t gồm các loại:
- P hân vi sinh cố đ ịnh Nọ (thương gọi là p h ân đạm sin h học) được sản x u ất từ
các vi k h u ẩ n nốt sần sống cộng sinh vói cây họ Đậu, các vi k h u ẩ n này sống tự do
trong đ ấ t và sông hội sinh với các loại cây trồng. Loại p h â n này có th ể kê cả bèo hoa
dâu, tảo lam (vi k h u ẩ n lam).
- P hân lân vi sinh được c h ế biên từ sinh khối của các loài vi sin h v ậ t (vi khuẩn,
xạ khuẩn, nấm sợi) sống ở trong đ ất hội sinh vối cây trồng, chủ yếu ở vùng rễ. Có h ai
loại phân lân vi sinh: p h â n giải các hợp c h ất phospho (P) h ữ u cơ và p h ân giải hợp
ch ất phospho vô cơ.
5



- P h ân vi sinh v ậ t biểu sinh được chế từ sinh khôi vi sin h v ật biểu sinh sống hội
sinh với cây trồng ỏ biểu bì th â n , lá.
1.1. PHÂN VI SINH CỐ ĐỊNH NITƠ PHÂN TỬ (N2) TỪ KHƠNG KHÍ (tên thường gọi:
phân vi sinh vật cố định đạm, phân đạm vi sinh hay phân đạm sinh học)
Nitơ trong tự n h iên tồn tạ i ở các
dạng khác nhau, từ dạng p h ân tử (N2)
trong khơng khí đến các dạng hợp ch ất
phức tạp (protein, ax it nucleic, kitin,...)
trong cơ th ể người và động, thực vật. Khi
cơ thể sinh v ật chết đi, các hợp c h ất hữu
cơ này vùi trong đ ấ t và được các vi sinh
v ật hoại sinh dị dưỡng p h â n huỷ, được
gọi là khống hố. Q trìn h khống hoá
các hợp ch ất h ữ u cơ, tro n g đó có các hợp
ch ất nitơ là vơ cùng quan trọng trong đời
sơng của tồn th ể sinh v ậ t trê n T rái Đ ất
Hình 1.1. Sơ đồ vịng tuẩn hồn nitơ
và đặc b iệt tro n g bảo vệ môi trường
trong tự nhiên
(phần này sẽ được đề cập tối ở chương 2).
Các k h âu của vịng tu ầ n hồn đều có sự th a m gia của vi sinh v ậ t (hình 1.1).
K hoáng hoá hợp c h ấ t chứa nitơ là một k h âu quan trọng của vòng tu ầ n hồn nitơ
trong tự nhiên (hình 1.1 và 1.2).

Hình 1.2. Vịng tuần hồn nitơ trong tự nhiên
1. Vì sinh vật cố định N2; 2. Vi sinh vật cộng sinh cố định N2; 3. Protein thực vật và vi sinh vật; 4. 8. Proteoliz
(phân huỷ protein); 5. sản phẩm phân huỷ; 6. Amơn hố; 7. Mùn; 9. Protein động vật; 10. Nitrat hoá; 11. Phản
niÈrat hoá; 12. Khử đổng hoá; 13. Rửa trơi.


Trong khí quyển có tới 78,16 % nitơ p h ân tử. Ưốc tín h cột k h í quyển trù m lên
lh a d ấ t có tới 8 triệ u tấ n nitơ, như ng cây trồng khơng th ể đồng hố trự c tiếp được.
6


H ằng năm , cây trồng lấy đi từ đ ấ t h àn g triệu tấ n nitơ. B ằng cách bón p h ân (phân
chuồng, phân hố học) con người mới trả lại cho đ ấ t được khoảng trê n 40% sơ" đó, cịn
lại là do vi sinh vật p h ân huỷ các xác động, thực v ậ t vùi tro n g đ ấ t và cơ" định nitơ.
Ngồi ra, do sấm sét biến nitơ phân tử (Nọ) th à n h n itra t (N 0 3) theo m ưa rơi xuống
đất. Chỉ tín h riêng vi k h u ẩn nốt sần cộng sinh với cây họ Đ ậu h ằn g năm làm giàu nitơ
cho đ ất 100 —200kg cho 1 ha, vi sinh vật sông tự do cố định nitơ - 5kg/ha và khoảng 3
- 30kg/ha hợp ch ất nitơ từ khơng khí được rơi xuống đ ất theo các trậ n mưa.
Trong đòi sống h ằ n g ngày của con người, xác động, thực v ậ t có chứa protein, axit
nucleic, lipoprotein, kitin,... được th ả i ra ỏ dạng rác th ả i hoặc ở tro n g nước với số
lượng vô cùng lớn. V ấn đề p h â n giải các hợp c h ất chứa nitơ tro n g xác động, thực v ật
cũng vô cùng cấp bách. Sự p h ân giải n ày sẽ tạo ra các hợp c h ấ t cho cây trồng dễ tiêu
hố và cịn có tác dụng làm sạch mơi trường sơng của lồi người.
1.1.1. Cố định nitơ phân tử của khơng khí
Nitơ là ngun tơ" dinh dưõng q u an trọ n g không th ể th iế u được đôi với cây trồng,
mà ngay cả đôi với vi sinh vật. N guồn dự trữ nitơ tro n g tự n h iên r ấ t lớn, chỉ tín h
riêng trong khơng khí, nitơ chiếm khoảng 78,16% thể tích của khơng khí. Người ta
ước tín h rằ n g tro n g bầu khơng khí bao trù m lên lh a đ ấ t đai chứa khoảng 8 triệu tấ n
nitơ, lượng nitơ này có th ể cung' cấp d in h dưdng cho cây trồ n g h àn g chục triệu năm,
song thực v ật khơng th ể đồng hố được loại nitơ này ỏ dạng p h â n tử (Nọ).
Trong cơ th ể các loại sinh v ật trê n T rái Đ ất chứa k hoảng 10 - 2 5 .109 tấ n nitơ.
Trong các trầ m tích chứa khoảng 4.1015 tỷ tấ n nitơ. N hưng tấ t cả nguồn nitơ trên,
cây trồng đểu khơng tự đồng hố được, m à p h ải nhờ ví sin h vật. Thơng qua hoạt
động sơng của các lồi vi sinh vật, nitơ nằm trong các d ạn g khác n h a u được chuyển
hoá th à n h dễ tiê u cho cây trồng sử dụng.

Hằng năm, cây trồng lấy đi từ đất hàng trăm triệu tấ n nitơ. Bằng cách bón phân,
con người trả lại cho đ ất được khoảng > 40%, lượng thiếu h ụ t còn lại cơ bản được bổ
sung bằng nitơ do hoạt động sống của vi sinh vật. Vi sinh v ật biến nitơ phân tử (N,,) của
khơng khí th àn h nitơ dễ tiêu hố ở dạng amơn để cây trồng có thế đồng hố được.
Vậy, q trìn h cơ" định nitơ p h ân tử là q trìn h đồng hố nitơ của khơng khí
th à n h nitơ am ơn dưới tác dụng cửa một sơ" vi sinh v ậ t có h o ạt tín h nitrogenaza.
Q trìn h cơ" định nitơ được H ellrigel và U nírac tìm ra n ăm 1886. Q trìn h này
xãy ra nhị các vi sinh v ật sông tự do trong đâ"t và sông cộng sin h ỏ rễ cây họ Đ ậu tạo
thành nốt sần - thường gọi là vi k h u ẩ n nô"t sần. Các vi k h u ẩ n n ày đều có h o ạt tín h
nìtrogenaza.
1.1.2. Cơ chế của quá trình cố định nitơ phân tử
Các vi sinh v ậ t có h o ạt tín h enzym n itrogenaza p h á đ ứ t môi liên k ết ba của p h ân
tử nitơ (N = N) tương dôi dễ dàng trong điều kiện bình thường về n h iệt độ và áp suất.
Trong khi đó, tro n g cơng nghiệp hố học, m n sản x"t được p h â n bón hố học phải
có trình độ cơng nghệ và tra n g th iế t bị cao để tạo ra được n h iệ t độ 4.00 —500°c và áp
suất 200 - l.OOOatm và nhữ ng ch ất xúc tác đ ắ t tiền.
7


Q trìn h cơ" định nitơ p h â n tử là quá trìn h k h ử N 2 th à n h N H 3 nhò enzym
n itrogenaza và năng lượng sinh học ở dạng ATP:
N 2 + AH2 + ATP

AO là chát cho electron
--------- > NHs + A + ADP
AH2

N àm 1992, các n h à khoa học đã hồn th iệ n q trìn h này và được trìn h bày sơ
giản như sau:
N s N —> NH = NH —> H2N -N H 2 -*• N H 3

N2 + 6e + 12ATP + 12H20

Các hợp chất khử

-

>2 N H / + 12ADP + 12P + 4H+

Feredoxin
Fiavodoxin

Glucozd,
saccarozd,
axìt hữu cơ

N itrogenaza đã được chiết xuất ra từ Azotobacter vinelandii - một loài vi k h u ẩn cô"
định nitơ sông tự do trong đất. N itrogenaza bao gồm hai th à n h p h ần khác nhau, m ệt
thành phần gồm protein và Fe; một th àn h phần gồm protein và Fe, Mo. Electron của
các chất khử sẽ đi vào th à n h phần thứ n h ạ t của nitrogenaza (phần có chứa protein và
sắt), sau đó được chuyển sang th à n h phần thứ hai, qua đó electron được hoạt hố có thể
phản ửng với No. N., cũng đi qua 2 th àn h phần của nitrogenaza và được hoạt hoá, Hydro
dtíợc hoạt hố nhờ các enzym của hệ thống hydrogenaza. N ăng lượng dùng trong quá
trình này là ATP của tê" bào. Cuối cùng, NH3 được hình thành. Có th ể tóm tắ t trong sơ
dồ sau (the hiện ở hình 1.3) và mơ hình hố thể hiện ở hình 1.4:


Feredoxin
dạng oxy hố
4


N,

L

ADP
▲

1r

ATP

Electron
’r

1r

'•
NH3

Feredoxin
dạng thử

ATP

Q trìn h cơ địn h nitơ là m ột quá trìn h k h ử liên tụ c N 2 qua diim it và hydragin
tói N H :Ỉ:
ATP

\


________________ /
Nitrogenase

/
CH=CH + 2H

\
CH3— CH3

Hình 1.4. Mơ hình khử Nj thành NH3 được xúc tác bỏi hệ nitrogenaza
a) Vòng tròn nhỏ chỉ azoferedoxin; vòng tròn to chỉ molybdoferredoxin; H+ và Mo chỉ chất khử molybdoferedoxin
b) Hoạt tính nitrogenaza có thể được xác định; nhờ hoạt tính khửaxetylen (C 2H2 hoặc C2H4)

Enzym n itrogenaza ngoài tác dụng khử N2 th à n h N H 3 cịn có k h ả n ăn g xúc tác
cho việc k hử m ột số c h ất khác. Ví dụ: nó có th ể khử axetylen th à n h etylen. P h ả n ứng
khử axetylen ngày nay được dùng để xác định h o ạ t tín h n itro g en aza (hình 1.4b).
Về lý thuyết, đế khử m ột Nọ cần 6 electron (tức cần ít n h ấ t 12ATP; 4ATP/ 1 cặp
e)- còn khử l .phân tử C2H 2 chỉ cần 2 electron. Căn cứ vào lượng C2H 4 sin h ra m à xác
4Ịnh dược lượng nitơ cố định được của ví sinh v ật c ế định nitơ.
Hệ nitro g en aza b ấ t h o ạt tro n g môi trường có oxy p h â n tử, ở n h iệ t độ 0°c.
Đối với m ột số vi k h u ẩ n lam quang hợp hiếu k h i n h ư n g lại có th ể cố định nitơ
9


như Nostoc, Anabaena th ì quá trìn h cố định nitơ lại diễn ra tro n g tế bào dị hình, nơi
chỉ có PSj h oạt động (hình 1.5a), quang hợp khơng giải phóng oxy p h â n tử.

Hình 1.5a. Nitơ phân tử được cố định tại dị bào nang (heterocyst)
Vòng tròn: tế bào sinh dưỡng (nơi quang hợp có PS||, PS| cùng hoạt động); Hình chữ nhật: dị bào nang, nơi
chỉ có PS| hoạt động.


Cịn đối với vi sinh v ậ t sống hiếu khí cố định nitơ th ì vai trị của hệ hydrogenaza
r ấ t quan trọng, nó biến ngay oxy dư thừa sau hơ hấp th à n h H90 (hình 1.5b).
Chất hữu cơ

Hình 1.5b. Sự cố định nitơ ỏ tế bào vi sinh vật hiếu khí

Nhị có vi sinh v ậ t cơ" định nitơ đã đóng kín chu trìn h nitơ tro n g tự n h iên (hình
1.1 và 1.2).

Azotobacter là loại vi k h u ẩ n hiếu khí, song quá trìn h cơ" định nitơ lại là một q
trìn h khử ở điều kiện khơng có oxy. H ai điều kiện trá i ngược n h a u được thoả m ãn đốì
vối một tế bào là do Azotobacter có nhiều m àng lipoprotein. Bên ngoài m àng là những
men hơ hấp h oạt động, sử dụng oxy để hình th à n h ATP và làm cho oxy không thấm
vào phía trong m àng, nơi đó có nitrogenaza tiến h àn h cố định nitơ ở điều kiện kỵ khí.
N H 3 được h ìn h th à n h đến một mức độ nào đó sẽ kìm hãm sự h o ạt động của
nitrogenaza, nó chính là yếu tơ" điều hịa h o ạt tín h của enzym.
O vi k h u ẩ n cô" định nitơ sống cộng sinh vói cây họ Đ ậu, cơ chê" cơ" định nitơ có
phần nào phức tạp hơn vì nó có liên q u an tới thực vật. V ai trò của thực v ậ t ở đây
chính là sự hìn h th à n h leghem oglobin, c h ất này đóng vai trị tro n g chuỗi chuyển
electron từ quá trìn h quang hợp của cây vào n itro g en aza của vi k h u ẩn . Enzym
nilrogenaza của vi k h u ẩ n nốt sần sông cộng sin h vổi cây họ Đ ậu cũng có cấu trúc
gMHig như nitrogenaza của vi k h u ẩ n cộng sinh nitơ sông tự do tro n g đất.
10


Mối quan hệ giữa thực v ậ t và vi k h u ẩ n trong quá trìn h cố đ ịn h nitơ cộng sinh có

ị
t

NH

Tuv nhiên gần đây, có m ột sơ" tác giả cho rằng, q trìn h cô" định nitơ p h ân tử
xảy ra 0 tế bào thự c v ậ t chứ không xảy ra ở tế bào vi k h u ẩ n , N hững tác giả này dựa
vào k ết quả th í nghiệm dùng ngun tơ" phóng xạ N 15 th ấ y nó x u ấ t h iện chủ yếu ỏ
m àng tế bào thực v ậ t trong k h i x u ất hiện r ấ t ít ở tế bào vi k h u ẩn .
1.1.3. Vi sinh vật cố định nitơ
N hiều loài vi sinh v ậ t có k h ả n ăn g cô" định nitơ p h ân tử. C húng bao gồm 3 nhóm
chính: nhóm vi k h uẩn cố định nitơ cộng sinh, nhóm vi k h u ẩ n cơ" định nitơ sơng tự do và
nhóm vi tảo cơ" định nitơ. Ngày nay ngưịi ta đã biết tới 40 loài tảo lam (vi k h u ẩn lam) có
khả năng cơ" đ ịnh nitơ, lh a lúa nưác có tảo lam có th ể cơ" đ ịn h được 30 - 35kg N 2
trong một năm . Ớ đây, chúng ta chỉ nghiên cứu kỹ 2 nhóm đầu.
a) Vi k h u â n cô" đ ịn h n itơ c ộ n g sin h vớ i câ y h ọ Đ ậu
- Đặc điểm chung:
+ Vi k h u ẩ n cô" định nitơ cộng sinh vối cây họ Đ ậu còn gọi là vi k h u ẩ n nốt sần.
Chúng h ình th à n h nhữ ng nốt sần ở rễ cây, đôi khi ỏ cả th â n cây p h ầ n gần với đ ấ t và
cư trú trong đó. Tại nốt sần, vi k h u ẩ n tiến h à n h quá trìn h cố định nitơ, sản phẩm cô"
định được m ột p h ần sử dụng cho vi k h u ẩ n và m ột p h ầ n sử dụng cho cây. N hững sản
phẩm quang hợp của cây cũng m ột p h ần được cung cấp cho vi k h u ẩn . C hính vì thê"
mà quan hệ giữa vi k h u ẩ n và cây là qu an hệ cộng sin h h ai bên cùng có lợi.
Năm 1888, B eijerinck đã p h ân lập được vi k h u ẩ n nốt sần. N ăm 1889, vi k h u ẩ n
nô"t sần được đ ặ t tê n là Rhizobium. Lúc đầu, ngưồi ta dựa vào cây đậu và vi k h u ẩ n
cộng sinh để đ ặ t tên lồi cho chúng. Ví dụ: loài Rhizobium legum inosurum cộng sinh
với cây đậu H à Lan, loài Rhizobium trifolli cộng sin h với cây cỏ ba lá. G ần đây người
ta chia vi k h u ẩ n nô"t sần th à n h hai nhóm, nhóm sin h trư ởng n h a n h và nhóm sinh
trương chậm dựa vào thời gian x u ất hiện k h u ẩ n lạc trê n mơi trư ịng ni cấy. Nhóm
sinh trưởng n h a n h th ì k h u ẩ n lạc x u ất hiện sau 3 - 5 ngày, có đường k ín h 2 - 4mm
thuộc chi Rhizobium . Nhóm sinh trư ỏng chậm , k h u ẩ n lạc x u ấ t h iện sau 5 —7 ngày
ni cấy, có đường k ín h không quá lm m thuộc chi B randirhizobium .
Trong quá trìn h ni cấy, VI k h u ẩ n nơ"t sần thường có sự th a y đổi h ìn h thái. Lúc

cịn non, đa sơ" các lồi có h ìn h que, có k h ả n ă n g di động b ằn g đơn mao, chùm mao
hoặc chu mao tùy từ n g lồi. Sau đó trở th à n h dạng giả k h u ẩ n th ể (bacteroid) có hình
que phân n h án h , m ấ t k h ả n ăn g di động. Ở dạng này, vi k h u ẩ n nơ"t sầ n p h ìn h to có
hình cơn, h ìn h chùy, h ìn h chữ X, V,... và có k h ả n ă n g cơ" định nitơ. K hi già, dạng
hình que p h ân n h á n h p h â n c ắt tạo th à n h dạng h ìn h cấu nhỏ.
11


