Í Gen PL Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TÉ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CÀN THƠ

HO VAN LOI
A2222”
ĐẠI HỌC Y DƯỢC CÂN THƠ

| THU VIEN

NGHIEN CUU XAY DUNG QUY TRINH DINH LUQNG

DONG THOI PARACETAMOL, LORATADIN,
GUAIFENESIN VA DEXTROMETHORPHAN
TRONG CHE PHAM DA THANH PHAN BANG
PHUONG PHAP SAC KY LONG HIEU NANG CAO
Chuyén nganh: Kiém tehiêm Thuốc — Độc chất
Mã số: 60.72.04.10. Cy me THUVIEN
BAN Ne

ey aug* Ale wat\

LUAN VAN CHUYEN KHOA

|

I

Người hướng dẫn khoa học:
Ts. Nguyễn Thị Ngọc Vân

Can Tho — 2016


Í Gen PL Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học

(

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tơi. Các số liệu, kết
quả nêu trong luận văn này được đảm bảo tính trung thực và chưa từng được
ai cơng bồ trong bất kì cơng trình nghiên cứu khác.

Cần Thơ, tháng 09 năm 2016

[Lk

Hồ Văn Lợi


(re

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

ul

LOI CAM ON

Em

xin được kính gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô TS. Nguyễn

Thị

Ngọc Vân, trong thời gian qua cô đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những

kiến thức và kinh nghiệm quý báu, động viên và định hướng giải quyết
những vấn đề mà em gặp phải trong lần đầu tiên làm quen với công tác

nghiên cứu khoa học để em có thể hồn thành luận văn này.

Em xin chân thành cảm ơn đến các quý thầy cô và các anh chị tại Liên
bộ mơn Hóa Phân Tích - Kiểm Nghiệm - Độc chất đã động viên, khích lệ tỉnh
thần và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất trong thời gian học tập và thực hiện
luận văn tại bộ môn.

Để có thể hồn thành tốt luận văn này, khơng thể không kể đến các anh
chị cùng làm luận văn của lớp chuyên khoa I Kiểm nghiệm Thuốc -- Độc chất,

cảm ơn các anh chị vì đã quan tâm, giúp đỡ, chăm sóc và cùng nhau vượt qua
khó khăn. Cũng xin gửi lời cám ơn chân thành đến em sinh viên Dược K37
đầy năng động, nhiệt tình, cảm ơn các em đã cùng tôi học tập, rèn luyện và
chia sẽ những khó khăn trong suốt thời gian cùng nhau thực hiện luận văn.
Cuối cùng, xin được cảm ơn ba mẹ và gia đình vì đã ln là chỗ dựa
vững chắc, nguồn động lực lớn lao tiếp thêm sức mạnh về ý chí tinh thần để

con có thể vượt qua những khó khăn, thử thách và hoàn thành nghiên cứu này.



`\*

I\6[ruwpuis Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học

tt

MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Loi cam on
Muc luc
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình vẽ, sơ đồ

ĐẶT VẤN ĐÌ. . . . . . . .

HnHHHHHH.....0.2122.11..1.1...........r.rrrrrrre 1

Churong 1. TONG QUAN TALI LIEU ..............................--5° se se vse+z 3
1.1. Téng quan vé paracetamol, loratadin, guaifenesin va dextromethorphan

DI... ố.ốốố.ốố..................

3

1.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao........................5-5 5Ă 555cc cssseessrsges 14
1.3. Các


nghiên

cứu

liên quan

đến

định lượng

đồng

thời paracetamol,

guaifenesin, dextromethorphan HBr va loratadin, trong chế phẩm đa thành
phần bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ........................------ccccc¿ 16

1.4. Thâm định quy trình định lượng .............................
2e se +xxecrkerrkrrrkrrreczre 20
Chương 2. ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............ 25
2.1. Đối tượng nghiên cứu .........................-----2° 2s +k+EkE+EkEEEEEvEEEEEEEvEkketkerrkerrkvee 25
2.2. Phương pháp nghiên Cứ. ...........................-5< S211 119181111151 111cxcerrrrersee 26

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU..............................--25° c5<-cceeccse 36
3.1. Điều kiện sắc ký định lượng đồng thời PAR, GUA, DEX và LOR bằng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao........................... s-cceectvxettvrvezvrrrerre 36

3.2. Thẩm định quy trình định lượng đồng thời PAR, GUA, DEX và LOR .39
Chương 4. BAN LUAN .........................---5--s<-sscssecseeossserzsersssore seceaeeesenees 52

4.1. Khảo sát điều kiện sắc ký thích hợp............................2 ccc2-©ccvzeerrrrreecee 52


`

I\6[ruwpuis Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học

Uv

4.2. Tham định quy trình định lượng lượng đồng thời PAR, GUA, DEX và
LOR trong chế phẩm..........................--2-+S£©E+EE+EE+EEEEEEEEA202715211211211222771x
xe. 55
4.3. Dự thảo quy trình định lượng đồng thời PAR, GUA, DEX và LOR trong
chế phẩm đa thành phần bằng phương pháp sắc ký long hiệu năng cao........ 63

s05.

