HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC
-------------***--------------

KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG VỚI NẤM GÂY
BỆNH HẠI CÂY TRỒNG CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM
TRICHODERMA SP. MỚI PHÂN LẬP

Hà Nội - 2023


HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC
-------------***--------------

KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG VỚI NẤM GÂY
BỆNH HẠI CÂY TRỒNG CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM
TRICHODERMA SP. MỚI PHÂN LẬP

Sinh viên thực hiện

: PHẠM VŨ LỆ SƢƠNG

Lớp

: K64CNSHA

MSV

: 642206

Giảng viên hƣớng dẫn : ThS. TRẦN THỊ ĐÀO
: PGS.TS. NGUYỄN VĂN GIANG
Bộ mơn

: CƠNG NGHỆ VI SINH

Hà Nội -2023



LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu khoa học do tôi thực hiện
trong thời gian từ 08/2022 – 2/2023 dưới sự hướng dẫn của ThS. Trần Thị Đào
và PGS.TS. Nguyễn Văn Giang, Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Khoa Công nghệ
Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Tất cả số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là trung thực và
chưa được cơng bố ở bất kỳ cơng trình nghiên cứu nào ở trong và ngồi nước.
Các tài liệu đã trích dẫn được nêu ở mục tài liệu tham khảo.
Hà Nội, ngày 10 tháng 02 năm 2023
Sinh viên

Phạm Vũ Lệ Sương

i



LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt
Nam, đội ngũ giảng viên, cán bộ đang giảng dạy và công tác tại Học viện Nông
Nghiệp Việt Nam. Tôi vô cùng biết ơn các thầy, cô khoa Công nghệ sinh học đã
giảng dạy, hướng dẫn và tạo điều kiện để tơi hồn thành chương trình học, thực
tập nghề nghiệp và khố luận tốt nghiệp.
Tơi xin bày tỏ sự kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Văn
Giang, ThS. Trần Thị Đào đã định hướng đề tài và tận tình hướng dẫn, giúp đỡ
tơi trong suốt q trình thực hiện khóa luận.
Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các cán bộ tại phịng thí nghiệm Bộ
mơn Cơng nghệ Vi sinh, các anh chị, bạn bè tại phịng thí nghiệm đã giúp đỡ tơi
nhiệt tình, đóng góp những ý kiến q báu cũng như tận tình chỉ dạy, tạo mọi
điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp.
Cuối cùng tôi muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến Bố, Mẹ, anh, chị và
bạn bè đã ln ln ủng hộ, khuyến khích và động viên để tơi có thể hồn thành
tốt khố luận tốt nghiệp.
Tơi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 10 tháng 02 năm 2023
Sinh viên

Phạm Vũ Lệ Sương

ii


MỤC LỤC
Lời cam đoan .............................................................................................................. i
Lời cảm ơn................................................................................................................. ii

Mục lục ..................................................................................................................... iii
Danh mục bảng........................................................................................................ vii
Danh mục hình ....................................................................................................... viii
Danh mục từ viết tắt ................................................................................................. xi
Tóm tắt .................................................................................................................... xii
PHẦN I. MỞ ĐẦU .................................................................................................. 1
1.1.

Đặt vấn đề ..................................................................................................... 1

1.2.

Mục đích và nội dung nghiên cứu................................................................. 2

1.2.1. Mục đích nghiên cứu..................................................................................... 2
1.2.2. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................... 3
1.2.3. Nội dung nghiên cứu. .................................................................................... 3
1.3.

Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài ......................................... 3

1.3.1. Ý nghĩa khoa học .......................................................................................... 3
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn ........................................................................................... 3
PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 4
2.1.

Giới thiệu chung về nấm Trichoderma ......................................................... 4

2.1.1. Vị trí phân loại Trichoderma ........................................................................ 4
2.1.2. Đặc điểm hình thái, cấu trúc của Trichoderma ............................................. 4

2.1.3. Các yếu tố môi trường ảnh hưởng tới sự phát triển của nấm
Trichoderma .................................................................................................. 7
2.1.4. Vai trò của Trichoderma như tác nhân kiểm soát sinh học (
Biological Control Agent - BCA) ................................................................. 8
2.1.5. Ứng dụng của Trichoderma trong nông nghiệp.......................................... 17
2.2.

Một số nấm gây bệnh phổ biến trên cây trồng............................................ 19
iii


2.2.1. Nấm Fusaium spp. ...................................................................................... 19
2.2.2. Nấm Collectotrichum spp. .......................................................................... 21
2.2.3. Nấm Sclerotium rolfsii ................................................................................ 22
2.3.

Tình hình nghiên cứu nấm Trichoderma đối kháng với nấm bệnh
trên cây trồng trong nước và trên thế giới................................................... 22

2.3.1. Tình hình nghiên cứu nấm Trichoderma đối kháng với nấm bệnh
trên cây trồng trong nước ............................................................................ 22
2.3.2. Tình hình nghiên cứu nấm Trichoderma đối kháng với nấm bệnh
trên cây trồng trên thế giới .......................................................................... 25
PHẦN III. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 28
3.1.