Vi k h u ẩ n nốt sần thuộc loại hiếu khí, ưa pH tru n g tín h hoặc hơi kiềm , thích hợp
với n h iệ t độ 28 - 30°c, độ ẩm 60 — 80%. Chúng có k h ả n ă n g đồng hóa các nguồn
cacbon khác nỊiau n hư các loại đường đơn, đường kép, axit h ữ u cơ, glyxerin,... Đốì với
nguồn nitơ, khi cộng sinh với cây đậu, vi k h u ẩ n nốt sần có k h ả n ăn g sử dụng nitơ
khơng khí. Khi sống tiềm sinh trong đ ất hoặc được nuôi cấy trê n môi trường, chúng
m ất k h ả năng cô" địn h nitơ. Lúc đó, chúng đồng hóa các nguồn nitơ sẵn có, n h ấ t là
các nguồn am ôn và n itra t. Chúng có th ể đồng hóa tố t các loại ax it am in, m ột sơ" có
thế đồng hóa pepton. N gồi nguồn dinh dưỡng cacbon và nitơ, vi k h u ẩ n nốt sần còn
cần các loại c h ất khống, trong đó quan trọng nhâ"t là phospho. K hi nuôi vi k h u ẩ n
nốt sần ở mơi trư ờng có sẵn đạm lâu ngày, chúng sẽ m ấ t k h ả n ă n g xâm nhiễm và
h ình th à n h nốt sần. Đó là điều cần chú ý trong việc giữ giống vi k h u ẩ n nốt sần.
+ Sự hình th à n h nốt sần và quan hệ cộng sinh của vi k h u ẩn nốt sần với cây bộ Đậu:
Q uan hệ cộng sinh giữa vi k h u ẩ n nốt sần và cây bộ Đ ậu tạo th à n h m ột th ể sinh
lý hoàn chỉnh. Chỉ trong q u an hệ cộng sinh này, chúng mối có k h ả n ăn g sử dụng nitơ
của khơng khí. K hi tách ra, cả cây đậu và vi k h u ẩ n đểu không th ể sử d ụ n g nitơ tự
do, không p h ải tấ t cả các cây thuộc bộ Đ ậu đều có k h ả n ăn g cộng sin h với vi k h u ẩn
nốt sần m à chỉ khoảng 9% trong chúng.
K hả năng h ìn h th à n h nốt sần ỏ cây đậu không n h ữ n g p h ụ thuộc vào vi k h u ẩ n có
trong đ ấ t m à còn ph ụ thuộc vào các điểu kiện ngoại cảnh khác n h au . Ví dụ về độ ẩm,
chúng thích ứng với độ ẩm từ 40 —80%, trong đó độ ẩm tối th ích là 60 —70%. Tuy
nhiên, cũng có nhữ ng trư ờng hợp ngoại lệ, ví dụ n h ư cây điền th a n h có th ế hình
th à n h nốt sần trong điều k iện ngập nưốc.

Độ thống k h í của đ ấ t cũng ản h hưởng đến sự h ìn h th à n h và c h ất lượng nốt sần.
Thơng thường, nốt sần chỉ h ìn h th à n h ở p h ần rễ nông, p h ầ n rễ sâu r ấ t ít nốt sần.
N guyên n h â n là do tín h h iếu khí của vi k h u ẩ n nốt sần, th iế u oxy sẽ làm giảm cường
độ trao đổi năng lượng và k h ả năng xâm nhập vào rễ cây. Đối với cây, th iế u oxy cũng
làm giảm sự h ìn h th à n h sắc tô" leghemoglobin. N hững nốt sần h ữ u hiệu có m àu hồng
chính là m àu của sắc tơ" này.
N hiệt độ thích hợp n h ấ t vối h oạt động của vi k h u ẩ n nốt sần là 24°c, dưới 10°c
nô"t sần vẫn có th ể h ìn h th à n h như ng hiệu quả cô" định nitơ giảm . Ở n h iệt độ 36°c,
cây đậu p h á t triể n tô"t như ng cường độ cô" định nitơ lại kém.
pH môi trường cũng ả n h hưởng đến sự h ìn h th à n h và c h ất lượng nơ"t sần. Có loại
chỉ h ình th à n h nốt sần ỏ pH = 6,8 - 7,4 có loại có k h ả n ăn g h ìn h th à n h nốt sần ở pH
rộng hơn, từ 4,6 - 7,5.
Tính đặc hiệu là m ột đặc điểm quan trọng trong quan hệ cộng sinh với một hoặc
vài loài vi k h u ẩ n nốt sần chỉ có k h ả năng cộng sinh với m ột hoặc vài lồi đậu. Cũng có
một sơ loại vi k h u ẩ n có k h ả năng hìn h th à n h nơ"t sần ở cây đậu khơng đặc hiệu vói nó
nhưng sơ" lượng nốt sần ít và có k h ả năng cơ định ni tơ kém. Tuy nhiên, đặc tín h này
giúp cho vi k h u ẩ n nốt sần có th ể tồn tạ i ở những nơi khơng có cây đ ậu đặc hiệu đơi với
nó. Tính đặc hiệu giữa vi k h u ẩ n và cây đậu được quyết định bỏi hệ gen của chúng. Bởi
vậy. người ta có th ể cải biến tín h đặc hiệu bằng các tác n h â n đột biến, hoặc có thê
đùng kỹ thuật di tru v ề n để cải biến hệ gen quy định tín h đặc hiệu cộng sinh.
12


Q uá trìn h h ìn h th à n h nốt sần được b ắ t đầu từ sự xâm n h ậ p của vi k h u ẩ n vào rễ
cây. Vi k h u ẩ n thường xâm n h ập vào rễ cây qua các lông h ú t hoặc vết thương ở vỏ rễ
cổy. Câv đậu thường tiế t ra nhữ ng ch ất kích thích sinh trư ởng của vi k h u ẩ n nốt sần
tương ứng, đó là các hợp c h ấ t cacbonhydrat, các axit amin,...*Muô"n xâm nhiễm tốt,
m ật độ của vi k h u ẩ n tro n g vùng rễ phải đ ạt tối 104 tế bào tro n g 1 gam đất. N ếu xử lý
với h ạ t đậu thì mỗi h ạ t đậu loại nhỏ cần 500 - 1.000 tế bào vi k h u ẩ n , h ạ t đậu loại to
cần khoảng 70.000 tế bào.

Khi m ật độ vi k h u ẩ n p h á t triển tới m ột mức độ n h ấ t định, nó sẽ kích thích cây
đậu tiết ra enzym polygalactorunaza có tác dụng p h â n giẵi th à n h lông h ú t để vi
k h u ẩn qua đó xâm n h ập vào. Đường vi k h u ẩ n xâm n h ập được tạo th à n h do tốc độ
p h á t triển của vi k h u ẩ n (sinh trưởng đến đâu, xâm n h ập đến đấy) h ìn h th à n h một
"dãy xâm nhập" được bao q u a n h bởi m ột lốp n h ầy do các c h ấ t của vi k h u ẩ n tiế t ra
trong quá trìn h p h á t triển . Ớ giai đoạn này, p h ản ứng của cây đối với vi k h u ẩn tương
tự như đối với v ậ t ký sinh. Bởi vậy, tốc độ tiến sâu vào n h u mô của dãy xâm nhập rấ t
chậm do p h á t triể n của cây (chỉ khoảng 5 - 8pm/giị). Khơng p h ải tấ t cả các dãy xâm
nhập đều tiến tới n h u mô rễ m à chỉ một sô" trong chúng. C hính vì thế, để h ìn h th àn h
nơt sần cần m ậ t độ vi k h u ẩ n lớn.
Khi tới lớp n h u mô, vi k h u ẩ n kích thích tế bào n h u mô p h á t triể n th à n h vùng mô
phân sinh. Từ vùng mô p h â n sinh, tế bào p h ân chia r ấ t m ạn h và h ìn h th à n h 3 loại
tế bào chuyên hóa: v ỏ nốt sần là lớp tê bào nằm dưói lớp vỏ rễ bao bọc q u an h nốt
sần. Mô gồm n hữ ng tế bào không chứa vi k h u ẩ n xen kẽ với các tế bào không nhiễm
vi k h uẩn và nhữ ng tế bào nhiễm vi k h u ẩn . N hững tế bào chứa vi k h u ẩ n có kích
thước lớn hơn tế bào không chứa vi k h u ẩ n tói 8 lần; có n h ữ n g mơ chứa vi khuẩn,
tồn bộ các tế bào đều bị nhiễm vi khu ẩn . Loại tế bào chuyên hóa th ứ ba là các mạch
dẫn từ hệ rễ vào nốt sần. Đ ây chính là con đứờng d ẫn tru y ề n các sản phẩm của quá
trìn h cố định nitơ cho cây và các sản phẩm quang hợp của cây cho nốt sần (hình 1.6).
Tại các tế bào chứa vi k h u ẩn , vi k h u ẩ n nốt sần xâm n h ập vào tế bào c h ất và tại
dây chúng p h â n c ắt r ấ t n h a n h . Từ dạng h ìn h que sẽ chuyển san g dạng h ìn h que
phân n h á n h gọi là dạng giả k h u ẩ n th ể (bacterioide). C hính ở dạng giả k h u ẩ n thể
này, vi k h u ẩ n b ắ t đầu tiế n h à n h quá trìn h cố định nitơ. Thồi kỳ cây ra hoa là thòi kỳ
nốt sần h ìn h th à n h nhiều n h ấ t và có hiệu quả cơ" định nitơ m ạn h n h ấ t. H iệu quả cô"
định nitơ thường th ể hiện ở những nốt sần có kích thưốc lớn và có m àu hồng của
leghemoglohin. Ĩ nhữ ng cây đậu có đời sơng ngắn từ 1 năm trở xuống, đến giai đoạn
cuối cùng của thòi kỳ p h á t triển , m àu hồng của sắc tô" leghemoglobin chuyến th à n h
m àu lục. Lúc đó k ế t thúc q trìn h cơ" định nitơ, dạng giả k h u ẩ n th ể p h â n cắt th à n h
những tê" bào h ìn h cầu. Khi cây đậu chết, vi k h u ẩ n nốt sần sông tiềm sinh trong đ ất
chờ đến vụ đậu năm sau. Tuy nhiên, có m ột vài cây họ Đ ậu n h ư cây điển th à n h h ạ t

trò n không th ấ y xuâ"t h iện dạng giả k h u ẩ n (hình 1.6).
0 những cây đậu 1 năm và nhữ ng cây đ ậu lâu năm (th â n gơ) cũng có sự khác
n h au về tín h c h â t nốt sần. ở cây lạc, cây đậu tương, nôt sần hữu h iệu (có k h ả năng
cố d inh ni tơ) thường có m àu hồng, kích thưóc lớn, thường nằm trê n rễ chính trong
kh: nốt sần vơ hiệu có m àu lục, kích thước nhỏ, thường nằm trê n rễ phụ. Tuy nhiên ở
13


m ột sô cây đ ậ u lâu năm lại khơng theo quy lu ậ t đó. Ví dụ như cây keo ta i tượng
dùng để trồng rừng, nốt sần h ữ u hiệu có cả ở rễ p hụ và khơng có m àu hồng.