.-...............

400.0. ~...................
TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

66
68


IRgiruwpLt Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoahọc


v/

DANH MUC CAC TU VIET TAT
Pal

Giá trị trung bình

ACN
AOAC

Acetonitrile
Association

of

Official

Hiệp

hội các nhà hóa phân

Analytical Chemists

tích quốc tế

AS

Asymmetry factor

Hệ số bất đối


DAD

Diode array detector

Đầu đò đãy điod quang

DDVN IV

Dược điển Việt Nam 4

DEX

Dextromethorphan HBR

GUA

Guaifenesin

HPLC
ICH
k

High

performance

liquid

chromatography

International

conference

on

Hiệp hội đồng thuận quốc tế

harmonisation

Hệ số dung lượng

>

Khối lượng / thê tích

kV/tt
LOR

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Loratadin
Theoretical plates

Số đĩa lý thuyết

MeOH

Methanol


PAR

Paracetamol

PDA

Photo Diode Array

Đầu dò dãy diod quang

Pic

Peak

Đỉnh trên sắc ký đồ

Coefficient of Correlation

Hệ số tương quan

Reversed phase

Pha đảo

Rs

Resolution factor

Hệ số phân giải


RSD

Relative Standard Deviation

Độ lệch chuẩn tương đối


(re

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

S
SD

Area
Standard deviation

SKD
tr

UV-Vis

Dién tich dinh
Độ lệch chuẩn

Sac ky dé
Retention time

tt/tt
TEA


i

Thời gian lưu

Thể tích / thể tích
Triethylamin
Ultraviolet-visible
spectrophotometry

Phổ tử ngoại khả kiến


te

I\6[ruwpuis Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học

VI

DANH MỤC CAC BANG
Trang
Bảng I. 1. Tóm tắt các quy trình định lượng đồng thời các chế phẩm chứa hai
tới ba trong bốn hoạt chất khảo sát bằng HPLC............................---e2 cczxzecccecre 17
Bảng 2.1. Thành phần các pha động được khảo sát..................-...--.----- 28
Bảng 2.2. Nồng độ các dung dịch PAR, GUA, DEX và LOR xây dựng đường

Bang 3. 1. Các thông số sắc ký ở các điều kiện (7), (8), (9) trong bang 2.1...37
Bang 3. 2. Chương trình chạy gradient thích hợp........................
‹-c«- c5 ccccc

Bảng 3. 3. Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống trên mẫu chuẩn ( n=6).39
Bảng 3. 4. Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống trên mẫu thử ( n=ó) .. 39

Bảng 3. 5. Độ tỉnh khiết pic các chất của mẫu thử và độ tương thích phổ UVVis các chất mẫu thử so với mẫu chuẩn.........................-2222 ©22+s+ES2E2EE2EE2EStEszrsez 42

Bảng 3. 6. Kết quả khảo sát tính tuyến tính giữa nồng độ và điện tích đỉnh của
PAR, GUA, DEX và LOR trong hến hợp chuẩn ............................-2-2 xcccvevez 43
Bảng 3. 7. Tính tương thích, ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi qui
Bảng 3. 8. Kết quả khảo sát độ chính xác định lượng PAR trong mẫu thử.... 46
Bảng 3. 9. Kết quả khảo sát chính xác lại định lượng GUA trong mẫu thử... 47
Bảng 3. 10. Kết quả khảo sát độ chính xác định lượng DEX trong mẫu thử . 47
Bảng 3. 11. Kết quả khảo sát độ chính xác định lượng LOR trong mẫu thử.. 48
Bảng 3. 12. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng PAR,

60.9090.0909. 10... ................

50

Bảng 3. 13. Kết quả xác định hàm lượng PAR, GUA, DEX va LOR trong ché
pham Musilax......scsccssssecssssssesecsssescsssseccossssecssssessesseeeessssecssssseessssessseeeeess
senses 51
Bảng 4. 1. Kết quả đánh giá hàm lượng PAR, GUA, DEX va LOR trong ché
phẩm MuSilaX...................

.. -- + 2

2211111 22229211 811111 11553531 11111 ty nướt 62


IƒT0MPL!8 Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

Vtu

DANH MỤC HÌNH VẼ, SƠ ĐỊ
Trang
Hình 1. 1. Cấu trúc hóa học của Paracefarmol..........................¿+ 5 k2 xe re xxkz 3
Hình 1. 2. Cấu trúc hóa học của Loratadin.................... NT THng ng ngu ra 6
Hình 1. 3. Cấu trúc hóa học của Guaifenesin............................----2¿ccsczxvExetzsscrssee 9

Hình 1. 4. Cấu trúc hóa học của Dextromethorphan HBï..............................
.--- il
Hình I. 5. Sơ đồ cấu tạo máy sắc ký lỏng hiệu năng cao..........................----¿ 15
Hình 3. 1. Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn tại các bước sóng khảo sát 215 nm và 280
0h...

