Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI
HESPERIDIN VÀ DIOSMIN TRONG VIÊN NÉN BAO PHIM DIOSFLON
Nguyễn Hà Mỹ Thùy*, Nguyễn Minh Đức*

TÓM TẮT
Mục tiêu: Nghiên cứu phương pháp định lượng chế phẩm DIOSFLON có chứa diosmin 450 mg và
hesperidin 50 mg.
Phương pháp: Dùng dimethyl sulfosid (DMSO) chiết diosmin và hesperidin ra khỏi chế phẩm và dùng
phương pháp HPLC để định lượng hai họat chất này.
Kết quả: Quy trình định lượng HPLC đã xây dựng và thẩm định cho phép định lượng đồng thời hesperidin
và diosmin với hệ số R2hesperidin= 0,9998, R2diosmin =0,9999, độ chính xác với RSD hesperidin=0,54%; RSD
diosmin=0,08%; độ đúng với tỷ lệ phục hồi 99,02 % với diosmin và 102,21 % với hesperidin.
Kết luận: Quy trình định lượng đồng thời diosmin và hesperidin bằng phương pháp HPLC đáng tin cậy và
khả thi, có thể ứng dụng vào kiểm nghiệm.
Từ khóa: diosmin, hesperidin, HPLC, DIOSFLON.

ABSTRACT
SIMULTANEOUS QUANTITATIVE DETERMINATION OF DISOMINE AND HESPERIDINE
IN DIOSFLON FILM-COATED TABLETS
Nguyen Ha My Thuy, Nguyen Minh Duc
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 570 - 573
Objectives: Study of a simultaneous quantititative method for DIOSFLON film-coated tablets containing
diosmine 450 mg and hesperidine 50 mg.
Method: Extraction of disomine and hesperidine by using dimethyl sulfoxyd (DMSO) prior to application
to HPLC.
Results: The validated HPLC procedure allowed to analyze quantitatively hesperidine và diosmine in the
product.

Conclusions: The established HPLC method is reliable and applicable for simultaneous quantitative
determination of disomine and hesperidine in ratio 9:1.
Key words: Diosmine, hesperidine, HPLC, DIOSFLON.
mạch mạn tính. Hiện nay nhu cầu việc điều trị
ĐẶT VẤN ĐỀ
bệnh này ngày càng tăng, trong khi đó thuốc
Bệnh suy tĩnh mạch là một bệnh khá phổ
ngọai nhập giá rất đắt. Vì vậy việc nghiên cứu
biến hiện nay, thể hiện qua các chứng vỡ mao
các chế phẩm có chứa hai họat chất này càng
mạch, trĩ và số triệu chứng tim mạch khác(3).
được nhiều công ty dược Việt Nam quan tâm.
DAFLON® một sản phẩm khá phổ biếncủa
Tuy nhiên, việc kiểm nghiệm đồng thời hai họat
hãng dược phẩm Servier chứa hai họat chất là
chất này vẫn gặp nhiều khó khăn.
diosmin 450 mg và hesperidin 50 mg với tỷ lệ là
Đề tài này nhằm mục đích xây dựng 1 quy
9: 1 có tác dụng chính trong diều trị suy tĩnh
*

Khoa Dược – Đại Học Y Dược TP.HCM
Tác giả liên lạc: GS. TS. Nguyễn Minh Đức

570

ĐT: 0908989865

Email:


Chuyên Đề Dược Khoa


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011
trình kiểm nghiệm đồng thời diosmin và
hesperidin trong viên DIOSFLON chứa 2
flanonoid nói trên với tỷ lệ 9:1.

ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Viên nén bao phim DIOSFLON 500, là sản
phẩm nghiên cứu của Ban NCKH-TV, được sản
xuất tại Cty dược Roussel Việt Nam.

Chất đối chiếu, hóa chất, dung môi
Chất đối chiếu: diosmin hàm lượng tính theo
khan 95%, độ ẩm 6,41 % (Mekophar), hesperidin
hàm lượng nguyên trạng 80% (Merck).
Dung môi, hóa chất: methanol HPLC
(Merck), acid acetic, DMSO PA, nước cất.

