Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 2 * 2016

Nghiên cứu Y học

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI TRIAMCINOLON,
METHYLPARABEN VÀ PROPYLPARABEN
TRONG CHẾ PHẨM DẠNG GEL BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG
HIỆU NĂNG CAO
Nguyễn Hữu Lạc Thủy*, Trần Hữu Tài*, Võ Thị Bạch Huệ*

TÓM TẮT
Mở đầu – Mục tiêu nghiên cứu: Triamcinolon acetonid (TA) là glucocorticoid được sử dụng khá phổ biến
để điều trị các triệu chứng viêm. Các dạng bào chế dùng ngoài của TA được sử dụng phổ biến như dạng kem,
thuốc mỡ; dạng bào chế gel của TA là dạng bào chế hiện đại. Trong các dạng bào chế này thường có hai chất bảo
quản methylparaben (MPB) và propylparaben (PPB). Các tiêu chuẩn kiểm nghiệm phần lớn tập trung định
lượng hoạt chất chính, các chất bảo quản được phân tích với mức chất lượng xác định giới hạn. Vì vậy, chúng tôi
thực hiện đề tài với mục tiêu xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời cả 03 đối tượng
triamcinolon acetonid, methylparaben và propylparaben trong chế phẩm gel bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao (HPLC).
Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Khảo sát các điều kiện hòa tan mẫu; các điều kiện sắc ký để định
lượng đồng thời triamcinolon acetonid, methylparaben và propylparaben trong chế phẩm dạng gel có hàm lượng
TA (0,1 %); MPB (0,18 %) và PPB (0,02 %).
Kết quả: Xác định dung môi hòa tan mẫu thử dạng gel và các điều kiện sắc ký thích hợp để tách hoàn toàn
các đối tượng phân tích bằng phương pháp HPLC. Quy trình được thẩm định theo ICH. Dung dịch thử: cân 1,5g
gel; chiết bằng methanol; điền đầy trong bình định mức 50 ml, thu được dung dịch thử nghiệm. Dung dịch đối
chiếu: các chất đối chiếu được pha trong methanol với các nồng độ 30; 54 và 6 ppm tương ứng với TA, MPB và
PPB. Điều kiện sắc ký: Cột C18 Knauer (150 x 4,6 mm; 5 m); pha động: acetonitril  nước (50 : 50); nhiệt độ cột:
40 oC; tốc độ dòng: 1 ml/phút; thể tích tiêm: 20 µl; đầu dò PDA (255 nm). Kết quả thẩm định: quy trình đạt độ
đặc hiệu; phương trình đường tuyến tính ŷ = 29146x; ŷ = 123076x và ŷ = 104666x tương ứng với TA; MPB và
PPB – các hệ số tương quan R2 ≥ 0,999; độ lặp lại và độ chính xác trung gian đều có RSD% < 2 %; độ đúng với tỷ
lệ phục hồi trong giới hạn 98 – 102 %; giới hạn phát hiện – giới hạn định lượng lần lượt của TA (0,30 và 0,99

µg/ml); MPB (5,20 và 17,76 µg/ml) và PPB (0,10 và 0,33 µg/ml).
Kết luận: xây dựng thành công quy trình định lượng đồng thời TA, MPB và PPB bằng HPLC. Quy trình
đạt tất cả các yêu cầu về thẩm định nên có thể ứng dụng để xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho chế phẩm dạng
gel có thành phần TA, MPB và PPB.
Từ khóa: HPLC, triamcinolon acetonid, methylparaben, propylparaben.

ABTRACT
SIMULTANEOUS QUANTITATIVE DETERMINATION TRIAMCINOLONE ACETONIDE,
METHYLPARABEN AND PROPYLPARABEN IN GEL PRODUCT BY HIGH PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY (HPLC) METHOD
Nguyen Huu Lac Thuy, Tran Huu Tai, Vo Thi Bach Hue
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement of Vol. 20 - No 2 - 2016: 365 - 370
*Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: TS. Nguyễn Hữu Lạc Thủy ĐT: 0903 838 274

Chuyên Đề Dược

Email:

