ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

TRẦN TRUNG ANH

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP GỘP MẪU LỚN
ỨNG DỤNG TRONG SÀNG LỌC COVID-19 BẰNG
REALTIME PCR

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

THÁI NGUYÊN – 2022


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

TRẦN TRUNG ANH

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP GỘP MẪU LỚN
ỨNG DỤNG TRONG SÀNG LỌC COVID-19 BẰNG
REALTIME PCR
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Mã số: 8420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Phú Hùng
TS.BS. Lê Thị Hương Lan

THÁI NGUYÊN - 2022

i

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tôi thực hiện dưới
sự hướng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Phú Hùng và TS.BS. Lê Thị Hương Lan.
Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Các số liệu, kết quả
nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng ai công bố trong một
công trình nào khác.

Thái Nguyên, ngày ..... tháng....... năm 2022
Tác giả


ii

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS.
Nguyễn Phú Hùng, Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học, Đại
học Thái Nguyên và và TS.BS. Lê Thị Hương Lan, Bệnh viện Trung ương
Thái Nguyên đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt thời
gian thực hiện và hồn thành luận văn này.
Tơi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Khoa họcĐại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ sinh học, phịng Sinh
hóa thực vật, Viện cộng nghệ sinh học và các thầy cô giáo, cán bộ trong Khoa
Công nghệ sinh học, đặc biệt là sự quan tâm, giúp đỡ của các anh chị kỹ thuật
viên phịng thí nghiệm khoa đã tạo điều kiện giúp đỡ tơi trong q trình làm
luận văn thạc sĩ.
Tơi xin cảm ơn gia đình và bạn bè ln bên cạnh ủng hộ, khuyến khích,
động viên tạo động lực để tơi hồn thành luận văn này.

Trong q trình làm luận văn khơng tránh khỏi những sai sót, tơi mong
nhận được sự đóng góp q báu từ phía thầy cơ và bạn bè để tơi hồn thành
bản luận văn.
Thái Nguyên, ngày ..... tháng ..... năm 2022
Tác giả


iii

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề...................................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu:..................................................................................... 3
3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 4
1.1. Đặc điểm của virus SARS-CoV-2 ............................................................. 4
1.1.1. Đặc điểm genome của virus SARS-CoV-2....................................... 4
1.1.2. Phương thức xâm nhập và gây bệnh ................................................. 5
1.1.3. Biến đổi di truyền của virus SARS-CoV-2....................................... 7
1.2. Tổng quan tình hình dịch bệnh virus SARS-CoV-2 trong nước và thế giới .... 10
1.2.1. Tình hình dịch bệnh trên thế giới .................................................... 10
1.2.2. Tình hình dịch bệnh tại Việt Nam .................................................. 11
1.3. Tổng quan về các phương pháp xét ghiệm SARS-CoV-2 ....................... 14
1.3.1. Các phương pháp chẩn đoán virus SARS-CoV-2........................... 14
1.3.2. Kit chuẩn đoán virus SARS-CoV-2 ................................................ 16
1.3.3. Tổng quan về đánh giá chất lượng sinh phẩm kit chẩn đoán ......... 17
1.4. Tình hình nghiên cứu về các phương pháp xét nghiệm trong sàng lọc
COVID-19 ....................................................................................................... 20
1.4.1. Hướng dẫn lấy mẫu, gộp mẫu và xét nghiệm của Bộ y tế .............. 20
1.4.2. Các nghiên cứu về phương pháp gộp mẫu trên thế giới ................. 23

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 25
2.1. Đối tượng, thời gian, địa điểm nghiên cứu .............................................. 25
2.2. Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu.................................................. 25
2.2.1. Vật liệu nghiên cứu ......................................................................... 25
2.2.2. Hoá chất và thiết bị nghiên cứu ...................................................... 25
2.3. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 27
2.3.1. Phương pháp thu thập và bảo quản mẫu lâm sàng.......................... 27


iv

2.3.2. Phương pháp tách chiết RNA từ mẫu bệnh phẩm bằng bộ sinh phẩm
QIAamp Viral RNA Mini Kit ................................................................... 27
2.3.3. Phản ứng Realtime RT-PCR ........................................................... 29
2.3.4. Xây dựng quy trình gộp mẫu và đánh giá quy trình gộp mẫu ........ 31
2.3.5. Xác định độ nhạy lâm sàng, độ đặc hiệu lâm sàng, LOD............... 32
2.3.6. Phương pháp tiến hành thử nghiệm thực tế .................................... 34
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ....................................................... 35
3.1. Thu nhân các mẫu bệnh phẩm.................................................................. 35
3.1.1. Mẫu bệnh phẩm dương tính với SARS-CoV-2 .............................. 35
3.1.2. Mẫu chứng âm................................................................................. 35
3.2. Nghiên cứu xây dựng phương pháp gộp mẫu lớn trong sàng lọc COVID-19 ..37
3.2.1. Phân tích độ nhạy lâm sàng của quy trình gộp mẫu ....................... 37
3.2.2. Phân tích độ đặc hiệu lâm sàng của quy trình gộp mẫu thơng qua
làm giàu mẫu ............................................................................................. 42
3.2.3. Phân tích độ lặp lại và tái lặp của quy trình gộp mẫu .................... 44
3.2.4. Ngưỡng phát hiện của quy trình gộp mẫu ...................................... 47
3.2.5. Đánh giá sự thay đổi trong chi phí và cơng xuất xét nghiệm ......... 48
3.3. Xây dựng quy trình thực hiện phương pháp gộp mẫu lớn trong sàng lọc
COVID-19 ....................................................................................................... 49