36

Hình 3. 2. Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn tại các điều kiện khảo sát (1),(2),(),(4)36
Hình 3. 3. Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn tại các điều kiện khảo sát (5),(6),(7)..... 37
Hình 3. 4. Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn tại các điều kiện khảo sát (7),(8),(9)..... 37
Hình 3. 5. Sắc ký đồ mẫu hỗn hợp chuẩn (1) và mẫu thử (2) ở điều kiện sắc
l‹Äi0(90.() 0N n...................

38

Hình 3. 6. Sắc ký đồ mẫu hỗn hợp chuẩn tiêm lặp lại 6 lần liên tiếp.............. 40
Hình 3. 7. Sắc ký đồ mẫu thử tiêm lặp lại 6 lần liên tiếp..........................--- 40
Hình 3. 8. Sắc ký đồ mẫu dung môi, pha động, mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu thử

012oẴ9 0

BS...

.....Ả...ƠƠ.

41

Hình 3. 9. Đồ thị tuyến tính của PAR trong hỗn hợp chuẩn........................... 44

Hình 3. 10. Dé thị tuyến tính của GUA trong hỗn hợp chuẩn........................ 44
Hình 3. 11. Đồ thị tuyến tính của DEX trong hỗn hợp chuẩn ........................ 44
Hình 3. 12. Đồ thị tuyến tính của LOR trong hỗn hợp chuẩn......................... 44
Hình 3. 13. Sắc ký đồ tính tuyến tính của PAR và GUA trong hỗn hợp chuẩn . 45

Hình 3. 14. Sắc ký đồ tính tuyến tính của DEX và LOR trong hỗn hợp chuẩn. .46
Hình 3. 15. Sắc ký đồ 6 mẫu thử khảo sát độ chính xác trong ngày............... 48
Hình 3. 16. Sắc ký đồ 3 mẫu thử khảo sát độ chính xác liên ngày.................. 49


(re

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoahọc

`

{ Xf

Hình 4. 1. Kiểm tra độ tinh khiết pic PAR - GUA trên hệ thống HPLC -PDA... 57
Hình 4. 2. Kiểm tra độ tinh khiết pic DEX - LOR trên hệ thống HPLC-PDA.... 57
Hình 4. 3. Độ tương thích phổ UV-Vis pic PAR-GUA miu thir so véi chuan trên

hệ thống HPLC - PDA.............................---.22..22L112211.11112171212...1111201120.112101...111gc.. 58
Hình 4. 4. Độ tương thích phé UV-Vis pic DEX-LOR mau thử so với chuẩn trên
hệ thống HPLC — PDA......................---2- 22¿+SEE++4EEEE1E17111112111177111212201111.222. 58


(re

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

DAT VAN DE
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời vào cuối thập
niên 60 đánh đấu một bước ngoặt mới trong lịch sử sắc ký. Phương pháp này
ngày càng được sử dụng phơ biến vì nhiều lý đo: độ nhạy cao, khả năng định

lượng đồng thời nhiều chất tốt, thích hợp tách các hợp chất khơng bay hơi và
chịu nhiệt. Trong lĩnh vực kiểm nghiệm dược phẩm, phương pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao được ứng dụng rộng rãi trong các tiêu chuẩn cơ sở cũng như
trong các chuyên luận Dược điển.
Hiện nay, trong lĩnh vực được phẩm, việc kết hợp nhiều hoạt chất trong
một công thức bảo chế nhằm phối hợp nhiều tác dụng trị liệu và thuận lợi cho

bệnh nhân sử dụng. Do đó các chế phẩm đa thành phần ngày càng phổ biến,
đặc biệt là hỗn hợp của các thuốc hạ nhiệt, giảm đau, cảm, ho, số mỗi, kháng
histamin... với rất nhiều biệt được hiện đang lưu thông trên thị trường. Bốn
hoạt chất thường thấy trong thành phần các biệt dược nảy là paracetamol
(PAR),

guaifenesin

(GUA),

dextromethorphan

HBr

(DEX)

va

loratadin

(LOR) véi hàm lượng khác nhau rất lớn, điều này thúc đây việc xây dựng các
quy trình phù hợp để định lượng các được phẩm chứa nhiều hoạt chất.
Trong các chuyên luận của DĐVN IV và được điển các nước hầu hết chỉ
có chuyên luận cho các chế phẩm có chứa một thành phần, trong USP 35 tuy
có đề cập một số chuyên luận về các chế phẩm

chứa ba hoặc bốn hoạt chất

nhưng việc phân tích các chất được tiến hành riêng biệt trên những điều kiện

phân tích khác nhau, gây sự tốn kém về dung mơi, hóa chất, thời gian.
Hiện nay khuynh hướng sử dụng pha động không chứa dung dịch đệm

muối trong các quy trình phân tích ngày càng gia tăng để tránh gây ăn mòn hệ

thống sắc ký, giảm thời gian rửa cột và hệ thống sắc ký đáng kể so với sử
dụng đệm muỗi.