365


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 2 * 2016

Background – Objectives: Triamcinolone acetonide (TA) is a glucocorticoid used to treat fairly common
symptoms of arthritis. The dosage forms for external use of TA are commonly used as creams, ointments; gels
dosage forms of TA is a modern dosage form. In dosage forms often have methylparaben (MPB) and
propylparaben (PPB). The assay focus largely quantitative main active ingredient, the preservative is analyzed to

determine the quantitative limits. Hence, development method with high precision and low detection limit
(HPLC) for simultaneous quantitative determination of TA, MPB and PPB in gels dosage forms is necessary.
Methods: HPLC method with PDA detector mode were developed for simultaneous quantitative
determination of TA, MPB and PPB in gels dosage forms. The suitable chromatography conditions were found
out for complete separation of TA, MPB and PPB.
Results: Test solution: 1.5 g sample was extracted by methanol in 50 ml volumetric flash. Reference solution:
a solution containing 30; 54 and 6 ppm each of triamcinolone; methylparaben and propylparaben RS in mobile
phase. A mixture of TA, MPB and PPB in sample were completely separated with chromatographic conditions: a
stainless steel column (150 x 4.6 mm), packed with octadecylsilane bonded to porous silica (5 m); mobile phase: a
mixture of 50 volumes of acetonitrile and 50 volumes of water; isocratic mode; flow rate 1 ml per minute; injection
volume 20 µl; column temperature 40 oC; PDA at 255 nm. These methods were validated and showed linearity
range ŷ = 29146x; ŷ = 123076x and ŷ = 104666x respectively TA, MBP and PPB, with high correlation coefficient
(R2 > 0.999), accuracy with recovery ratio in 98 – 102 % and precision with RSD ≤ 2.0 %; LOD and LOQ are
(0.30; 0.99); MPB (5.20; 17.76) and PPB (0.10 and 0.33) µg/ml respectively TA, MBP and PPB.
Conclusions: HPLC method was successfully developed for TA, MPB and PPB in gels dosage form.
Key words: HPLC, triamcinolone acetonide, methylparaben and propylparaben.
chất lượng thuốc có thành phần là các chất bảo
ĐẶT VẤN ĐỀ
quản nhóm paraben.
Triamcinolon acetonid (TA) là glucocorticoid
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
được sử dụng khá phổ biến để điều trị các triệu
chứng viêm. Các dạng bào chế dùng ngoài của
Đối tượng
TA được sử dụng phổ biến như dạng kem, thuốc
Triamcinolon acetonid (TA), methylparaben
mỡ; dạng bào chế gel của TA là dạng bào chế
(MPB) và propylparaben (PPB) có trong chế
hiện đại. Trong các dạng bào chế này thường có
phẩm gel với hàm lượng trong 1 đơn vị gel (10

song song hai chất bảo quản methylparaben
g): TA (0,1 %); MPB (0,18 %) và PPB (0,02 %).
(MPB) và propylparaben (PPB). Một vài công
Chất đối chiếu
trình nghiên cứu về phương pháp định lượng
TA (98,12%), MPB (99,95%) và PPB (99,93%)
triamcinolon bằng quang phổ Uv-Vis(2), HPLC(1),
(3)
do
Viện
Kiểm Nghiệm Thuốc Tp. HCM phân
định lượng đồng thời MPB và PPB bằng HPLC ,
phối.
định lượng đồng thời hydrocortison, MPB và
PPB bằng HPLC(5). Các tiêu chuẩn kiểm nghiệm
phần lớn tập trung định lượng hoạt chất chính,
các chất bảo quản được phân tích với mức chất
lượng xác định giới hạn. Vì vậy, chúng tôi thực
hiện đề tài với mục tiêu xây dựng và thẩm định
quy trình định lượng đồng thời cả 03 đối tượng
triamcinolon acetonid, methylparaben và
propylparaben trong chế phẩm gel bằng phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Kết quả
nghiên cứu sẽ góp phần vào công tác đánh giá

366

Dung môi – Hóa chất
Methanol, acetonitril do Merck sản xuất và
nước cất dùng cho HPLC.

Thiết bị
Hệ thống HPLC Alliance 2695-2996, đầu dò
PDA; cột C18 Knauer (250 x 4,6 mm; 5m).

