HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
-------------------------------------------------

BẠCH PHƯƠNG DUNG

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
GLUCOSAMINE TRONG THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC
KHỎE BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU
NĂNG CAO

Hà Nội – 09/2021


HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM
--------------------------------------------------

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
GLUCOSAMINE TRONG THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC
KHỎE BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU
NĂNG CAO HPLC
Người thực hiện

: Bạch Phương Dung

Lớp

: K62CNTPB

Khóa

: 62

Khoa

: Công Nghệ Thực Phẩm

Mã SV: 620935

Giáo viên hướng dẫn : T.S Nguyễn Thị Hồng Lan
Bộ mơn: Thực phẩm và Dinh dưỡng
Th.S Nguyễn Thị Lê Hịa
Khoa Hóa Thực phẩm - Viện Dinh dưỡng

Hà Nội – 09/2021


LỜI CAM ĐOAN

Tơi xin cam đoan: bản khóa luận này là cơng trình nghiên cứu thực sự của cá
nhân, được thực hiện dựa trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết, nghiên cứu khảo sát tình hình
thực tiễn dưới sự hướng dẫn khoa học của T.S Nguyễn Thị Hoàng Lan và Th.S Nguyễn
Thị Lê Hòa. Số liệu, bảng biểu và những kết quả trong khóa luận là trung thực, các nhận
xét, phương hướng đưa ra xuất phát từ thực tiễn và kinh nghiệm hiện có.
Một lần nữa tơi xin khẳng định về sự trung thực của lời cam đoan.


Hà Nội, tháng 9 năm 2021
Sinh viên thực hiện

Bạch Phương Dung

i


LỜI CẢM ƠN
Bản luận văn này được thực hiện tại Viện Dinh Dưỡng Quốc Gia, 48B Tăng Bạt
Hổ, Hai Bà Trưng, Hà Nội và hồn thành tại Học viện Nơng Nghiệp Việt Nam, với sự
hướng dẫn của TS. Nguyễn Thị Hồng Lan. Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc và lời
cảm ơn trân thành tới:
Th.S Nguyễn Thị Lê Hòa - Viện Dinh dưỡng Quốc gia, người đã trực tiếp hướng
dẫn, giúp đỡ tôi. Đồng thời, tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị trong khoa Hóa Thực
phẩm - Viện Dinh dưỡng Quốc Gia đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tơi trong q trình
nghiên cứu và thực hiện luận văn này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn T.S Nguyễn Thị Hồng Lan, bộ mơn Thực
phẩm Dinh dưỡng - Khoa Công Nghệ Thực Phẩm - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam
cùng các thầy các cô Khoa Công Nghệ Thực Phẩm - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam
đã dạy dỗ, chỉ bảo, tạo điều kiện tốt cho tôi học tập, tạo cơ hội cho tôi đi thực tập và làm
khóa luận tốt nghiệp.
Và cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã quan tâm động
viên tơi trong q trình học tập và thực hiện luận văn. Do kiến thức và khả năng tiếp thu
thực tế còn nhiều hạn chế nên bài báo cáo sẽ cịn nhiều thiếu sót, kính mong sự góp ý
và giúp đỡ của Quý thầy cô.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 9 năm 2021
Sinh viên thực hiện


Bạch Phương Dung

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ...........................................................................................................i
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................... ii
MỤC LỤC .................................................................................................................... iii
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT ...........................................................vi
DANH MỤC CÁC BẢNG.......................................................................................... vii
DANH MỤC CÁC HÌNH ......................................................................................... viii
PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................ 1
1.1. Tính cấp thiết của đề tài .........................................................................................1
1.2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài ..............................................................................2
1.2.1. Mục tiêu ........................................................................................................2
1.2.2. Yêu cầu .........................................................................................................2
PHẦN II : TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........................................................................3
2.1. Tổng quan về Glucosamine ...................................................................................3
2.1.1. Cấu trúc, tính chất lý hóa của Glucosamine .................................................3
2.1.2. Cơ chế tác dụng của Glucosamine ................................................................ 5
2.1.3. Nguồn gốc .....................................................................................................7
2.2. Tổng quan về thực phẩm bảo vệ sức khỏe có chứa Glucosamine ......................8
2.3. Các phương pháp phân tích xác định hàm lượng Glucosamine ........................9
2.3.1. Trên thế giới ..................................................................................................9
2.3.2. Tại Việt Nam .............................................................................................. 13
2.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ............................................................ 14
2.4.1. Khái quát về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ............................... 14
2.4.2. Cấu tạo của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) .......................... 15
PHẦN III: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 18

3.1. Nguyên vật liệu và thiết bị ...................................................................................18
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................18
3.1.2. Chất chuẩn ..................................................................................................18
3.1.3. Chuẩn bị dung dịch chuẩn ..........................................................................18
iii


3.1.4. Dung mơi, hóa chất .....................................................................................18
3.1.5. Thiết bị và dụng cụ .....................................................................................19
3.2. Phạm vi nghiên cứu .............................................................................................. 20
3.3. Nội dung nghiên cứu phương pháp xây dựng hàm lượng Glucosamine bằng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ....................................................................20
3.3.1. Khảo sát các điều kiện phân tích Glucosamine bằng HPLC ......................20
3.3.2. Thẩm định phương pháp xác định Glucosamine bằng sắc ký lỏng hiệu năng
cao ..................................................................................................................................20
3.3.3. Ứng dụng phương pháp đã xây dựng phân tích hàm lượng Glucosamine
trong mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe đang lưu hành trên thị trường .......................... 20
3.4. Phương pháp nghiên cứu .....................................................................................20
3.4.1. Phương pháp lấy mẫu .................................................................................20
3.4.2. Quy trình dự kiến tách và xác định Glucosamine trong thực phẩm bảo vệ sức
khỏe ............................................................................................................................... 21
3.4.3. Thẩm định phương pháp .............................................................................21
3.4.4. Ứng dụng phương pháp đã xây dựng phân tích Glucosamine trong mẫu thực
phẩm bảo vệ sức khỏe đang lưu hành trên thị trường ...................................................24
3.5. Phương pháp xử lý số liệu ....................................................................................25
PHẦN IV: KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC VÀ THẢO LUẬN ...........................................26
4.1. Khảo sát các điều kiện sắc ký ..............................................................................26
4.1.1. Lựa chọn phương pháp nghiên cứu xác định hàm lượng Glucosamine trong
thực phẩm bảo vệ sức khỏe bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ..................26
4.1.2. Lựa chọn điều kiện sắc ký ..........................................................................28

