0121 nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng đồng thời metformin hydroclodrid và sitagliptin trong huyết tương bằng phương pháp lc m
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (15.66 MB, 115 trang )
(em
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
BỘ Y TẾ
TRUONG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CÀN THƠ
ĐÈ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CÁP TRƯỜNG
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
DONG THOI METFORMIN HYDROCLORID VA
SITAGLIPTIN TRONG HUYET TUONG BANG
PHUONG PHAP LC-MS/MS
CHUTICH HOIDONG
La
PGS.TS. DUONG XUAN CHU
_
CHU NHIEM:
PGS. TS. PHAM THANH SUOL
CONG SU:
yf
THS. NGUYEN
NGOQC NHÃ THẢO
(em
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của nhóm thực hiện nghiên cứu. Các
số liệu, kết quả trong nghiên cứu là hoàn toàn trung thực và chưa từng được công bố
trong bất kỳ nghiên cứu nào khác.
Cần Thơ, ngày 12 tháng 11 năm 2015
Tác giả công trình nghiên cứu
Phạm Thành Si
(ae
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học,
1
MỤC LỤC
Lời cam OaT................
ng
ng
TH
HE
HE
TH Cu
go
re 1
"0101177 —....................................... iii
PHAN 1. TOM TAT DE TAI
PHAN 2. TOAN VĂN CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU
Danh mục các ký hiệu, chữ viết tắt....................
2v tt 11H.
reo x
P010:
v8.0
PP
nAẽ...
...............
xii
Danh mục hình vẽ, $0 G8... cecessssssesssessessseccerssecsessseccessecssvecersneesscsusesucssessucensessess xii
3J:706,196270 7000715158 ...........
Chương 1. TƠNG QUAN TÀI LIỆU ...........................---c--c5<22-czcccszeecszecccszerccse 3
1.1.HOẠT CHÁT METEFORMIN HYDROCHLORID. ....................................--- 3
hy
a2
1...3...
3
1.1.2. Một số phương pháp định lượng metformin hydrochblorid.,......................
. -«--.-s-« 3
1.1.3. Cơ chế tác đụng và được động học............... L1
ch nh ng TH HH TH
ng
ngờ 3
1.2. HOẠT CHÁT SITAGLIPTIN PHOSPHAT MONOHYDRATT.................... 4
1.2.1. Tính chất lý hóa.......................----2222 n1...
2...1...
crrrrrrrrrrie 4
1.2.2. Các nghiên cứu liên quan về định lượng sitaglitin phosphat monohydrat........ 5
1.2.3. Cơ chế tác dụng và dược động học.....
a)
1.3. NỘI CHUĂN SỬ DỤNG..................
1.3.1. Phenformin hydrochlorid (PF).....
...5
...5
IV
i0)()08...i.10 6000...
..............
6
1.4. CAC CONG TRINH DINH LUQNG BONG THOI METFORMIN VA
SITAGLIPTIN TRONG DỊCH SINH HỌC. .........................................5 cs2
1.5. PHÂN TÍCH DƯỢC CHÁT TRONG DỊCH SINH HỌC.............................. 7
1.5.1. Các phương pháp xử lý mẫu trong huyết tương
...................................----.ccceee 7
1.5.2. Tham định qui trình định lượng dược chất trong dịch sinh học ...................... 9
1.5.3. Ý nghĩa của một số yêu cầu thẩm định được chất trong địch sinh học........... 10
1.6. PHƯƠNG PHÁP UPLC-MS/MS...............................cccccccssesssssssestrsrsrrrrrrrre 11
1.6.1. H€ thémg UPL vnc escessssccsssscessssccacssccsnsssecusscesssscascaveresssecsarssescneceaecuesensess 11
(ae
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
1.6.2. Đầu đị hai lần khối phổ (MSM)................................ che.
12
Chương 2. ĐĨI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....................... 14
2.1. ĐÓI TƯỢNG NGHIÊN CỨU..........................-22 s
2.3. HĨA CHẤT —- THUOC THU —- TRANG THIẾT BỊ..............................-----<¿ 14
2.3.1. Chất chuẩn đối chiếu và nội chuẩn...........................---222-cscccceererceerrkrrrrrrerree 14
2.3.2. Dung mi, h6a Chat ......cecsessccsssssecsssssescossssccsssssecsessecsssnsecsssveossssessssscsssssnsvsee 15
2.3.3. Trang Ahidt Dic.c.cccececsescecccsseeccecsecscseesuccssssecarssesecseesecsussussessessesstenseeessussueseeereees 15
2.4. PHUONG PHAP NGHIEN CUU...
„16
2.4.1. Khảo sát lựa chọn nội chuẩn ([S)......................--5-2 cctSzcttkzcErEkgrkrrrrrerrrrrrie 16
2.4.2. Khao sát điều kiện khối phổ tối ưu tín hiệu MET, SGT và nội chuẩn trong
h8
8
PNNNg năắi3..............
17
2.4.3. Khảo sát điều kiện sắc ký tối ưu định lượng đồng thời MET, SGT trong
ID
2n:
NA...
....g.
18
2.4.4. Khảo sát quy trình xử lý mẫm..............................-22+ 22 ©2ztSxe+rerxtrrerxecreerxerrrerrree 18
2.4.5 Thâm định qui trình định lượng đồng thời trong MET, SGT, IS trong huyét
tương người bằng phương pháp UPLC—MS/MS.....................--«-ccssccserrssrcessrrasserasser 22
Chương 3. KÉT QUÁ NGHIÊN CỨU ..............................sscescccseeezseeerrseseraesrsrree 29
3.1. KET QUÁ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH............................ 29
3.1.1. Tối ưu hóa điều kiện khối phổ xác định MET, SGT và nội chuẩn................. 29
3.1.2. Kết quả khảo sát điều kiện sắc ký........................--5c sc 2t 22 1xEEEELkrrrkrrrkrerrree 31
3.1.3. Xây dựng quy trình xử lý mẫu và đánh giá ảnh hưởng của nền mẫu.............. 32
3.2. KET QUA THAM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHẦN TÍCH.......................... 33
ko
i26,
1n n6...