Hình 1.6. Vi khuẩn cố định nitơ cộng sính ỏ rễ cây họ Đậu
A) Rễ cây họ Đậu với nốt sần; B) Lát cắt của nốt sần; C) t ế bào thực vật chứa đầy Rhizobium; D) Ví khuẩn
có thể giả khuẩn (Bacterioides); E) Vi khuẩn xâm nhập qua đầu lông hút và phát triển thành đưịng xâm
nhập vào rễ.

Một số lồi xạ k h u ẩ n , địa y, tổ hợp vi k h u ẩ n lam với quyết thực v ậ t cũng có k hả
năng cố định nitơ.
Ngày nay, người ta tìm th ấ y 40 lồi vi k h u ẩ n lam có k h ả n ăn g cô" định đạm
(Schỉegeỉ. 1993), h ằ n g năm trong các ruộng lúa nưốc, vi k h u ẩ n lam có k h ả n ăn g cố
14


định 30 - 50kg nitơ trê n lh a . Vi k h u ẩ n lam cô' định đạm gồm n h ữ n g cơ th ể đơn bào
như Gloeocapsa, tạo sợi khơng có tế bào lạ như Oscillatoria, tạo sợi có tế bào lạ (dị
bào nang —heterocyst) n h ư Anabaena, Calothix, Nostoc,...
Vi k h u ẩ n sông tự do cố đ ịnh đạm gồm n h iều nhóm (bảng 1.1):
Bảng 1.1. Các vi khuẩn cố định đạm sống tự do xếp theo nhóm sinh lý
Hõ hấp hiếu khí bắt buộc


Azotobacter chroococum
A. vinelandi
Azomonas agilis
Alcaligenes latus
Xanthobacter autotrophicus
Beijenrinckia inơica
Derxìa gummona
Azospirillum lipoferum
Vài lồi Methylotrophs

Hơ hấp ky. khí bắt buộc
- Các vi khuẩn khử lưu huỳnh:

C ó th ể quang hợp
- Không thải oxy:

Desufovibrio

Chromatium

Desulfotomaculum

Rhodospirillum

-C á c cơ thể sinh metan:

Metanobacterium
Metanosarcine
- Các vi khuẩn lên men kỵ khí


Clostridium

Rhodopseudomonas
Rhodobacter
Heliobacter
Chlorobium
- Thải oxy:
Hầu hết các vi khuẩn lam.

Kỵ khí khơng bắt buộc:

Klebsiella pneumoneae
Bacillus polimyxa

Nhờ phương p h áp nuôi in vitro, sử dụng nguyên tử đ á n h dấu N 15 người ta p h á t
hiện k h ả n ăn g cố định đạm ỏ nhiêu loại vi k huẩn: Azotobacter, Clostridìum, các vi
k h u ẩn quang hợp, vi k h u ẩ n khử sunfat,...
Đối với các vùng đ ấ t chua ở Việt N am n h â n dân ta thường bón vơi, biện pháp
này làm pH trở về tru n g tính, nâng cao k h ả n ăn g tạo th à n h nốt sần, cũng như sự
p h á t triển n h a n h chóng của các vi k h u ẩ n sống tự do cố định đạm .
- Azotobacter:

Azotobacter (được p h á t h iện từ năm 1901 do B eijerinck) là m ột loại vi k h u ẩn
hiếu khí, khơng sinh bào tử, có k h ả năn g cô" định nitơ p h â n tử, sông tự do trong đất.
Khi nuôi câ"y Azotobacter trong môi trường n h â n tạo, chúng biểu hiện đặc tín h
đa hình: khi cịn non chúng có dạng trực k h u ẩ n h ìn h que, có tiê n mao, có k h ả năng
di động. Khi già, Azotobacter có k h ả năn g di động, tế bào chuyển th à n h dạng hình
cầu, xung q u an h được bao bọc bởi một lớp nhầy. M ột sơ" loại Azotobacter có k h ả năng
hình th à n h nang xác vỡ, tê" bào lại sinh trưởng, p h á t triển . N ang xác là m ột hình
thức tồn tạ i của Azotobacter, nó khơng phải là bào tử. M ột n a n g xác có th ể bao bọc

một sô tê bào bên trong. K h u ẩn lạc của Azotobacter lúc non cịn có m àu trắ n g đục.
Khi già chuyển th à n h m àu lục hoặc m àu nâu.
Trong đất, n h ấ t là đ ấ t lúa, thường có phổ biến n h ữ n g lồi Azotobacter sau:
* Azotobacter chroococcum: có k h ả n ăn g di động lúc còn non, kh i già có k h ả năng
hình th à n h nang xác. K huẩn lạc lúc già có sắc tơ" m àu n â u hoặc m àu đen, không
khuếch tá n vào môi trường.
* Azotobacter beijerinckii: khơng có k h ả n ăn g di động, có k h ả n ă n g h ìn h th à n h
n an g xác. K huẩn lạc lúc già có m àu vàng hoặc m àu n â u sáng, sắc tô" không khuếch
lá n vào môi trươTĩg,
15


• Azotobacter vinelandii: có k h ả han g di động và h ìn h th à n h n an g xác. K huẩn
lạc m àu h u ỳnh quang, sắc tơ" khuếch tá n vào mơi trường.
• Azotobacter agìllis: có k h ả n ăn g di động, không tạo th à n h n a n g xác, k h u ẩ n lạc
m àu vàng lục h u ỳnh quang, sắc tô" khuếch tá n vào mơi trường.

Azotobacter có k h ả p ăn g đồng hóa n h iều loại đường khác n h au , n h ấ t là các sản
phẩm phân giải của xenlulozd. Bỏi vậy, đ ấ t có bón p h â n xanh, rơm rạ, rác rưởi rấ t
tô t cho sự p h á t triể n của Azotobacter. Sự p h á t triể n và k h ả n ăn g cô" định nitơ của
Azotobacter phụ thuộc r ấ t nhiều vào hàm lượng phospho dễ tiê u tro n g mơi trường.
Ngồi ra, canxi và các nguyên tô" vi lượng n h ư B, Mo, Fe, M n cũng r ấ t cần th iế t đối
vối Azotobacter. M ột vài ngun tơ" phóng xạ có tác dụng kích th ích sinh trư ỏng đối
với Azotobacter.
Azotobacter th ích hợp n h ấ t vói pH = 7,2 - 8,2, song chúng có 'thể p h á t triể n được
pH = 4,5 - 9,0. C húng thích hợp với nhiệt độ 25 - 30°c.
Azotobacter đã được nghiên cứu để chế tạo p h ân vi sin h v ậ t bón cho lúa, ở m ột sô"
nơi chúng th ể h iện h iệu quả tô t nhưng không phổ biến b ằn g p h â n vi k h u ẩ n nô"t sần
n itragin. C hế phẩm chế tạo từ Azotobacter được gọi là azotobacterin.
- Clostridium:

Clostridium được p h á t h iện từ năm 1893, là m ột loài vi k h u ẩ n kỵ k h í sơng tự do
trong đất. Khác với Azotobacter, nó có khả năng h ìn h th à n h bào tử. Loài phổ biến
n h ấ t trong đ ấ t là Clostridium pasteurianum có h ìn h con thoi do bào tử h ìn h th à n h
lốn hơn kích thước-tế bào.
Clostridium có k h ả năng đồng hóa n h iều nguồn cacbon k h ác n h a u như các loại
đường, rượu, tin h bột,... Nó thuộc loại kỵ k h í nên các sản p h ẩm tra o đổi c h ất của nó
thường là các loại axit h ữ u cơ, butanol, etanol, axeton,... Đó là các sản phấm chưa
được oxy hóa hồn tồn.
P, K là 2 ngúyên tô" rấ t cần th iết cho sự p h át triển và cô" định nitơ của Clostridium .
Ngồi ra, các ngun tơ vi lượng như Mo, Co, Cu, M n cũng r ấ t cần th iế t đôi vối
Clostridium.
Clostridium cỏ k h ả n ăn g p h á t triển ở pH = 4,7 —8,5. Bào tử của chúng có thể
chịu đựng được n h iệ t độ cao, có th ể sơng được 1 giờ ở n h iệ t độ 80°c. M ột số lồi cịn
có thể chịu được n h iệ t độ 100°c trong 30 phút.
Ngồi n hữ ng giơng vi sin h v ật cô" định nitơ p h ân tử nói trê n , cịn vơ sơ những
giơng khác đều có k h ả n ăn g cơ" định nitơ p h ân tử, chúng có n h iều ý n g h ĩa trong sản
x u ất nơng, lâm , ngư nghiệp.
- Vi khuẩn:
• Nhóm vi khuẩn cơ định nitơ phân tử hiếu khí: Azotomonas insolita; Azotomonas
fluorescens; Pseudomonas azotogenis; Azospirillum,...
• Nhóm vi k h u ẩn cơ" định nitơ phân tử kỵ khí quang hợp: Rhodospirillum rubrum;
Chromatium sp; Rhodom icribium sp,...
• Nhóm vi k h u ẩ n cơ’ định nitơ ph ân tử kỵ kh í không q u ang hợp: Desulfovibrio
desulfuricans; M ethanobacterium sp,...
16


• Xạ khuẩn: Một sơ" lồi thuộc giống: Streptomyces, Actinomyces; Frankia; Nocardia;
Actinopolyspora; Actinosynoema,...
• Nấm: Rhodotorula,...