4.2. Xây dựng quy trình xử lý mẫu ............................................................................32
4.2.1. Khảo sát dung môi chiết .............................................................................32
4.2.2. Khảo sát thời gian chiết ..............................................................................33
4.2.3. Khảo sát tỉ lệ và thời gian dẫn xuất O-phthalaldehyd (OPA) .....................34
4.3. Thẩm định phương pháp phân tích ....................................................................36
4.3.1. Độ đặc hiệu .................................................................................................36
4.3.2. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn ............................................................ 37
4.3.3. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng .....................................................38
iv


4.3.4. Độ lặp lại .....................................................................................................39
4.3.5. Độ thu hồi ...................................................................................................40
4.4. Ứng dụng phương pháp đã xây dựng phân tích Glucosamine trong mẫu thực
phẩm bảo vệ sức khỏe đang lưu hành trên thị trường. ............................................41
PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................43
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 45

v


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT
Ký hiệu

Tiếng Anh

Tiếng Việt

ACN


Acetonitrile

Acetonitrile

Association of Official

Hiệp hội các nhà phân tích

AOAC
GlcN
HPLC

Analytical Communities

chính thống

Glucosamine
High

Performance

Glucosamine
Liquid

Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

LOD


Limit of Detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of Quantitative

Giới hạn định lượng

MCPA

Mecaptopropionic acid

ME

Mecaptoethanol

MeOH

Methanol

OPA

o-phthalaldehyd

PAD

Photo array Diod Detector


Detector mảng diot phát quang

ppm

parts per million

Phần triệu

RI

Refrative Index Detector

RSD

Relative Standard Deviation

Độ lệch chuẩn tương đối

RT

Retention time

Thời gian lưu

SD

Standard deviation

Độ lệch chuẩn


Methanol

TCVN
THF

Tiêu chuẩn Việt Nam
Tetrahydrofuran

TPBVSK

Thực phẩm bảo vệ sức khỏe
vi


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Độ hòa tan của GlcN.HCl trong một số loại dung môi khảo sát ở ở 25℃ .....4
Bảng 2.2: Tổng hợp các nghiên cứu đã công bố trên thế giới về quy trình phân tích
Glucosamine ....................................................................................................................9
Bảng 4.1: Kết quả khảo sát cột sắc ký ...........................................................................28
Bảng 4.2: Ảnh hưởng của tốc độ dòng đến sắc ký đồ GlcN .........................................30
Bảng 4.3: Kết quả khảo sát dung môi chiết mẫu ........................................................... 32
Bảng 4.4: Khảo sát tỷ lệ dẫn xuất ..................................................................................34
Bảng 4.5: Khảo sát thời gian phản ứng dẫn xuất trước khi bơm vào cột sắc ký ...........35
Bảng 4.6: Sự phụ thuộc của diện tích pic sắc ký vào nồng độ GlcN ............................ 37
Bảng 4.7: Kết quả khảo sát giá trị LOD và LOQ của Glucosamine ............................. 38
Bảng 4.8: Độ lệch chuẩn (SD) và độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) trên nền rắn của
TPBVSK tại các nồng độ khác nhau .............................................................................39
Bảng 4.9: Độ thu hồi của phương pháp ở 3 mức thêm chuẩn khác nhau......................40
Bảng 4.10: Hàm lượng Glucosamin trong mẫu phân tích thực tế .................................41


vii


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1: Hợp chất huỳnh quang GlcN-OPA/2ME ......................................................12
Hình 2.2: Hợp chất GlcN-OPA/3MPA..........................................................................12
Hình 2.3: Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC .......................................................................15
Hình 2.4: Hệ thống HPLC tại khoa Hóa Thực phẩm - Viện Dinh dưỡng Quốc gia .....15
Hình 3.1: Quy trình dự kiến tách và xác định Glucosamine trong thực phẩm bảo vệ sức
khỏe .............................................................................................................................. 21
Hình 4.1: a,b,c lần lượt là sắc ký đồ và quang phổ hấp thụ chuẩn GlcN 500µg/ml chạy
theo nghiên cứu (1), (2), (3) ......................................................................................... 27
Hình 4.2: a,b lần lượt là sắc ký đồ chuẩn GlcN trên cột C18 ........................................29
Hình 4.3: a,b lần lượt là sắc ký đồ chuẩn GlcN với tỷ lệ pha động 85:15 và 80:20 .....30
Hình 4.4: a,b,c lần lượt là sắc ký đồ chuẩn GlcN với v1 = 0,8 ml/phút, v2 = 1 ml/phút, v3
= 1,2 ml/phút .................................................................................................................31
Hình 4.5: Sắc ký đồ mẫu nạp chuẩn với dung môi chiết khác nhau ............................. 33
Hình 4.6: Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình chiết GlcN ......................................34
Hình 4.7: Quy trình chiết mẫu Glucosamine tối ưu ......................................................36
Hình 4.8: a,b,c lần lượt là sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu trắng nạp chuẩn, mẫu chuẩn GlcN
60 ppm ........................................................................................................................... 36
Hình 4.9: Đường chuẩn Glucosmine .............................................................................38

viii


PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1. Tính cấp thiết của đề tài
Ngày nay, khi cuộc sống của con người ngày càng được nâng cao thì mối quan
tâm đến sức khỏe càng được chú trọng nhiều hơn. Tuy nhiên, do phải bắt nhịp với thời