Thiết bị
Máy HPLC Shimadzu 20-AD,
Eurosphere LC 18 (150 x 4,6 mm, 5μm)

cột

Nghiên cứu Y học

Phương pháp nghiên cứu

Qua nhiều khảo sát trên các tỷ lệ dung môi
khác nhau chúng tôi chọn được pha động với tỷ
lệ như sau acicid acetic: methanol:nước
(30:32:65), Detector-UV 275 nm, thể tích bơm 20
μl, nhiệt độ cột 25 0C, tốc độ dòng 1,2 ml. Với
điều kiện trên, 2 píc hesperidin và diosmin tách
rõ đẹp trên sắc đồ HPLC.
Chiết hai họat chất ra khỏi chế phẩm bằng
DMSO, tiến hành pha loãng sao cho hàm lượng
mẫu chế phẩm và mẫu đối chiếu có hàm lượng
là diosmin chuẩn 450 μg/ml, hesperidin chuẩn
50 μg/ml. Tiến hành xác định đường hồi quy
tuyến tính, độ đúng và độ chính xác(1).

KẾT QUẢ
Sắc ký đồ HPLC thể hiện phân lập đồng thời
hesperidin và diosmin

Hình 1. Sắc ký đồ HPLC mẫu chế phẩm(trên) và mẫu đối chiếu (dưới).

Chuyên Đề Dược Khoa

571


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011

Nghiên cứu Y học
Tính tương thích hệ thống


3000000

Tiến hành tiêm lần lượt mẫu dung dịch thử
6 lần, chúng tôi thu được kết quả tính như sau.

2500000

Bảng 1. Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống
hỗn hợp diosmin-hesperidin 9:1
Tên

tR

Nồng
độ

/ l

y = 19396x - 26707
R2 = 0.9998

2000000
1500000
1000000

S

N

AF


hesperidin 7,940

883605

8944

0,802

500000

hesperidin 7,891

888244

9052

0,799

0

hesperidin 7,862

883745

9090

0,790

hesperidin 7,839


885908

9134

0,812

hesperidin 7,845

880872

9128

0,821

hesperidin 7,822

884077

9075

0,806

Trung bình 7,866

884408

9070

0,812


0

50

100

150

Diện tích đỉnh

Hình 2. Sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và
diện tích đỉnh hesperidin.

diosmin 17,379 7165011 11039

0,791 1,189 7,331

Nhận xét: có tương quan tuyến tính giữa
nồng độ và diện tích đỉnh phương trính hồi quy
có dạng y=19396x-26707, với R2 = 0,9998,
P=0,07>α=0,05.

diosmin 17,211 7172023 11051

0,792 1,181 7,317

Bảng 3. Kết quả khảo sát tính tuyến tính diosmin.

diosmin 17,141 7145204 10992


0,800 1,180 7,306

diosmin 17,064 7168565 11012

0,805 1,177 7,302

diosmin 17,077 7158432 11039

0,809 1,177 7,308

diosmin 17,018 7148269 11091

0,810 1,176 7,308

Trung bình 17,148 7159584 11037

0,801 1,180 7,312

RSD %

0,54

0,28

0,77

1,390

Tên


tR

S

N

AF

RSD %

0,77

0,15

0,31

K’

Rs

1,038 0,416 0,143

Nhật xét: RSD của các lần tiêm lập lại < 2%
nên quy trình định lương hesperidin và diosmin
đạt tốt tính tương thích hệ thống.

Khảo sát tính tuyến tính.
Khảo sát 3 dung dịch chuẩn với tương ứng 5
nồng độ hesperdin khác nhau ta thu được kết


Diện tích đỉnh
1483571
3482268
6979013
8919336
17943958

20000000
y = 16196x - 255365
18000000
R2 = 0.9999
16000000
14000000
Nồng oä 12000000
độ µg/ml
l) 10000000
8000000
6000000
4000000
2000000
0
0
500
1000

1500

Diện tích đỉnh


quả như sau
Bảng 2. Kết quả khảo sát tính tuyến tính hesperidin.

572

Nồng độ (µg/ml)
112.5
225
450
562.5
1125

Nồng độ (µg/ml)

Diện tích đỉnh

12,5

200738

25

465534

50

944875

62,5


1198620

125

2390525

Hình 3. Sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và
diện tích đỉnh diosmin.
Nhận xét: có tương quan tuyến tính giữa
nồng độ và diện tích đỉnh phương trính hồi quy
có dạng y=16196x-255365, với R2 = 0,9999,
P=0,03<α=0,05.