3.3.1. Quy trình thực hiện ......................................................................... 49
3.3.2. Sơ đồ hướng dẫn thực hiện ............................................................. 55
BÀN LUẬN .................................................................................................... 57
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 62
1. Kết luận ....................................................................................................... 62
2. Kiến nghị ..................................................................................................... 62
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
WHO

World Health Organization

Ct

Cycle threshold

PC

Positive control

NC

Negative control



vi

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Trình tự mồi và mẫu dị .................................................................. 26
Bảng 2.2. Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu.................................................. 26
Bảng 3.1. Danh sách mẫu bệnh phẩm dương tính được thu thập ................... 35
Bảng 3.2. Độ nhạy của quy trình gộp mẫu trên các mẫu bệnh phẩm dương tính ....37
Bảng 3.3. Đánh giá độ đặc hiệu của quy trình gộp mẫu trên các mẫu bệnh
phẩm âm tính..................................................................................... 42
Bảng 3.4. Độ lặp lại của quy trình trên mẫu dương tính................................. 45
Bảng 3.5. Độ tái lặp của quy trình trên mẫu dương tính................................. 46
Bảng 3.6. Giới hạn phát hiện đối với mẫu chứng dương tổng hợp (CDTH) .. 47
Bảng 3.7. Giới hạn phát hiện đối với mẫu chuẩn do NIHE cung cấp ............ 48
Bảng 3.8. Bảng so sánh tương đối về sự thay đổi chi và công xuất xét nghiệm
so với xét nghiệm mẫu đơn ............................................................... 48
Bảng 3.9. Sự thay đổi chi phí so với xét nghiệm mẫu đơn theo từng hạng mục .... 49


vii

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Bản đồ phân bố các gene trong genome của virus SARS-CoV-2
(Trình tự tham chiếu NCBI: NC_045512.2) ....................................... 5
Hình 1.2. Q trình xâm nhập và giải phóng SARS-CoV-2 khỏi tế bào chủ ... 6
Hình 1.3. Biểu đồ phân bố số lượng đột biến trên genome của virus SARSCoV-2 [27] .......................................................................................... 8
Hình 1.4. Đột biến D614G và sự phân bổ về sự lưu hành của chủng G614 ở
châu Âu theo thời gian [4] .................................................................. 9
Hình 1.5. Biến đổi trên gen S mã hóa cho protein kháng nguyên Spike của
chủng Omicron so với chủng Delta .................................................. 10
Hình 3.1 Hình ảnh khuếch đại tín hiệu huỳnh quang của các mẫu dương tính

bằng phương pháp Realtime PCR chuẩn theo quy trình khuyến cáo
của WHO........................................................................................... 36
Hình 3.2. So sánh đường tín hiệu huỳnh quang giữa quy trình chuẩn theo
WHO và quy trình gộp mẫu trong nghiên cứu này .......................... 40
Hình 3.3. So sánh giá trị Ct giữa phương pháp Realtime PCR chuẩn và PCR
gộp mẫu trên các mẫu bệnh phẩm. ................................................... 41
Hình 3.4. Phân bổ mẫu dương theo giá trị Ct trong gộp mẫu 100 .................. 41
Hình 3.5. Sơ đồ quy trình sàng lọc bằng phương pháp gộp mẫu 100............. 55


1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
COVID-19 là bệnh viêm đường hô hấp cấp gây ra bởi virus SARSCoV-2, lần đầu tiên được xác định tại Vũ Hán, Trung Quốc vào giữa tháng 12
năm 2019. Chỉ trong một thời gian ngắn, căn bệnh này đã trở thành một đại
dịch mang tính tồn cầu. Tính đến nay, trên tồn thế giới đã có trên 640 triệu
người bị nhiễm. Đại dịch COVID-19 được coi là sự khủng hoảng lớn nhất của
nhân loại kể tử sau chiến tranh thế giới lần thứ hai, cướp đi sinh mạng gần 7
triệu người trên thế giới.
Tình hình COVID-19 trên thế giới vẫn rất phức tạp, chưa ổn định, tại
nhiều quốc gia, số ca mắc mới vẫn ở mức cao, nhiều loại biến chủng mới,
biến chủng phụ, tiềm ẩn khả năng lây lan nhanh và khó dự đốn được mức độ
nguy hiểm. Ủy ban Khẩn cấp của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đánh giá:
“Thế giới vẫn trong tình trạng đại dịch COVID-19 và các nước vẫn phải tiếp
tục tăng cường hệ thống giám sát và mở rộng năng lực điều trị, vắc-xin cho
các đối tượng nguy cơ cao, đồng thời tiếp tục cập nhật kế hoạch chuẩn bị và
ứng phó quốc gia với đại dịch COVID-19”
Việt Nam cũng là một trong những quốc gia bị ảnh hưởng nghiêm
trọng bởi dịch bệnh với trên 40 nghìn người chết. Mặc dù giai đoạn nghiêm

trọng nhất đã qua đi xong việc đề phòng cho các đợt bùng phát mới là rất cần
thiết. Thời gian gần đây, nhiều người dân bắt đầu chủ quan, lơ là trong việc
thực hiện các biện pháp phòng bệnh sau khi đã tiêm các mũi vắc-xin cơ bản
hoặc đã từng mắc COVID-19. Đặc biệt là việc chưa tích cực tham gia tiêm
vắc xin mũi 3, mũi 4 và tiêm vaccine cho trẻ em. Người đã từng mắc COVID19 vẫn có khả năng bị tái nhiễm và mắc các biến chứng của bệnh, bao gồm cả
trẻ em và người lớn. Nguy cơ xuất hiện biến chủng mới, thoát khỏi tác động
của vaccine và thuốc điều trị là mối lo ngại của nhiều quốc gia trên thế giới,
trong đó có Việt Nam.