đại cơng nghiệp hóa khiến con người bận rộn hơn, thời gian luôn eo hẹp, đôi khi không
đủ để chăm sóc chu đáo cho bản thân. Vì vậy, con người bắt đầu tìm đến những sản
phẩm, dịch vụ chăm sóc sức khỏe tốt nhất, nhanh nhất và tiện dụng nhất. Chính vì thế,
thực phẩm bảo vệ sức khỏe (TPBVSK) là một trong những lựa chọn đầu tiên mà con
người hướng tới. Nhưng thực tế hiện nay, việc hiểu biết và sử dụng đúng TPBVSK còn
rất hạn chế. Đặc biệt là các sản phẩm TPBVSK hỗ trợ điều trị các bệnh về xương khớp.
Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), giai đoạn từ năm 2011 đến 2020 được xem
là “Thập niên xương khớp” do số người mắc bệnh xương khớp ngày càng tăng cao. Kết
quả ước tính cho thấy trong dân số thế giới có khoảng 9,6% nam giới và 18% nữ giới
trên 60 tuổi mắc các triệu chứng về xương khớp (Hồ Thị Bích Phượng và cộng sự, 2020).
Theo ước tính của ngành y tế, Việt Nam là một trong những quốc gia có tỷ lệ mắc
các bệnh xương khớp cao nhất thế giới. Trong những năm gần đây, tỷ lệ này đã tăng
khoảng 20%. Một nghiên cứu về tình trạng thối hóa khớp tại Việt Nam gần đây đã phản
ánh nguy cơ gặp phải các vấn đề về thối hóa khớp (THK) đang ngày càng trở nên phổ
biến hơn và có xu hướng trẻ hóa. Theo đó, có 30% người trên tuổi 35, 60% người trên
tuổi 65 và 85% người trên tuổi 85 gặp vấn đề về THK (WHO).
Bệnh xương khớp đang là vấn đề lớn của xã hội vì nó có thể làm người bệnh tàn
phế, suy giảm sức lao động. Trong nhiều thập niên qua, việc điều trị viêm khớp chủ yếu
là dùng các thuốc kháng viêm giảm đau nhằm mục đích giảm các triệu chứng đau và
hạn chế vận động khớp viêm cho người bệnh. Tuy nhiên những thuốc này có rất nhiều
tác dụng phụ và thường khơng cải thiện được tình trạng bệnh lý của sụn khớp bị hư
hỏng. Theo khuyến cáo của Cơ quan đánh giá Dược phẩm châu Âu (EMEA),
Glucosamin được xem là thuốc có hiệu quả và có nhiều ưu điểm hơn các thuốc kháng
viêm non- steroid do có rất ít tác dụng phụ.
1


Theo Nghị định 15/2018/NĐ-CP của chính phủ cho phép các doanh nghiệp tự cơng
bố chất lượng sản phẩm, do đó việc hậu kiểm tra chất lượng các sản phẩm TPBVSK
trên thị trường là rất quan trọng nhằm đảm bảo các sản phẩm này đạt chất lượng và an

tồn như cơng bố (Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia (NIFC),
14/04/2020). Với vai trị là phịng thí nghiệm quốc gia, việc phát triển các kỹ thuật kiểm
nghiệm chất lượng sản phẩm phục vụ công tác quản lý là 1 trong những ưu tiên hàng
đầu của Viện Dinh dưỡng. Đặt mối quan tâm đến một hoạt chất mới và mong muốn
nghiên cứu một phương pháp định lượng hoạt chất này, trên cơ sở đó, chúng tơi tiến
hành nghiên cứu đề tài: “Xây dựng quy trình định lượng Glucosamine trong thực
phẩm bảo vệ sức khỏe bằng phương pháp sắc khí lỏng hiệu năng cao”.
1.2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài
1.2.1. Mục tiêu
Xây dựng được quy trình định lượng Glucosamine có trong thực phẩm bảo vệ sức
khỏe bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
1.2.2. Yêu cầu
Khảo sát và xây dựng được quy trình chiết xuất Glucosamine trong thực phẩm bảo
vệ sức khỏe.
Thẩm định được quy trình phân tích hàm lượng Glucosamine bằng phương pháp
HPLC theo tiêu chuẩn AOAC 2016 (độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện
LOD, giới hạn định lượng LOQ, độ lặp lại, độ thu hồi của phương pháp).
Áp dụng phương pháp phân tích đã chuẩn hóa để xác định được hàm lượng
Glucosamine trong một số mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe cải thiện chức năng xương
khớp trên thị trường Hà Nội.

