Mục lục
Phần 1: Giới thiệu chung
1. Định nghĩa phôi soma
2. Đặc điểm tế bào có khả năng sinh phôi
3. Sự hình thành phôi
4. So sánh phôi hữu tính và phôi vô tính(Phôi soma )
Phần 2: Sự sinh phôi từ tế bào soma
1. Định nghĩa sự sinh phôi từ tế bào soma
2. Các giai đoạn trong quá trình hình thành phôi soma
3. Các yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới quá trình sinh phôi
Phần 3: Nuôi cấy phôi soma
Phần 4: Nhân giống cây cacao qua con đường tạo phôi soma
1.Giới thiệu chung
2.Qui trình
3.Giải thích qui trình

Phần 1: Giới thiệu chung
1.Định nghĩa :
Phôi soma là phôi được hình thành và phát triển từ các tế bào dinh dưỡng ,
mà các tế bào này có thể phân hóa thành những cấu trúc lưỡng cực, một cực hình
thành rễ còn một cực tạo ra chồi, giống như phôi hợp tử.
2.Đặc điểm phôi : Tế bào có khả năng sinh phôi là những tế bào :
- Có tế bào chất đậm đặc.
- Nhiều hạt tinh bột lớn .
- Có hạch nhân khá lớn ăn màu phẩm nhuộm đậm.
- Hàm lượng protein và RNA cao.
3.Sự hình thành phôi:
Sự hình thành phôi(nói chung ) trải qua các bước:
- Sự biệt hóa các tế bào có khả năng sinh phôi thành tế bào phôi
- Sự phát triển những tế bào phôi mới hình thành qua các giai đoạn sau: phôi
hình cầu, phôi hình trái tim, phôi hình cá đuối (hình thủy lôi).

Hình cầu
Hình trái tim
Hìnhcá đuối (Hình thủy lôi)
Sự sinh phôi từ tế bào soma:
- Giai đoạn 1 tạo mô sẹo :
Mô được nuôi trong môi trường có auxin sẽ tăng trưởng nhanh ,các tế bào
trong môi trường này sẽ bị khử phân hóa (không còn ở trạng thái phân hóa) và mất
tính hữu cực.
- Giai đoạn 2:
Mô sẹo sẽ đựợc chuyển vào môi trường có ít hoặc không có auxin, trong môi
trường này tính hữu cực và sự sinh phôi được cảm ứng với trạng thái phôi từ hình
cầu đến trạng thái hình trái tim và trạng thái hình cá đuối.
Các giai đoạn trong quá trình phát sinh phôi soma
Tế bào đơn Phân chia Cụm tế bào nhỏ Giai đoạn
Có không bào lớn phôi hình cầu



Giai đọan phôi Giai đoạn phôi
cây con hình thủy lôi hình tim

4. So sánh phôi hữu tính và phôi vô tính (phôi soma )
 Phôi hữu tính :
Được hình thành và phát triển từ những tế bào sinh dục : sau khi sự thụ tinh
đôi xảy ra: một tinh trùng thụ tinh với trứng và thành lập hợp tử lưỡng bội, một
loạt các phân cắt đẳng nhiễm xảy ra, hợp tử phát triển thành phôi (cây bào tử thực
vật mới ).
 Phôi soma :
Phôi soma là phôi được phát triển từ những tế bào dinh dưỡng ,chúng được
tạo ra từ những tế bào của cơ thể thực vật, nhưng chúng hành động như một hợp