• Vi k h u ẩ n lam: Glococapsa sp; Lyngbyaps; Plectonema; Boyryanum; Anabaena
azollae; Anabaena ambigua; Anabaena cycadae; Anabaena cylindrica; Anabaena
fartilisim a,...
Vi khuẩn có k h ả năng cô" định nitơ sống trê n bề m ặt rễ và ăn sâu vào lớp tổ chức
bể m ặt rễ của m ột sơ" cây hịa thảo như lúa, ngơ,... Đó là m ột loại vi k h u ẩ n có dạng
xoắn dược p h á t h iện từ năm 1974 thuộc chi Azospirillum đã được nghiên cứu nhiều
trê n th ế giới. Ở V iệt N am cũng có những nghiên cứu bước đ ầu và ứng dụng chế phẩm
Azospirillum nhằm mục đích nâng cao sản lượng của các cây hịa thảo nói trên.
- Tảo đơn bào cũng có k h ả n ăn g cơ" định nitơ. Ví dụ n h ư tảo lam sông tự do và
tảo lam sông cộng sin h tro n g bèo hoa dâu. Các lồi này cũng đóng góp khơng nhỏ vào
q trìn h cơ" định nitơ khơng khí.
b ) N g u y ê n liệ u sả n s u ấ t

Đe sản x u ấ t các chế phẩm vi k h u ẩ n làm p h â n vi sin h cô" đ ịn h nitơ thường dùng
các dạng đường đơn, đường đôi, tin h bột, cám mì, cám gạo,... có kh i dùng m an n it
(m anitol, m an an sugar), glyxerol,... cùng những loại muối k hống th ích hợp với từng
chủng giông.
- Một sô" tác giả đã sử dụng nguồn cơ c h ất cacbon và N h ữ u cơ tro n g các môi
trường tổng hợp nuôi các vi k h u ẩ n cô" định nitơ như sau (bảng 1.2).
Bảng 1.2. Môi trường tổng hợp với nguồn

c và N dùng

nuôi vi khuẩn cô' định nitơ

Tên vi khuẩn

Thành phần cd bản của môi trường

Tác giả


Pseudomonas

Nước thủy phân đậu, thịt

Bashan (1986)

Azospirillum

10g/l glyxerol

Bacillus

50g/l nước thủy phân tinh bột
20g/l casein

Atkison & Mavitune (1993)

3,3g/l NaHPO„

Rhizobium
í

20g/l nước chiết nấm men

Somasegara (1985)

10g/l manitol

—Sử dụng các nguồn đường làm cơ ch ất thường dùng các môi trường phổ biến

như sau (g/1):
1) Glucozơ - lOg; K9H PO 4 - 0,5g; MgSCV 7H20 - 0,2g; N aCl - 0,lg; cao nấm men
hoãc nước chiết cây đậu tương ứng với vi k h u ẩn - 0,4g; nước - 1 lít; pH = 6,5 - 7.
Mơi trường này dùng nuôi cấy vi khuẩn nô"t sần, nếu dùng giữ giông thêm 15 —20g/l
thạch.
2) Nước luộc đậu được bổ sung 1% saccarozơ, thêm 1,5% th ạch dùng để cấy chuyền
hoặc hoạt hóa vi k h u ẩ n nơ"t ^ i t Ị q ^ gc-^^^i^^r^gìềịng.
17


3) Môi trư ờ n g n u ô i cấy ch u n g cho các ch ủ n g vi k h u ẩ n cố đ ịn h n itơ (g/1):

Saccarozơ (có th ể th a y bằng m annit)
K2H P 0 4
M g S 0 ,.7 Il20
CaCL
FeCl3 (pha th à n h dung dịch 10%)
Muôi m olipden
Nước cho đủ
pH
Ba mơi trư ịng này dùng cho vi k h u ẩ n cố

15
15 (m anitol)
0,2
0,5
0,2
0,2
0,02 C a S 0 4 - 0,1
0,05 N a C l- 0 ,2

Vết
C a C 0 3- 5,0
1 lít Nước đủ 1 lít
7,2
pH 8,3
định N ọ sống tự do.

20 (m anitol)
0,2
0,2
K2SO4- 0 , l
N aC l - 0,2
C aC 0 3- 5
Nước đủ 1 lít
pH 8,3

1.1.4. Sản xuất phân vi sinh vật cố định nitơ
a) Sơ đồ c ô n g n g h ệ (n g u y ê n lý) sả n x u ấ t p h â n v i s in h v ậ t c ố đ ịn h n itơ
Sản phẩm của công nghệ sản x u ấ t p h ân bón vi sin h v ậ t cô" đ ịn h nitơ là sin h khối
các giông vi k h u ẩ n th u ầ n chủng có khả năng cơ" định nitơ p h â n tử N 2 từ không kh í
hay là có khả năng chuyển hóa nitơ ph ân tử th à n h N H 3.
Công nghệ sản x u ấ t sinh khôi vi k h u ẩ n về nguyên lý cũng tương tự n h ư các quá
trìn h lên men th u sinh khối trong cơng nghiệp vi sinh vật. Quy trìn h công nghệ được
thô hiện ở sơ đồ n hư sau:

b) G iôn g sả n x u ấ t
Là giông th u ầ n chủng được phân lập và tuyển chọn từ nguồn tự nhiên, giữ giông
trong th ạch nghiêng ỏ lạ n h trong phịng th í nghiệm . Trước k h i sử dụng được cấy
chuyền qua ống có mơi trư ờng thạch để "đánh thức", sau đó n h â n giống trước khi
đưa vào lên men. Có th ể n h â n giống cấp I, câ"p II,... để đảm bảo tiếp chuyền giống có

thế gấp 5 - 1 0 lần qua mỗi lần.
Yêu cầu n h â n giông: dịch giông không tạp nhiễm , m ật độ từ vài tră m triệ u đến
hàng tỷ tế bào/ml, thường k ết thúc n h â n giống ở mỗi câ"p tạ i thòi điểm sinh khối
p h át triên chậm dần khi sắp sửa vào pha cân bằng.
Tùy thuộc vào giống th u ầ n chủng hiếu kh í hoặc kỵ kh í ta sẽ quyết định nuôi cây
chúng theo phương pháp lên m en bề m ặt hoặc lên m en chìm. Ni cấy bề m ặt đối vối
vi khuân trên môi trường rắ n (hay bán rắn, xốp) đòi hỏi độ ẩm 70 —80% là khó thơng
khí (hiêu khí kém) và vi k h u ẩn khơng có hệ sợi cơ ch ất như vi nâ"m nên râ"t khó p h át
18


triển. Ni cấy chìm cần ni ở th ù n g lên men sục kh í tro n g điểu kiện vơ trùng, n h ân
giống cấp I có th ể thực hiện trong bình tam giác và được đ ặ t trê n m áy lắc.
c) L ên m en
Lên m en tro n g trư ờng hợp này là nuôi cấy mở rộng vi k h u ẩ n để th u sin h khối để
chế tạo chế phẩm vi sinh cô" định nitơ. Môi trường lên m en thường chú trọng nguồn
cacbon và nitơ. N guồn c là các loại đường hoặc m anitol h ay glyxerol. N guồn N là
nước chiết đậu, nấm m en h ay dịch th ủ y p h ân từ cây hoặc h ạ t đậu, th êm các nguồn
muối khoáng cần thiết.
Nuôi cấy các giông th u ầ n chủng cơ" định nitơ thường dùng phương pháp lên men
chìm. Q trìn h lên m en cần kiểm sốt n h iệt độ, pH, 0 2 hòa tan . Đây là quá trìn h
lên men một pha: pha sin h trưởng. K ết thúc lên m en kh i sin h trư ởng đ ạ t ỏ đầu pha
cân bằng, sau đó ly tâ m để n h ậ n sinh khôi. Lên m en công nghiệp ỏ các fern en ter tới
hàng chục m ét khôi hoặc lốn hơn.
Sinh khôi th u được đem trộ n vối c h ất m ang (th ạch cao, đ ấ t sé t không nghiền
nhỏ, đ ấ t phù sa khô, nhỏ, hoặc diatom it, th a n b ù n khô,...) và các c h ấ t p h ụ gia, đem
sấy khô với n h iệ t độ không k h í nóng khơng q 45°c để đảm bảo các tê bào vi k h u ẩn
sống (qua sấy có th ể bị chết m ột tỷ lệ tế bào nào đó. Mục đích càng giảm tỷ lệ này
càng tơi).
C hế phẩm có th ể sử dụng ở dạng lỏng, nhưng p h ải đóng gói kỹ và giữ vệ sinh,