2


PHẦN II : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về Glucosamine
2.1.1. Cấu trúc, tính chất lý hóa của Glucosamine
Glucosamine là một aminomonosaccharide có nguồn gốc nội sinh, là một thành
phần giúp tổng hợp glycosaminoglycan cấu tạo lên mô sụn trong cơ thể, là đơn vị cấu
trúc của nhiều loại polysaccharide và một số nhóm chất khác (như glycoprotein) trong

các cơ thể sống (Trần Hồng Lê, 2010).
Bản chất của Glucosamine là đường chứa gốc amin được gọi là đường amino. Các
loại đường amino bao gồm D- glucosamine, D- galactosamine và D- mannosamine
(Nguyễn Thu Hiền, 2012).
a. Glucosamine tự do
Công thức phân tử 𝐶6 𝐻13 𝑂5 𝑁, phân tử khối M = 179,17 g/mol
Công thức cấu tạo:

Tên khoa học: (3R,4R,5S,6R)-3-amino-6-(hydroxymethyl) oxane-2,4,5-triol. Tên
gọi thông dụng: 2-Amino-2-deoxy-D-glucose; 2-amino-2-deoxy-β-D glucopyranose;
chitosamine; D-glucosamine.
Glucosamine tự do là chất rắn dạng tinh thể, không màu, không mùi được cấu tạo
từ 2 thành phần chính là glucose và amino acid glutamine, nóng chảy tại nhiệt độ 88℃
và phân hủy tại 110℃. Độ hòa tan ở 25℃: trong nước 330 mg/ml, hòa tan nhẹ trong
MeOH, EtOH, không tan trong ete và chloroform (Arshine, 2021).
Điều chế: Glucosamine có thể được điều chế bằng cách thủy phân chitosan, sử
dụng enzyme α-amylase, sau đó là enzyme glucoamylase
3


b. Glucosamin hydroclorua
Công thức phân tử C6 H13 O5 N. HCl, phân tử khối M = 215,63 g/mol
Công thức cấu tạo

Tên khoa học: (3 R, 4 R, 5 S, 6 R ) -3-amino-6- (hydroxymetyl) oxan-2,4,5-triol
hydroclorua
Glucosamin hydroclorua là chất rắn dạng tinh thể, khơng màu, khơng mùi. Điểm
nóng chảy ở 190-194℃ hoặc 300℃.
Bảng 2.1: Độ hòa tan của GlcN.HCl trong một số loại dung mơi khảo sát ở ở
25℃

Độ hịa tan

Dung mơi
Nước

43 mg / mL

Methanol

1 mg/ml

Aceton, Acetonitril, Tetrahydrofuran

Khơng hịa tan
0.03 mg/ml

Ethanol

Khơng hòa tan
(Nguồn:Arshine, 2021)

Ứng dụng: Glucosamine HCl được cho là chứa glucosamine hữu cơ ít hơn và ổn
định hơn trong cơ thể nhưng nó khơng mang lại cơng dụng giảm đau như là glucosamine
sulfate. Công dụng của glucosamine hydrochloride đối với sụn chưa được thử nghiệm
(Arthritis Australia, 2015).
Trong các nghiên cứu khoa học được trích dẫn trong “Khoa học Dinh dưỡng”.
Một số nhà sản xuất sử dụng các nguồn thực vật để sản xuất Glucosamine HCl thay vì

4



sử dụng vỏ tôm cua của động vật để ngăn ngừa khả năng người dùng dị ứng với vỏ tôm
cua. Như vậy, Glucosamine HCl là chất bổ sung an toàn hơn với ít tác dụng phụ hơn.
c. Glucosamin sulfat
Cơng thức phân tử (C6 H13 O5 N)2 . SO4 , khối lượng phân tử M = 277,25 g/mol
Công thức cấu tạo:

Tên khoa học: (2 R ,3 R ,4 S ,5 R )-2-amino-3,4,5,6-tetrahydroxyhexanal axit
sulfuric
Glucosamin sulfat là chất rắn dạng tinh thể, không màu, khơng mùi, độ hịa tan
trong nước 55 mg/ml. Glucosamin sulfat có hiệu quả cao nhưng do tính hút ẩm cao ở
dạng tự do nên khơng bền và nhóm amin dễ bị oxy hóa, Glucosamine sulfate tinh khiết
phân hủy hồn tồn trong vịng ít ngày hơn ở 20℃ (Cơng ty cổ phần thực phẩm Thiên
Nguyên).
Ứng dụng: Hầu hết các nghiên cứu khoa học về Glucosamine đã được thực hiện
bằng cách sử dụng Glucosamine sulfate. Một số nhà nghiên cứu tin rằng Glucosamine
hydrochloride có thể khơng hoạt động tốt như Glucosamine sulfate. Họ cho rằng phần
"sulfat" của Glucosamine sulfat là yếu tố quan trọng vì cơ thể cần sulfat để sản xuất sụn
(Martel-Pelletier, Johanne Farran, Aina Montell, Eulàlia Vergés, Josep Pelletier & JeanPierre, 2015).
2.1.2. Cơ chế tác dụng của Glucosamine
Glucosamine có nhiều trong sụn khớp cũng như nhiều mô khác như: xương, dây
chằng, đĩa đệm giữa các đốt sống, động mạch chủ, giác mạt (mắt) và da.
 Glucosamine ở sụn khớp
Các cơng trình nghiên cứu những năm gần đây cho thấy Glucosamine có tác dụng
hỗ trợ điều trị các bệnh lý về xương khớp, đó là do GlcN tham gia vào cấu trúc màng tế
bào, có trong thành phần các sợi chun ở các mạch máu lớn, chiếm tỷ lệ cao trong chất
5