2

Việc tầm soát đánh giá tỷ lệ mắc trong cộng đồng đóng vai trị quan
trọng trong sự phát triển kinh tế - xã hội của đất nước, ví dụ như sàng lọc
ngẫu nhiên cho đối tượng học sinh, sinh viên trong các trường học của hệ
thống giáo dục, cho lực lượng vũ trang, an ninh quốc phòng và cho những cơ
quan trọng yếu của Chính phủ. Cơng việc này vẫn đang được các trung tâm
kiểm soát bệnh tật (CDC) vùng thực hiện theo hướng dẫn của Bộ Y tế.
Những thách thức lớn đặt ra là khó khăn cho việc sàng lọc thường
xuyên và trên diện rộng do chi phí lớn, là gánh nặng đối với ngân sách quốc
gia. Gộp mẫu trong PCR rất quan trọng để giúp tăng công xuất xét nghiệm,
cho phép sàng lọc diện rộng, giảm thời gian xét truy vết, giảm chi phí. Tuy
nhiên, gộp mẫu trong PCR hiện nay phổ biến là 5 mẫu, các loại gộp mẫu cao
hơn (10, 20, 30…) có nguy cơ dẫn tới âm tính giả, điều này đã được báo cáo
trong nhiều nghiên cứu khác nhau trên thế giới. Độ nhạy của gộp mẫu 5 được
báo cáo là giảm xuống còn khoảng 70 – 80% so với 95 – 98% ở PCR mẫu
đơn. Do đó, khó khăn trong gộp mẫu thơng thường vẫn cịn nhiều hạn chế khả
năng tầm sốt dịch bệnh trong cộng đồng. Bài toán đặt ra trong xét nghiệm,
tầm sốt dịch bệnh là làm thế nào để có thể thực hiện được xét nghiệm gộp
mẫu lượng lớn từ vài chục đến vài trăm mẫu trong xét nghiệm bằng PCR

nhưng vẫn đảm bảo độ chính xác cao, nâng được công xuất xét nghiệm, giảm
thời gian sàng lọc trên quy mô lớn và giảm nhiều về giá thành xét nghiệm.
Đã có một số nghiên cứu trên thế giới về lượng gộp mẫu lớn hơn từ 10
- 30 mẫu cũng như nghiên cải thiết độ nhạy của chẩn đoán Realtime PCR.
Tuy nhiên, việc nghiên cứu tăng lượng mẫu gộp lên tới hàng trăm mẫu đồng
thời tăng cả độ nhạy của phản ứng thì cịn rất hạn chế. Nhằm hướng tới việc
nâng cao hiệu quả của việc tầm soát dịch trong trạng thái bình thường mới
hiện nay, cũng như dự phịng phương án xét nghiệm diện rộng trong cộng
đồng nếu dịch bùng phát trở lại, chúng tôi tiến đề tài nghiên cứu này.


3

2. Mục tiêu nghiên cứu:
- Thiết lập được quy trình gộp mẫu lượng lớn, đảm bảo được độ nhạy
và độ đặc hiệu cao để nâng hiệu xuất sàng lọc, chẩn đoán SARS-CoV-2.
3. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Thu thập bộ mẫu bệnh phẩm nghiên cứu
Nội dung 2: Xây dựng quy trình sàng lọc gộp mẫu
Nội dung 3: Đánh giá hiệu quả gộp mẫu trên các bộ mẫu lựa chọn
Nội dung 4: Đề xuất quy trình chuẩn để áp dụng thực tế


4

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặc điểm của virus SARS-CoV-2
1.1.1. Đặc điểm genome của virus SARS-CoV-2
SAR-CoV-2 là một trong 7 chủng coronavirus được phát hiện là có
khả năng gây bệnh ở động vật có vú. Ở người, coronavirus gây nhiễm trùng

nhẹ đường hô hấp nhưng cũng gây tử vong nếu người mắc đã có sẵn các
bệnh lý nền. Giống như các chủng coronavirus khác, SARS-CoV-2 có hình
cầu với các protein hình gai nhọn trên bề mặt. Những gai protein này giúp
SARS-CoV-2 liên kết với thụ thể trên màng tế bào chủ của người, sau đó
biến đổi cấu trúc cho phép quá trình dung hợp màng tế bào virus với màng tế
bào người.
Virus SARS-CoV-2 cũng như các virus khác trong họ corona có vật
chất di truyền là RNA sợi đơn (single-strand ribonucleic acid), kích thước bộ
gene khoảng 30 kb [32]. Khi so sánh với các chủng corona đã từng gây nên
các bệnh trên người như chủng SARS-CoV 2003 (gây ra Hội chứng suy hơ
hấp cấp tính nặng năm 2003) hay chủng virus MERS-CoV (gây ra hội chứng
hô hấp vùng Trung Đơng năm 2012), chủng virus mới này có trình tự tương
đồng lên đến 79,5%; tuy nhiên SARS-CoV-2 vẫn có những đặc điểm riêng
biệt về mặt di truyền [7]. SARS-CoV-2 và SARS-CoV cùng thuộc họ
Coronavirus thế hệ B (Betacoronavirus Lineage B, Sarbecovirus) [14]. Vì
vậy, trình tự hệ gene của chúng có nhiều điểm tương đồng và gồm 4 gene
chính mã hóa cho 4 protein cấu trúc được liệt kê dưới đây:
- Gene S: Mã hóa cho protein spike (S) tạo thành các gai đặc trưng
trong cấu trúc vỏ của coronavirus có hình "vương miện". Các protein này có
thể bị glycosyl hóa mạnh tạo thành dạng homotrimer, một thụ thể giúp virus
gắn vào màng tế bào vật chủ. Các thành phần của protein S là kháng nguyên
chính kích thích kháng thể trung hòa, đồng thời đây cũng là một mục tiêu
quan trọng của tế bào lympho gây độc tế bào.