Phương pháp nghiên cứu

Chuyên Đề Dược


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 2 * 2016
Khảo sát điều kiện phân tích TA, MPB, PPB bằng
HPLC:
Xử lý mẫu: khảo sát dung môi chiết
(methanol, acetonitril và cloroform); số lần
chiết lên mẫu gel để chọn dung môi và số lần
chiết cho hiệu quả chiết lớn nhưng ít tạp chất
hòa tan theo.
Thành phần và pH pha động: methanol và
acetonitril được phối hợp với nước hoặc dung
dịch acid có pH thay đổi nhằm tìm pha động cho
các thông số sắc ký đạt yêu cầu.
Xây dựng và thẩm định quy trình phân tích TA,
MPB, PPB bằng HPLC:
Tổng hợp các điều kiện khảo sát để xây dựng
quy trình định lượng đồng thời TA, MPB và PPB
bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao. Xác định khả
năng phù hợp của quy trình lên hệ thống thử
nghiệm.
Việc thẩm định được tiến hành theo hướng
dẫn của ICH(4) với các yêu cầu về tính đặc hiệu,

khoảng tuyến tính, độ chính xác, độ đúng, giới
hạn phát hiện, giới hạn định lượng.

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Khảo sát quy trình xử lý mẫu
Dung dịch đối chiếu: các chất đối chiếu được
pha trong pha động, các nồng độ 30; 54 và 6 ppm
tương ứng với TA, MPB và PPB. Dung dịch thử:
cân 1,5 g gel; chiết 3 lần (20; 20; 10 ml) dung môi
(acetonitril, methanol hoặc cloroform), siêu âm
trong 30 phút ở 50 oC. Để nguội, cho vào bình
định mức 50 ml và điền đầy bằng dung môi
tương ứng.
Kết quả khảo sát cho thấy dịch chiết bằng
dung môi methanol cho diện tích pic của các
chất khảo sát tương ứng với diện tích pic của
dung dịch hỗn hợp chất đối chiếu tương ứng về
nồng độ. Vì vậy chọn methanol làm dung môi
chiết hoạt chất trong mẫu thử.

Kết quả khảo sát pha động
Khảo sát các tỷ lệ pha động trên các hệ dung
môi: (I) methanol - nước; (II) acetonitril - nước;

Chuyên Đề Dược

Nghiên cứu Y học

(III) acetonitril - acid acetic 1%. Tiến hành sắc ký
trên mẫu đối chiếu và mẫu thử với các pha động

là hệ dung môi (I) với các tỷ lệ thay đổi.
Kết quả khảo sát cho thấy: với dung môi
methanol – nước (50:50) cho sắc ký đồ có các
thông số sắc ký đáp ứng các yêu cầu, vì vậy chọn
tỷ lệ này để khảo sát tiếp trên hệ (II) và (III). Kết
quả khảo sát được trình bày ở bảng 1 như sau:
Bảng 1: Kết quả khảo sát pha động
Pha
động
Hệ I

Hệ II

Hệ III

TR
Rs (Rs ≥
S (µV*sec)
(phút)
1,5 )

AF (0,8 –
1,5)

MPB
TA
PPB

5,4
13,7

16,7

6666777
655287
880169

16,8
16,8
4,1

1,6
1,2
1,2

MPB

4,1

6644019

3,6

1,7

TA

4,7

847872


3,6

1,6

PPB
MPB

5,9
3,9

643580
6526272

5,7
3,4

1,6
1,8

TA

4,6

814166

3,4

1,6

PPB


5,7

647309

5,2

1,6

Từ kết quả khảo sát ở bảng 1 cho thấy hệ
dung môi (II) acetonitril – nước được lựa chọn,
tuy nhiên hệ số bất đối AF tương đối lớn. Vì vậy,
giải pháp giảm chiều dài cột được tiến hành để
cải thiện hệ số này và giảm thời gian phân tích.
Bảng 2: Kết quả phân tích giữa cột sắc ký 150 và 250
(mm)
Cột
250
(mm)

150
(mm)

MPB
TA
PPB
MPB
TA
PPB


TR
Rs (≥ 1,5 AF (0,8–
S (µV*sec)
(phút)
)
1,5 )
4,0
6644019
3,7
1,7
4,7
847872
3,7
1,6
5,9
643580
5,7
1,6
2,1
6542446
4,0
1,4
2,6
888797
4,0
1,2
3,4
657714
5,6
1,2


Kết quả ở bảng 2 cho thấy hệ số bất đối và
tổng thời gian phân tích được cải thiện khi
giảm chiều dài cột còn 150 mm. Vì vậy, chọn
cột C18 (150 nm x 4,6 mm, 5 µm) cho các thử
nghiệm tiếp theo.