cơ bản ở mô sụn và xương nên bảo đảm cho sụn xương khơng những có độ chắc mà cịn

có tính đàn hồi.
GlcN là nguyên liệu chủ yếu trong quá trình tái tạo mơ sụn và xương. Chất này
cũng có tác dụng ức chế enzym elastase (enzyme này là chất trung gian gây thối hóa
sụn khớp), collagenase, phospholipase và giảm các gốc tự do superoxide phá hủy các tế
bào sụn, kích thích q trình tổng hợp các proteoglycan (là một glycoprotein có tỷ lệ
glucid rất cao) nên được chỉ định dùng bổ trợ trong các chứng hư và thối hóa khớp.
Glucosamine đóng vai trị là tiền chất để tổng hợp glucosaminoglycan (hay
mucopolysaccharide) – một hợp chất tham gia cấu tạo nên proteoglycan. Proteoglycan
là thành phần cơ bản cấu tạo nên sụn khớp (chiếm 15-40% so với trọng lượng khô của
sụn) cùng với collagen (60-80% so với trọng lượng khô của sụn) và nước (chiếm 7085% tổng trọng lượng của sụn). Glucosamine được hấp thu vào trong cơ thể chủ yếu ở
dạng dẫn xuất của nó.
Ở nhiều nước, GlcN được xem là chế phẩm bổ sung dinh dưỡng, nó cũng được
nhiều bác sĩ chuyên khoa phối hợp với Chondroitin dùng vào điều trị viêm xương khớp
có tác dụng tốt (Das, A.Hammad & T. A, 2000).
 Glucosamine ở tế bào
Glucosamine tham gia cấu trúc tế bào và các bào quan, bảo đảm cho các tế bào
thực hiện được các chức năng của nó và ngăn chặn sự thối hố tế bào (Marc Cohen,
Rory Wolfe, Trudy Mai & Daniel Lewis, 2003).
Glucosamine cịn có thể bổ sung để điều trị và ngăn tắc nghẽn động mạch, có tác
động chống đơng máu. GlcN làm tăng sinh một số loại tế bào bạch cầu, tăng tổng hợp
RNA trong tế bào sụn ni cấy do đó làm tăng tổng hợp proteoglycogens và collagens,
thúc đẩy sự tích luỹ hyalin trong gan, tuỵ và hạt lympho.
Glucosamine trong các mô, đặc biệt mô liên kết: gân - cơ - dây chằng, đảm bảo
tính đàn hồi...
 Glucosamine đối với hệ tiêu hóa

6


Glucosamine giúp tăng cường và trao đổi chất, giảm thiểu rối loạn hệ đường ruột.

Glucosamine có khả năng cân bằng hệ vi sinh ở bên trong đường ruột, giúp cho hệ tiêu
hóa của mọi người hoạt động tốt hơn.
Glucosamine có tác dụng sửa chữa niêm mạc đường tiêu hóa và ngăn ngừa chứng
bệnh ruột bị rò rỉ – biểu hiện của nó là các hạt protein thực phẩm chưa tiêu hóa đã đi
vào trong máu (từ các lỗ hở nhỏ trong lớp lót của đường tiêu hóa) gây ra tình trạng viêm
khớp ảnh hưởng xấu đến những phản ứng miễn dịch và các tình trạng khác (Thnthao,
22/04/2019).
 Glucosamine đối với hệ bài tiết
Sự phân hủy albumin hơn mức bình thường là đặc điểm sinh hoá lên quan đến
bệnh tiểu đường. GlcN có khả năng làm giảm tốc độ bài tiết albumin để bảo vệ chức
năng thận nên đã được thử nghiệm để chữa trị bệnh tiểu đường. Theo Skaha và cộng sự
(1996), bệnh nhân bị tiểu đường sau khi uống GlcN từ 3-6 tuần cho kết quả tốc độ bài
tiết albumin đều giảm và hiệu quả này kéo dài 3-6 tuần sau khi sử dụng thuốc (Setnikar
I, Giacchetti C & Zanolo G, 1986).
 Ngồi ra GlcN cịn giúp hạn chế các bệnh về mắt (tăng độ ẩm cho mắt, chống
khô và mỏi mắt, ngăn ngừa tình trạng viêm giác mạc ) (Phạm Thị Khánh Vân & Vũ Thị
Thái, 2004).
2.1.3. Nguồn gốc
Nguồn nguyên liệu chứa nhiều Glucosamine được sản xuất bằng cách chế
biến chitin từ vỏ của động vật giáp xác bao gồm tôm, tôm hùm và cua. Để đáp ứng nhu
cầu của những người ăn chay và những người khác phản đối động vật có vỏ, các nhà
sản xuất đã đưa các sản phẩm glucosamine ra thị trường được sản xuất bằng cách sử
dụng nấm Aspergillus niger và từ ngô lên men (European Food Safety Authority, 2009)
(Lorraine Heller, 25-1-2008).

7


2.2. Tổng quan về thực phẩm bảo vệ sức khỏe có chứa Glucosamine
Các sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe, trong đó có các TPBVSK cải thiện

xương khớp với thành phần chính là Glucosamine, Chondroitin…ngày càng trở nên phổ
biến trên thị trường quốc tế.
 Trên thế giới
Theo Công ty nghiên cứu thị trường minh bạch TMR, quy mô thị trường
Glucosamine tồn cầu là 63,9 triệu đơ la vào năm 2027. Số ca viêm khớp ngày càng gia
tăng trên toàn cầu dự kiến sẽ thúc đẩy nhu cầu sử dụng sản phẩm trong giai đoạn đánh
giá 2020-2030.
Thị trường Glucosamine ở Bắc Mỹ có thể ghi nhận mức tăng trưởng theo cấp số
nhân trong giai đoạn đánh giá 2020-2030. Số lượng người tiêu thụ TPBVSK ngày càng
tăng lên nhanh chóng. Khía cạnh này có thể được chứng minh là một yếu tố tăng trưởng
đáng kể cho thị trường Glucosamine ở Bắc Mỹ (Sánchez-Machado & Delgado-Rosas,
2019).
Mỹ là một trong những thị trường Glucosamine lớn nhất, chiếm hơn 30% về khối
lượng vào năm 2017. Ở Đức, Glucosamine được dùng hỗ trợ điều trị viêm khớp từ năm
1969. Hiện nay các nước Anh, Mỹ, Nhật, các sản phẩm là dẫn xuất của Glucosamine,
trong đó Glucosamine sulfate và Glucosamine hychlorua chiếm hơn 70% được sử dụng
phổ biến để chữa bệnh viêm khớp (Nguyễn Lục Thơ, Nguyễn Thị Chung & Nguyễn
Đức Tuấn, 2014).
 Tại Việt Nam
Năm 2019 – Thị trường thực phẩm dinh dưỡng tại Việt Nam ước tính có giá trị
xấp xỉ 1 tỷ USD, dựa trên dữ liệu về doanh số bán hàng năm của các công ty quốc tế
hàng đầu. Một số người ước tính rằng hơn một nửa dân số Việt Nam tiêu thụ thực phẩm
và đồ uống chức năng và khoảng 15 triệu người tiêu dùng tại Việt Nam đã từng mua các
TPBVSK- cải thiện xương khớp. Glucosamine là sản phẩm có doanh số bán tăng nhanh
nhất tại Việt Nam (PR, Pinpoint, 13/12/2019).