5

- Gene M: Mã hóa cho protein M là protein màng (M - Membrane)
chiếm số lượng nhiều nhất trong số 4 protein cấu trúc. Protein M thường tồn
tại ở dạng dimer, chúng tạo thành cấu trúc hình cầu đặc trưng của họ

coronavirus [22].
- Gene N: Mã hóa cho protein nucleocapsid liên kết với bộ gene RNA
để tạo thành nucleocapsid. Nó có thể tham gia vào q trình điều hịa tổng
hợp RNA của virus và có thể tương tác với protein M trong quá trình nảy chồi
của virus.
- Gene E: Gene E có trình tự nucleotide ngắn mã hóa cho protein vỏ (E
- Envelope). Chức năng của protein này hiện vẫn chưa được phát hiện, mặc
dù ở virus SARS-CoV, protein E cùng với M và N là cần thiết để lắp ráp và
giải phóng virus [38]. Một nghiên cứu đã chỉ ra rằng, coronavirus tái tổ hợp bị
thiếu gene E thường khơng tồn tại được dù chúng có mặt trong vật chủ [23].

Hình 1.1. Bản đồ phân bố các gene trong genome của virus SARS-CoV-2
(Trình tự tham chiếu NCBI: NC_045512.2)
1.1.2. Phương thức xâm nhập và gây bệnh
SARS-CoV-2 có thể truyền từ người sang người thơng qua các giọt bắn
trong q trình tiếp xúc [31]. Vòng đời của SARS-CoV-2 giống như hầu hết
các chủng virus corona đã được phát hiện bao gồm 5 bước: Gắn vào vật chủ,
Xâm nhập, Sinh tổng hợp, Lắp ráp, Giải phóng (Hình 1.2).


6

Hình 1.2. Q trình xâm nhập và giải phóng SARS-CoV-2 khỏi tế bào chủ
( />
Sau khi truyền sang vật chủ mới, các protein gai của SARS-CoV-2 gồm
hai tiểu phần S1 và S2 thực hiện nhiệm vụ: tiểu phần S1 bám vào thụ thể
ACE2 trên màng tế bào chủ và tiểu phần S2 dung hợp màng virus với màng tế
bào người. Cấu trúc vỏ của SARS-CoV-2 thay đổi cho phép giải phóng RNA
virus vào tế bào chất của tế bào người. Hệ gene của SARS-CoV-2 là RNA sợi
đơn nên được sử dụng trực tiếp làm khuôn tổng hợp các protein cấu trúc tạo

nên phức hệ phiên mã.
Từ đó, q trình tổng hợp mRNA virus được diễn ra theo phương thức
không liên tục nhằm tạo ra tất cả các protein cấu trúc của SARS-CoV2 (protein gai S, protein vỏ E, protein màng M, protein nucleocapsid N). Các
protein này di chuyển tới mạng lưới nội chất để lắp ráp và được đóng gói
thành virion hồn chỉnh ở bộ máy Golgi đồng thời giải phóng khỏi tế bào chủ
nhờ các túi tiết [3].


7

Ở người, các tế bào biểu bì phổi có mức độ biểu hiện thụ thể ACE2
cao, đây là lí do vì sao SARS-CoV-2 có thể dễ dàng xâm nhập và phá hủy các
tế bào này, gây nên chứng viêm phổi cấp [16]. Bên cạnh đó, trong q trình
lắp ráp, nhiều trường hợp các hạt virion thiếu protein S dẫn đến tình trạng các
virion này khơng gắn vào thụ thể ACE2. Vì vậy, hệ thống miễn dịch khơng
nhận diện được kháng nguyên dẫn tới sự hình thành các tế bào đa nhân khổng
lồ. Các tế bào này chứa một lượng lớn virus và tồn tại trong cơ thể người mà
không bị hệ thống miễn dịch phát hiện và tiêu diệt [29].
Các triệu chứng của bệnh viêm phổi cấp COVID-19 được báo cáo bao
gồm: 90% trường hợp mắc bệnh có biểu hiện sốt, 80% trường hợp có biểu
hiện mệt mỏi và ho khan, 20% bị khó thở và suy hơ hấp chiếm 15%, những
trường hợp nặng có thể dẫn đến tử vong chiếm 5% tổng số ca nhiễm. Các
triệu chứng của bệnh sẽ bắt đầu trung bình sau khoảng từ 2 đến 14 ngày tính
từ thời điểm nhiễm virus. Một thực tế đó là hầu hết bệnh nhân COVID-19 là
những người lớn tuổi và có bệnh lí nền, có 2 lí do được đưa ra để giải thích
cho hiện tượng này. Thứ nhất, mức độ biểu hiện thụ thể ACE2 là khác nhau
giữa người trưởng thành và trẻ em. Một nghiên cứu đã chỉ ra rằng, ACE2
được biểu hiện theo cụm ở các tế bào biểu bì biệt hóa cao. Sau khi phân chia,
các tế bào biểu mô ở phổi tiếp tục phát triển. Thứ hai, các đáp ứng của cơ thể
trẻ nhỏ đối với SARS-CoV-2 khác biệt so với người trưởng thành. Ở người

lớn tuổi, sự kích thích đối với kháng nguyên và tuyến ức dẫn tới sự phân bố
của quần thể các tế bào T [30]. Điều này dẫn tới sự biểu hiện giảm của CD27
và CD28, hai phân tử có vai trị trong việc tăng cường tính nhạy cảm đối với
tác nhân gây bệnh [24].
1.1.3. Biến đổi di truyền của virus SARS-CoV-2
Sử dụng tất cả dữ liệu giải trình tự sâu của toàn bộ genome của virus
SARS-CoV-2 trên toàn thế giới (kho dữ liệu NCBI), Naveen Vankadari đã
xác định được hàng trăm đột biến điểm hoặc các đa hình đơn nucleotide trong