Quy trình định lượng
Mẫu trắng: pha động theo tỷ lệ khảo sát.
Mẫu placebo: hỗn hợp thành phần tương tự
như chế phẩm gel, không có các đối tượng
nghiên cứu. Dung dịch đối chiếu: các chất đối

367


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 2 * 2016

chiếu được pha trong pha động, các nồng độ
30; 54 và 6 ppm tương ứng với TA, MPB và
PPB.
Dung dịch thử: cân 1,5 g gel cho vào cốc có
mỏ, siêu âm trong 30 phút ở 50 oC với (20; 20; 10
ml) methanol. Gộp các dịch chiết methanol, cho
vào bình định mức 50 ml và điền đầy bằng
methanol.
Điều kiện sắc ký: cột Eurospher II 100 C18
(150 x 4,6 mm; 5 m); pha động: acetonitril 

nước (50 : 50); nhiệt độ cột: 40 oC; tốc độ dòng:
1 ml/phút; thể tích tiêm: 20 µl; đầu dò PDA tại
255 nm.

Hàm lượng mg của TA, MPB, PPB trong 1
đơn vị 10 g được tính theo công thức:

hệ thống, kết quả trình bày ở bảng 3; 4 và 5 của
các pic TA; PPB và MPB.
Bảng 3: Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống của
mẫu đối chiếu TA
TR
(phút)

S

H

AF

Rs

N

TB

2,62

893519


186176

1,26

3,81

7337

RSD
%

0,16

0,39

0,38

0,44

0,31

0,58

Bảng 4: Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống của
mẫu đối chiếu MPB
TR
(phút)
TB

2,18


RSD%

0,0

H

AF

6611869 1480768 1,34
0,27

0,32

0,31

Rs

N

3,81

5948

0,31

0,43

Bảng 5: Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống của
mẫu đối chiếu PPB

TR
(phút)

Trong đó:

S

S

H

Rs

N

1,245

5,29

5932

0,44

0,21

0,24

TB

3,41


- Sc: diện tích pic của chất đối chiếu

RSD %

0,0

- Cc: nồng độ chất đối chiếu (µg/ml)

Kết quả thẩm định quy trình: Tính đặc hiệu: sắc
ký đồ mẫu trắng, mẫu placebo không xuất hiện
pic trong khoảng thời gian lưu tương ứng với
thời gian lưu trên sắc ký đồ của mẫu đối chiếu.
Sắc ký đồ mẫu thử cho pic có thời gian lưu tương
ứng với pic trên mẫu đối chiếu (Hình 3 và 4).
Các pic cần định lượng trên mẫu thử và đối
chiếu đạt yêu cầu về độ tinh khiết pic được tính
trên phần mềm của hệ thống.

- mt: khối lượng cân mẫu thử (g)
- St: diện tích pic của mẫu thử
- C%: hàm lượng % của chất đối chiếu
- 0,5: hệ số quy đổi
Tiến hành khảo sát tính phù hợp hệ thống của
quy trình: quy trình đạt yêu cầu về tính phù hợp

Hình 1: Sắc ký đồ mẫu trắng

Hình 3: Sắc ký đồ mẫu đối chiếu


368

648915 95182

AF

0,28

0,36

Hình 2: Sắc ký đồ mẫu placebo

Hình 4: Sắc ký đồ mẫu thử chiết từ gel

Chuyên Đề Dược


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 2 * 2016
Bảng 6: Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của quy trình
định lượng TA, PPB và MPB
Mẫu đối chiếu
max (nm)

tR (phút)

max (nm)

TA

2,62


240,3

2,63

240,3

MPB

2,18

255,7

2,18

255,7

PPB

3,41

255,7

3,41

255,7

Khoảng tuyến tính: pha các mẫu đối chiếu có
nồng độ 40 đến 140 % so với nồng độ định
lượng, tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn.

Các kết quả được trình bày như bảng 7, có sự
tương quan giữa diện tích pic và khoảng nồng
độ khảo sát.
Bảng 7: Tương quan nồng độ và diện tích pic của TA,
PPB và MPB
TA

MPB

C (ppm)

S

Bảng 9: Tỷ lệ phục hồi của TA; MPB và PPB
Khoảng nồng độ

Mẫu thử

tR (phút)

C (ppm)

12
349752
18
524628
25
728650
30
874380

37
1078402
43
1253278
ŷ = 29146x
2
R = 0,9993

S

22
2707672
33
4061508
44
5415344
55
6769180
67
8246092
78
9599928
ŷ = 123076x
2
R = 0,9991