8


Các sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe trên thị trường, trong đó có các TPBVSK

cải thiện xương khớp với thành phần chính là Glucosamine, Chondroitin… có mặt tại
Việt Nam đến từ nguồn sản xuất từ trong nước và chủ yếu nhập khẩu từ nước ngoài với
các tên biệt dược như Gosamil (Hàn Quốc), Bosamin (Mỹ), Viatril (Ý) (Nguyễn Lục
Thơ, Nguyễn Thị Chung & Nguyễn Đức Tuấn, 2014).
Trên thị thường hiện nay có nhiều chế phẩm kết hợp glucosamine với các thành
phần khác như các vitamin, khoáng chất và các dược liệu. Hàm lượng các chế phẩm
cũng thường khác biệt, từ 100 mg đến 1500 mg đối với Glucosamine (Hooper &
Michele, 2001). Dạng bào chế cũng rất phong phú như dạng viên, dạng bột, dạng cốm.
Các nghiên cứu đã chỉ ra hiệu quả của GlcN trong việc giảm thu hẹp khơng gian
khớp và làm chậm q trình thối hóa của sụn khớp. Liều khuyến cáo cho điều trị viêm
khớp ở người của glucosamine sulfate là 1500 mg/ngày (Cục Quản lý Dược, 2010). Với
16 nghiên cứu cho thấy Glucosamine sulphat dùng đường uống với lượng 1500 mg/ngày
tạo ra 60% (thay đổi so với ban đầu) trong việc giảm đau và tăng 33% chức năng
trong viêm xương khớp mà khơng có tác dụng phụ (Bruyère, O.Altman, R. D.Reginster
& J. Y., 2016).
2.3. Các phương pháp phân tích xác định hàm lượng Glucosamine
2.3.1. Trên thế giới
Những năm gần đây có một số nghiên cứu quy trình phân tích Glucosamine trong
TPBVSK ở một số nước như Mỹ, Ấn Độ, Indonesia, Brazil, Malaysia… Hai phương
pháp phổ biến thường được áp dụng là sắc ký lỏng (HPLC) và điện di trong mao mạch.
Một số các quy trình đã nghiên cứu được tóm tắt trong bảng 2.2
Bảng 2.2: Tổng hợp các nghiên cứu đã công bố trên thế giới về quy trình
phân tích Glucosamine

Thành phần

Phương pháp

Ưu điểm


Nhược
điểm

Cột Zebra C18, pha động Xác định đồng
Phương pháp RP- Quy
trình
Amoni Axetat: ACN = thời
HPLC được đề xuất chiết
mẫu
60:40 ở bước sóng λ = 267 Glucosamin và đơn giản, nhanh phức tạp
Diacerein trong chóng, nhạy, là một
9

TLTK
(S. Pulla
redd & C
Rambabu,
2015)


nm. Phương pháp có dạng bào chế
khoảng tuyến tính với dược
phẩm
GlcN
3000-9000 μg/ theo RP-HPLC
ml, độ thu hồi 100% với
RSD = 0,5

cách tiếp cận tốt để
xác định GlcN và

Diacerin ở dạng
tinh khiết và dạng
bào chế kết hợp.

Cột Luna C18, pha động
Natri peclorat (50 mM, pH
6,5):axetonitril (99:1,v / v)
ở 0,8ml/phút. LOD=
0,05 μg/ml. Độ thu hồi
100.5%

Xác định nhanh
Glucosamine
trong các công
thức
dược
phẩm
bằng
HPLC không
tạo dẫn xuất
trước cột với
máy dị tìm
mảng (DAD) ở
193nm

Khơng tạo dẫn xuất
trước cột, việc sử
dụng cột phân tích
pha đảo ngược điển
hình, rửa giải đẳng

dòng, độ tinh khiết
của đỉnh cao với
thời gian lưu ngắn,
chạy sắc ký hồn
thành trong 4phút
mà khơng cần làm
sạch cột và cân
bằng, độ chính xác
tốt với quy trình
đơn giản và chi phí
thấp

Phát
hiện
quang phổ ở
λ = 193nm
thấp chưa có
tính chọn lọc
với
nhiễu
nền

Mẫu chỉ bao gồm việc hịa
tan mẫu trong nước DI
Khoảng tuyến tính (0,32–
6,4 µg/ml). Độ thu hồi đạt
101 ± 1,3 và 102 ± 0,3%.