...s1....
33
3.2.2. Độ đặc hiệu — chọn lọc của phương pháp..........................--- sec
34
3.2.3. Xác định giới hạn định lượng đƯỚI........................ choi
"
36
3.2.4. Xây dựng đường chuẩn và khoảng tuyến tính .....................-....
co cccccvcccscc 37
3.2.5. Độ đúng — độ chính xác trong ngày và khác ngày ............................cceceieeeeiee 39
3.2.6. Xác định tỉ lệ thu hồi của hoạt chất và nội chuẩn...........................---5-csserxrersree 40
(ae
Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học
3.2.7. Kết quả nghiên cứu độ Ôn địnhh.........................-----set E921 2EEE9221211521xsrkx 41
Chương 4. BÀN LUẬN ...........................--2-2°cc
¿9 0005.797...
........
45
4.1.1. Tối ưu hoá điều kiện khối phổ xác định MET và SGT......................... --scxs-cxs 45
4.1.2. Khao sát lựa chọn chất nội nội chuẩn ...........................2.. -¿-cccecrLkecrkxerrrkeerrrkerre 46
4.1.3. Khảo sát điều kiện sắc ký.........................---sc
22s c2 222.2EExcEEEkeEEE.Erkrrrrrrrkrree 48
4.1.4. Kỹ thuật xử lý mẫy..........................-+. 22 s37 TH. ESE. A1113 E1178 711173251. re 51
4.2. THÂM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ..................................-.-------> 52
4.2.1. Tính tương thích hệ thống.................À...-2-22 2 c2 92109 195911251 EEx2E171xEEersrkrsre 52
4.2.2. Độ đặc hiệu — chọn lọc của phương pháp.....................-ác + S2 ntrerrirrerree 53
4.2.3. Xác dinh gidi han dinh long du6i occ
sesessesesseeeecsseesssssesevsrsseeenessessseess 54
4.2.4. Xây dựng đường chuẩn và khoảng tuyến tinh ........................
22-22 ccs+crxeerxeeree 54
4.2.5. Độ đúng — độ chính xác trong ngày và khác ngày..........................eocece.54
600/507.
460
~......................
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
Šẽ....,.........,.
57
50
(ae
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học,
1
PHẦN 1: TÓM TẮT ĐỀ TÀI
Trước xu thế hội nhập và nhu cầu nâng cao chất lượng điều trị, Bộ Y tế đã
ban hành thông tư 08/2010/TT-BYT, ngày 26/4/2010 về việc Hướng dẫn báo cáo
SỐ liệu nghiên cứu sinh khả dụng/tương đương sinh học trong đăng lý thuốc.
Theo thông tư này, metformin và sitagliptin (thuộc nhóm làm hạ đường huyết) là
các dược chất được đưa vào điều 6 “Nguyên tắc lựa chọn các được chất đưa vào
Danh mục các dược chất yêu cẩu báo cáo số liệu nghiên cứu trơng đương sinh học
khi đăng ký” [8].
Trên thị trường quốc tế, hãng MSD đã bào chế sản phẩm Janumet XR kết hợp
500mg metformin va 50mg sitagliptin dạng phóng thích kéo đài trong thời gian còn
độc quyền và sắp hết hạn. Sân phẩm nhằm điều trị bệnh ĐTĐ týp 2, căn bệnh đang
là một trong những mối quan tâm hàng đầu của thế giới [1].
Theo hiệp hội ĐTĐ Hoa Kỳ (ADA), ĐTĐ có tốc độ tăng nhanh chóng từ 382
triệu người (2013) đến khoảng 471
mắc bệnh được dự đoán vào năm 2035 [30].
Đây là tiềm năng lớn cho thuốc generic của các công ty trong sản xuất trong nước,
song chưa có nghiên cứu SKD/TĐSH
được tiến hành tại Việt Nam. Bên cạnh đó,
một số doanh nghiệp dược trong nước cũng đang bắt đầu nghiên cứu sản xuất thuốc
generic có chứa hai hoạt chất này, do vậy nhu cầu nghiên cứu về SKD và TĐSH đối
với metformin và sitagliptin là rất cần thiết và thực tiễn.
Để thực hiện được các nghiên cứu đánh giá SKD
và TĐSH
các thuốc nói
chung và hai thuốc metformin và sitagliptin nói riêng, một trong những nội dung
quan trọng đầu tiên là xây dựng quy trình kỹ thuật chiết tách, xử lý mẫu và phân
tích định lượng thuốc trong dịch sinh học (máu, huyết tương, nước tiểu...). Quá
trình này thường gặp nhiều khó khăn do nồng độ thuốc trong mẫu thường rất thấp;
mẫu có nhiều thành phần tạp chất, đồng thời thiết bị phân tích cũng cần có độ chính
xác, độ đặc hiệu cao và giới bạn định lượng thấp. Vì thế, hệ thống phân tích
LC-MS/MS ra đời là bước nhảy vọt về kỹ thuật phân tích, tạo điều kiện cho các nhà
khoa học thực hiện được các nghiên cứu sinh khả dụng một cách dễ dàng.
(ae
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
1
Xuất phát từ những thực tế trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu:
“Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng đồng thời metformin
hydrochlorid và sitaglipin trong huyết tương bằng phương pháp LC-MS/MS”
1. Khảo sát điều kiện sắc ký và khối phổ thích hợp cho việc định lượng đồng
thời
metformin
hydrochlorid
và sifaglipin
trong huyết
tương
người
bằng phương pháp LC-MS/MS.
2. Thâm định quy trình định lượng đồng thời metformin hydrochlorid và
sitagliptin trong huyết tương người bằng phương pháp LC-MS/MS
hướng dẫn của US-EDA.