(re

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

|

2

Từ những lý do trên chúng tôi tiến hành đề tài “Wghiên cứu xây dựng
quy trình

định

lượng đồng thoi paracetamol,

loratadin, guaifenesin

và

dextromethorphan trong chế phẩm đa thành phan bằng phương pháp sắc

ký lỏng hiệu năng cdø ” với hai mục tiêu:
1. Xác định

điều kiện sắc ký để định lượng đông thời PAR, GUA, DEX

và LOR bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.
2. Thẩm định quy trình định lượng đồng thời PAR, GUA, DEX và LOR
bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.

(re

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

3
Chương 1

TỎNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Tổng

quan

về

paracetamol,

loratadin,

guaifenesin

và

dextromethorphan HBr
1.1.1. Paracetamol

1.1.1.1. Công thức cấu tao [1],[17],[35]

H
N..

Y

CH;

O

HO

Hình 1. 1. Câu trúc hóa học của Paracetamol
Cơng thức phân tử: CsHạNO;

Phân tử lượng: 151,2 g/mol
Tên chung quốc tế: Paracetamol hay Acetaminophen
Tên khoa học: N-acetyl-p-aminophenol
Loại thuốc: Giảm đau, hạ sốt khơng steroid

1.1.1.2. Tính chất hóa lý [LJ,[17],[35]
- Paracetamol tén tai đạng bột kết tỉnh trắng, không mùi, vị đắng nhẹ;

hơi tan trong nước (tất ít tan trong nước lạnh, tan nhiều trong nước nóng), tan
trong ethanol (1:10), methanol,

diethylformamid,

ethylen

diclorid, aceton,

ethyl acetat; rất khó tan trong cloroform, ether, methylen clorid, dé tan trong
dung dich kiém; không tan trong ether dầu hỏa, pentan, benzen

- Điểm chảy: 168-172°C, hằng số phân ly: pKa = 9,5, hệ số phân bố
(octanol/nước): log P = 0,5.

- Amax = 257 nm (A!“ = 715) trong môi trường kiềm nhẹ; À„;„= 249
nm (A'1e„ = 668) nếu dung môi là ethanol, methanol hay dung dich HCI.


I\6[ruwpuis Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học

1.1.1.3. Dinh tinh

- Phổ hồng ngoại (IR): Phé IR cia paracetamol cho cdc dinh hấp thụ ở

các số sóng: 1227 cm}, 1263 cm, 1506 em, 1565 cm, 1612 cm], 1657

om” [1],{17], [18].
- Phổ tử ngoại — khả kiến (UV-Vis): Hòa tan một lượng bột thuốc tương
đương 0,l g paracetamol trong methanol và pha lỗng thành 100,0 ml với
cùng dung mơi. Lấy 1,0 ml dung dịch, thêm 0,5 ml dung dich acid hydrocloric
0,1 M, thêm methanol thành 100,0 ml. Bảo quan dung dich này tránh ánh .
sáng và đem đo ngay độ hấp thụ ở bước sóng cực đại 249 nm. A (1%, 1 cm)
phải trong khoảng 860 đến 980 [1],[17].
- Điểm

chảy: Nguyên

liệu paracetamol

có điểm

chảy từ 168-172°C

[1].[17].[351].
- Phản ứng hóa học [1],[17]:
+ Ðun nóng một lượng bột thuốc tương đương 0,1 g paracetamol trong 1
ml acid hydrocloric trong 3 phut, thém 1 ml nước, làm lạnh trong nước đá,
khơng có tủa tạo thành. Thêm

I giọt dung dich kali dicromat 0,49 %, xuất

hiện màu tím và khơng chuyển sang màu đỏ (phân biệt với phenacetin).
+ Hòa tan một lượng bột thuốc tương đương 0,1 g paracetamol trong 10
ml nước và thêm 1 giọt đung dịch FeCl; 2,5 %, một màu xanh tím xuất hiện.

+ Dun cach thủy một lượng bột thuốc tương duong 0,1 g paracetamol
voi 5 ml acid hydrocloric loang trong 40 phút và làm lạnh. Thêm 5 giọt natri
nitrit vao 0,5 ml dung dich, lắc kỹ, pha loãng với 3 ml nước, thêm 2 ml B-

naphthol kiềm và lắc, một màu đỏ xuất hiện.
- Sắc ký lớp mỏng [33],[35]:
+ Bán sắc ký silica gel 60 F254 (Merck).
+ Hệ dung môi: methylen clorid — methanol (4:1, tt/tt).


I\6[ruwpuis Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học

5
+ Dung dịch thử: lấy 1 lượng bột thuốc tương đương 50 mg paracetamol,
thém 50 ml methanol, lac đều, lọc để được dung dịch thử nồng độ 1 mg/ml.
+ Dung dich déi chiéu: lay 5 mg paracetamol, thém 5 ml methanol để
được dung dịch có nồng độ 1 mg/ml.