Đối tượng, vật liệu nghiên cứu ................................................................... 28

3.1.1. Thời gian, địa điểm nghiên cứu .................................................................. 28
3.1.2. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................. 28

3.1.3. Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu ................................................................... 28
3.1.4. Hóa chất ...................................................................................................... 28
3.2.

Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 29

3.2.1. Phương pháp thu thập mẫu đất ................................................................... 29
3.2.2

Phương pháp phân lập Trichoderma ........................................................... 29

3.2.3

Phương pháp khảo sát hình thái sợi nấm .................................................... 30

3.2.4. Phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của các chủng
Trichoderma sp. mới phân lập với các chủng nấm gây bệnh bằng
phương pháp đồng nuôi cấy ........................................................................ 31
3.2.5. Phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của các chủng
Trichoderma sp. mới phân lập đối với nấm bệnh bằng các hợp chất
hữu cơ dễ bay hơi ........................................................................................ 31
3.2.6. Phương pháp xác định hoạt tính sinh ezyme ngoại bào (cellulase,
chitinase) ..................................................................................................... 32

iv


3.2.7. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến sự phát triển của các các chủng
Trichoderma sp. mới phân lập .................................................................... 32
3.2.8. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của các

chủng Trichoderma sp. mới phân lập ......................................................... 33
3.2.9. Ảnh hưởng của các nồng độ pH đến sự phát triển của các chủng
Trichoderma sp. mới phân lập .................................................................... 33
PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 34
4.1.

Kết quả phân lập nấm Trichoderma............................................................ 34

4.2.

Khả năng đối kháng của các chủng Trichoderma sp. mới phân lập
với nấm bệnh Fusarium sp. ........................................................................ 37

4.2.1. Khả năng đối kháng của các chủng Trichoderma sp. mới phân lập
với nấm bệnh Fusarium sp. bằng phương pháp đồng nuôi cấy .................. 37
4.2.2. Khả năng đối kháng của các chủng Trichoderma sp. mới phân lập
với nấm bệnh Fusarium sp. bằng các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi............. 39
4.3.

Khả năng đối kháng của các chủng Trichoderma sp. mới phân lập
với nấm bệnh Collectotrichum sp. ............................................................. 41

4.3.1. Khả năng đối kháng của các chủng Trichoderma sp. mới phân lập với
nấm bệnh Collectotrichum sp. bằng phương pháp đồng nuôi cấy .................... 41
4.3.2. Khả năng đối kháng của các chủng Trichoderma sp. mới phân lập với
nấm bệnh Collectotrichum sp. bằng các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi .............. 43
4.4.

Khả năng đối kháng của các chủng Trichoderma sp. mới phân lập
với nấm bệnh Sclerotium rolfsii .................................................................. 45


4.4.1. Khả năng đối kháng của các chủng Trichoderma sp. mới phân lập
với nấm bệnh Sclerotium rolfsii bằng phương pháp đồng nuôi cấy ........... 45
4.4.2. Khả năng đối kháng của các chủng Trichoderma sp. mới phân lập với
nấm bệnh Sclerotium rolfsii bằng các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi ................... 47
4.5.

Khả năng sinh enzyme ngoại bào ............................................................... 48

4.5.1. Khả năng sinh enzyme cellulase ................................................................. 48
v


4.5.2. Khả năng sinh enzyme chitinase ................................................................. 50
4.6.

Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến sự phát triển của các chủng
Trichoderma sp. phân lập ........................................................................... 50

4.7.

Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của các
chủng Trichoderma sp. mới phân lập ......................................................... 53

4.8.

Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của các
chủng Trichoderma sp. mới phân lập ......................................................... 56

PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................. 60

5.1.

Kết luận ....................................................................................................... 60

5.2.

Kiến nghị ..................................................................................................... 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 61
PHỤ LỤC ............................................................................................................... 80

vi


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Địa điểm thu mẫu...................................................................................... 3
Bảng 4.1. Nguồn gốc các chủng nấm Trichoderma phân lập ................................. 34
Bảng 4.2. Mơ tả hình thái các chủng nấm Trichoderma mới phân lập................... 35
Bảng

4.3.

Hoạt

tính

đối

kháng


Fusarium

sp. của các

chủng

Trichoderma sp. được đánh giá bằng phương pháp đồng ni cấy........ 37
Bảng 4.4. Hoạt tính đối kháng Fusarium sp. của các chủng Trichoderma sp.
được đánh giá bằng các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi .................................. 40
Bảng 4.5. Hoạt tính đối kháng Collectotrichum sp. của các chủng
Trichoderma sp. được đánh giá bằng phương pháp đồng nuôi cấy........ 41
Bảng 4.6. Hoạt tính đối kháng Collectotrichum sp. của các chủnng
Trichoderma sp. được đánh giá bằng các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi ........ 43
Bảng 4.7. Hoạt tính đối kháng Sclerotium rolfsii của các chủng
Trichoderma sp. được đánh giá bằng phương pháp đồng nuôi cấy........ 45
Bảng 4.8. Hoạt tính đối kháng Sclerotium rolfsii của các chủng
Trichoderma sp. được đánh giá bằng các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi......... 47
Bảng 4.9. Khả năng sinh cellulase của 5 chủng Trichoderma phân lập ................. 49
Bảng 4.10. Khả năng sinh chitinase của 5 chủng Trichoderma phân lập ............... 50
Bảng 4.11. Tốc độ tăng trưởng của sợi nấm (mm) của các chủng
Trichoderma phân lập ở các nồng độ muối khác nhau ........................... 51
Bảng 4.12. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của các
chủng Trichoderma sp. phân lập............................................................. 54
Bảng 4.13. Ảnh hưởng của pH môi trường đến sự phát triển của các chủng
Trichoderma sp. phân lập ....................................................................... 57