PPB
C
S
(ppm)

2
209332
3
313998
4
418664
6
627996
7
732662
8
837328
ŷ = 104666x
2
R = 0,9994

Độ lặp lại – Độ chính xác trung gian:

Nghiên cứu Y học

80 %
100 %
120 %

Tỷ lệ phục hồi TB (%)
TA
MPB
PPB
100,1
100,6

101,3
100,5
100,1
99,6
100,6
98,7
99,0

Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định
lượng LOQ:
Bảng 10: Giới hạn phát hiện và định lượng của TA,
MPB và PPB
TA
MPB
PPB

LOD (µg/ml)
0,3
5,2
0,1

LOQ (µg/ml)
0,99
17,16
0,33

Ứng dụng quy trình định lượng để khảo
sát hàm lượng TA, MPB và PPB trong một số
chế phẩm có thành phần triamcinolon trên thị
trường, kết quả khảo sát được trình bày ở

bảng 11.
Bảng 11: Hàm lượng (mg/10g) của TA, MPB và
PPB trong chế phẩm X, Y
Chế phẩm TA (mg/10g) MPB (mg/10g) PPB (mg/10g)
X
10,01
18,20
1,89
Y
10,22
18,14
1,98

KẾT LUẬN:

9,94

6455724 17,67 628078

1,91

870669

9,89

6460235 17,59 629979

1,91

872532


10,02 6466752 17,82 628871

1,93

Dựa vào kết quả thu được từ thực nghiệm,
có thể áp dụng quy trình để định lượng đồng
thời
triamcinolon,
methylparaben
và
propylparaben trong các chế phẩm thuốc. Đây là
dạng chế phẩm đa thành phần nên các yếu tố
ảnh hưởng đến độ phân giải giữa các pic được
quan tâm hàng đầu. Các điều kiện ảnh hưởng đã
được khảo sát và thẩm định đầy đủ nên có thể
ứng dụng với độ chọn lọc, độ chính xác và độ
đúng cao.

4

877969

9,83

6498300 17,42 634766

1,89

TÀI LIỆU THAM KHẢO


5

875972

9,88

6493028 17,57 631918

1,90

1.

Tiến hành sắc ký 6 lần trên mẫu thử. Kết quả
được trình bày ở bảng 8.
Bảng 8: Kết quả khảo sát độ lặp lại của quy trình định
lượng TA, MPB và PPB
TA
C (mg)

Số
mẫu

S

1

870934

2

3

6

878294 9,77
TB = 9,89 mg
RSD% = 0,91

S

MPB
C (mg)

S

PPB
C (mg)

6510948 17,36 633913 1,88
TB = 17,58 mg
TB = 1,90 mg
RSD% = 0,92
RSD% = 0,84

Độ đúng: thực hiện trên mẫu placebo ở 3
khoảng nồng độ 80; 100 và 120 % so với nồng độ
định lượng. Kết quả được trình bày ở bảng 9,
cho thấy quy trình có tỷ lệ phục hồi đạt yêu cầu.

Chuyên Đề Dược


2.

3.

Adriana DFP (2012), “Development and validation of a HPLC
Method for detemination of Triamcinolone acetonide from
Polyurethane intracular implants”, International Journal of
Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 24, pp. 132-136.
Aquino (2011), “Validation of quantitative analysis method
for triamcinolone in ternary complexes by UV-Vis
spectrophotometry”, Journal of Basic and Applied
Pharmaceutical Sciences, 32(1), pp. 35-40
Basima A, Mohammad A(2013), “Development of A
Validated HPLC Method for the Analysis of Two Preservative
Agents MPB, PPB in Topical Creams Containing Steroids in

369


Nghiên cứu Y học

4.
5.

370

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 2 * 2016

the Patient’s Terms of Use”, International Journal of

Pharmaceutical Sciences Review and Research, 22(2), pp. 200 205.
I.C.H. Harmonised tripartite guildeine, (2005), Validation of
analytical procedure: Text and Methodology, pp.1 - 13.
Hajkova R, Solich P (2003), “Simultaneous determination of
MPB, PPB, hydrocortisone acetate and its degradation

products in a topical cream by RP-HPLC”, Journal of
Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 32, pp. 921 – 927.

Ngày nhận bài báo:
Ngày phản biện nhận xét bài báo:
Ngày bài báo được đăng:

30/10/2015
20/11/2015
20/02/2016

Chuyên Đề Dược