tử, trải qua một quá trình phát triển như một cấu trúc phôi.
5.Ứng dụng phôi soma
Nhân giống sinh dưỡng nhanh các kiểu di truyền mong muốn – hữu ích cho
các kiểu di truyền làm vườn , dòng trên những vụ mùa khô cằn và các thực vật
chuyển gen .
Sự phân phối trực tiếp thực vật nuôi cấy mô tới cánh đồng – đặc biệt hữu ích
cho loài giao phấn cùng giống dị hợp tử hoặc cho những loài cây trồng rừng
Nhân giống kiểu di truyền giống cha hoặc mẹ cho sự sản xuất các thế hệ lai
F1 hoặc tổng hợp các thế hệ có giới hạn.
Nguồn của các chất chuyển hóa mới – hạt dạng lipid như cocoa butter, sáp
lỏng từ các cây jojoba hay acid linolenic
Phần 2: sự sinh phôi từ tế bào soma
1. Định nghĩa: Sự sinh phôi từ tế bào soma là một quá trình ,qua đó một vài tế bào
soma,trong các điều kiện thực nghiệm (bao gồm việc sử dụng các chất điều hòa
sinh trưởng thực vật ), có thể dấn thân vào một sự phân chia theo một trật tự nhất
định để cho một phôi,theo kiểu giống hay gần giống như kiểu sinh phôi từ hợp tử.
2.Các giai đoạn trong quá trình phát sinh phôi soma :có 4 pha
- Pha thứ nhất bắt đầu khi những tế bào đơn hình thành những cụm tế bào có khả
năng sinh phôi trên môi trương auxin (tương ứng với giai đoạn tạo mô sẹo ở phần
giới thiệu )
- pha thứ hai xảy ra khi cụm tế bào có khả năng sinh phôi này được chuyển sang
môi trường không có auxin. Trong pha này các tế bào tăng sinh chậm và dường
như không có biệt hóa .
- pha thứ ba có sự phân bào xảy ra nhanh ở một số cụm tế bào dẫn đến việc hình
thành những phôi hình cầu.
- Pha thứ tư cây con invitro phát triển từ phôi hình cầu qua giai đoạn phôi hình
trái tim và phôi hình cá đuối
3.Các yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới quá trình sinh phôi
-Tính toàn năng
Tính toàn năng của tế bào thực vật là một trong các chức năng đặc trưng

nhất của tế bào thực vật và sự sinh phôi của tế bào soma được xem là một kiểu của
tính toàn năng .Sự sinh phôi từ tế bào soma giúp cho việc nghiên cứu toàn bộ quá
trình phân hóa của thực vật cũng như những cơ chế biểu hiện của tính toàn năng tế
bào thực vật.Gần đây sự sinh phôi từ tế bào soma đã được các nhà công nghệ sinh
học chú ý bởi vì đây là một trong những phương tiện hữu hiệu trong công nghệ gen
ở thực vật và các thao tác ở mức tế bào(Komamine, 1992).
Thuyết tế bào khái quát khái niệm về tính toàn năng tế bào thực vật được
định nghĩa như khả năng khiến cho một tế bào thực vật đã phân hóa và còn sống có
thể bước vào phản phân hóa ,phân chia, và cho một cây trưởng thành bình thường
qua các giai đoạn của sự phát triển phôi.
Có nhiều công trình được thực hiện thành công,dẫn đến sự thừa nhận hiện
tại rằng phần lớn các tế bào thực vật dù ở mức độ chuyên hóa nào đều có khả năng
phân hóa để trở về trạng thái phôi .Ở trạng thái này một tế bào được gọi là có khả
năng sinh phôi hay tế bào sinh phôi,có thể nuôi trong điều kiện thích hợp để cho
một phôi theo một quá trình gọi là sự phát sinh phôi soma
- Các chất điều hào sinh trưởng thực vật : (Sẽ nói rõ hơn ở phần nuôi cấy )Đặc
biệt là auxin có vai trò trong sự thành lập các tế bào có khả năng sinh phôi là do
chúng ảnh hưởng lên tính lưỡng cực của tế bào và kích thích các phân chia không
cân xứng sau đó Nếu không có auxin ở giai đoạn tạo mô sẹo thì tế bào sẽ kéo cài
ra và khồng có khả năng biệt hóa thành phôi ,do ở môi trường không có auxin thì
tế bào sẽ bị mất tính toàn năng.Tính toàn năng của tế bào được thể hiện khi tế bào
được cấy trên môi trường có auxin,sau đó chuyển sang môi trường không có auxin
để biệt hóa thành phôi với tần số cao
- sự thành lập tính hữu cực như là bước đầu tiên trong sự sinh phôi.Quá trình
phá vỡ tính cân xứng căn bản của tế bào cần thiết cho sự phát triển của một cấu
trúc phôi lần lượt xảy ra bởi sự phân lập một trụ, sau đó là sự phân hóa của cực
chồi và cực rễ và sau đó là sự tượng các lá
Phần 3: Nuôi cấy phôi soma
1.Chọn mẫu cấy
Mẫu có thể là :