vii


DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1. Khuẩn lạc của các lồi Trichoderma trên PDA (7 ngày), (A):
T.atroviride; (B): T. longibrachiatum; (C): T. virens; (D)
:T.harzianum. ............................................................................................ 5
Hình 2.2. Đặc điểm hình thái của khuẩn lạc Trichoderma asperelloides
TSU1 trên môi trường thạch khoai tây dextrose (PDA), (A) mặt
trên và (B) mặt dưới; (C) khuẩn lạc được quan sát dưới kính hiển
vi soi nổi; (D) chi tiết của hạt bào tử và phialides; (E) khối lượng
conidia và (F) conidia. .............................................................................. 6
Hình 2.3. Sơ đồ tương tác ký sinh giữa sợi nấm Trichoderma với sợi nấm
gây bệnh .................................................................................................... 9
Hình 2.4. Sự chuyển hóa dạng sắt khơng hịa tan (Fe 3+ ) thành dạng hịa tan
và

dễ

đồng

hóa

(Fe 2+ )

bởi

các

siderophore

do

nấm Trichoderma tạo ra .......................................................................... 14

Hình 4.1. Kết quả phân lập Trichoderma spp. từ đất .............................................. 34
Hình 4.2. Hình thái đại thể của các chủng nấm Trichoderma phân lập.................. 36
Hình 4.3. Hình thái vi thể của chủng nấm Trichoderma phân lập. Conidia
(bào tử), phialides (thể bình). .................................................................. 36
Hình 4.4. Khả năng đối kháng của các chủng Trichoderma sp. với nấm
bệnh Fusarium sp. bằng phương pháp đồng ni cấy ............................ 38
Hình 4.5. Khả năng đối kháng của các chủng Trichoderma sp. với nấm
bệnh Fusarium sp. bằng các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi ....................... 40
Hình 4.6. Khả năng đối kháng Collectotrichum sp. của các chủng
Trichoderma sp. bằng phương pháp đồng ni cấy ............................... 42
Hình 4.7. Khả năng đối kháng của các chủng Trichoderma sp. với nấm
bệnh Collectotrichum sp. bằng các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi ............ 44
Hình 4.8. Khả năng đối kháng Sclerotium rolfsii của các chủng
Trichoderma sp. bằng phương pháp đồng nuôi cấy ............................... 46
viii


Hình 4.9. Khả năng đối kháng của các chủng Trichoderma sp. với nấm
bệnh Sclerotium rolfsii bằng các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi ................ 48
Hình 4.10. Hoạt tính enzyme cellulase của các chủng nấm Trichoderma
phân lập ................................................................................................... 49
Hình 4.11. Hoạt tính enzyme chitinase của các chủng nấm Trichoderma
phân lập ................................................................................................... 50
Hình 4.12. Tốc độ tăng trưởng của sợi nấm (mm) của các chủng
Trichoderma phân lập ở các nồng độ muối khác nhau. .......................... 52
Hình 4.13. Chủng Tr.1 trên mơi trường PDA bổ sung các nồng độ NaCl
khác nhau ................................................................................................ 52
Hình 4.14. Chủng Tr.2 trên mơi trường PDA bổ sung các nồng độ NaCl
khác nhau ................................................................................................ 52
Hình 4.15. Chủng Tr.3 trên môi trường PDA bổ sung các nồng độ NaCl

khác nhau ................................................................................................ 53
Hình 4.16. Chủng Tr.4 trên mơi trường PDA bổ sung các nồng độ NaCl
khác nhau ................................................................................................ 53
Hình 4.17. Chủng Tr.5 trên môi trường PDA bổ sung các nồng độ NaCl
khác nhau ................................................................................................ 53
Hình 4.18. Chủng Tr.1 sau 3 ngày nuôi cấy trên các môi trường PDA,
MPDA, CA, WA. .................................................................................... 55
Hình 4.19. Chủng Tr.2 sau 3 ngày ni cấy trên các mơi trường PDA,
MPDA, CA, WA. .................................................................................... 55
Hình 4.20. Chủng Tr.3 sau 3 ngày nuôi cấy trên các môi trường PDA,
MPDA, CA, WA. .................................................................................... 55
Hình 4.21. Chủng Tr.4 sau 3 ngày nuôi cấy trên các môi trường PDA,
MPDA, CA, WA ..................................................................................... 56
Hình 4.22. Chủng Tr.5 sau 3 ngày ni cấy trên các môi trường PDA,
MPDA, CA, WA ..................................................................................... 56
ix