8

genome của virus SARS-CoV-2 [27]. Đây có thể là nguyên nhân dẫn tới sự
thay đổi liên tục về khả năng lây nhiễm cũng như độc lực và làm gia tăng tỷ lệ
mắc và tỷ lệ tử vong bởi SARS-CoV-2. Từ dữ liệu về genome virus SARSCoV-2 phân lập từ 12 quốc gia khác nhau, nhóm nghiên cứu đã chỉ ra rằng,
trong số hàng trăm biến đổi di truyền có thể có tới 47 đột biến có ảnh hưởng
tới độc lực cũng như khả năng đáp ứng các thuốc điều trị kháng virus sử dụng
trong điều trị Covid-19. Đặc biệt chú ý, gene mã hóa cho protein gai của virus
(spike glycoprotein) hay còn gọi là protein S tăng đột biến. Cùng với đó các
gene Nsp1, RdRp và vùng ORF8 đã bị biến đổi nặng nề trong vịng 3 tháng,
trong q trình lây truyền từ người sang người. Mức độ đột biến được mơ tả
trong Hình 1.3 [27], [25].

Hình 1.3. Biểu đồ phân bố số lượng đột biến trên genome của virus SARSCoV-2 [27]
Đặc biệt chú ý, đột biến D614G trên gene mã hóa cho protein S, đây là
protein có chức năng giúp virus bám dính vào tế bào chủ (Hình 1.4). Các
nghiên cứu khác nhau đều chỉ ra rằng, đột biến này đang chiếm phổ biến ở
các quốc gia hiện nay [2], [35].



9

Hình 1.4. Đột biến D614G và sự phân bổ về sự lưu hành của chủng G614 ở
châu Âu theo thời gian [4]
Đột biến tại vị trí 614 trên gen S đã làm thay đổi amino acid aspartic
thành glycine. Biến đổi này đã giúp cho virus tương tác hiệu quả với thụ thể
ACE2 của tế bào chủ và làm tăng khả năng lây nhiễm gấp nhiều lần so với
chủng đầu tiên phân lập tại Vũ Hán. Thêm vào đó, bằng các chẩn đoán
Realtime RT-PCR, các bệnh nhân mắc COVID-19 mang đột biến này đều cho
thấy virus được phát hiện ở chu kỳ PCR sớm hơn [4]. Đột biến này giúp cho
chủng G614 dần thay thế chủng D614 ở nhiều quốc gia khác nhau trên thế
giới trong đó điển hình là tại Mỹ.
Những thay đổi liên tục trên genome của virus SARS-CoV-2 đã và
đang tạo ra thách thức nhất định đối với việc chẩn đoán bằng kỹ thuật
Realtime PCR. Nếu những mẫu dị được thiết kế vào vùng gene có nhiều đột
biến như gene ORF hoặc gene S, gene N đều có nguy cơ bỏ sót các đột biến


10

khơng bắt cặp với các mẫu dị hoặc trình tự mồi [12], [15]. Thêm vào đó, thay
đổi trên các gene mã hóa kháng nguyên đặc trưng của virus cũng sẽ tạo ra
những khó khăn nhất định cho việc nghiên cứu và sản xuất vacxin phòng
bệnh Covid-19 [17], [10].
Nhưng thay đổi đồng loạt nhiều vị trí khác nhau trên gen S đã đưa đến
một biến chủng mới siêu lây nhiễm và có nguy cơ kháng vaccine. Chủng này
lần đầu tiên được phát hiện tại Nam Phi và tới nay đã lan sang nhiều quốc gia
khác nhau trên toàn thế giới. Omicron đã là lỗi lo lắng của tồn thế giới.

Hình 1.5. Biến đổi trên gen S mã hóa cho protein kháng nguyên Spike của

chủng Omicron so với chủng Delta
1.2. Tổng quan tình hình dịch bệnh virus SARS-CoV-2 trong nước và thế giới
1.2.1. Tình hình dịch bệnh trên thế giới
COVID-19 là bệnh viêm đường hô hấp gây ra bởi virus SARS-CoV-2,
lần đầu tiên được xác định tại Vũ Hán, tỉnh Hồ Bắc, Trung Quốc vào cuối
năm 2019. Ngay sau đó, ngày 30 tháng 1 năm 2020 WHO đã tuyên bố
COVID-19 là một trường hợp khẩn cấp về sức khỏe cộng đồng và chính thức
tuyên bố là một đại dịch vào giữa tháng 3 năm 2020. Giai đoạn đầu của dịch
bệnh, Trung Quốc là tâm điểm của đại dịch sau đó dịch đã lan rộng sang châu
Âu, châu Mỹ và các châu lục khác. Đặc biệt, số trường hợp COVID-19 đã