hoặc có thèm c h ấ t bảo quản. C hế phẩm dạng lỏng thường không giữ được lâu và cần
được giữ ở điều kiện lạnh.
Các chế phẩm vi k h u ẩ n cố định nitơ có n h iều tê n gọi khác nhau: A zotobacterin,
Rhizobin, Rizogin, F lavobacterin, N itragin, E n tero b acterin . Phổ biên hơn cả là
Azotobacterin, N itragin.
d) A z o to b a c te r in
A zotobacterin là c h ế phẩm p h ân bón làm từ vi k h u ẩ n Azotobacter sông tự do.
trong d ấ t và tro n g vùng rễ của các cây cốc (lúa, ngơ, m ạch, cao lương, kê,...), cây
mía, hướng dương. Ở vùng rễ của các cây này có r ấ t n h iề u vi sin h vật. C húng ta
thấy có các lồi thuộc gốc Azotobacter và Azospirollium . C húng có k h ả n ăn g cơ định
dạm (N.J của khơng k h í nhờ hệ enzym của b ản th â n xúc tác q trìn h chuyển nitơ
từ khí quyển th à n h n h ữ n g hợp c h ấ t cho cây có th ể tiêu hóa được, cũng n h ư tạo ra
các ch ất kích th ích sin h trư ỏng thực v ậ t và tă n g cường cho cây hâ"p th u các ch ất
dinh dưỡng khác.
Một sơ chủng thuộc lồi Azotobacter chrooccum có h o ạ t tín h cơ đ ịn h nitơ cao và
được dùng sản x u ấ t A zotobacterin. Đ ây là những chủng vi k h u ẩ n khơng sin h bào tử
hiếu khí. Tê bào trong thời kỳ phân chia thường kéo dài ra hoặc có h ìn h ovan. Kích
thước tê bào là 2 - 5pm. K hi già, xung q u an h tế bào tạo th à n h m àng nhầy. H oạt lực
eố định nitơ của chúng được tă n g lên kh i mơi trường có m ặ t m olipden (Mo). Do vậy,
môt trường nuôi cấy vi k h u ẩ n cần phải bổ sung kim loại này với tư cách là nguyên tô
vi Iưựng cần th iết.
Nuôi cấy vi k h u ẩ n Azotobacter như đã giói th iệu ở p h ầ n trên .
19


Ni ở n h iệ t độ th ích hợp là 25 - 27°c trê n m áy lắc và k ế t th ú c kh i sin h khối đ ạt
được ở mức p h á t triể n ổn định. Tách bỏ dịch nuôi cấy b ằn g ly tâ m để th u sin h khối.
Sinh khối th u được đem trộn với đ ấ t hoặc th a n bùn đã xử lý, th a n h trùng. Cách
xử lý đ ất và th a n bùn n hư sau: chọn đ ấ t nhiều m ùn, có th ể là đ ấ t p hù sa. T han bùn
cần phải qua phân hủy sơ bộ bằng axit clohydric rồi tru n g hòa đưa về tru n g tính.

Nghiền nhỏ những phần thơ hoặc tạp ch ất lớn cần phải loại bỏ qua sàng. Sau đó đ ất
hoặc th a n bùn được bổ sung 1 - 2% vôi bột hoặc C aC 0 3 và 0,1% supephosphat, trộn
đều, chia vào các chai hoặc bình nửa lít n ú t bằng n ú t bơng. Đ ất hoặc th a n bùn ở trong
bình cần được làm ẩm tới 40 —60%. Đem hấp th a n h trùng.
Sinh khôi được ch ế th à n h dịch huyền p h ù rồi lấy p ip et vô trù n g h ú t chuyển vào
đ ất hoặc th a n bùn đã vô trù n g ở tro n g bình. Mỗi b ìn h tam giác 500m l chỉ cần cho vài
giọt giống. Lắc đểu và nuôi tiếp ở tủ ấm.
Giống vi k h u ẩ n có th ể ni trê n mơi trường th ạ ch vói th à n h p h ầ n dinh dưỡng
như đã giới th iệ u ở trê n . N h iệt độ nuôi là 25 - 27°c với thòi gian là 3 —5 ngày đến
khi trê n m ậ t th ạ ch p h ủ đều m ột lớp khôl nhầy.
D ùng nước vô trù n g để rử a cạo th u sinh khối th à n h dịch h u y ền p h ù giông. Lấy
huyền phù giông b ằn g pipet vô trù n g nhỏ vào đ ấ t hoậc th a n b ùn vô trù n g trong các
bình tam giác. Lắc đều và để ở tủ ấm vối n h iệ t độ th ích hợp cho vi k h u ẩ n tiếp tục
p h á t triển.
Sau khi nuôi cấy, mỗi gam chế phẩm khơng ít hơn 50 triệ u tế bào. Thời gian bảo
quản để sử dụng vào khoảng 2 - 3 tháng.
Sử dụng chế phẩm cho vào đ ấ t canh tác hoặc xử lý h ạ t giông b ằn g cách ngâm
h ạ t với dịch nước hòa với chế phẩm . Bón cho cây theo liều sử dụng là 3 - 6kg cho lh a
gieo trồng.
A zotobacterin thích hợp cho các loại cây cốc cho h ạ t, có th ể tă n g sản lượng được
9 - 18%. Ngồi ra, cịn th ấ y hiệu quả cho cây cà chua, củ cải đường, hoặc củ cải làm
thức ăn chăn nuôi, khoai tây.
e) N itr a g in
C hế phấm này được chế từ vi k h u ẩ n nốt rễ của cây họ Đ ậu (đậu, lạc, điền
thanh,...) và được dùng rộng rã i n h ấ t trong trồng trọ t. Vi k h u ẩ n n ố t rễ sống cộng
sinh với cây chủ ở bộ rễ làm cho rễ có nhữ ng nốt sần và vi k h u ẩ n có h o ạt tín h cơ" định
nitơ từ khơng khí. Trong tự nhiên ta thấy, cây chủ nào, vi k h u ẩ n ấy. Đó là quan hệ
đã đượẹ chọn lọc và tiế n hóa.
Vi k h u ẩ n nốt rễ thuộc giống Rhizobium. Đây là loại trự c k h u ẩ n khơng lớn, hiếu
khí. đôi khi chuyển động, G ram âm (-), không sin h bào tử. C húng có th ể mọc tố t ở

mơi trường có nước chiết đậu (nước luộc đậu) hoặc nước chiết các cây khác. N hiệt độ
thích hợp cho p h á t triể n của vi k h u ẩ n là 20 - 26°c, pH th ích hợp là 7.
Đôi với từ ng loại cây họ Đ ậu cần p h ải có chế ph ẩm N itrag in th ích hợp để làm
phân bón cho cây ấy, được ch ế từ những chủng vi k h u ẩ n tương ứng. N hững chủng
này được tu y ển chọn từ nổt rễ của cây chủ theo đặc tín h cố định nitơ, cường độ thârn
vào bộ rễ của cây trồng.
C hế phẩm N itrag in được th u n h ậ n như sau:
20


Nước luộc đ ậu được bổ sung 1,0% saccarozd và 1,5% th ạch . Mơi trư ờng chia vào
các bình tam giác, đậy n ú t bông sạch và hấp th a n h trù n g . Chò kh i m ặ t th ạch rắ n lại
th ì cấy giông.
C hủng giông để tu y ển chọn đem n h â n trong môi trư ờng nước luộc đậu, rồi lấy
pipet vô trù n g chuyển tiếp vào môi trường thạch. Nuôi ở 20 - 25°c tro n g vài ngày
đến khi vi k h u ẩ n mọc đều trê n bề m ặt thạch, chuyển th à n h dịch huyền p hù rồi cấy
chuyên tiếp sang đ ấ t hoặc th a n bùn đã vô trù n g (cách làm tương tự n h ư p h ầ n trê n Azotobacterin).
Đồ có một lượng lớn chế phẩm , người ta nuôi vi k h u ẩ n qua n h â n giống ở bình lắc
rồi tiếp vào các b ìn h lên men: trước h ế t là chọn các chủng Rhizobium cấy vào mơi
trường rỉ đường thêm m i khống trong các bình ta m giác, rồi đem lắc ở n h iệ t độ 20
- 25°c. Sau đó tiếp giơng vào lên men ỏ các bình có k h u ấy và sục khí. Ni đến khi
sinh trưởng đ ạ t tối mức tốì đa th ì đem ly tâm th u sin h khối. Để làm giảm tỷ lệ nước
trong sinh khối ta thêm c h ất độn - cao lanh khô và vô trù n g . S au đó đem đi đơng
khơ. Sinh khơi có c h ấ t độn được làm đông lạn h tới - 20°c -í- - 40°c rồi cho sấy th ăn g
hoa ở chân không với áp s u ấ t dư 12 - 13kPa (kilo Pascan). T rong thời gian sấy, n h iệt
độ khơng q 30°c, độ ẩm cịn lại trong chế phẩm là 3 - 7%.
Trong quá trìn h sấy, một số tế bào vi k h u ẩ n bị chết hoặc m ấ t h o ạ t tín h (khoảng
20 - 25%). Để giảm tỷ lệ này có th ể dùng các c h ất bảo vệ n h ư gelatin, đường, huyết
thanh, rỉ đường,...
C hế phẩm n itra g in c h ế theo phương pháp này là loại đơng khơ, giữ được thịi