Hình 4.23. Chủng Tr.1 sau 3 ngày ni cấy trên môi trường PDA ở các
nồng độ pH khác nhau ............................................................................ 58
Hình 4.24. Chủng Tr.2 sau 3 ngày ni cấy trên môi trường PDA ở các
nồng độ pH khác nhau ............................................................................ 58
Hình 4.25. Chủng Tr.3 sau 3 ngày ni cấy trên môi trường PDA ở các
nồng độ pH khác nhau ............................................................................ 58
Hình 4.26. Chủng Tr.4 sau 3 ngày ni cấy trên môi trường PDA ở các
nồng độ pH khác nhau ............................................................................ 58
Hình 4.27. Chủng Tr.5 sau 3 ngày ni cấy trên môi trường PDA ở các
nồng độ pH khác nhau ............................................................................ 59

x



DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Giải nghĩa

ml

Milliter

Nm

Nanometer

µl

Microliter

BCA

Biological Control Agent

CA

Carrot agar

CDA

Cornmeal Dextrose Agar


ĐC

Đối chứng

MPDA

Modified Potato Dextrose Agar

PDA

Potato Dextrose Agar

ROS

Reactive oxygen species

PPNs

Plant-parasitic nematodes

WA

Water Agar

VOCs

Các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi

xi



TÓM TẮT
Hiện nay, ứng dụng biện pháp sinh học trong phòng trừ bệnh hại cây
trồng đang được coi là giải pháp cần thiết để thay thế dần việc sử dụng thuốc
diệt nấm hóa học. Với mục đích tạo ra các nguồn nguyên liệu cho sản xuất chế
phẩm sinh học phòng trừ nấm gây bệnh trên cây trồng, đề tài nghiên cứu:
“Khảo sát khả năng đối kháng với nấm gây bệnh hại cây trồng của một số
chủng Trichoderma sp. mới phân lập” đã được tiến hành.
Kết quả, đã phân lập được 5 chủng Trichoderma từ đất và cả 5 chủng
đều có khả năng kháng nấm Fusarium sp., Collectotrichum sp., Sclerotium
rolfsii gây bệnh hại trên cây trồng. Tất cả các chủng Trichoderma phân lập
được đều có khả năng ức chế sự phát triển của nấm bệnh Fusarium sp. với
phần trăm ức chế dao động từ 73,68±1,52% đến 97,37±1,52%, phần trăm ức
chế với Collectotrichum sp. dao động từ 68,75±1,04% đến 97,92±1,20%,
phần trăm ức chế sự phát triển của Sclerotium rolfsii dao động từ
70,00±1,09% đến 92,86±0,83% khi đánh giá khả năng đối kháng bằng
phương pháp đồng nuôi cấy.
Đánh giá khả năng đối kháng của các chủng Trichoderma sp. phân lập với
các chủng nấm bệnh bằng các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi. Kết quả cho thấy tất
cả các chủng Trichoderma phân lập được đều có khả năng ức chế sự sinh trưởng
của Fusarium sp. với phần trăm ức chế dao động từ 37,18±0,64 đến
44,87±0.64%., phần trăm ức chế sự sinh trưởng của Collectotrichum sp. dao
động từ 44,16±1,13 đến 50,65±0,75%, phần trăm ức chế sự sinh trưởng của
Sclerotium rolfsii dao động từ 17,78±0,64 đến 30,00±0,64%.
Các chủng Trichoderma sp. mới phân lập đều có thể sinh trưởng được
trên môi trường bổ sung 10% muối và sinh trưởng tốt nhất trên môi trường PDA
tại pH (4.5 – 5.5) và đều có khả năng sinh enzyme cellulase và chitinase.

xii



PHẦN I: MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Mầm bệnh và sâu bệnh thực vật có tác động lớn đến năng suất nông
nghiệp. Bệnh hại thực vật làm giảm năng suất từ 21–30% ở một số loại cây
trồng quan trọng trên toàn thế giới (Savary & cs., 2019). Stress sinh học liên
quan đến nấm, vi khuẩn, vi rút, tuyến trùng, cỏ dại và côn trùng, gây ra thiệt hại
về năng suất lên tới 31–42%. Trong số đó, nấm gây bệnh là yếu tố hạn chế
nghiêm trọng nhất đối với sản xuất cây trồng trên toàn thế giới. Nấm được coi là
nguyên nhân gây ra rất nhiều bệnh thực vật (Sood & cs., 2020). Theo Tổ chức
Lương thực và Nông nghiệp của Liên Hợp Quốc (FAO), bệnh nấm thực vật
thường ảnh hưởng nhất đến 5 loại cây trồng quan trọng nhất trên thế giới là lúa
gạo, lúa mì, ngơ, khoai tây và đậu tương (Almeida & cs., 2019).
Do đó, thuốc diệt nấm hóa học được sử dụng tràn lan như một phương
tiện chính để quản lí nấm bệnh trong trồng trọt. Những hóa chất này không chỉ
đắt tiền mà việc sử dụng chúng cịn dẫn đến việc tích tụ độc tố có hại cho con
người, môi trường tự nhiên và tăng khả năng kháng thuốc (Sood & cs., 2020).
Vì vậy, ứng dụng biện pháp sinh học trong phòng trừ bệnh hại cây trồng là giải
pháp thay thế hiệu quả hơn vì nó có mức độ độc hại rất thấp theo quan điểm môi
trường và hiệu quả về chi phí.
Các tác nhân kiểm sốt sinh học đã chứng minh hiệu quả của chúng là
một chiến lược xanh để quản lý bệnh cây trồng, kích thích tăng trưởng và tăng
năng suất cây trồng. Bên cạnh đó, chúng có thể ngăn chặn các bệnh hại thực vật
bằng cách tạo ra các hóa chất ức chế và tạo ra phản ứng miễn dịch ở thực vật
chống lại mầm bệnh thực vật (El-Saadony & cs., 2022). Trong số các chủng vi
khuẩn hoặc nấm được sử dụng để chống lại các tác nhân gây bệnh trên cây
trồng, nấm Trichoderma vẫn là một trong các loài vi sinh vật được ứng dụng
nhiều nhất trong kiểm soát sinh học (Sánchez-Montesinos & cs., 2021).
Trichoderma spp. là loại nấm phổ biến nhất được sử dụng làm tác nhân