11

tăng nhanh chóng tại Hoa Kỳ và đưa nước này trở thành vùng dịch lớn nhất
thế giới. Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới, châu lục có tỉ lệ nhiễm và
tử vong lớn nhất là châu Mỹ, chiếm 50% về tổng số ca mắc và số ca tử vong.
Theo ước tính của các chun gia thì tỷ lệ nhiễm và tỷ lệ tử vong thực tế có
thể cao gấp vài lần so với các con số đã được thống kê ở các quốc gia. Một số
quốc gia có tỷ lệ nhiễm và chết cao nhất thế giới phải kể tới Hoa Kỳ, Brazil,
Ấn Độ. Do ảnh hưởng của dịch bệnh, nhiều nước đã phải ban bố tình trạng
phong tỏa các địa điểm công cộng như sân bay, nhà ga, trường học, cửa hàng
gây nên nhiều thiệt hại to lớn về kinh tế, xã hội. Theo thống kê của WHO,
tính đến ngày 15/11/2022 trên thế giới ghi nhận 620.211.783 ca nhiễm, số ca
tử vong 6.612.315 (chiếm 1.07%). Châu Á đứng đầu trong tổng ca mắc mới
trong 24 giờ, trung bình có khoảng 100.000 người mắc mới. Trung Quốc hiện
nay vẫn phải áp dụng chiến lược “Zero Covid” để thốt khỏi tình trạng khủng
hoảng của COVID-19.
Các triệu chứng điển hình của của bệnh viêm phổi cấp COVID-19
bao gồm mệt mỏi, ho khan và bị khó thở. Một số trường hợp bị suy hơ hấp

nặng có thể dẫn đến tử vong. Nguyên nhân khác dẫn đến tử vong do mắc
COVID-19 là hội chứng rối loạn chức năng đa cơ quan, tỷ lệ tử vong lên tới
66% ở nam giới [5]. Các triệu chứng này có thể xuất hiện trong 2 đến 14 ngày
sau khi bị nhiễm virus SARS-CoV-2, một số trường hợp triệu chứng xuất hiện
muộn hơn cũng đã được báo cáo. COVID-19 thực sự đã trở thành cuộc khủng
hoảng lớn nhất của nhân loại kể từ sau chiến tranh thế giới lần thứ 2 đến nay.
1.2.2. Tình hình dịch bệnh tại Việt Nam
1.2.2.1. Tình hình dịch bệnh
Ngày 22 tháng 01 năm 2020, Việt Nam ghi nhận 02 trường hợp mắc
COVID-19 đầu tiên tại Bệnh viện Chợ Rẫy, các bệnh nhân này có quốc tịch
Trung Quốc và xuất phát từ thành phố Vũ Hán. Tình hình dịch bệnh COVID19 tại Việt Nam được chia làm các giai đoạn chính như sau: Giai đoạn 1 gồm


12

16 bệnh nhân đầu tiên, đều có liên quan đến lịch sử di chuyển và tiếp xúc gần
với các ca bệnh tại Vũ Hán, Trung Quốc; Giai đoạn 2 gồm các bệnh nhân lây
nhiễm từ các quốc gia ngoài Trung Quốc nhập cảnh vào Việt Nam qua đường
hàng không; Giai đoạn 3 là giai đoạn chống lây nhiễm trong cộng đồng, đây
là giai đoạn đối phó với dịch bệnh quan trọng nhất nhằm ngăn chặn tình trạng
bùng phát các ổ dịch trong cộng đồng. Đợt dịch lần thứ 4 kể từ tháng 5 cho
tới nay đã để lại hậu quả rất nặng nề cho Việt Nam, hàng triệu người đã bị
nhiễm và hàng chục nghìn người đã bị tử vong. Thành phố Hồ Chí Minh là
nơi chịu tổn thất nặng lề nhất với hơn 30 nghìn người chết.
Theo thống kê của WHO, kể từ đầu dịch đến nay Việt Nam có
11.509.473 ca nhiễm, đứng thứ 13/230 quốc gia và vùng lãnh thổ, trong khi
với tỷ lệ số ca nhiễm/1 triệu dân, Việt Nam đứng thứ 117/230 quốc gia và
vùng lãnh thổ (bình qn cứ 1 triệu người có 116.312 ca nhiễm).
Hiện nay dịch bệnh lan rộng ra và bao phủ tất cả các tỉnh thành trên cả
nước. Từ tháng 04/2022 cho tới nay, mặc dù số ca nhiễm tăng nhanh nhưng tỷ

lệ tử vong hoặc diễn biến lâm sàng nặng đã giảm rất rõ rệt. Kết quả này có
được là nhờ chiến lược bao phủ vaccine của Việt Nam đã phát huy tác dụng.
Theo thống kê của BYT, tính đến ngày 14/11/2022 tổng số liều vắc-xin đã
được tiêm là 262.719.806 liều, trong đó: số liều tiêm cho người từ 18 tuổi trở
lên là 222.256.111 liều, số liều tiêm cho trẻ từ 12-17 tuổi là 23.588.672 liều,
số liều tiêm cho trẻ từ 5-11 tuổi là 16.875.023 liều.
Tại thời điểm này, xét nghiệm kháng thể kháng SARS-CoV-2 khơng
cho biết cơ thể có thể miễn dịch chống lại COVID-19. Kết quả xét nghiệm
kháng thể kháng SARS-CoV-2 dương tính khơng có nghĩa là cơ thể miễn
nhiễm hoặc có miễn dịch có thể chống lại COVID-19. Các kháng thể trung
hịa có tương quan với việc bảo vệ nhiễm SARS-CoV-2 ở người có triệu
chứng [6] [28]. Dữ liệu cho thấy rằng các kháng thể kháng lại SARS-CoV-2
tồn tại ít nhất 6 tháng sau khi tiêm vắc xin. Đã có các báo cáo về việc giảm