Đối tượng
nghiên
cứu: Mẫu
theo
,
trắng: huyết tương trắng; mẫu chuẩn: hịa tan
metformin va sitagliptin trong hổn hợp
dung mơi MeOH
— nuréc
(8:2, tt/tt);
mẫu tự tạo: là mẫu chuẩn bị bằng cách pha chất chuẩn của chất cần phân tích
hoặc nội chuẩn trong huyết tương trắng. Mẫu kiểm chứng/ kiểm tra (mẫu QC):
mẫu tự tạo chứa hoạt chất cần phân tích với nồng độ đã biết trước nằm trong
khoảng đường chuẩn của phương pháp. Các mẫu QC được chuẩn bị độc lập so
với các mẫu của đường chuẩn và thường được sử dụng để đánh giá độ đúng,
độ chính xác của quy trình phân tích.
Thiết kế nghiên cứu: Khảo sát lựa chọn nội chuẩn (IS), tìm điều kiện khối phổ
t6i wu cho tin hiéu cha MET,
tách hồn tồn MET,
nội
chuẩn
có
trong
SGT, nội chuẩn;
điều kiện sắc ký thích hợp để
SGT cũng như qui trình chiết tối ưu cho hoạt chất và
mẫu
huyết
tương
người.
Từ
đó,
tiến
hành
thấm
định
phương pháp theo hướng dẫn của US-FDA..
Kết quả nghiên cứu: nội chuẩn được lựa chọn là phenformin hydrochlorid với
điều kiện khối phê tơi ưu tín hiệu thé mao quan, thé cone, nang long phân mảnh
ion lần lượt của MET, SGT và IS là 3,5kV; 40V và 20, 18, 18V. Điều kiện sắc ký
thích hợp cho sự tách là: cột phenomenex
pha động MeOH
Gemini
C18
(150 x 4,6 mm,
5 pm);
- nước acid formic 0,1% (45:55, tt/tt); tốc độ dòng: 0,8 mÍ/phút;
nhiệt độ cột: khơng điều nhiệt; thể tích tiêm mẫu: 10 pl; nhiệt độ autosampler: 20°C.
(ae
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học,.
1
"hương pháp phân tích được thấm định có độ chọn lọc cao với MET
và SGT,
ó LLOQ 5,0268 ng/mL, đối với MET (bằng khoảng 1/200 Cmax), có khoảng nồng
lộ tuyến tính lớn (5,028 — 3217,1296 ppb); LLOQ của SGT là 0,986 ng/mL (bang
“hoảng 1/220 Cmax), có khoảng nồng độ tuyến tính lớn 0,9986 — 798,8992 ppb; độ
lứng cao 87,23% đến 109,28% đối với MET và trong khoảng 85,67% đến 12,39%
lối với SGT; độ chính xác trong ngày và khác ngày nhỏ (đưới 10%); ổn định trong
liều kiện bảo quản huyết tương ở nhiệt độ phịng trong 6 giờ.
Kết luận: Quy trình định lượng đồng thời metformin hydrochlorid và
ifagliptin trong huyết tương người bằng phương pháp LC—-MS/MS được phát triển
rà thâm định đạt yêu cầu theo hướng din cia US-FDA.
(em
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
K
|
PHAN 2: TOAN VAN CONG TRINH NGHIEN CUU
(ae
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
DANH MUC CAC KY HIEU, CHU VIET TAT
Chữ viết tắt
Tw nguyén
ACN
Acetonitril
CE
DAD
Capillary Electrophoresis
Điện đi mao quản
Diode Array Detector
Đầu đò đấy diođ quang
DĐVN
Dược điển Việt Nam
DTD
Đái tháo đường
ESI
FDA
Electrospray Ionization
Ton hóa bằng phun mù electron
The United States Food and
Cục quản lý được phẩm và thực
Drug Administration
phẩm Hoa Kỳ
High Performance Liquid
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
HPLC
Chromatography
Nghĩa tiếng Việt
.
HQC
High quality control
Mẫu kiểm tra nồng độ cao
1S
Internal Standard
Nội chuẩn
LLOQ
Lower Limit of Quantification
Giới hạn định lượng đưới
LOD
Limit of Detection
LOQ
Giới hạn phát hiện
Limit of Quantification
Giới hạn định lượng
LQC
Low quality control
Mẫu kiểm tra nồng độ thấp
MET
Metformin
MeOH
Methanol
MQC
Medium quality control
MRM
Multiple reaction monitoring
MT
Metoprolol
PF
Phenformin
RSD
Relative Standard Deviation
Độ lệch chuẩn tương đối
Area
Diện tích
Signal / Noise
Tín hiệu / Nhiễu
S/N
Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình
(ae
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học.
1
DANH MỤC CÁC BẰNG
Tên bảng
Bảng 1.1. Một số phương pháp định lượng đồng thời MET và SGT trong
Trang
7
huyết tương
Bang 1.1. Các hướng dẫn thấm định được chất trong dich sinh hoc
Bang 2.1. Thông tin các chất chuẩn và nội chuẩn
14
Bảng 2.2. Các trang thiết bị dự kiến được sử dụng trong nghiên cứu
15
Bảng 2.3. Nồng độ của mẫu tự tao trong huyét trong
19
Bảng 2.4. Nồng độ của mẫn kiểm tra (QC)
19
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát lựa chọn chất nội chuẩn
29
Bảng 3.2. Các thông số của detector khối phố đùng để định tính, định
30
lượng MET và SGT và IS
Bảng 3.3. Kết qua khao sát các quy trinh xử lý mẫu
33
Bảng 3.4. Kết quả kiểm tra tính tương thích của hệ thống UPLC-MS/MS
33
Bảng 3.5. Kết quả độ nhiễu (%) giữa đáp ứng píc của dược chất ở mẫu
trắng và mẫu tự tạo
Bảng 3.6. Kết quả xác định giới hạn định lượng đưới (LLOQ) của MET và
36
SGT
Bang 3.7. Két qua khảo sát đường chuẩn của MET va SGT
37
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày
39
của MBT (n= 5)
Bảng 3.9. Kết quả khảo sát độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày
40
của SGT (n=5)
Bảng 3.10. Kết quá xác định tỉ lệ thu hồi của hoạt chất và nội chuẩn (n = 6)
41
Bảng 3.11. Kết quả đánh giá độ ôn định của dung địch chuẩn gốc (n = 6)
42
Bảng 3.12. Kết quả độ ổn định của mẫu huyết tương sau 3 chu kỳ đông —
42
rã đông
(ae
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học...