kiểm soát sinh học (Biological Control Agents - BCA ) vì nó có thể ức chế các
1


loại nấm gây bệnh thực vật bằng cách tăng cường sức đề kháng của thực vật để
có thể thốt khỏi mầm bệnh hoặc bằng cách đối đầu trực tiếp thông qua ký sinh,
cạnh tranh, sản xuất kháng sinh (Odebode, 2006). Việc sử dụng Trichoderma đã
ghi nhận tỷ lệ thành công tốt trong việc kiểm sốt các bệnh thực vật chính
(Nusaibah & Musa, 2019).
Nhiều loài thuộc chi này, bao gồm: T. harzianum; T. viride; T. atroviride;
T. virens; T. longibrachiatum; T. polysporum; T. hamatum; T. asperellum, đã
được mô tả là tác nhân kiểm soát sinh học chống lại mầm bệnh thực vật
(Sánchez-Montesinos & cs., 2021). Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng
Trichoderma có hiệu quả cao trong việc chống lại các loại nấm gây bệnh trên
cây trồng như Fusarium spp., Rhizoctonia solani, Phytophthora spp., Erwinia
spp., Pythium spp. (Lahlali & cs., 2022), Colletotrichum spp. (Freeman & cs.,
2004), Sclerotium rolfsii (Compant & cs., 2005). Do đó, khai thác và sử dụng các
lồi Trichoderma đã được coi là một phương pháp thay thế khả thi để quản lý bệnh
cây trồng, cũng như giảm nhẹ điều kiện sinh trưởng khơng thuận lợi và kích thích
tăng trưởng cây trồng (Alfiky & Weisskopf, 2021).
Đề tài “Khảo sát khả năng đối kháng với nấm gây bệnh hại cây trồng
của một số chủng Trichoderma sp. mới phân lập” được thực hiện nhằm tuyển
chọn các chủng Trichoderma có hoạt tính đối kháng mạnh với nấm bệnh, góp
phần làm nguồn nguyên liệu cho sản xuất chế phẩm sinh học phòng trừ nấm gây
bệnh trên cây trồng.
1.2. Mục đích và nội dung nghiên cứu
1.2.1. Mục đích nghiên cứu
 Tuyển chọn được các chủng Trichoderma có khả năng đối kháng cao
với nấm gây bệnh hại cây trồng.
 Đánh giá ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sự phát triển của các

chủng Trichoderma phân lập.

2


1.2.2. Đối tượng nghiên cứu
Chủng nấm Trichoderma phân lập từ 3 mẫu đất được lấy tại Bắc Ninh và
Hà Nội.
Bảng 1.1. Địa điểm thu mẫu
Địa điểm thu mẫu

STT

Số mẫu

1

Phường Đình Bảng, thị xã Từ Sơn, tỉnh Bắc Ninh

1

2

Phường Vũ Ninh, Thành phố Bắc Ninh, tỉnh Bắc Ninh

1

3

Phường Ngọc Lâm, huyện Long Biên, Hà Nội


1

1.2.3. Nội dung nghiên cứu.
 Phân lập nấm Trichoderma từ các mẫu đất.
 Đánh giá khả năng đối kháng của chủng nấm Trichoderma sp. phân lập
với các chủng nấm bệnh Fusarium sp., Collectotrichum sp., Sclerotium rolfsii.
 Khảo sát một số đặc điểm sinh học của các chủng Trichoderma phân lập.
 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy sự phát triển của các chủng
Trichoderma sp. phân lập.
1.3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
1.3.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp và bổ sung nguồn dữ liệu về các chủng
nấm Trichoderma có khả năng đối kháng với các chủng nấm bệnh hại cây trồng.
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp thông tin về các chủng nấm
Trichoderma có khả năng đối kháng nấm bệnh hại cây trồng, nhằm mục đích
nghiên cứu, sản xuất chế phẩm sinh học có hiệu quả. Từ đó góp phần nâng cao
hiệu quả sản xuất trong nơng nghiệp, giảm thiểu lượng phân bón hóa học, góp
phần xây dựng nền nông nghiệp bền vững.