13

kháng thể trung hòa [1]. Chưa rõ liệu giảm hiệu giá kháng thể có giảm khả
năng bảo vệ khơng. Hiện tại, chưa rõ mức độ kháng thể trung hòa hoặc các
dấu hiệu miễn dịch khác có liên quan với việc bảo vệ của vắc xin khỏi nhiễm
bệnh, tiến triển bệnh nặng hay lây truyền.
Ngồi ra, việc chủ quan, khơng tiêm vắc-xin mũi nhắc hoặc những
người đã từng mắc COVID-19 vẫn có khả năng bị tái nhiễm và mắc các biến
chứng của bệnh cũng làm tăng nguy cơ dịch bệnh có thể quay trở lại bất cứ
lúc nào. Đây là thách thức lớn đối với hệ thống y tế của bất kỳ một quốc gia
nào trên thế giới trong đó có Việt Nam.
1.2.2.2. Nghiên cứu và phát triển sinh phẩm chẩn đoán COVID-19 tại
Việt Nam
Đầu tháng 2 năm 2020, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương công bố nuôi
cấy thành công chủng virus SARS-CoV-2, giúp Việt Nam trở thành một trong

số rất ít 13 quốc gia phân lập được virus corona chủng mới tại thời điểm đó,
mở ra cơ hội thuận lợi cho nghiên cứu về dịch tễ học cũng như phát triển các
bộ sinh phẩm chẩn đoán SARS-CoV-2 của Việt Nam. Đầu tháng 3, Nguyễn
Thu Anh và cộng sự đã cơng bố trên tạp chí Lancet, một tạp chí uy tín hàng
đầu về Y học đã thơng tin về sự lây truyền của virus SARS-CoV-2 tại miền
Bắc Việt Nam. Cùng với đó, Phạm Thị Lan và nhóm nghiên cứu tại viện
Pasteur thành phố Hồ Chí Minh đã cơng bố trên tạp chí New England Journal
of Medicine về trường hợp virus SARS-CoV-2 truyền từ người cha 57 tuổi
sống tại tâm dịch Vũ Hán - Trung Quốc cho người con trai 26 tuổi đang làm
việc tại thành phố Hồ Chí Minh. Nghiên cứu này cùng với một số công bố
quốc tế trước đó chỉ ra cho thấy, virus này có khả năng truyền từ người sang
người [13], [19]. Nghiên cứu dịch tễ học gần đây đã chỉ ra rằng, trường hợp
đầu tiên của Việt Nam bị mắc COVID-19 là do lây truyền từ Trung Quốc, nơi
được coi là khởi phát của đại dịch COVID-19 [20]. Genome đầy đủ của
chủng SARS-CoV-2 phân lập đầu tiên tại Việt Nam cũng đã được các nhóm


14

nghiên cứu của Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh cơng bố trên ngân hàng
gene quốc tế. Bên cạnh đó, nhiều trình tự gene khác nhau gồm gene E, gene
N, gene M trên chủng lưu hành ở Việt Nam cũng đã được bổ sung vào ngân
hàng gene [21]. Ngày 4/3, Bộ Y tế đã có Quyết định số 774/QĐ-BTY về việc
ban hành danh mục 02 sinh phẩm chẩn đoán in vitro xét nghiệm virus Corona
(SARS-CoV-2) được cấp số đăng ký do Học viện Quân y nghiên cứu để phục
vụ kịp thời cơng tác phịng chống dịch bệnh COVID-19. Đây là bộ kit Onestep Realtime RT - PCR phát hiện virus SARS-CoV-2 dựa trên công nghệ
Realtime RT - PCR. Bộ kit dựa trên trình tự hệ gen đích N với độ chuẩn xác
cao. Bộ kit này là sản phẩm của đề tài nghiên cứu khoa học cấp nhà nước.
Tháng 6 năm 2020, Việt Nam chính thức có thêm 02 bộ sinh phẩm phát hiện
SARS-CoV-2 mang tên One-step RT-PCR COVID-19 kit và RT-LAMP

COVID-19 được nghiên cứu, phát triển bởi Viện Kiểm định Quốc gia vắc xin
và sinh phẩm y tế và trường Đại học Bách khoa Hà Nội, chuyển giao cho
Công ty cổ phần Sao Thái Dương.
Tại Thái Nguyên, để góp phần vào cơng tác phịng chống dịch bệnh
COVID-19, nhóm nghiên cứu của trường Đại học Khoa học - Đại học Thái
Nguyên đã tiến hành nghiên cứu phát triển bộ sinh phẩm chẩn đoán virus SARSCoV-2 bằng kỹ thuật Realtime PCR sử dụng chất phát tín hiệu huỳnh quang
Sybr Green, đề tài thuộc nhiệm vụ khoa học cấp tỉnh “Nghiên cứu và phát triển
bộ sinh phẩm phát hiện SARS-CoV-2 virus bằng kỹ thuật Realtime PCR”.
1.3. Tổng quan về các phương pháp xét ghiệm SARS-CoV-2
1.3.1. Các phương pháp chẩn đốn virus SARS-CoV-2
Hai nhóm phương pháp được sử dụng trong sàng lọc, chẩn đoán
COVID-19 hiện nay là phương pháp dựa trên nguyên lý miễn dịch (kháng
nguyên – kháng thể) và phương pháp phát hiện acid nucleic của virus. Các
phương pháp sàng lọc kháng thể cho phép phát hiện nhanh trong vòng vài
phút tới vài chục phút, tuy nhiên phương pháp này thường cho độ đặc hiệu