+ Lượng mẫu chấm: 10 pl.
+ Chiều dài khai triển: khoảng 10 cm.
+ Cách phát hiện: sấy khô bản mỏng, soi dưới đèn UV (bước sóng 254 nm).
+ Yêu cầu: Giá trị R; của dung địch thử và dung dịch đối chiếu phải
giống nhau.
- Phương pháp HPLC: So sánh thời gian lưu của peak khi thực hiện đồng

thời với mẫu paracetamol chuẩn [35].
1.1.1.4. Định lượng
Có 3 phương

pháp định lượng paracetamol

gồm:

chuẩn độ thể tích,

quang phổ hấp thu UV-Vis, HPLC.

- Phương pháp chuẩn độ thể tích [1].[17].[35]:
Hồ tan 0,300 g chế phẩm trong hỗn hợp gồm 10 ml nước và 30 ml dung
dich acid sulfuric lỗng (TT). Ðun sơi hồi lưu trong 1 giờ, làm lạnh và pha

loãng thành 100,0 ml bằng nước. Lấy 20,0 ml dung dịch, thêm 40 ml nước, 40

ø nước đá, 15 mi dung dịch acid hydrocloric loãng (TT) và 0,1 ml dung dich
feroin (TT). Định lượng bằng dung dịch amoni ceri sulfat 0,1 M (CĐ) cho đến
khi xuất hiện màu vàng xanh. Song song tiến hành mẫu trắng trong cùng điều

kiện.
1 ml dung dịch amoml ceri sulfat 0,1 M (CĐ) tương đương với 7,56 mg

CgHạNO:.
- Phương pháp quang phổ hấp thu UV-Vis [17] :
Cân 20 viên, tính khối lượng trung bình của bột thuốc trong một nang và
nghiền

thành bột mịn.

Cân

chính xác một

lượng bột viên tương ứng với


(re

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

6.
khoảng

0,150 g paracetamol vào bình định mức

200 mi, thêm 50 mÌ dung

dich natri hydroxyd 0,1 M (TT), thêm 100 mi nước, lắc 15 phút. Thêm nước

đến định mức. Lắc đều, lọc. Loại bỏ 10 ml dich loc đầu. Lấy chính xác 10 ml
dịch lọc cho vào bình định mức 100 ml, pha lỗng với nước đến định mức, lắc

đều. Lấy chính xác 10 ml dung dịch này cho vào bình định mức 100 ml khác,
thêm 10 ml dung dich natri hydroxyd 0,1 M (TT), pha loãng với nước đến

định mức, lắc đều. Đo độ hấp thụ (Phụ lục 4.1) của dung dịch thu được ở
bước sóng 257 nm, céc day 1 cm. Ding dung dich natri hydroxyd 0,01 M làm
mau trang.

Tính hàm lượng paracetamol, CsH)»NO, theo AC1 %, 1 cm). Lấy 715 là giá
trị A(1 %, 1 cm) ở bước sóng 257 nm.
- Phương pháp HPLC [35]:
Hòa tan paracetamol trong pha động để thu được dung dịch có nồng độ
10 pg/ml. Tién hành sắc ký theo những điều kiện sắc ký như sau:

+ Cột: RP ODS (300 x 3.9 mm, Sum)
+ Pha động: nước: methanol (3:1, tt/t
+ Tốc độ đòng: 1,5 ml/phút
+ Detector: UV (A= 243 nm)
1.1.2. Loratadin

1.1.2.1. Công thức cấu tạo [17],[35]
Z5

Hạ

N

N

for

—

\ og

Hình 1. 2. Cấu trúc hóa học của Loratadin


I\6[ruwpuis Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học

Tên chung quốc té: Loratadin
Tên

khoa

học:

Ethyl

4-(8-cloro-5,6-dihydro-11H-

benzo[5,6]cyclohepta[1,2-b]pyridin-11 -yliden)-1-piperidincarboxylat
Phân tử lượng: 382,88 g/mol

Loại thuốc: Kháng histamin
1.1.2.2. Tính chất hóa lý [17],[18],[35]
- Loratadin ở đạng bột màu trắng đến trắng ngà, kết tỉnh từ acetonitril;
không

tan trong

nước,

tan

trong

alcol

(1:10),

rất tan

trong

aceton

và

cloroform.

- Điểm chảy: từ 132-137°C, hằng số phân ly: pKa = 5,0, hệ số phân bố
(octanol/nước): log P = 5,20, Àmax= 254 nm.
1.1.2.3. Định tính

- Phổ hồng ngoại (IR): Phổ IR của loratadin cho đỉnh hấp thụ tại các số
sóng: 997 cm}, 1226 em", 1435 cm”, 1709 cm [17],[18],[35].
- Điểm chảy: Từ 132-137°C [35].
- Sắc ký lớp mỏng [35]:
+ Bản sắc ký silica gel 60 F254 (Merck).
+ Hệ dung môi: ethyl ether - điethylamin (40:1, tt/tt).
+ Dung dịch thử: lấy 1 lượng bột thuốc tương đương khoảng 20 mg
loratadin, thêm 5,0 ml hén hợp cloroform và methanol (1:1, tt/tt), siêu âm
trong 30 phút.