bì
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỊ THỊ
Tên hình
Trang
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của metformin hydrochlorid
3
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của sitagliptin phosphat monohydrat
4
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của phenformin hydrochlorid
6
Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của metoprolol succinat
6
Hình 1.5. So dé cua giao diện ESI
12
Hình 1.6. Sơ đỗ khối của ba tứ cực nối tiếp (triple quadrupole)
13
Hình 1.7. Sơ đồ khối hệ thống Xevo TQD
Hình 2.1. Hệ thống UPLC-MS/MS của Waters
Hinh 2.2. So dé quy trình xử lý mẫu bằng phương pháp chiết lỏng -
13
16
20
lỏng
Hình 2.3. Sơ đồ quy trình xử lý mẫu bằng phương pháp tua protein
21
(khơng cơ quay)
Hình 2.4. Sơ đồ quy trình xử lý mẫu bằng phương pháp tủa protein(có
22
cơ quay)
Hình 3.1. Phổ so sánh năng lượng phân mảnh tối ưu và các mảnh tạo
thành 2 nội chuẩn PE và MT khảo sát
29
Hình 3.2. Năng lượng phân mảnh tối ưu và các mảnh tạo thành của
31
MET (a, b) và SGT (c, d)
Hình 3.3. Phé 46 MS2 (MRM, ES+) MET, SGT va IS 6 diéu kiện sắc
ký và khối phổ tối ưu
32
Hình 3.4. Phố đồ của MET, SGT, IS trong khảo sát độ đặc hiệu
35
Hình 3.5. Đường chuẩn của MET, SGT được vẽ bằng phần mềm
38
Targetlynx 4.1
(ae
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
PHAN MO DAU
Vào những năm 60 cia thé ky XX, van dé sinh khả dụng của thuốc được đề
cập đến và nhanh chóng trở thành vấn đề được hầu hết các tập đoàn dược phẩm đa
quốc gia quan tâm và phát triển. Cho đến nay, nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng
(SKD) và tương đương sinh học (TĐSH) đang được cơ quan quản lý Dược và các
doanh nghiệp dược Việt Nam đặc biệt chú trọng quan tâm. Đó là một việc làm rất
cần thiết nhằm sản xuất những thuốc có hiệu quả điều tri cao, phục vụ người bệnh
với giá cả hợp lý, phù hợp điều kiện kinh tế và thúc đẩy nhà sản xuất không ngừng
nâng cao chất lượng dé có tính cạnh tranh cao. Đồng thời, các nghiên cứu này còn
cung cấp thêm bằng chứng chất lượng, làm cơ sở cho bác sĩ lựa chọn thuốc thay thế
hoặc điều chỉnh liều trong thực hành lâm sàng.
Trước xu thế hội nhập và nhu cầu nâng cao chất lượng điều trị, Bộ Y tế đã
ban hành thông tư 08/2010/TT-BYT, ngày 26/4/2010 về việc Hướng dẫn báo cáo
số liệu nghiên cứu sinh khả dụng/tương đương sinh học trong đăng ký thuốc. Theo
thông tư này, metformin và sitagliptin (thuộc nhóm làm hạ đường huyết) là các
được chất được đưa vào điều 6 “Nguyên tắc lựa chọn các dược chất đưa vào Danh
mục các được chất yêu cầu báo cáo số liệu nghiên cứu tương đương sinh học khi
đăng ký ” [R].
Trên thị trường quốc tế, hãng MSD đã bảo chế sản phẩm Ianumet XR kết hợp
500mg metformin và 50mg sitagliptin dạng phóng thích kéo dài trong thời gian còn
độc quyền và sắp hết hạn. Sản phẩm nhằm điều trị bệnh ĐTĐ týp 2, căn bệnh đang
là một trong những mối quan tâm hàng đầu của thế giới [1].
Theo hiệp hội ĐTĐ Hoa Kỳ (ADA), ĐTĐ có tốc độ tăng nhanh chóng từ 382
triệu người (2013) đến khoảng 471
mắc bệnh được đự đoán vào năm 2035 [30].
Đây là tiềm năng lớn cho thuốc generic của các công ty trong sản xuất trong nước,
song chưa có nghiên cứu SKD/TĐSH được tiến hành tại Việt Nam. Bên cạnh đó,
một số doanh nghiệp dược trong nước cũng đang bắt đầu nghiên cứu sản xuất thuốc
(ae
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
generic có chứa hai hoạt chất này, do vậy nhu cầu nghiên cứu về SKD và TĐSH đối
với metformin và sitagliptin là rất cần thiết và thực tiễn.
Để thực biện được các nghiên cứu đánh giá SKD
và TĐSH
các thuốc nói
chung và hai thuốc metformin và sitagliptin nói riêng, một trong những nội dung
quan trọng đầu tiên là xây đựng quy trình kỹ thuật chiết tách, xử lý mẫu và phân
tích định lượng thuốc trong dịch sinh học (máu, huyết tương, nước tiểu...). Q
trình nảy thường gặp nhiều khó khăn do nồng độ thuốc trong mẫu thường rất thấp;
mẫu có nhiều thành phần tạp chất, đồng thời thiết bị phân tích cũng cần có độ chính
xác, độ đặc hiệu cao và giới hạn định lượng thấp. Vì thế, hệ thống phân tích ỦPLCMS/MS ra đời là bước nhảy vọt về kỹ thuật phân tích, tạo điều kiện cho các nhà
khoa học thực hiện được các nghiên cứu sinh khả dụng phức tạp.