3


PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu chung về nấm Trichoderma
2.1.1. Vị trí phân loại Trichoderma
Trichoderma được mơ tả bởi Christiaan Hendrik Persoon vào năm 1794,
nhưng việc phân loại và xác định Trichoderma vẫn chưa rõ ràng và khá phức tạp
(Bissett & cs., 2015).

Persoon ex Grey (1801) phân loại Trichoderma như sau:
Giới :

Fungi

Ngành: Ascomycota
Lớp:

Euascomycetes

Bộ:

Hypocreales

Họ:

Hypocreaceae

Chi:

Trichoderma

Năm 1969, Rifai đề xuất khái niệm lồi ―tổng hợp‖, trong đó các lồi
Trichoderma được chia thành 9 ―tập hợp loài‖, cụ thể là T. aureoviride Rifai, T.
hamatum Bain, T. harzianum Rifai, T. koningii Oudem, T. longibrachiatum Rifai, T.
piluliferum Rifai, T. polysporum Rifai, T. pseudokoningii Rifai và T. viride (Chaverri
& Samuels, 2003). Barnett & Barry Bhunter (1972) lại cho rằng Trichoderma thuộc
lớp Deuteromycetes, bộ Moniliaceae, họ Moniliaceae. Esposito & Manuela da silva
(1998), cho biết Trichoedrma thuộc họ Hypocreaceea, lớp Ascomycetes và
Trichoderma được phân thành 5 nhóm: Trichoderma, Longibrachiatum,

Satunisporum, Pachibarium, Hypocrenum (Hermosa & cs., 2000).
2.1.2. Đặc điểm hình thái, cấu trúc của Trichoderma
2.1.2.1. Đặc điểm hình thái đại thể của Trichoderma
Các chủng Trichoderma có thể được xác định dựa vào một số đặc điểm
của khuẩn lạc: màu sắc, tốc độ tăng trưởng của khuẩn lạc, sắc tố tạo ra trên mơi
trường, hình thành mụn mủ và mùi (Gams và Bissett, 2002).
4


Nấm thường phát triển nhanh, sợi nấm ban đầu chìm xuống, sau đó bơng
lên tùy vào chủng và mơi trường nuôi cấy. Không tạo sắc tố trên môi trường
hoặc tạo ra nhiều màu sắc khác nhau như vàng, hổ phách, đỏ xỉn hoặc vàng
xanh. Mùi chủ yếu rõ rệt hoặc thoang thoảng, đặc trưng của Trichoderma là mùi
dừa hoặc long não. Ví dụ, T. viride, sẽ tạo ra mùi ngọt ngào đặc trưng giống như
mùi ―dừa‖. Khuẩn lạc thường có màu xanh lục hoặc ít phổ biến hơn là màu
trắng, xám hoặc nâu (Harman & Kubicek, 2002).
Theo Samuels & cs (2002), phần lớn nấm Trichoderma phát triển nhanh ở
25°C - 30°C và thường không phát triển ở 35°C. Tuy nhiên, một số loài phát
triển tốt ở 35°C. Điều này như là một tiêu chí quan trọng giúp phân biệt giữa các
lồi giống nhau về hình thái. Ví dụ, T. harzianum có thể là phân biệt với các lồi
tương tự về hình thái như T. aggressivum và T. atroviride bằng cách nuôi chúng
ở 35°C. Sau 96 giờ, cả T. aggressivum và T. atroviride có bán kính khuẩn lạc
hơn 5 mm trong khi T. harzianum phát triển tốt và sinh bào tử ở 35°C (Samuels
& cs., 2002).

Hình 2.1. Khuẩn lạc của các loài Trichoderma trên PDA (7 ngày), (A):
T.atroviride; (B): T. longibrachiatum; (C): T. virens; (D) :T.harzianum.
(Nguồn: Ru & Di, 2012)
Sự phát triển của sợi nấm và màu sắc khuẩn lạc được quan sát tốt hơn
trong môi trường giàu dinh dưỡng như Potato Dextrose Agar (PDA). Các khuẩn


5


lạc có màu trắng trên mơi trường PDA và trong suốt trên môi trường Cornmeal
Dextrose Agar (CMD). Khi sinh bào tử thì khuẩn lạc có nhiều màu sắc khác
nhau (thường là xanh đậm, xanh vàng, hoặc lục trắng) tùy thuộc vào màu sắc
của bào tử (Almeida & cs., 2019). Khuẩn lạc của một số Trichoderma trên PDA
được thể hiện trong hình 2.1.
2.1.2.2. Đặc điểm hình thái vi thể của Trichoderma
Trichoderma được xác định dựa vào một số đặc điểm như: hình dạng,
màu sắc, kích thước của bào tử, hình dạng cành bào tử, cách mọc của thể bình
(phialides).
Đặc điểm hình thái chung của nấm Trichoderma là sợi nấm khơng màu,
có vách ngăn, có khả năng phân nhánh nhiều, cành bào tử khơng màu, bào tử rất
nhiều đính ở đỉnh của cành bào tử. Bào tử thường có màu xanh hoặc khơng màu,
đơn bào, hình trứng, trịn, elip, hoặc oval tùy theo từng lồi (Chaverri &
Samuels, 2003).