+ Dung dịch đối chiếu: hòa tan khoảng 20 mg loratadin đối chiếu trong 5
ml hén hop cloroform va methanol (1:1, tt/tt), trén đều.
+ Lượng mẫu chấm: 5 pl.

+ Chiều dai khai triển: hơn 2/3 chiều đài bản mỏng.
+ Phát hiện: sấy khô bản mỏng, soi đưới đèn UV (bước sóng 254 nm).


I\6[ruwpuis Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học

8

+ Yêu cầu: Giá trị R; của dung dịch thử và dung dịch đối chiếu phải
giống nhau.
- Phương pháp HPLC: So sánh thời gian lưu của peak khi thực hiện đồng

thời với mẫu loratadin chuẩn [35].
1.1.2.4. Định lượng

Có 2 phương pháp định lượng loratadin: chuẩn độ thé tich va HPLC.

- Phương pháp chuẩn độ thể tích [17]:
Hịa tan chính xác một lượng bột thuốc tương đương khoảng 0,300 g
loratadin trong 50 ml acid acetic bang. Chuan d6 bang acid percloric 0,1 M. 1
ml acid percloric 0,1 M tương đương 38,29 mg C22H23CIN2O2.
- Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [35]:

Dung dịch pha loãng: Chuyển 400 m1 acid hydrochlorid 0,05N và 80 ml
dung dịch 0,6 M kali dihydrophotphat vào bình định mức 1000 ml, pha loãng
với một hỗn hợp methanol và acetonitril (1: 1), trộn đều.
Hòa tan loratadin trong dung dịch pha lỗng để thu được dung địch có
néng d6 400 pg/ml. Tiến hành sắc ký theo những điều kiện sắc ký như sau:
+ Cột: L7 (octylsilan) (150 x 4,6 mm, 5 um)
+ Pha động: hỗn hợp dung môi đikali hydrophosphat 0,01 M — methanol —
acetonitril (7:6:6, tt/tt/tt), chỉnh đến pH 7,2 bang dung dich acid phosphoric 10%.
+ Bước sóng phát hiện: 254 nm
+ Tốc độ dòng: 1 ml/phút

+ Nhiệt độ cột duy trì trong khoảng 25 — 35°C.
+ Thể tích tiêm mẫu: 15 ul


I\6[ruwpuis Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học

9
1.1.3

Guaifenesin

1.1.3.1 Cơng thức cấu tạo [1],[L7]
OH

0

A

Lon

OCH,
Hình 1. 3. Câu trúc hóa học của Guaifenesin
Cơng thức phân tử: C¡¿H¡4O¿
Phân tử lượng: 198,2 g/mol

Tên chung quốc tế: Guaifenesin

Tên khoa học: 3-(2-methoxyphenoxy) -1,2- propandiol
Loại thuốc: Long đờm
1.1.3.2. Tinh chất hóa ly [1},[35]
- Bột kết tinh trắng hay gần nhuw-trang. Hoi tan trong nudc, tan trong
ethanol 96%.

.

- Điểm chảy: 79-83°C, hằng số phan ly: pKa = 13,53, Amax= 276 nm.
1.1.3.3. Định tính

- Điểm chảy: Từ 79-83°C [1],[171.
- Phô hồng ngoại: của chế phẩm phải phù hợp với phổ hồng ngoại của
guaifenesin chuẩn [1].

- Phương pháp sắc ký lớp mỏng: Vết chính trên sắc ký đồ của đung dịch

thử phải tương ứng với vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu về vị
trí, màu sắc và kích thước [1],[17].
+ Ban mong: Silica gel G (TT)
+ Dung môi khai triển: Methylen clorid — propanol (20 : 80).


I\6[ruwpuis Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học

10
+ Dung dich déi chiéu: Hoa tan 30 mg guaifenesin chuẩn (ÐC) trong 10
ml methanol (TT).

+ Dung dich thir: Hoa tan 30 mg ché pham trong 10 ml methanol (TT).

+ Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên ban méng 5 pl mdi dung dich
trên. Triển khai sắc ký tới khi dung môi đi được hơn 2 /3 bản mỏng, để khơ
bản mỏng

ngồi khơng

khí. Phun

lên bản mỏng

hỗn hợp

đồng thể tích

của dung địch kali fericyanid 1%; dung dich sat (III) clorid 20% va ethanol
96%(TT). Vét chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải tương ứng với vết

chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu về vị trí, màu sắc và kích thước.
- Phương pháp HPLC: So sánh thời gian lưu của peak khi thực hiện đồng

thời với mẫu guaifenesin chuẩn [35].
1.1.3.4. Định lượng

Có 2 phương pháp định lượng guaifenesin: chuẩn độ thể tích và HPLC

- Phương pháp chuẩn độ thể tích [1],[17]:
Thêm 10,0 mi hỗn hợp vừa mới chuẩn bị gồm I thể tích anhydrid acetic
(TT) và 7 thể tích pyridin (TT) vào 0,500 g (m g) chế phẩm. Dun séi dudi
sinh hàn ngược 45 phút. Để nguội và thêm 25 ml nước. Chuẩn độ bằng dung
dich

natri

hydroxyd

1

M

(CBD)

sử

dụng

0,25

ml

dung

dich

phenolphthalein(TT) lam chi thi (n ml). Song song làm mẫu trắng (n; ml).
Tính hàm lượng phần trăm của guaifenesin C\gH,40, bằng cơng thức:

19,82 x (nạ- mị)
2m
- Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [35]:
Hòa tan guaifenesin trong nước để thu được dung dịch có nồng độ 2
mg/ml,

Hut 2ml dung dich này vào bình định mức

100 ml, thêm 45 ml

methanol, pha lỗng bằng nước đến vạch và trộn đều để thu được dung dịch

có nồng độ 40 uig/ml. Tiến hành sắc ký theo những điều kiện sắc ký như sau:


I\6[ruwpuis Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học

11

+ Cột Supelcosil Cị; (250 mm x 4,6 mm, 10 tưn )
+ Pha động: Nước : methanol : acid acetic bang (60 : 40 :1,5)

+ Nhiệt độ cột: 25 - 35”C
+ Bước sóng phát hiện: 276 nm

+ Tốc độ dịng: 2ml/ phút
+ Thẻ tích tiêm: 10 pl
1.1.4 Dextromethorphan HBr

1.1.4.1 Cơng thức cấu tạo [1].[L7].{35]

GHạO

Hình 1. 4. Cấu trúc hóa học của Dextromethorphan HBr
Công thức phân tử: C¡zH;¿NO.HBr.H;0
Phân tử lượng: 370,32 g/mol
Tên chung quốc tế: Dextromethorphan hydrobromid
Tên

khoa

học:

(95,13S,4S5)-3-methoxy-17-methylmorphinan

monohydrobromid monohydrat
Loại thuốc: Ho

1.1.4.2. Tinh chất hóa ly [1],[17],[18]

- Bột kết tinh gần như trắng, hơi tan trong nước, dé tan trong ethanol
96%, hoi tan trong nước.

- Diém chay: 125°C, hang s6 phan ly: pKa = 9,85. Amax= 280 nm.


I\6[ruwpuis Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học

12
1.1.4.3. Định tính

- Phổ hồng ngoại: Phổ IR của dextromethorphan cho các đỉnh hấp thụ ở

các số sóng: 1040 cm-1, 1070 cm}, 1242 cm", 1280 cm-I, 1300 cm”, 1496

cm” [17], [18].
- Phổ hấp thụ tử ngoại: Chuẩn bị dung dịch dextromethorphan HBr thử
và chất đối chiếu trong acid hydrocloric 0,1 N để thu được các dung dịch có

nồng độ 100 ug/ml. Xác định độ hấp thụ của dung dich thử và dung dịch đối
chiếu ở bước sóng hấp thu cực đại khoảng 278 nm. Độ hấp thụ tính trên base

khan, không khác biệt hơn 3,0 % so với đung địch đối chiếu [35].
- Góc quay cực riêng: Hịa tan 0,200 g nguyên liệu dextromethorphan
HBr trong acid hydrocloric 0,1 M và pha lỗng thành 10,0 ml với cùng một

dung mơi. Giá trị góc quay cực riêng từ +28° đến +30° tính theo chế phẩm đã
làm khô[1], [17].

- Phương pháp sắc ký lớp mỏng [1],[17]:

+ Ban mong silica gel G.

+ Hệ dung môi: amoniac — methylen clorid — methanol — ethyl acetat —
toluen (2:10:13:20:55, tt/tt/tt/tt/tt).
+ Dung dịch thử: Lấy một lượng nguyên liệu tương đương khoảng 25
mg dextromethorphan HBr, hoa tan trong 10 ml methanol, lắc kỹ, lọc, dùng

dịch lọc để chấm sắc ký.
+ Dung dịch đối chiếu: Hòa tan 25 mg dextromethorphan HBr đối chiếu
trong 10 ml methanol.

+ Lượng mẫu chấm: 5 yl.

+ Chiều dài khai triển: Hơn 2/3 chiều dài bản mỏng.
+ Phát hiện: Sấy khơ ngồi khơng khí, phun thuốc thử hiện màu là dung
dich kali iodobismutat.


I\6[ruwpuis Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học

13
+ Yêu cầu: Vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải phù hợp về
vị trí và kích thước với vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu.
- Phản ứng hóa học: Lấy một lượng bột viên tương đương với 20 mg
dextromethorphan hydrobromid, thêm 5 ml nước lắc kỹ, ly tâm lay dung dich
trong, thêm 5 giot dung dich acid nitric 10% (TT) va 1 ml dung dich bac nitrat

2% (TT) sẽ xuất hiện tủa vàng. Lọc lấy tủa, rửa tủa 3 lần, mỗi lần với 1 ml
nước. Phân tán tủa trong 2 ml nước, thém 1,5 ml dung dịch amoniac

10 M

(TT) tủa khó tan [1],[17].
- Phương pháp HPLC: So sánh thời gian lưu của peak khi thực hiện đồng
thời với mẫu dextromethorphan HBr chuẩn [1],[17].
1.1.4.4. Định lượng

a. Phương pháp chuẩn độ thể tích
- Phương pháp chuẩn độ trong mơi trường khan
Hịa tan chính xác một lượng bột thuốc tương đương khoảng

0,5 g

dextromethorphan HBr trong 40 ml acid acetic băng và thêm 10 ml thủy ngân
acetat/acid acetic, làm ấm nhẹ nếu cần. Chuẩn độ bằng acid percloric 0,1 M.