Xuất phát từ những thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện dé tai:
“Nghiên
cứu
xây
dụng
quy
trình
định
lượng
đồng
thoi
metformin
hydrochlorid và sitagliptin trong huyết tương bằng phương pháp LO-MS/MS”
Với các mục tiêu:
1.
Khảo
sát điều kiện sắc ký và khối phổ thích hợp cho việc định lượng
đồng thời metformin hydrochlorid và sitagliptin trong huyết tương bằng
phuong phap LC-MS/MS.
2. Thâm định quy trình định lượng đồng thời metformin hydrochlorid vả
sifagliptin trong huyết tương bằng phương pháp LC_-MS/MS theo hướng
dẫn của US-EDA.
(ae
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
Chuong 1. TONG QUAN TAI LIEU
1.1. HOẠT CHAT METFORMIN HYDROCHLORID-
1.1.1. Tính chất lý hóa [3], [4], [15], [28]
Metformin hydrochlorid (MET) có cấu trúc hóa học như hình 1.1.
NH
HạC
`N
NH
N
big
NE
.
HCI
Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của metformin hydrochlorid
Cơng thức phân tử: C4H::N:.HƠI.
Phân tử lượng:165,6 g/mol.
Khối lượng phân tử metformin dạng bazơ: 129,2 g/mol.
Cmax của metformin trong huyết tương người (khi uống viên nén kết hợp 500
mg metformin hydrochlorid va 50 mg sitagliptin): khoang 1180 ppb.
Tén
chung
quốc
té:
metformin
hydrochlorid;
Tén
khoa
học:
1,1-
dimethylbiguanid hydrochlorid.
Loại thuốc: Thuốc chống DTD (uéng).
Metformin hydrochlorid 14 dang tinh thể màu trắng, tan 1/2 phần nước, 1/100
phần ethanol, thực tế khong tan trong ete, chloroform, aceton, methylchlorid, điểm
chảy khoảng 222 đến 226 °C, bước sóng cực đại là 232 nm. Metformin có pKa =
11,5 ở 32 °%C [19].
1.1.2. Một số phương pháp định lượng metformin hydrochlorid.
Trên thế giới, nhiều nghiên cứu đã sử dụng các phương pháp khác nhau để
định lượng MET như sắc ký lông hiệu năng cao, điện đi mao quản....
_ Các nghiên cứu về định lượng MET bằng phương pháp HPLC và LC-MS/MS
được tóm tắt ở Phụ lục 1.
1.1.3. Cơ chế tác dụng và dược động học
1.1.3.1. Cơ chế tác đụng [2], [4]
(ae
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
MET là dẫn xuất biguanid thuộc nhóm thuốc làm tăng nhạy cảm của tế bao
với insulin. Cơ chế tác dụng chính là giảm sản xuất glucose ở gan, ức chế sự tân tạo
glucose, làm tăng sử dụng glucose ở mô ngoại biên (cơ, mỡ), nên giảm để kháng
insulin.
1.1.3.2. Dược động học [6], [11]
MET được hấp thu chậm và khơng hồn tồn ở đường tiêu hóa. Thời gian bán
hủy của metformin khoảng 4 giờ và hiệu quả lâm sảng duy trì đến § giờ. Tác động
đạt mức tối đa khoảng 2 giờ sau khi uống.
1.2. HOAT CHAT SITAGLIPTIN PHOSPHAT MONOHYDRAT
1.2.1. Tính chất lý hóa [19], [24], [28], [46]
Sitagliptin phosphat monohydrat (SGT) có cấu trúc hóa học như hình 1.2.
F
NH, O
N
F
w¬*Z N
`.
CF,
.H,PO,
.H,O
Hình 1.6. C4u tric héa học của sitagliptin phosphat monohydrat
Công thức phân tử : CisHisFeNsO. H3PO4.H20.
Tên quốc tế: sitagliptin; Tên khoa học: 7 — [(@R) - 3 — amino — 1 — oxo — 4—
[(2,4,5 — trifluorophenyl) butyl] — 5,6,7,8 — tetrahydro — 3 — (trifluoromethyl) —
1,2,4 — triazolo [4,3-a] pyrazin phosphat (1:1) monohydrat.
Phan tr long sitagliptin phosphat monohydrat: 523,32 g/mol.
Khối lượng phân tt sitagliptin dang bazo: 407,314 g/mol.
Cmax cha sitagliptin trong huyết tương người (khi nống viên nén kết hợp 500
mg metformin hydrochlorid va 50 mg sitagliptin): khodng 414 nmol/l (trong ứng
khoảng 168,63 ppb).
Loại thuốc: Thuốc chống ĐTĐ (uống), nhóm ức chế men DPP-4.
Sitaglipin
là dạng
tỉnh thể màu
trắng, tan trong nước
và N,N-dimethyl
formamid, tan it trong ethanol khan, tan it trong methanol, kém tan trong acetonitril,
(ae
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học,
không tan trong heptan, isopropanol, isopropyl acetat, chloroform. Diém chay tir
215 —217°C, pKa= 7,7 [19], bude séng phat hién 14 265 nm [10].
1.2.2. Các nghiên cứu liên quan về định lượng sitaglitin phosphat monohydrat.
Cho đến nay, vẫn chưa có chuyên luận kiểm nghiệm SGT trong Dược điển
Việt Nam IV nhưng đã có chuyên luận về sitagliptin phosphat monohydrat và viên
nén sitagliptin trong dược điển châu Âu (EP) 8.7 [44], được điển Mỹ (USP) 39 [46].
Có nhiều nghiên cứu đã ứng dụng các phương pháp như UV-Vis, HPLC, dién
di mao quản (CE) và LC-MS/MS
để định lượng SGT. Các nghiên cứu liên quan
đến định lượng SGT bằng phương pháp HPLC và LC-MS/MS trong huyết tương
được tóm tắt trong Phụ lục 2.