- Tế bào sinh dưỡng của cây trưởng thành
- Các tế bào sinh sản không phải là tế bào sinh dục
- Trục hạ diệp hay tử diệp của phôi hợp tử mà cây con không thông qua sự
phát triển từ mô sẹo.
2.Khử trùng mẫu
Người ta thường sử dụng các dung dịch khử trùng thông thường như Ca-
hypochlorite , Na-hypochlorite , thủy ngân clorur…Ngoài ra người ta còn dụng
thêm các chất hoạt động bề mặt như Tween 80 , teepol , mannoxol
4.Môi trường nuôi cấy phôi
Phôi được tách ra hoàn toàn đang trong tình trạng tự dưỡng .
Như vậy môi trường nuôi cấy phôi cần được cung cấp đầy dủ chất dinh dưỡng
thích hợp để có thể thực hiện được khả năng phát sinh phôi
Vai trò của các chất điều hòa sinh truởng thực vật trong sự sinh phôi soma
-Auxin: Auxin là yếu tố cần thiết cho sự phát triển phôi, nó có ảnh hưởng khác
nhau đến những giai đoạn khác nhau trong quá trình sinh phôi.Sự hiện diện của
auxin cần thiết cho sự thành lập các tế bào hay nhóm các tế bào có khả năng sinh
phôi từ các tế bào cô lập. Tuy nhiên auxin lại cản sự sinh phôi ở các pha tiếp
theo.Ở pha đầu tiên nếu như trong môi trường không có auxin thì các tế bào cô lập
không thể phân hóa thành phôi do không thành lập được tính hữu cực, tiếp theo sự
loại bỏ auxin giúp cho thành lập tính hữu cực và tính hữu cực này tác động đến sự
sắp xếp bộ xương tế bào dẫn đến sự phân chia không cân xứng tạo ra một tế bào
lớn và một tế bào nhỏ,đây là bước đầu tiên trong sự tạo phôi.
Trong quá trình nuôi cấy thực hiện trên những loại mô khác nhau, các chất
điều hào sinh trưởng thực vật,đặc biệt auxin hay auxin liên kết với 1 cytokinin cần
thiết cho sự hình thành phôi thế hệ.Một số loài có thể được cảm ứng tạo phôi bởi
nhiều loại auxin khác nhau như trường hợp daucus carota, nhưng trên một số thực
vật khác thì việc sử dụng auxin có giới hạn hơn như trường hợp của các loài ngũ
cốc thì chỉ có một loài auxin mới có thể tác động ví dụ như 2,4-D.Đối với một số
loài thực vật chỉ cần một loại auxin để tạo mô sẹo, duy trì huyền phù tế bào và cảm
ứng tạo phôi nhưng cũng có những loài khác thì các giai đọan kể trên cần đến các

loại auxin khác nhau và khác nhau ở mỗi loài thực vật.
- Cytokinin: là chất điều hòa sinh trưởng thực vật cần thiết cho sự sinh phôi
soma ở một số loài. Nhu cầu về cytokinin có tính chuyên biệt đối với từng loại
thực vật cũng như từng giai đoạn.Nồng độ cytokinin cũng thay đổi khác nhau trong
quá trình nói trên.
- Gibberellin: Gibberellin thường ít khi được sử dụng phối hợp với các chất
điều hòa sinh trưởng khác trong quá trình phát sinh phôi soma.Tuy nhiên người ta
cũng chứng minh được rằng gibberellins cũng có vai trò trong một số trường hợp
giúp cho sự tăng trưởng của phôi hoặc kích thích sự ra rễ và những tăng trưởng về
sau cho cây, hoặc gibberellins giúp cho phôi thoát ra khỏi trạng thái hữu miên.
- vai trò của nguồn carbohydrate: Sucrose là loại đường thường được sử
dụng để cung cấp nguồn carbohydrate cho sự phát sinh phôi soma, bên cạnh đó
một số đương đôi, đương đơn khác cũng có thể được áp dụng thành công.Ở một số
trường hợp các loại đường khác như glucose hay loại khác lại có hiệu quả hơn trên
những đối tượng thực vật khác.Đôi khi người ta cũng kết hợp 2 loại đường khác
nhau đế giúp cho sự thành lập phôi soma.
- Ảnh hưởng của các thành phần khoáng trong môi trường nuôi cấy: Thành
phần các chất khoáng trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng đến sự phát sinh
phôi soma ở thực vật và sự ảnh hưởng này khác nhau ở từng loài thực vật
5.Điều kiện nuôi cấy phôi
- Ánh sánh :Sự tạo phôi soma có thể tạo ra trong những điều kiện sang tối
khác nhau,có những loại cần ánh sang nhưng có những loài sự hình thành
phôi soma xảy ra trong điều kiện tối hoàn toàn.Người ta cũng chứng minh
rằng chiếu một tia đỏ xa trong một thời gian ngắn sẽ thúc đẩy sự sinh phôi từ
tế bào soma
- Nhiệt độ: Sự tạo phôi xảy ra trong khoảng nhiệt độ 20-30 ◦c,nhiệt độ còn tùy
thuộc vào từng loại cây muốn tạo phôi
Phần 4: Nhân giống cây cacao qua con đường tạo phôi soma
1.Giới thiêu chung:
Cây ca cao trồng chủ yếu ở vùng khí hậu nhiệt đới.Hột cacao là nguồn cung