15

khơng cao, có thể xuất hiện âm tính hoặc dương tính giả. Một số cơng ty tại
Mỹ và Nhật Bản đã chế tạo thành công kit phát hiện virus SARS-CoV-2 dựa
trên phản ứng miễn dịch (phương pháp ELISA) giữa kháng thể IgG, IgM và
kháng nguyên N hoặc S của virus, có thể phát hiện virus trong thời gian từ 10
đến 15 phút [17], [18], [39]. Trong đó, việc sử dụng phương pháp ELISA dựa
trên kháng nguyên N cho độ nhạy cao hơn hẳn so với sử dụng kháng nguyên
S của SARS-CoV-2. Tuy nhiên cho đến thời điểm hiện tại, một số kit đã bộc
lộ một số hạn chế về độ nhạy, độ đặc hiệu khi các kết quả trả về có các trường
hợp dương tính giả và âm tính giả. Vào ngày 27/03/2020, chính quyền Tây
Ban Nha đã ghi nhận 640.000 bộ kit mua từ một công ty Trung Quốc đã bị
phát hiện là thiếu chính xác và khơng phát hiện được đầy đủ những trường

hợp nhiễm coronavirus. Với đặc điểm của chủng SARS-CoV-2 có hệ gene là
RNA kém bền vững, tần số đột biến cao, khả năng biến chủng đa dạng, việc
nghiên cứu và chế tạo bộ kit sinh phẩm phát hiện SARS-CoV-2 là hết sức cần
thiết và khẩn cấp khi tình hình dịch bệnh trên thế giới vẫn đang diễn biến
phức tạp và việc phát minh vắc-xin vẫn đang trong q trình thử nghiệm.
Hệ gene hồn chỉnh của virus corona SARS-CoV-2 đã được các nhà
khoa học tại Bệnh viện Trung tâm Vũ Hán và Đại học Khoa học và Cơng
nghệ Hoa Trung giải trình tự vào ngày 05/01/2020 và cơng bố trên ngân hàng
gen NCBI (ID: NC_045512.2). Ngồi ra, các biến thể của chủng virus này
cũng được các nhà khoa học từ Úc, Mỹ và nhiều quốc gia khác giải trình tự và
cơng bố trên mẫu bệnh phẩm mà họ thu được. Dựa trên các trình tự này, hai
phương pháp phổ biến nhất đã được sử dụng để phát hiện sự có mặt của
SARS-CoV-2 là Realtime PCR và giải trình tự gene thế hệ mới. Tuy nhiên,
phương pháp giải trình tự được sử dụng giới hạn vì địi hỏi nhiều trang thiết bị
và giá thành cao. Vì vậy, Realtime PCR được sử dụng phổ biến hơn tại nhiều
quốc gia trên thế giới nhằm phát hiện virus trong các mẫu máu và dịch đường
hô hấp. Những bộ kit phát hiện nhanh đầu tiên đã được các nhà khoa học và
các công ty Trung Quốc phát triển dựa trên kỹ thuật RT-PCR. Trung tâm


16

kiểm soát và ngăn ngừa bệnh tật Trung Quốc (China CDC) khuyến cáo việc
sử dụng mồi đặc hiệu và mẫu dò ORFlab cùng gene N nhằm phát hiện SARSCoV-2 [8]. Ngoài Trung Quốc, một số nước khác cũng đã phát triển thành
công bộ kit phát hiện nhanh SARS-CoV-2 như Hàn Quốc, Nhật Bản. Phương
pháp chẩn đoán SARS-CoV-2 sử dụng chất phát huỳnh quang Sybr Green:
Sybr Green là hóa chất nhuộm huỳnh quang sử dụng trong các thí nghiệm
sinh học phân tử vì khả năng liên kết với DNA. Sybr Green được sử dụng phổ
biến trong việc phát hiện sự có mặt của DNA/RNA bằng phương pháp
Realtime PCR, ứng dụng trong các phân tích và chẩn đốn bệnh [22]. Việc sử

dụng Sybr Green nhằm phát hiện sự có mặt của RNA SARS-CoV-2 trong
mẫu bệnh phẩm đã được nghiên cứu. Ưu điểm của Sybr Green đó là cho phép
chẩn đốn thơng qua phân tích đường cong nóng chảy Tm, giúp phát hiện
chính xác chủng virus trong mẫu bệnh phẩm [9]. Hạn chế lớn nhất của
Realtime PCR là khả năng tạo sản phẩm phụ do các mồi sẽ tạo ra tín hiệu
dương tính giả. Chính vì vậy, việc thiết kế, sàng lọc lựa chọn các cặp mồi đòi
hỏi thời gian và nhiều thử nghiệm để tối ưu điều kiện phản ứng [26].
1.3.2. Kit chuẩn đoán virus SARS-CoV-2
Khi dịch bệnh gây ra bởi virus SARS-CoV-2 được công bố, CDC Hoa
Kỳ đã phát triển bộ kit xét nghiệm đầu tiên có tên ‘‘Centers for Disease
Control and Prevention (CDC) 2019-Novel Coronavirus (2019-ncoV) RealTime Reverse Transcriptase (RT)-PCR Diagnostic Panel’’. Bộ xét nghiệm
này được sử dụng cho các phịng thí nghiệm được CDC đánh giá là đủ điều
kiện, có thể thực hiện các xét nghiệm có độ phức tạp [41].
Sau đó, do tình hình dịch bệnh diễn ra căng thẳng ở nhiều nước trên
tồn thế giới, có rất nhiều công ty đã nghiên cứu và phát triển sản phẩm phục
vụ cơng tác xét nghiệm. Tính đến ngày 16/08 đã có 16 bộ kit Real-time PCR
được WHO khuyến cáo sử dụng và 99 bộ sinh phẩm được cấp số đăng ký bởi
FDA (Food and Drug Administration), trong đó có 66 bộ sinh phẩm sử dụng
phương pháp Real-time PCR [41]; [43].