Song song tiến hành mẫu trắng. 1 ml acid percloric 0,1 M tuong duong voi

35,23 mg C,gsH»sNO.HBr [33].

- Phương pháp chuẩn độ thế [1], [17]

Hịa tan chính xác một lượng bột thuốc tương đương khoảng 0,3 g
dextromethorphan

HBr

trong một

hỗn

hợp

gồm

5,0 mi

dung

dịch

acid

hydrocloric 0,01 M va 20 ml ethanol 96 %. Chuan d6 bang dung dich natri

hydroxyd 0,1 M. Xác định điểm tương đương bằng phương pháp đo thé.
1 ml dung

C,gH2sNO.HBr.

dich natri hydroxyd

0,1

M

tương

đương

với 35,23

mg


(re

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

14
b. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [1], [17].[35]:
Hòa tan một lượng loratadin trong nước để thu được dung dịch có nồng
dé 1 mg/ml. Hut 1 ml dung dich nay vao bình định mức 100 ml, pha loảng với

pha động để được dung dịch có nồng độ 10 pg/ml. Tién hanh sic ky theo
những điều kiện sắc ký như sau:
+ Cột €ị; (25 cm x 4,6 mm, 5 pm)

+ Pha động: Dung dịch chứa natri docusat 0,007 M và amoni

nitraf

0,007 M: trong hỗn hợp acetonitril - nước (70 : 30). Điều chỉnh đến pH 3,4
bang acid acetic bang (TT). Loc qua loc 0,45 um.
+ Bước sóng phat hién: 280 nm

+ Tốc độ dịng: I ml/phút
+ Thể tích tiêm mẫu: 20 pl

1.2. Phương pháp sắc ký lóng hiệu năng cao

1.2.1. Khái niệm
Sắc ký là một quá trình phân tách các chất tan nhờ sự di chuyển khác
nhau về động lực học của các

chất đó trong một hệ thống hai hay nhiều pha,

trong đó một pha chuyển động liên tục theo một hướng nhất định (gọi là pha
động) và một pha cố định (gọi là pha tĩnh).
Chất phân tích sau khi được rửa giải ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi

đầu dò. Việc lựa chọn đầu dò để sử dụng phải dựa trên tính chất lý hóa của
chất cần được phân tích như: khả năng hấp thụ UV — Vis, huỳnh quang... Đầu
dị PDA là đầu đị thơng dụng nhất trong HPLC. Đầu dò PDA cung cấp phổ
UV-Vis của các chất phân tích trong khoảng bước sóng đã chọn, kiểm tra sự

tỉnh khiết của sản phẩm và định đanh được sản phẩm bằng cách so sánh phổ
của pic sắc ký với phố của một ngân hàng dữ liệu hoặc với phổ của một chất

chuẩn [4].


Í (re

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

15
1.2.2. Cấu tạo máy sắc ký lỏng hiệu năng cao
HỆ THĨNG SẮC KÝ LỎNG

Bộ phận

Thai

phát hiện

Hình 1. 5. Sơ đồ cấu tạo máy sắc ký lỏng hiệu năng cao
1.2.3. Ứng dụng của phương pháp sắc ký lồng hiệu năng cao [4]
Hiện nay phương pháp HPLC

có mặt ở hầu hết các phịng thí nghiệm

phân tích hiện đại, được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực như: Y học, được
phẩm, thực phẩm, mỹ phẩm, môi trường, độc chất học, nông nghiệp..., do
những ưu điểm vượt trội về độ nhạy, tính đặc hiệu, độ chính xác rất cao. Đặc

biệt, trong lĩnh vực kiểm nghiệm thuốc, phương pháp này có mặt hầu hết
trong các chuyên luận kiểm nghiệm nguyên liệu hay thành phẩm thuốc trong

các Dược điển Mỹ (USP), Anh (BP), Nhật (JP), Việt Nam IV...,
Tùy theo loại đầu dò ghép nối với hệ thống sắc ký lỏng mà phương pháp
HPLC có thê được ứng dụng với những mục đích khác nhau:
- Ứng dụng HPLC trong kiểm nghiệm dược liệu và hợp chất tự nhiên:

+ Định tính dược liệu và các hợp chất tự nhiên: Xác định độ tỉnh khiết và
định tính các chất.

+ Định lượng dược liệu và các hợp chất tự nhiên: trong trường có chất
chuẩn hay khơng có chất chuẩn.