1.2.3. Cơ chế tác dụng và dược động học
1.2.3.1. Cơ chế tác dung [2], [7]
SGT thuộc nhóm thuốc ức chế enzym DPP-4 là enzym thủy phân hormon
increafin thành các chất bất hoạt. Cơ chế kiểm sốt đường huyết của SGT thơng qua
việc làm tăng lượng hormon increatin. Cả bai tác động trên đều phụ thuộc vào nồng
độ glucose huyết tương. Vì thế, khác với các nhóm thuốc khác, SGT khơng gây hạ
đường huyết.
1.2.3.2. Dược động học [2]
Hấp thu: sinh khá dụng tuyệt đối của sitagliptin khoảng 87%.
Phân bố: thé tích phân bố trung bình ở trạng thái ổn định sau khi tiêm tinh
mạch với liều đơn sifapgliptin 100mg ở người khỏe mạnh là 198 lít.
Thải trừ: thời gian bán huỷ sau khi uống một liều 100mg là 12,4 giờ và độ
thanh thải qua thận khoảng 350 ml/phút.
1.3. NOI CHUAN SỬ DỤNG
1.3.1. Phenformin hydrochlorid (PF) [19]
Phenformin hydrochlorid (PF) có cấu trúc hóa học như hình 1.3.
(ae
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học.
)
|
Hình 1.7. Cấu trúc hóa học của phenformin hydrochlorid
Cơng thức phân tử: C¡oH¡zN:.HCI, phân tử lượng: 241,7 g/mol; phân tử lượng
phenformin dang bazơ: 205,3 g/mol
Tén
chung
quéc
té:
phenformin
hydrochlorid;
Tén
khoa
hoc:
1-
Phenethylbiguanide hydrochlorid.
Loại thuốc: Thuốc chống DTD (uéng).
Phenformin hydrochloride là một đạng bột tinh thể màu trắng hoặc gần trắng,
khơng mùi với điểm nóng chảy 175 ~ 178 °C,
hoa tan vào 1 trong 8 phần nước và
1 trong 15 ethanol, thực tế không tan trong chloroform, ether. Hằng
số phân ly
(pKa) là 11,8 (ở 32 °C), và hệ số phân bố log P (octanol/nước) = -0,8.
1.3.2. Metoprolol succinat (MT) [19], [46]
Metoprolol succinat có cấu trúc hóa học như hình 1.4.
H;CO
oN
H
OH -
CH,
A
°
CH,
9
HO
|
Oo
2
OH
Hình 1.8. Cấu trúc hóa học của metoprolol succinat
Cơng thức phân tử: (C1:HazNOs);.C4HsOÖs, phân tử lượng metoprolol succinat:
652,82 g/mol, phân tử lượng metoprolol dạng bazơ: 267;4 g/mol.
Tên
chung
quốc
tế:
metoprolol
succinat
Tên
khoa
học:
(RS)-1-
(Isopropylamino)-3-[4-(2-methoxyethyl)phenoxy] propan-2-ol.
Loại thuốc: Thuốc chen betal — adrenergic; thuốc chống tăng huyết ap.
Metoprolol là dạng bột kết tỉnh hoặc tỉnh thể nhỏ màu trắng, tan nhiều †rong
nước, methanol, hơi tan trong isopropanol, không tan trong ete. Điểm chảy: 120 0C.
(ae
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
1.4. CAC CONG TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐƠNG THỜI METEORMIN VÀ
SITAGLIPTIN TRONG DỊCH SINH HỌC
Một số phương pháp định lượng đồng thời MET và SGT trong dịch sinh học được
trình bày ở bảng 1.1.
Bang 1.2. Một số phương pháp định lượng đồng thời MET và SGT trong huyết tương
Nim/
Tàiliệu
Đối tượng
nghiên cứu
ne
2011 — Vếtmáu
[32]
2012
khôngười
++z_z.
Xử lý mẫn
FTA
DKMP-C
[33]
tương người
Huyét
~ Chiét pha ran
2013
Huyét
Tua protein
[21]
tương người
2014
Huyét
[42]
tuongngudi
(SPE)
Phương pháp
P
hân tích
PL,
Thời gan
phân tích
mẫu (phú)
MS/MS
của
LLOQ
——— (pb) _
MET
SGT
10
;
CZE
10
6390
1480
bằng ACN
LC-MS/MS
2
25
5
Tua protein
LC_MS/MS
32
10
3
bang ACN
1.5. PHAN TICH DUQC CHAT TRONG DJCH SINH HOC
1.5.1. Các phương pháp xử lý mẫn trong huyết twong [21], [33], [35]
Huyết tương là nền mẫn phức tạp có chứa rất nhiền thành phần nội sinh (các
mỗi vô cơ, lipid, protein, chất chuyển hóa,...) nên việc chiết tách hoạt chất ra khỏi
mơi trường này gặp nhiều khó khăn do lượng mẫu ít, nồng độ hoạt chất rất thấp, số
lượng mẫu cần phân tích nhiều và có sự khác nhan giữa các cá thể nên phương pháp
xử lý và phân tích mẫu cần những yêu cầu cơ bản sau:
Tỉnh đặc hiệu cao: phần biệt được chất cần phân tích với các tạp chất lẫn trong
mẫu, đặc biệt là chất chun hóa có cơng thức tương tự.
Độ nhạy cao: nồng độ thuốc trong dịch sinh học thường rất thấp, địi hỏi
phương pháp phải có độ nhạy cao.
Thơi gian xử lý và phân tích mẫu: càng ngắn càng tốt vì số lượng mẫu cần
đánh giá trong tương đương sinh học rất nhiều, nếu thời gian phân tích kéo dài có
thé ảnh hướng đến kết quả phân tích.
(ae
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
Để đáp ứng tất cả các yêu cầu cũng như để giải quyết những khó khăn trong
việc chiết tách các hoạt chất trong môi trường huyết tương, một số phương pháp
thường đùng để xử lý mẫu trong dịch sinh học được nghiên cứu:
Phương pháp chiết pha rắn (SPE) [33]
Nguyên tắc: Là phương pháp tách riêng chất cần phân tích ra khỏi các tạp có
trong nền mẫu, đựa trên sự khác nhau về ái lực của chất cần phân tích và các tạp
chất đối với pha động (dạng lỏng) và pha tĩnh (dạng rắn).