gian dài vẫn cịn h o ạt tín h và tiện sử dụng. Do vậy, chỉ cần 500g ch ế phẩm cho lh a
gieo trồng và tiế t kiệm p h â n bón hóa học từ 30 - 200 lần.
N itragin có h iệu quả cao n h ấ t vối cây đậu tương, đặc b iệ t là với đ ấ t mới trồng
đậu hoặc đ ấ t thường bị khô hạn, ngập nước. C hế phẩm này làm tă n g n ăn g suất rõ
rột với các loại cây đậu, lạc.
Từ lâu người ta đã biết sử dụng vi k h u ẩ n nốt sần làm p h â n bón cho cây đậu. Có
thể sản xuâ't theo phương pháp đơn giản: Rễ cây họ Đ ậu rử a sạch có th ể nhúng qua
cồn 65°c, rồi lấỷ dịch chiết từ các nốt sần (giã vỡ rồi ngâm với nưốc vô trùng) cấy vào
môi trường nước n ấ u đ ậu có thêm 1% saccarozơ và 1,5% th ạch . Môi trường hấp
thanh trùng, đổ nguội chờ khi m ặ t thạch rắ n th ì cấy giống từ dịch ép nốt rễ. Nuôi ở
25 —28UC trong vài ngày, vi k h u ẩ n mọc đều trê n m ặ t th ạ ch rồi g ạt lớp vi khuẩn cho
vào nước vô trù n g th à n h dịch huyền phù rồi đem ngâm tẩm với hạt đậu giống trưổc
khĩ trồng hoặc p h u n vào đ ấ t q u anh chỗ gieo h ạt. C ũng có th ê đem dịch huyền phù vi
khuẩn trộn với đ ấ t khô hoặc th a n bùn khô cùng với saccarozơ, đem phơi ở ánh sáng
bức xạ tối khô th à n h chế phẩm dùng dần.
1.2. PHÂN LÂN VI SINH (PHÂN LÂN SINH HỌC)
Phân lân vi sinh hay p h ân lân sinh học là chê phẩm các vi sinh vật có k h ả năng
phản giải các hợp châ"t phospho khó tan th à n h dạng dễ tan và cây trồng có th ề đồng
hóa dược.
Phospho (P) là ngun tơ" quan trọng đôi với p h á t triể n của cây trồng. Hợp chất
2Ï


p dễ tiêu đối với cây trồ n g ở trong đ ấ t thường khơng đủ đáp ứng vói n h u cầu của
thực vật, n h ấ t là n h ũ n g cây có n ăn g s u ấ t cao. Để khắc phục tìn h trạ n g này, p h â n lân
được dùng rộng rã i trong nông nghiệp là các loại su p ep h o sp h at, p h â n lâ n n u n g
chảy,... song cũng có th ể dùng các hợp c h ất hữu cơ có trong xác động, thực v ậ t vào
trong d ất hoặc các hợp c h ấ t p vơ cơ khó ta n được vào đ ấ t nhờ có vi sin h v ậ t p h â n giải
các hợp ch ât nàv th à n h các dạng dễ tiêu. N hư vậy cũng đã có hiệu quả k in h tế.
1.2.1. Phân giải hợp chất phospho hữu cơ

Các hợp c h ấ t phospho hữu cơ có trong cơ th ê động v ật, thực v ậ t n h ư phytin,
phospholipit, ax it nucleic. Trong khơng bào của tê bào cịn th ấ y d ạn g vô cơ là
o rthophosphat làm nhiệm vụ đệm và c h ất dự trữ. Cây trồ n g khơng th ể trực tiếp
đồng hóa được hợp c h ất phospho hữu cơ. Các vi sin h v ậ t có th ể chuyển hóa các hợp
c h ất hữu cơ này th à n h các dạng muối p h o sp h at của H 3P 0 4.
Phytin là muối Ca và Mg của axit phytic. Trong đ ất có những dẫn x u ất của phytin
như inositol, inositol m onophosphat, inositol triphosphat. Các ch ất này đều có nguồn
gơc- thực vật. P hytin và d ẫn x u ất chiếm khoảng 40 - 80% phospho có trong đất.
Phospholipit là hợp c h ấ t k ết hợp lipit với p h o sp h at có tro n g đ ất.
Axit nucleic, nucleoprotein trong đất có nguồn gổc là thực vật, động v ật và vi sinh
vật. Hàm lượng các c h ấ t này ở trong đâ't < 10%.
Các ui sinh vật p h â n giải p (lân) hữu cơ:
Trong số các vi sin h v ậ t phân giải p hữu cơ ta th â y có các lồi thuộc giơng
Bacillus (fì. megatherrium, B. subtìlìs, B. malaberensis). B. megatherium có k h ả
nàng p h á n hủy hợp c h ấ t p hữu cơ và cơ vơ. Ngồi ra, còn th ấ y các chủng vi k h u ẩ n
thuộc giông Sarratia, Proteus, Athrobacter, các chủng n ấm thuộc giông Aspergillus,
Pénicillium, Rhizopus, Cunnighamella và xạ k h u ẩ n Streptomyces.
1.2.2. Phân giải hợp chất phospho vô cơ
llỢp ch ất phospho vô cơ (thường gọi là lân vô cơ) thường ở các d ạn g khoáng như
ap atit, p h osphat sắt, p h o sp h a t nhóm. Đâv là các hợp c h ất khó ta n và cây trồng
khống thổ đồng hóa trự c tiếp dược. Đổ cây trồng sử d ụ n g trự c tiếp được, cần phải
biên chúng th à n h dạng dễ ta n trong nưóc.
Các dạng lân hữu cơ như phần trên đã đề cập tới nhờ vi sinh v ật khống hóa (phân
giải) thành lân vơ cơ (muôi của axit phosphoric) và được cây trồng sử dụng một phần,
cịn lại biến th àn h dạng khó tan như Ca:i(P0 2)2, FePOj và A1P0|. Các muối phosphat
này khó tan, nhưng ở đất có pH thích hợp (dất có phản ứng axit) sẽ chuyển hóa th àn h
dạng dê tan. Sự biên đổi này trông chờ vào hoạt động của vi sinh v ậ t vùng rễ.
N hiều công trìn h n ghiên cứu dã xác định n h iều chủng thuộc các giơng vi sinh
vặt có k h ả năng p h â n giải lân vô cơ:
—Vĩ khuấn: Pseudomonas, Alcaligennes, Achromobacter, Agrobacterium, Aerobacter,

B m tbacterium , Micrococcus, Flavobacter,...
—N ấm -Aspergillus, Pénicillium, Rhizopus, Scỉerotium,...
—Xạ khuẩn: Streptomyces.


1.2.3. C ơ chế sự phân giải hợp chất phospho
Đại đa số các cơng trìn h nghiên cứu đều cho rằng, sự p h â n giải Ca3( P 0 4)? có liên
quan đến sự tạo th à n h ax it tro n g q trìn h sơng của vi sin h v ậ t ở vùng rễ cây trồng.
Ở vùng này có nh iều vi k h u ẩ n sinh axit (lactic, axetic, butyric,...), tro n g đó có axit
cacbonic (H2C 0 3). A xit này cũng th am gia vào p h ân giải C a3( P 0 4)2:
C a3(PO ,)2+ 4H 20 + 4 C 0 2 ------ > 2 C a(H C 0 3) + C a(H 2P 0 4)2
Trong đất, các vi k h u ẩ n n itr a t hóa, vi k h u ẩ n chuyển hóa lưu h u ỳ n h (S) cũng có
tác dụng trong p h â n giải C a3( P 0 4)2.
Người ta cho rằn g , q trìn h hịa ta n các hợp c h ất lân khó ta n có th ể theo cơ chê:
lân khó ta n tạ m thời được vi sinh v ậ t đồng hóa, sau đó giải phóng khỏi tế bào vi sinh
vật là hợp c h ất lân dễ tiê u câv trồng có th ể đồng hóa được.
Q trìn h p h â n giải hợp c h ấ t lâ n khó ta n chịu ảnh hưởng một số nhân tô:
- Độ pH: Có ả n h hưởng đến p h ân giải lân không nhiều. 0 pH 7,8 —7,9 tác dụng
tốt đến p h á t triể n của hệ vi sinh v ật p h ân giải lân.
- Độ ẩm: Độ ẩm cao, n h ấ t là ruộng ngập nước có h àm lượng axit hữu cơ cao do
hoạt động của vi sin h vật, làm tà n g q trìn h p h â n giải lân khó tan.
- Q trìn h m ùn hóa khơng ả n h hưâng đến quá trìn h p h â n giải lân, nhưng ở
■quá trìn h này nhờ p h â n giải các hợp ch ất lân hữu cơ dở d an g m à vi sin h v ậ t có thế
đồng hóa và p h á t triển , sau đó th ả i ra mơi trường n hữ ng hợp c h ấ t dễ tan .
- Vi sinh v ậ t vùng rỗ phong ph ú kích thích sinh trư ởng và p h á t triển của vi sinh
vật. đồng thời cũng làm tă n g cường sự p h ân giải các hợp c h ấ t lân khó tan .
1.2.4. Sản xuất các chế phẩm làm phân lân vi sinh
a) P h â n lậ p v à tu y ể n c h ọ n c h ủ n g v i sin h v ậ t p h â n g iả i lâ n
N guồn VI sinh v ậ t thường là m ẫu đ ấ t lấy ở nơi có n h iều châ't h ữ u cơ hoặc vùng rễ
cây trồng. Theo phương pháp dịch huyền phù, m ẫu được pha lỗng cấy vào mơi

trường thạch vô trù n g trong các hộp Petri, sau 5 - 7 ngày, chọn các k h u ẩ n lạc riêng
biệt. Trong môi trư ờng p h â n lập chủng vi sinh p h ân hủy lân hữu cơ, người ta thường
dùng lơxitin hoặc axit nucleic làm ch ất cảm ứng. Trường hợp khơng có lơxitin và axit
nucleic ta có th ể dùng lịng đỏ trứ n g gà (sau kh i luộc chín, lấy lịng đỏ nghiền nhỏ,
dùng rượu và axeton k ết tủ a, cuối cùng dùng rượu hịa tan).
Mơi trường p h â n lập có th à n h ph ần (g/1):
MgSOị
Lơxitin
0,05