cấp bột cacao và bơ.Bột cacao là thành phần chủ yếu trong chocolate,bánh kẹo, bơ
cacao được dung trong sản xuất dược phẩm và mỹ phẩm.Theo thống kê hàng năm
có khoảng 2,76 triệu tấn hột cacao khô được sản xuất .Cacao được nhân giống chủ
yếu bằng hột,nhưng theo cách này sẽ thu được những thế hệ cacao có tỷ lệ gen dị
hợp tử cao và không xác định.Những cải tiến trong nhân giống vô tính cacao đến
nay vẫn còn ít.Cây cacao khó có thể tái sinh chồi và vi nhân giống in vitro
Phương pháp nhân giống vô tính qua con đường phát sinh phôi soma là một
phương pháp được lựa chọn để nhân giống cây cacao invitro. Phôi soma hình
thành do sự phát triển lưỡng cực của các tế bào soma ,do đó cây được hình thành
qua sự tái sinh phôi soma sẽ mang những đặc tính của cây mẹ và mang đặc tính
tăng trưởng giống như cây trồng có hột
2.Qui trình:
3.Giải thích qui trình
- Vật liệu nuôi cấy:
Vật liệu nuôi cấy là nhị lép được thu từ những chồi hoa chưa trưởng
thành của cây cacao trong vương ươm.Những nụ hoa chưa trưởng thành dài 4-
5mm được thu vào buổi sang sớm.
- Khử trùng:
Khử trùng bề mặt nụ hoa bằng cách nhúng vào và để yên trong
hypochlorite calcium nồng độ 1% trong 20 phút.sau đó rửa sạch dung dịch khử
trùng bằng nước cất vô trùng .làm khô nụ hoa bằng giấy thấm vô trùng.Nụ hoa
được cắt ngang ở vị trí khoảng 1/3 từ dưới gốc lên.Nhị được lấy ở phần trên và cấy
vào môi trường tạo mô sẹo.
- Tạo mô sẹo:
Môi trường tạo mô sẹo ban đầu (PCG: primary callus growth ) là môi
trường cơ bản DKW (driver và kuniyuku, 1984, tulecke và Mcgranahan, 1985) có
bổ sung 2,4-D 9 µM, TDZ (thidiazuron) với các nồng độ khác nhau (22,7; 45,5;
113,6; 227,3; và 454,5 nM), glutamine 250 mg/l, myo-inositol 200 mg/l, thiamine-
Vật liệu nuôi cấy
Khử trùng mẫu