Mẫu được đưa vào pha tĩnh, dùng dung môi thích hợp để rửa giải tạp chất ra
trước trong khi chất cần phân tích vẫn cịn được lưu giữ trên cột hoặc ngược lại. Sau
đó rửa giải chất phân tích cịn lưu giữ trên cột bằng dung mơi thích hợp.
Phương pháp này có ưu điểm là hoạt chất chiết được tỉnh khiết, chọn lọc, nền
mẫu sạch hơn, có thể làm giàu mẫu, thuận lợi cho các thiết bị phân tích sau đó. Tuy
nhiên phương pháp này có nhược điểm là phức tạp, tốn kém, do đó ở Việt Nam, kỹ
thuật này chưa được sử dụng nhiều để xử lý mẫu huyết tương.
Phương pháp kết tủa protein [21], [33], [35]
Nguyên tắc: sử dụng các tác nhân gây tủa protein để làm đơng vón và loại
phần lớn protein trong mẫu huyết tương trước khi phân tích. Một số tác nhân gây
tủa protein là:
- Thêm dung mơi hữu cơ có thể trộn lẫn được với nước như acetonitril,
methanol làm giảm hằng số điện môi của dung dịch.
- Thêm acid mạnh như acid pereloric, tricloroacetic để làm thay đổi pH
cua dung dich.
- Thêm muối như ammoni
sulft, natri clorid hoặc các ion kim loại như
Cư*2, Zn*?, Fe? dé làm thay đổi lực ion.
-Đun nóng mẫu, thay đổi pH để làm biến tính protein.
Phương pháp này có ưu điểm là đơn giản đễ tiến hành, sử dụng ít dung mơi
nên chỉ phí thấp. Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này là hoạt chất chiết
được có độ tỉnh khiết không cao, dung địch thu được đem tiêm sắc ký thường không
sạch nền làm giảm tuổi thọ cột.
(ae
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
)
Chiết phân bố lông — lông [33]
Nguyên tắc: sử dụng đung môi hữu cơ không phân cực, không đồng tan với
huyết
tương
(ethyl
acetat,
diethyl
ether,
chloroform,
diclormethan,
n-hexan,
eyclohexan...) để chiết tách chất phân tích. Khi sử dụng kỹ thuật này cần chuyển
chất phân tích sang dạng tan tốt trong đung mơi hữu cơ.
Phương pháp này có ưu điểm là đơn giản dễ tiến hành và chỉ phí thấp, nền
mẫu thường sạch hơn và có thế làm giàu mẫu. Tuy nhiên, so với phương pháp tủa
protein, phương pháp này cho hiệu suất chiết thấp hơn, phức tạp, trải qua nhiều
bước hơn và hiệu suất chiết hoạt chất thường không cao.
Trong thực tế, người ta có thể kết hợp hai hay nhiều kỹ thuật trên để xử lý
mẫu, đặc biệt với những mẫu mà khi xử lý bằng một kỹ thuật không thu được kết
quả mong muốn.
1.5.2. ThAm định qui trình định lượng được chất trong dịch sinh học [45]
1.5.2.1. Khái niệm
Thâm định một phương pháp phân tích thuốc trong địch sinh học là quá trình
xác định bằng nghiên cứu trong phịng thí nghiệm những đặc điểm đặc trưng của
phương pháp để đảm bảo phương pháp đó đạt yêu cầu với các ứng dụng phân tích
thực tế.
Các đặc điểm phân tích đặc trưng cần được thâm định bao gềm: độ đúng, độ
chính xác, độ chọn lọc, giới hạn định lượng, khoảng nồng độ tuyến tính. Ngồi ra
có thể có những yêu cầu khác tùy theo loại phương pháp và đối tượng nghiên cứu.
Mục đích của thẩm định phương pháp là chứng minh phương pháp đó đủ độ
nhạy, tín cậy và lặp lại tốt.
1.5.2.2. Các hướng dẫn thâm định được chất trong dịch sinh học [12], [29], [45]
Bảng 1.3. Các hướng dẫn thẩm định được chất trong dịch sinh học
An
che
thd.
at
Yéu cau tham dinh
STT
1
Tính tương thích hệ thống
2 _ Độ nhạy
3
Tính đặc hiệu
US-—FDA
2001
EMEA
2011
VKNTITW
—
—
—
+
+
+
-
+
=
(ae
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học 5.
3.
4 _
5
,
6
7.
Đường chuân và khoảng tuyêntính '
Giới hạn địnhlượng đưới (LLOQ)
Độ chính xác và độ đúng trong ngày
va lién ngay
Hiệu st chiết
Độ ơn định dung dich géc và chất phân
tích trong huyết tương ở điều kiện tiến
hành và bảo quản
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+/-
+
+/-
+
+
+
1.5.3. Ý nghĩa của một số yêu cầu thẩm định dược chất trong dịch sinh học
Tinh chon loc (specificity) [12], [45]
Tính đặc hiệu thể hiện khả năng phương pháp phân tích có thể xác định (định
tính- định lượng) chất cần phân tích khi có mặt các thành phần khác có thể có trong
mẫu thử.
Thơng thường các thành phần này gồm các tạp chất, sản phẩm phân hủy, chất.
nén,...
Duong chuẩn (standard curve) và khoảng nồng độ tuyến tính (quantification
range) [12], [45]
Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa đáp ứng píc (diện tích hay chiều
cao) và nồng độ thuốc trong địch sinh học.
Khoảng tuyến tính là khoảng nơng độ từ thấp nhất đến cao nhất có đáp ứng
tuyến tính. Trong khoảng nồng độ này, quy trình phân tích đã được chứng minh đáp
ứng độ chính xác, độ đúng và tính tuyến tính.