Hình 2.2. Đặc điểm hình thái của khuẩn lạc Trichoderma asperelloides
TSU1 trên môi trƣờng thạch khoai tây dextrose (PDA), (A) mặt trên và (B)
mặt dƣới; (C) khuẩn lạc đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi soi nổi; (D) chi tiết
của hạt bào tử và phialides; (E) khối lƣợng conidia và (F) conidia.
(Nguồn: Ruangwong & cs., 2021)
Các bào tử áo (chlamydospores) đơn bào, hình cầu, được hình thành trong
sợi nấm hoặc ở đầu sợi nấm. Thơng thường, chlamydospores là không màu, hơi
6


vàng nhạt hoặc hơi xanh. Chúng là những cấu trúc dạng ngủ, đóng vai trị quan

trọng giúp Trichoderma tồn tại được ở điều kiện bất lợi như không được cung
cấp chất dinh dưỡng (Gams & Bissett, 2002).
Hiện nay, việc sử dụng những đặc điểm hình thái để định danh các loài
Trichoderma đang dần được thay thế bằng kĩ thuật phân tử, nhanh chóng và dễ
dàng hơn (Almeida & cs., 2019).
2.1.3. Các yếu tố môi trường ảnh hưởng tới sự phát triển của nấm
Trichoderma
Nhiệt độ: Trichoderma spp. có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ từ
15°C - 35°C, ở nhiệt độ từ 15°C - 20°C Trichoderma spp. hình thành bào tử
chậm hơn. Nhiệt độ 25°C - 30°C là khoảng nhiệt độ tối ưu để Trichoderma spp.
sinh trưởng và phát triển nhanh, lượng bào tử nhiều và thời gian sinh sản bào tử
sớm. Ở 35°C Trichoderma spp. phát trển kém, khả năng sinh bào tử yếu (NietoJacobo & cs., 2017).
Ánh sáng: Với cường độ chiếu sang liên tục, sợi nấm phát triển nhanh,
nhưng mật độ bào tử ít. Tối liên tục sợi nấm phát triển chậm, mật độ thưa thớt,
sợi nấm chưa hình thành xong nhưng bào tử hình thành theo từng đợt rất rõ.
Sáng tối xen kẽ nấm hình thành nhiều (chỉ sau 2 ngày), mật độ dày, sau đó xuất
hiện nhiều bào tử (Nieto-Jacobo & cs., 2017).
pH: Nhiều nghiên cứu đã báo cáo rằng các loài Trichoderma phát triển tốt
hơn trong điều kiện axit. Nghiên cứu của Limón MC & cs (2004), cho thấy độ
pH axit tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của nấm hơn độ pH kiềm.
Jackson & cs (1991) báo cáo rằng các chủng T. harzianum cho thấy sự phát triển
sợi nấm tối ưu giữa pH 4,8 đến 6,8.
Stress mặn: Stress mặn là một trong những yếu tố phi sinh học tác động
đáng kể đến hệ sinh thái vi sinh vật đất và do đó hạn chế năng suất cây trồng. Độ
mặn của đất là một yếu tố môi trường quan trọng hạn chế khả năng sinh trưởng của
Trichoderma và do đó đóng một vai trị quan trọng trong q trình tuyển chọn các
7


chủng Trichoderma có tiềm năng. Tốc độ phát triển sợi nấm của tất cả các loài nấm

Trichoderma spp. giảm khi tăng nồng độ NaCl. Sự phát triển của khuẩn lạc đạt tối đa
được quan sát thấy ở 0mM NaCl (Abu-Shanab & cs., 20222).
2.1.4. Vai trò của Trichoderma như tác nhân kiểm soát sinh học ( Biological
Control Agent - BCA)
Một trong những khả năng vượt trội nhất của các loài Trichoderma là tác
nhân kiểm soát sinh học chống lại các bệnh thực vật. Một số chủng Trichoderma
đã được nghiên cứu rộng rãi nhờ khả năng cạnh tranh chất dinh dưỡng và khơng
gian sống, ký sinh trên các loại nấm khác, kích hoạt kháng sinh bằng cách tạo ra
các chất chuyển hóa thứ cấp hoặc các hợp chất kháng vi sinh vật, tạo ra các phản
ứng phòng vệ trong thực vật và thúc đẩy sự phát triển của thực vật. Chìa khóa
thành cơng của lồi Trichoderma trong đất là tốc độ sinh trưởng nhanh và khả
năng sinh sản cao, giúp chúng sống sót trong điều kiện khơng thuận lợi, khả năng
sử dụng chất dinh dưỡng và chống lại nấm bệnh cây trồng.
2.1.4.1. Cơ chế đối kháng của nấm Trichoderma với mầm bệnh
Trichoderma spp. sử dụng một số cơ chế đối kháng chống lại mầm bệnh
thực vật. Chúng bao gồm kháng sinh, kí sinh và cạnh tranh.
‒ Kí sinh:
Khả năng ký sinh của các loại nấm khác đã được sử dụng rộng rãi để kiểm
sốt sinh học các lồi gây hại nơng nghiệp (chủ yếu chống lại nấm gây bệnh và
tuyến trùng ký sinh). Cơ chế kí sinh của Trichoderma spp. giúp ức chế hoặc tiêu
diệt các loại nấm gây bệnh thực vật đã được công nhận là một cơ chế quan trọng
(Mukherjee & cs., 2012).
Kí sinh nấm bao gồm 4 bước:
+ Bước thứ nhất được gọi là sự phát triển có tính chất hướng hóa
(chemotrophic growth), tức là một tác nhân kích thích hóa học gây ra bởi nấm
ký chủ đã hấp dẫn chủng nấm ký sinh (nấm đối kháng).
+ Bước thứ hai là sự nhận diện đặc hiệu (specific recognition), chủng