Rửa sạch,lau khô
Tạo mô sẹo
Tạo phôi soma
Tái sinh cây
Trồng cây trong
chậu đất
HCl 2 mg/l, acid nicotinic 1 mg/l, glycine 2 mg/l, glucose 20 g/l và phytagel 2
g/l.Mẫu được cấy trong các đĩa petri 100×15mm có chứa 30ml môi trường .Mẫu
cấy được nuôi trong tối,ở nhiệt đọ 25◦c trong 14 ngày.
Sau tuần nuôi cấy đầu tiên, mẫu cấy trong môi trường PCG sẽ tăng thể tích
gấp 2-3 lần so với ban đầu.Tiếp theo là trên mẫu cấy xuất hiện những mô sẹo
chắc.TDZ nồng độ 22,7 nM kích thích sự tạo mô sẹo chắc trên suốt bề mặc mẫu
nuôi cấy.Trong khi đó trên môi trường không có TDZ mô sẹo chỉ hình thành ở vị
trí vết cắt, còn trên môi trường có TDZ nông độ 45,5 nM thì mô sẹo chỉ xuất hiện ở
phần gốc của mẫu cấy và phàn còn lại của mẫu bị hóa đen và chết.
Sau 14 ngày nuôi cấy trên môi trường mô sẹo ban đầu,mẫu cấy được
chuyển sang môi trường tạo mô sẹo thứ 2 (SCG: secondary callus growth).Môi
trường này gồm các thành phần khoáng cơ bản theo công thức nuôi cấy cây thân
gỗ của McCown (Lloyd và McCown, 1980 ),thành phần vitamin theo Gamborg
(Gamborg, 1966), 2,4-D 9 µM, kinetin 1,4 µM,nước dừa 50ml/l, glucose 20g/l và
phytagel 2,2 g/l.Mẫu cấy tiếp tục được nuôi trong 14 ngày trong điều kiện như trên
.Nước dừa được lấy từ trái dừa còn non và lọc qua 2 lớp giấy lọc Whatman số 4,
chình giữa có than họat tính .
Tốc độ tăng trường của mô sẹo sẽ chậm lại khi được chuyển sang môi
trường SCG. Tuy nhiên, sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường này,có sự xuất kiện
những cụm mô sẹo hình cầu trên tòan bộ mẫu cấy
-Tạo phôi soma:
Mô sẹo tạo ra từ môi trường SCG được cấy chuyền sang môi trường vào
môi trường cảm ứng phôi (ED: embryo development ). Thành phần môi trường ED
gồm có: khoáng DKW, myo-inositol 100 mg/l, thiamine-HCl 2 mg/l, acid nicotinic

1mg/l, glycine 2 mg/l, sucrose 30g/l, glucose 1g/l và phytagel 2g/l. Mô sẹo được
nuôi trong tối, ở 25◦c và được cấy chuyền sau mỗi 14 ngày.Các phôi soma phát
triển đến giai đoạn hình cá đuối sẽ được tách ra khỏi mô sẹo và tiếp tục nuôi trên
môi trường ED trong điều kiện tương tự.
Sự tạo phôi soma xảy ra sau khi chuyển mô sẹo sang môi trường ED được 2
tuần.Đầu tiên trên bề mặc mô sẹo xuất hiện những chỗ phồng lên, sau đó những
cấu trúc này phát triển thành phôi hình cầu .Sau 4 tuần ( có khi đến 2 tháng ) nuôi
cấy trên môi trường ED, trên toàn bề mặt mẫu nuôi cấy mẫu xuất hiện những phôi
ở giai đoạn hình trái tim.
-Tái sinh cây:
Sau 2 tháng nuôi cấy,những phôi soma trưởng thành được chuyển sang môi
trường tái sinh cây (PR: plant regeneration ) gồm có khoáng DKW 1/5, myo
inositol 100 mg/l, thiamine-HCl 2 mg/l, acid nicotinic 1 mg/l, glycine 2 mg/l,
glucose 10 g/l, sucrose 5 g/l, KNO
3
0,2 g/l và phytagel 1,7 g/l.Mẫu cấy được nuôi
cấy dưới cường độ ánh sang 50 µmol m
-2
s
-1
,16 giờ/ngày và được cấy chuyền sang
môi trường mới có thành phần tương tự sau mỗi 14 ngày.
Sau khoảng 1 tháng nuôi cấy trên môi trường PR, chồi với các lá màu xanh,
nhỏ bắt đầu xuất hiện.
-Trồng cây trong chậu đất:
Cây cacao con có khoảng 3 lá và bộ rễ khỏe mạnh dài khoảng 4cm sẽ được
chuyển ra trồng ở các chậu plastic đường kính 10cm có chứa hồn hợp đất, phân vô
trùng nuôi trong nhà kính ở nhiệt độ 27-30◦c , ẩm độ 70%.Sau 2 tháng cây được
chuyển sang chậu plastic đường kính 38 cm có chứa hỗn hợp đất và phân.Cây
được tưới bằng nước có độ pH 5,5-6,0 và tưới phân 2 tuần 1 lần.Sau 10 ngày kể từ

ngày đưa ra vườn ươm,cây cao khoảng 1,5 m,có khoảng 50-60 lá, phát sinh khoảng
5 chồi bên và có các đốt thân ngắn.Những cây con được tạo ra qua con đường phát
sinh phôi soma cũng có sự phát triển tương tự như cây trồng từ hột theo từng giai
đoạn