Xác
định

Glucosamine
trong
Thực
phẩm bổ sung
trao đổi anion
hiệu suất cao
với sắc ký đo
ampe đo xung
HPAE-PAD

Không cần tạo dẫn
xuất trước hoặc sau
cột khi sử dụng
phát hiện tia UV
hoặc huỳnh quang.
Công suất cao của
CarboPac PA20 và
việc sử dụng chất
rửa giải cho phép
phân tích đẳng cấp
hơn 100 mẫu mỗi
ngày trong 5 ngày.
Phương pháp này
có hiệu quả với
nhiều loại nền mẫu,
được chứng minh
bằng việc áp dụng
thực tế phương
pháp này để xác
định chính xác


Điều kiện (Dionex
thiết bị chưa Corporatio
đáp ứng với n, 2008)
phịng
thí
nghiệm

10

(Armando
Alcázar
Maga ,
Katarzyna
Wrobel ,
Alma Rosa
Corrales
Escobosa
&
Kazimierz
Wrobel
2014)


GlcN trong bảy loại
thực phẩm chức
năng
Hệ thống LC- Sê-ri
Agilent HPLC 1100, Cột
LC- Phenomenex Prodigy

(MidBore ™ ) ODS-3 100
Å, 5 μm,150×3.2mm, pha
động:
0.05%
TFA
(trifluoroacetic acid) trong
nước (pH 2.4): ACN. Cho
triethylamin vào trung hoà
acid, sau đó dẫn xuất
Glucosamine base tự do
với
N-(9fluorenylmethoxycarbony
loyxy-succinimide
(FMOC-Su)
Phương
pháp
này
GlcN.sunfat được phản
ứng
với
Phenylisothiocyanat
(PITC) tạo dẫn xuất
Phenylthiourea có độ hấp
thụ cực đại ở λ = 227 nm.
Phương pháp xây dựng
khoảng tuyến tính từ 5-25
μg/ml, độ thu hồi 99,699,8%.

Xác
định

Glucosamine
trong nguyên
liệu thô và
Thực phẩm bổ
sung
chứa
Glucosamine
Sulfate
và
Glucosamine
Hydrochloride
bằng sắc ký
lỏng hiệu suất
cao bằng tia
cực tím λ = 265
nm với dẫn
xuất FMOC-Su

AOAC
INTERNATIONA
L
chấp
nhận.
Phương pháp sễ
thực hiện

Điều kiện
phịng
thí
nghiệm chưa

đáp ứng

(Joseph
Ziqi Zhou,
Ted
Waszkuc
& Felicia
Mohamme
d, 2005)

Nghiên cứu xác
định
Glucosamin
trong viên nén
bằng phương
pháp đo quang
phổ UV

Chính xác, có độ
nhạy, dùng để định
lượng GlcN trong
các TPBVSK

Bao gồm các
bước loại bỏ
lượng thuốc
thử dẫn xuất
dư và làm
khô
mẫu

trong chân
không. GlcN
tạo dẫn xuất
cần thời gian
ổn định là 24
giờ trong pH
kiềm (Natri
acetat)

(Gaonkar,
Priya
Khanvilkar
, Vineeta
Shettigar,
Rajani
Gadgoli &
Chhaya,
2006)

Có thể thấy kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao được nhiều tác giả nghiên cứu phát
triển để phân tích Glucosamin trong TPBVSK. Phương pháp điện di mao mạch, sắc ký
đo ampe đo xung HPAE-PAD,… cũng là phương pháp có độ tin cậy và độ nhạy cao,

11


tuy nhiên với điều kiện về thiết bị, hóa chất trong các phịng thí nghiệm hiện nay chưa
đáp ứng được gây ra nhiều khó khăn.
Với một số nghiên cứu về việc tạo dẫn xuất trước cột trước khi chạy HPLC của
một số tác giả (Joseph Ziqi Zhou, Ted Waszkuc & Felicia Mohammed, 2005) và

(Gaonkar, Priya Khanvilkar, Vineeta Shettigar, Rajani Gadgoli & Chhaya, 2006) như
sau


Tạo hợp chất huỳnh quang GlcN-OPA/2ME có độ nhạy cao
Các phân tích về GlcN.HCl được thực hiện với tạo dẫn xuất trước cột bằng cách

sử dụng OPA với việc bổ sung 2-mercaptoethanol (2-ME). Hình thức này tạo thành các
hợp chất huỳnh quang có thể được phát hiện OPA/2-ME thường được dùng làm thuốc
thử để cải thiện việc phát hiện các axit amin. GlcN có nhóm amin bậc một (NH2) do đó
thuốc thử OPA phản ứng với nhóm amin chính cơ chất để tạo ra các dẫn xuất isindole
với độ hấp thụ phân tử cao của ánh sáng UV hoặc nhóm huỳnh quang.

Hình 2.1: Hợp chất huỳnh quang GlcN-OPA/2ME
 Tạo hợp chất GlcN-OPA/3MPA
Dẫn xuất mới tạo thành có khả năng hấp thụ bước sóng chọn lọc khơng bị nhiễm
tạp do bước sóng càng thấp sự hấp thụ của tạp chất và chất cần phân tích có khả năng
trùng lặp  tăng độ chọn lọc của chất phân tích.

Hình 2.2: Hợp chất GlcN-OPA/3MPA
12


Nhược điểm: các dẫn xuất OPA của một số hợp chất amin có độ ổn định tương đối
kém. Giảm độ pH của OPA từ 9,5 xuống 7,2 trước khi bơm chúng lên cột, dẫn đến mất
phản ứng đáng kể
2.3.2. Tại Việt Nam
Nhóm nghiên cứu Trần Hữu Dũng cùng các cộng sự đã sử dụng phương pháp
HPLC để định lượng đồng thời Glucosamine và Chondroitin. Hai thành phần được hoà
tan trong nước, rửa giải trên cột pha đảo C8 (250 mm x 4.6 mm; 10 μm) với pha động