0.3


0,3

FeS04

Vết

C aC 0 3

5,0

Glucozơ

10,0

NaCl

0,3

Thạch

M nS04

Vết

Nước cho đủ 1 lít

1 5 - 1 8 ,0

Nuôi các hộp P e tri có mơi trường đã cấy dịch huyền p h ù m ẫu đ ấ t ỏ 28 —30°c
trong 3 — 4 ngày th ấ y x u ấ t hiện các k h u ẩ n lạc m àu trắ n g đục h ìn h trịn, có mép
nhãn. Soi tế bào dưới k ín h h iển vi, nếu th ấy tế bào h ìn h que h a i đ ầu hơi tròn, đứng
23


riêng rẽ hoặc k ế t chuỗi. Đó có th ể là vi k h u ẩ n p h â n giải lâ n h ữ u cơ và đấy cũng có
thể thuộc giơng Bacillus megatherium.
b) P h â n lập v à tu y ể n c h ọ n v i sin h v ậ t p h â n g iả i lâ n v ô cơ
M ẫu đ ấ t (như trên ) hoặc cánh bèo dâu, hoặc rễ cây điền th a n h là nguồn tự nhiên
đê phân lập, chọn các chủng vi k h u ẩ n có khả n ăn g p h â n giải lân vô cơ.
T h àn h p h ần môi trư ờng p h ân lập như sau (g/1) hoặc có th ể d ù n g môi trư ờng đã
giới thiệu ở trên.
Sacearozơ
10,0
0,03
M nS04
(N H 1)2S 0 4

0,03
0,5
Fe2(S 0 4)3.7H20
10,0
NaCl
CaTPO ,),
0,3
KC1
20,0
03
Thạch
Nước cho đủ 1 lít
M gS 04
0,3
Mơi trường sau k h i th a n h trù n g p h ân vào các hộp P etri, cấy dịch huyền p hù
m ầu thử, tra n g đều, nuôi ở 28 - 30°c. Sau 5 - 7 ngày xem khuẩn lạc và tế bào. N ếu
xung quanh k h u ẩ n lạc có vịng p h ân giải trong sucrt th ì đó là chủng ta cần tìm .
Để kiểm tra , ta nhỏ dung dịch am ơn m olipdat (NH4)tíMo70 24.2H 20 vào vịng phân
giải, nếu có lân dễ ta n sẽ k ế t hợp với am ôn m olipdat th à n h phosphom olipdat có k ết
tủ a m àu vàng.
c) Q uá tr ìn h lê n m e n th e o p h ư ơ n g ph áp n u ô i c ấ y c h ìm
Sinh khối th u được có th ể thêm c h ất m ang và sấy khô th à n h ch ế ph ẩm vi k h u ẩ n
phân giải lân.
Chê phẩm phân giải lân hữu cơ làm phân lân vi sinh điển hình là phosphobacterin.
Phosphobacterin là ch ế phẩm p h ân bón được chế từ vi k h u ẩ n Bacillus megaterium
var. phosphoticum. Vi k h uẩn hình que nhỏ, kích thước tế bào là (1,8 - 2) X (2,5 - 6)pm.
Chúng hiếu khí, tạo th à n h bào tử và có k h ả n ăn g k h á n g hóa r ấ t h ữ u hiệu các hợp
c h ất phospho hữ u cơ, n h ư nucleotit, axit nucleic, lơxitin, phy tin ,... và cung cấp cho
cây những hợp c h ất phospho có th ể tiê u hóa được.
Giơng th u ầ n chủng có h o ạt tín h cao p h ân hủy các hợp c h ấ t phospho h ữ u cơ được

nhân giông trê n môi trư ờng rỉ đường có thêm cao ngơ và mi khống tro n g bình lắc
hoặc bỉnh ni có sục khí. Lên m en trong bình có k h u ấ y và sục k h í đến giai đoạn tế
bào vi k h u ẩ n sinh bào tử. T hu sinh khối qua ly tâm , th êm p h ụ gia rồi sấy khô bằng
sấy th ă n g hoa hoặc sấy phun. C hế phẩm th u được có độ ẩm là 2 - 3%. Mỗi gam chế
phẩm cần có ít n h ấ t 200 triệu tế bào sông.
Chê phẩm vi sinh p h ân giải lân có th ể được sản x u ấ t từ nâ'm mốic. Để có chế
phám nấm mốc làm p h â n lân vi sinh, người ta có th ể ni giơng sản x u ấ t theo
phương pháp bề m ặt trê n môi trư ờng xốp đến khi nấm sin h bào tử già th ì đem sấy
khơ ỏ dưới 45°c, sau đó trộ n với c h ất mang.
1.3. CHẾ PHẨM VI KHUẨN B iểu SINH (epiphytic)
Các vi k h u ẩ n biểu sinh thường sổng trê n bề m ặt thực vật, n h ư trê n lá, thân, rễ
cãy. Chúng sử dụng c h ấ t chiết ra từ cây. Người ta đã chọn n hữ ng chủng thuộc giống


Pseudomonas hoặc Pseudobacterium có h o ạt tín h cao, kích th ích sinh trưởng bộ rễ,
r ú t ngắn thời gian sin h trư ởng và tă n g n ăn g s u ấ t cây trồng. Có h iệu quả n h ư vậy là
do chúng sinh tổng hợp được vitam in nhóm B, h etero au x in làm kích thích sinh
trưởng cho cây trồ n g (và cịn nhiều c h ất có ích khác).
Các chủng vi k h u ẩ n thuộc 2 giống trê n không sin h bào tử, mọc tố t trê n mơi
trường có hydratcacbon và dịch chiết từ thực vật.
Sau đây sẽ d ẫn ra m ột môi trường nuôi cấy các vi k h u ẩ n n ày (g/1):
Cám mì (như ng được dùng qua dịch chiết)
20
Saccarozơ
10
Pepton
.
2,5
Nước cho tới
1 lít

pH
7
N hân giống vi k h u ẩ n tro n g bình lắc, lên m en ở tro n g b ìn h có k h u ấ y và sục kh í
2 - 3 ngày ở n h iệ t độ 26 - 28°c đến khi sinh khối đ ạ t 4 - 8g/l (tín h theo c h ấ t khô). Ly
tâm th u sinh khơi ở dạng nhão có độ ẩm 89 —92%, trộ n vối cao la n h khô, vô trù n g
làm ch ất độn h ú t nước theo tỷ lệ 1 : 1, rồi sấy khô tới độ ẩm 7%.
Chê' phẩm này có 40 - 60% tế bào sơng. N ếu sây th ă n g hoa cần có c h ất bảo vệ là
dường - gelatin,...
Chê phẩm này dùng cho lh a gieo trồng không quá 0,5kg cho tă n g n ă n g su ấ t
khoảng 10 - 15%, đơi với cây có củ - tới 20%.
C ách là m nư ớc c h iế t cám :
Cám mì hịa nước theo tỷ lệ 1 : 4, giũ ở 30°c khoảng 20 - 24 giờ cho tự p h â n nhờ
enzvm có sẵn tro n g cám, th ỉn h thoảng k h u ấy trộn, giữ ở pH 5,4 — 5,8. Sau đó gia
n h iệt tới 100°c tro n g 10 ph ú t, lọc. Dịch lọc đem pha môi trường.
Dịch chiết cám mì có 1,4% chất khử, 1,05% N - tổng; 0,04% N - NH3; 1,01% N - hữu
cơ: 0,68% p (tro, trong đó có 0,007% p và 0,34% K); 1,25 - l,5g/m3thiam in; 0,05g/m3biotin.
Ngoài các ch ế phẩm p h â n bón từ vi k h u ẩ n như giới th iệ u ở trê n , người ta còn
chú ý đến các chế phẩm từ nâ'm và đặc b iệt từ tảo. Tảo Anabeana sống hội sin h với
bèo dâu là m ột dạng p h â n bón sinh học giá trị cao, vì nó có k h ả n ăn g cô' định đạm
mạnh mẽ. Sinh khối tảo lam (Cyanobacteria ) làm ch ế phẩm khô bón cho ruộng lúa
nước đ ạ t hiệu quả lổn, vì tảo này có hoạt tín h cơ' định N2 cũng r ấ t cao.
Ngoài các loại ch ế phẩm vi sinh như trên , ngày nay còn sản x u ấ t dạng ch ế phẩm
vi sinh hỗn hợp gồm các loại vi kh u ẩn , nấm mốc, xạ k h u ẩ n dị dưỡng có k h ả năng
khống hóa các c h ất hữu cơ, đề k h á n g các loại vi sinh v ậ t gây bệnh cho cây trồng,...
làm p h ản bón sin h học đa năng.
1-4. SỬ DỤNG PHÂN BÓN VI SINH VẬT
Như trê n ta đã biết, p h â n bón vi sinh v ậ t là n h ữ n g ch ế ph ẩm vi sin h có m ật độ
t ế bào sơng từ vài v ạn đến h àn g chục triệ u (hoặc hơn tù y theo công nghệ chế tạo)
CFU/g hoặc ml. Khi được bón cho cây (đưa vào đ ấ t ro ặ c p h u n lên cây, hoặc có thế
25