Chuyên Đề Dược Khoa


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011

Nghiên cứu Y học

Khảo sát độ lặp lại

Bảng 6. Kết quả khảo sát độ đúng đối với hesperidin

Thực hiện định lượng mẫu chế phẩm
DIOSFLON dựa trên điều kiện HPLC đã khảo
sát với nồng độ 450 μg/ml, hesperidin 50 μ
g/ml.

STT

1
2
3
4
5
6
7
8
9

Bảng 0. Kết quả khảo sát độ lặp lại của hàm lượng
diosmin và hesperidin
HL diosmin so với trên HL hesperidin so với trên
nhãn (mg)
nhãn (mg)
1
451,8
49,74
2
452,0
49,87
3
451,4
49,26
4
451,0
49,57
5
451,6
49,19

6
452,0
49,60
TB
452,6
49,52
SD
0,38
0,27
RSD
0,08
0,54
STT

Nhận xét: Kết quả cho độ lặp lại tốt.

Khảo sát độ đúng
Độ đúng được xác định bằng cách thêm
chuẩn. Thêm một lương chất chuẩn tương ứng
với 80, 100, 120 % nồng độ họat chất tìm thấy
trong mẫu thử. Tiến hành trên 3 mẫu thử riêng
biệt tương ứng với từng nồng độ, chúng tôi thu
được kết quả sau.
Bảng 5. Kết quả khảo sát độ đúng đối với diosmin.
STT
1
2
3
4
5

6
7
8
9

HL thêm vào HL tìm thấy
(mg)
(mg)
362,1
362,1
362,1
452,6
452,6
452,6
543,1
543,1
543,1

358,7
352,5
364,9
463,9
452,9
431,2
542,3
549,2
527,1

Chuyên Đề Dược Khoa


% HL tìm
thấy
99,06
97,35
100,77
102,50
100,07
95,27
99,85
101,1
97,05

% HL TB
tìm thấy
99,06

HL thêm vào HL tìm thấy
(mg)
(mg)
39,6
39,6
39,6
49,5
49,5
49,5
59,4
59,4
59,4

% HL tìm

thấy

39,9
40,4
41,1
49,2
49,2
49,1
60,0
61,1
60,9

100,76
102,02
103,79
99,39
99,39
99,19
101,01
102,86
102,53

% HL TB
tìm thấy
102,19

99,32

102,13


Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy phương
pháp có độ đúng cao. Tỷ lệ tìm thấy 99,02 % ở
diosmin và 101,21 % ở hesperidin cho thấy
phương pháp phù hợp và đảm bảo định lượng
đúng và đồng thời hesperidin, diosmin.

KẾT LUẬN
Các kết quả thực nghiệm cho thấy quy trình
HPLC đã xây dựng cho phép định lượng đồng
thời hesperidin và diosmin trong viên nén bao
phim DIOSFLON 500 chứa 450 mg diosmin và
50 mg hesperidin với độ chính xác cao, độ đúng
tốt, khoảng tuyến tính rộng với độ tương quan
tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ và diện tích píc
đã khảo sát. Ngoài ra, cách tiến hành cũng đơn
giản, nhanh chóng. Do đó, phương pháp này có
thể ứng dụng để định lượng đồng thời diosmin
và hesperidin trong các chế phẩm tương tự.

TÀI LIỆU THAM KHẢO.
1.

99,28

2.

99,33

3.


Nguyễn Minh Đức (2006), Sắc ký lỏng cao áp ứng dụng và
nghiên cứu Dược liệu và hóa hợp chất tự nhiên, Nhà xuất bản
Y học, Chi nhánh TP. Hồ Chí Minh
Jobiell (2002), Facts and Comparisons the Preview of Natural
Products, Second Edition. Acaeamic Press, San Diego,
California, pp 1-22.
USP XXIX, Dissolution (pp 2673 – 2682); In vitro and in vivo
evaluation of dosage forms (pp2924 – 2929); In vivo
bioequivalence guidances (pp 2929 – 2968).

573