là dung dịch đệm phosphat 0,025M ở pH 3,2. Phương pháp sử dụng detector UV-VIS
đặt tại bước sóng 192nm. Phương pháp này tiếp tục được phát triển để định lượng đồng
thời 3 thành phần gồm glucosamine, chondroitine và vitamin C, sử dụng điều kiện sắc
kí gần tương tự (Trần Hồng Lê, 2010). Tuy nhiên đáng chú ý là sự có mặt của ion clorid
(Cl-) và ion sulfat (SO42-) với khả năng hấp thụ năng lượng ở bước sóng thấp chưa được
đề cập đến. Trên thực tế, lượng Cl- và SO42- trong nguyên liệu và chế phẩm thường dư
so với lượng cần thiết để tạo muối Glucosamine và Chondroitine. Chính vì vậy, nếu ion
Cl- và SO42- có ảnh hưởng đến kết quả định lượng khi sử dụng bước sóng phát hiện thấp
(192 nm) thì kết quả định lượng phản ánh không đúng chất lượng thực tế (Nguyễn Quang
Mẫn & Trần Hữu Dũng, 2012).
Nhóm nghiên cứu Y học của Nguyễn Lục Thơ và các cộng sự (2014) đã xây dựng
quy trình định lượng Glucosamin bằng phương pháp HPLC với đầu dò PDA, sử dụng
cột Ascentic RP C8 (250 x 4,6 mm; 5 μm), pha động gồm acetonitril– đệm phosphat pH
3 có triethylamin (35:65, tt/tt), bước sóng phát hiện 195 nm, tốc độ dịng 0,5 ml/phút.
Kết quả thẩm định cho thấy quy trình định lượng có tính chọn lọc cao, khoảng tuyến
tính rộng từ 600 – 1400 μg/ml, độ đúng thể hiện qua tỷ lệ hồi phục nằm trong khoảng
98% - 102% và RSD < 2% đối với độ chính xác (Nguyễn Lục Thơ, Nguyễn Thị Chung
& Nguyễn Đức Tuấn, 2014).
Kết luận: Với phương pháp không tạo dẫn xuất: khi khơng tạo dẫn xuất thì GlcN
được phát hiện ở bước sóng 𝜆 = 190-195 nm khơng tránh được khả năng nhiễm tạp với
dung môi, nền mẫu, peak thấp và khả năng tách nền kém do tại các bước sóng thấp tạp
chất hấp thụ mạnh khả năng chất phân tích kém. Do điều kiện phịng thí nghiệm, hóa
13


chất kết hợp với tài liệu tham khảo, chúng tôi quyết định chọn phương pháp HPLC để
xác định Glucosamin có tạo dẫn xuất.
2.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC - High Perfomance Liquid
Chromatography) là phương pháp có tốc độ tách nhanh, độ chọn lọc và độ nhạy cao, có

thể tự động hố phân tích hàng loạt mẫu và phân tích đồng thời nhiều chất có trong mẫu.
Mặt khác, HPLC là phương pháp hiện đại, đang phát triển mạnh và được ứng dụng rộng
rãi trong các phịng thí nghiệm phân tích của các nước tiên tiến trên thế giới cũng như ở
các phịng thí nghiệm ở Việt Nam (Azim Md.Sabir, Mitra Moloy & Bhasin Parminder
S, 2015).
2.4.1. Khái quát về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Nguyên tắc: HPLC là một kỹ thuật phân tách vật lý hai hay nhiều cấu tử trong một
hỗn hợp, có thể dùng để phân tích các phân tử hoặc ion hữu cơ. Kỹ thuật này bao gồm
một pha rắn cố định (pha tĩnh) được nhồi vào một cột thép không rỉ và một pha lỏng di
động (pha động) chạy qua. Các thành phần trong mẫu tương tác mạnh với pha tĩnh sẽ di
chuyển chậm hơn so với các thành phần có tương tác yếu hơn (Phạm Luận, 2006).
Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chất sử dụng trong sắc ký lỏng hiệu năng cao
(HPLC), HPLC được chia thành 4 loại sắc ký hấp phụ, sắc ký phân bố, sắc ký trao đổi
ion và sắc ký lọc gel.
Trong HPLC, pha tĩnh chính là chất nhồi cột làm nhiệm vụ tách hỗn hợp chất phân
tích, đó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ, từ 3 - 7 µm. Tuỳ theo bản chất
của pha tĩnh, trong phương pháp sắc ký lỏng thường chia làm 2 loại: sắc ký pha thuận
và sắc ký pha đảo
Sắc ký pha thuận: Pha tĩnh có độ phân cực cao hơn độ phân cực của dung môi pha
động. Cơ chế là chất phân cực nhiều sẽ tương tác mạnh với pha tĩnh và được giữ lại lâu
hơn, kỹ thuật này thường dùng để phân tích các chất có độ phân cực cao. Trong sắc ký
pha thuận, chất ít phân cực nhất được rửa giải đầu tiên, khi tăng độ phân cực của pha
động thì thời gian lưu giảm.

14


Sắc ký pha đảo: Ngược với sắc ký lỏng pha thuận, pha tĩnh có độ phân cực thấp,
pha động có độ phân cực cao hơn. Cơ chế là chất phân cực nhiều sẽ được giữ lại yếu
hơn trên pha tĩnh, chất càng ít phân cực thì càng bị giữ mạnh hơn trên pha tĩnh. Phương

pháp này dùng để phân tích các hợp chất từ không phân cực đến phân cực vừa. Dung
môi sử dụng là các dung môi phân cực như methanol, acetonitril, tetrahydrofuran, nước
và hỗn hợp của chúng. Sắc ký pha đảo thường được ứng dụng nhiều hơn trong thực tế.
2.4.2. Cấu tạo của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Hình 2.3: Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC

Hình 2.4: Hệ thống HPLC tại khoa Hóa Thực phẩm - Viện Dinh dưỡng
Quốc gia
Hệ thống HPLC gồm có các bộ phận cơ bản như sau

15