,
Độ chính xác (precision) [12], [45]
Mức độ chụm giữa các kết quả riêng biệt khi lặp lại quy trình phân tích nhiều
lần trên cùng một mẫu thử đồng nhất, được biểu thị bằng giá trị CV (%). Độ chính
xác bao gồm độ lặp lại trong ngày và độ lặp lại khác ngày.
Đối với các phương pháp phân tích thuốc trong địch sinh học độ chính xác
của phương pháp thường được xác định bằng độ chụm của kết quả phân tích các
mẫu QC.
Độ đúng (accuracy) [9], [12]
Giá trị phản ánh độ sát gần của kết quá phân tích với giá trị thực của mẫu đã
(ae
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
1
biết. Đối với phương pháp phân tích thuốc trong dịch địch sinh học độ đúng của
phương pháp thường được xác định bằng ti lệ %4 giữa lượng hoạt chất có trong các
mẫu QC (xác định bằng đường chuẩn/ khoảng tuyến tính của phương pháp) so với
lượng hoạt chất thực có trong mẫu QC.
Độ ỗn định (stability) [12], [45]
D6 ổn định của chất phân tích được khảo sát cả trong dung dịch chuẩn gốc và
trong mẫu sinh học, trong điều kiện và thời gian bảo quản đài, trong quá trình xử lý
mẫu và sắc ký.
Để đánh giá độ ôn định, người ta thường so sánh kết quả phân tích mẫu bảo
quản với các mẫu mới chuẩn bị.
Giới hạn định lượng đưới (LLOQ) [12], [45]
Giới hạn định lượng dưới là nồng độ thấp nhất trong mẫu thử có thể định
lượng được với tính đúng và tính chính xác chấp nhận.
Hiệu suất chiết (recovery) [9], [45]
Độ tìm lại của phương pháp phân tích sinh học được biểu hiện là hiệu suất
chiết của quá trình chuẩn bị mẫu.
Xác định bằng phần trăm giữa đáp ứng của chất phân tích trong mẫu đã qua
xử lý so với đáp ứng của chất phân tích trong dưng mơi pha mẫu (không qua xử lý)
1.6. PHƯƠNG PHÁP UPLC-MS/MS
Phương pháp UPLC-MSMS
được xem là một trong những cơng cụ phân
tích mạnh nhất hiện nay cho độ nhạy (fg/m]l), độ chính xác và tính đặc hiệu cao:
được ứng dụng trong phân tích mẫu được phẩm, thực phẩm,
mỹ phẩm, độc chất
học, sinh được học và được động học,...
1.6.1. Hệ thống UPLC [5], [48]
Hệ thống sắc ký lỏng siêu áp (UPLC) có thể chịu được áp suất lên đến 1200
bar cho phép phân tích với các cột sắc ký có kích thước hạt nhỏ từ 1,5 — 2 um giúp
giảm thời gian, dung môi phân tích và quan trọng hơn làm tăng khả năng phân
tách, hiệu năng cột giúp cải thiện độ phân giải và tính đặc hiện của phương pháp
lên gầp nhiều lần.
(ae
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
2
1.6.2. Đầu đò hai lần khối phỗ (MSMS) [14], [31], [46]
1.6.2.1. B6 phan ion héa phun mii electron (ESI)
.
Trong kỹ thuật ESI, từ trong một ống mao quản đường kính 0,1 — 0,5 mm,
dung địch chất điện ly phun sương ra khỏi ống vi quản vào vùng có điện trường
mạnh 3 — 6 kV, ở áp suất khơng khí.
:
Khí xung quanh các giọt sương tạo thành nhiệt năng làm bay hơi dung mơi
nên càng xa lỗ phun sương thì kích thước giọt sương cảng nhỏ đến khi tạo nên sự
tase
giai hap cac ion.
a
cmp
Analjte/Stlvent |
"Sproy NeeilleiCapillary:
‘droplets tepray)
_\
“ATHOSEHERIC PRESSURE:
:|
Hình 1.5. Sơ đồ của giao diện ESI
Ưu điểm: ESI tao ion đương hoặc âm tuy vào việc áp cực điện thé, thích hợp
cho các hợp chất kém bền nhiệt, có khối lượng phân tử lớn và có tính phân cực.
Nhược điểm: các hợp chất mà phân tử khơng mang nhóm chức dễ ion hóa có
thể áp dụng kỹ thuật ESI bằng cách tạo muối Na; K; amoni formiat hay acetat.
Tuy nhiên, với sự hiện diện của các ion này có thể tạo các sản phẩm cộng, gây khó
khăn cho việc biện giải cầu trúc hóa học.
1.6.2.2. Bộ phận phân tích khối 3 lần tứ cực (triple quadrupole) [5]
Đầu đò hai lần khối phổ (MSMS) với bộ phận phân tích khối kiểu ba lần tứ
cực ghép nối tiếp nhau như hình 1.6.2.
Trong đó Q1 sẽ chọn lọc các ion mong muốn (ion cha mẹ) được đưa vào Q2
có vai trị tạo ra sự phân ly ion do va cham (collision induced dissociation; CID)
với các khí khí trơ (Na, Heli) ở áp suất cao hơn với mức năng lượng va đập được
lựa chọn.
Qieweus
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa hoe.
Hình 1.6. Sơ đồ khối của ba tứ cực nối tiếp (triple quadrupole)
Nhờ va chạm này năng lượng động học của các ion chuyển thành nội năng
nên chúng bị phân mảnh tiếp tạo ra các ion nhỏ hơn, ion con (daughter ion). Tiếp
các ion con hình thành này được dẫn vào Q3, tách riéng va dén detector.
`
:
Oilision Gas
L3⁄4E:05 mBar __|
Hình 1.7. Sơ đề khối hệ thống Xevo TQD
Uu điểm: độ nhạy tốt nhất cho phân tích định lượng. Cho nhiều thơng tin về
cấu trúc hợp chât nhờ sự kiểm soát những ion báo trước, ion con, mảnh trung hòa.
Nhược điểm: giá thành cao, địi hơi điều kiện về hệ thống điện trường đạt
chuẩn.