8



nấm ký sinh nhận diện được bề mặt tế bào của nấm ký chủ.
+ Bước thứ ba bao gồm hai quá trình tách biệt nhau. Quá trình thứ nhất
là sự quấn (coiling), sợi nấm ký sinh Trichoderma bao quanh sợi nấm ký chủ.
Quá trình thứ hai bao gồm sự tương tác và tiếp xúc sợi nấm gắn kết với nhau
(intimate hyphal interaction and contact), tức sợi nấm Trichoderma phát triển
hoàn toàn dọc theo sợi nấm ký chủ.
+ Bước cuối cùng bao gồm sự tiết các enzyme phân giải đặc biệt, chúng
sẽ phân hủy vách tế bào của nấm ký chủ (Trần Văn Tý, 2018).

Hình 2.3. Sơ đồ tƣơng tác ký sinh giữa sợi nấm Trichoderma với sợi nấm
gây bệnh
(Nguồn: Tyśkiewicz & cs., 2022)
Phức hợp enzyme phân hủy thành tế bào được sản xuất từ
Trichoderma spp. bao gồm chitinase, β-glucanase, cellulase và protease. Những
enzyme này có thể phân hủy thành tế bào của mầm bệnh thực vật, giúp sợi nấm
có thể xâm nhập, định cư và kích hoạt ký sinh ở thực vật (Ghasemi & cs., 2020).
Sự hình thành các enzyme này đã được nghiên cứu trong quá trình tương tác vật
ký sinh - ký chủ giữa các loài Trichoderma spp. với một số nấm gây bệnh cây
trồng nhất định (Haran & cs., 1996).
Chitinase là nhóm enzyme ly giải quan trọng nhất được tổng hợp bởi
nấm Trichoderma, thủy phân các liên kết β-glycosid giữa carbon C1 và C4
của hai N-acetylglucosamine liền kề trong chuỗi chitin (Nguyễn Hoàng Lộc
& cs., 2020).
9


Enzyme glucanase phân giải thành tế bào của nấm gây bệnh thông qua hai
bộ enzyme là exo-β-glucanase và endo-β-glucanase (Sood & cs., 2020). Hoạt
tính phân giải chitinolytic và glucanolytic tăng lên đã được chứng minh bởi

chủng Trichoderma TkZ3A0 trong môi trường ni cấy lỏng có chứa thành tế
bào đơng khơ của chủng F. culmorum gây bệnh (Jaroszuk-Ściseł & cs., 2019).
Ngoài chitinase và glucanase, một vai trò quyết định trong quá trình ký
sinh trùng nấm là do các enzyme phân giải protein, xúc tác cho quá trình thủy
phân các liên kết peptide trong protein. Protease aspartic P6281 do T.
harzianum tiết ra đã ức chế đáng kể sự nảy mầm của bào tử và sự phát triển của
nấm gây bệnh thực vật (đặc biệt là B. cinerea và R. solani ), cũng như giảm sự
xuất hiện của mốc xám trên dưa chuột, táo và cam (Deng & cs., 2018).
‒ Kháng sinh:
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng Trichoderma có khả năng tiết ra
một lượng lớn các chất chuyển hóa thứ cấp khác nhau có tác dụng ức chế sự
tăng trưởng của nấm và vi khuẩn. Cơ chế kháng sinh thường diễn ra phối hợp
với ký sinh nấm (Schirmböck & cs., 1994). Các chất kháng sinh có thể ức chế sự
tạo thành vách tế bào, làm gia tăng hoạt động của những enzyme thủy phân. Các
chất kháng sinh cũng có thể tác động tới nấm mục tiêu thông qua một loạt các
cơ chế khác nhau, như kìm hãm sự phát triển, sự sản xuất các chất chuyển hóa,
sự hấp thu các chất dinh dưỡng và sự hình thành bào tử (Trần Văn Tý, 2018).
Các chủng Trichoderma khác nhau sẽ biểu hiện hoạt tính kháng nấm bệnh khác
nhau (Ghisalberti & cs., 1990).
Sản xuất các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi (VOCs) được coi là một cơ chế
kháng sinh hiệu quả của các loài Trichoderma . Các lồi Trichoderma sản xuất
và giải phóng các chất dễ bay hơi có giá trị liên quan đến khả năng kháng khuẩn,
tạo ra các phản ứng phòng vệ ở thực vật và thúc đẩy sự phát triển của thực vật
(Phoka & cs., 2020). VOCs do một số loài vi sinh vật giải phóng trực tiếp ức chế
sự phát triển của mầm bệnh hoặc gây ra những thay đổi bất thường của mầm
10