Tìm hiểu phương pháp cố định Enzyme bằng chất mang Alginate
1)Khái niệm về cố định enzyme
 Enzyme cố định (immobilized) hay enzyme không hòa tan
(insoluble enzyme) được Micheal Trevan định nghĩa là
những phân tử enzyme được đưa vào những pha riêng
rẽ,pha này được tách riêng vớ pha dung dịch tự do nhưng
ở đó enzyme vẫn có khả năng xúc tác với những phân tử
cơ chất. Pha enzyme không hòa tan trong nước và được
gắn với những polymer ưa nước có trọng lượng phân tử
lớn
 Còn theo Klaus Mosbach thì định nghĩa về enzyme cố
định theo nghĩa mở rộng và thực tế hơn. Enzyme không
hòa tan bao gồm các enzyme đã được cố định vào một
chất mang và cả những enzyme có trong tế bào sống được
cố định trong các bình phản ứng sinh học có sự gắn kết
vào một chất mang cho phép tái sử dụng nhiếu lần
2)Lịch sử phát triển và tình hình nghiên cứu
enzyme cố định trong và ngoài nước
 Enzyme cố định được nghiên cứu đấu tiên vào năm 1916 bởi Nelson và Griffin
khi hai ông này quan sát khả năng thủy phân đường sacchaose của enzyme
invertase từ nấm men háp phụ lên than hoạt tính
 1949,Michel và Iuers đã sử dụng phương pháp azid hóa các cacbonxylmethyl
cellulose để cố định những chuỗi proein có hoạt tính
 1953, Grubhofer và Schleith đã cố định enzyme carboxyl peptidase,diatase,
pepsin và ribonuclease trên polyminostyene bằng liên kết đồng hóa trị (covalent
binding)
 1956,Mizt cố định enzyme catalase trên DEAE-cellulose bằng liên kết ion(ionic
binding)
 1964, Quiciio và Richards đã mô tả phương pháp khâu mạch (cross-linking) các
enzyme carboxyl-peptidase với glutaralhyde. Chang đã tiến hành tạo vi nang để
nhốt enzym carbonic anhydrase(microcapsule).

 1969,Wilson đã xây dựng thành công xưởng thực nghiệm để sản xuất glucose
bằng glucoamylase cố định.Chibata là người đầu tiên thực hiện thành công việc
sản xuất vào công nghiệp.
 1973,Chibata và cộng sự lần đầu tiên cố đinh thành công tế bào vi sinh và
từ(E.coli) để sản xuất L-aspartate từ amonium fumarate bằng gel acrylamide.
 Từ những thành tựu đạt được ở trên đã mở ra những ứng dụng to lớn của enzyme
và tế bào cố định trong công nghiệp. Một trong những bằng chứng thuyết phục
nhất là sử dụng glucoisomerase cố định trong sản xuất fructose từ glucose ở quy
mô công nghiệp. Từ năm 1078 cho đến nay có khoảng 4.5 tấn fructose syrup được
sản xuất theo phương pháp enzyme cố định.
Trang 1
Tìm hiểu phương pháp cố định Enzyme bằng chất mang Alginate
 Trên thế giới hiện nay đã sử dụng rộng rãi công nghê cố định enzyme vào trong
các lĩnh vực công nghiệp thực phẩm,y học,công nghiệp hóa chất,bảo vê môi
trường và các lĩnh vực phân tích.
 Ở Việt Nam,nghiên cứu cố định enzyme mới chỉ bắt đầu vài năm gần đây và thu
được kết quả còn rất hạn chế.1994-1995,Viện Sinh học Nhiệt đới đã cộng tác với
Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Tp Hồ Chí Minh nghiên cứu cố định
enzyme glucoisomerase trên các hạt cylochrom B,hoạt hoá bằng glutaraldehyde.
Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên đã có nhiều công trình nghiên cứu cố định
các enzyme thủy phân như: protease,amylase,urease,pectinase…Hiên nay Viện
Sinh học Nhiệt Đới cũng đang nghiên cứu sử dụng chế phẩm enzyme
glucoisomerase (Novo,Đan Mạch) để sản xuất fructose syrup,tuy nhiên mới chỉ ở
quy mô phòng thí nghiệm.
 Những năm gần đây,phòng thí nghiệm công nghệ bức xạ,Viện Hạt Nhân Đà Lạt
đã có nhiều công trình nghiên cứu cố định enzyme và tế bào ,các chất có hoạt tính
sinh học khác bằng kỹ thuật bức xạ như: cố định enzyme
glucoamylase,protease,vi khuẩn tả(Vibrio,Cholerae), tế bào nấm men, vi khuẩn
xử lý nước thải (Pseudomonas maltophilla) và hormon ptrogesteron trên các giá
thể polymer tổng hơp được chế tạo bằng kỹ thuật bức xạ.

3) Đặc điểm của enzyme cố định
Enzyme cố định có những đặc điểm khác với enzyme hòa tan như:
• Enzyme cố định bền nhiệt hơn enzyme hòa tan do chúng được bảo vệ bởi chất
mang
• Có khả năng bảo quản tốt hơn
• Có sự di chuyển pH tối thích sang kiềm hay acid so với enzyme hoà tan
• Có khả năng tái sử dụng nhiều lần
• Enzyme cố định tuân theo định luật Michaelis-menten,tuy nhiên cũng có sự sai
khác như:
o Xảy ra hiện tượng cạnh tranh giữa cơ chất,enzyme và chất mang
o Hiện tượng cản trở sự khuếch tán cơ chất và sản phẩm của phản ứng dẫn
đến vận tốc phản ứng giảm
• Hoạt tính của enzyme cố định thường thấp hơn enzyme hòa tan cùng loại do 2
nguyên nhân sau:
o Do ảnh hưởng điện tích của chất man nên làm thay đổi cấu trúc không
gian của enzyme.
o Do enzyme bị nhốt vào trong gel nên sự tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất
với tâm hoạt động khó khăn.
4)Ưu nhược điểm của enzyme cố định
Enzyme cố định ngày càng được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực do những
ưu điểm sau:
• Hiệu quả kinh tế cao ,do enzyme cố định là chế phẩm sinh học rất đắt tiền nếu
sử dụng dạng hòa tan thì chỉ sử dụng được 1 lần,khó thu hồi.Khi enzyme cố
định trên giá thể thì sử dụng được nhiều lần,giá thành giảm,sử dụng được nhiều
lần,giá thành giảm,nâng cao hiệu quả kinh tế,
• Sản phẩm thu được sau phản ứng được xúc tác bằng enzyme cố định khá tinh
sạch do enzyme được cố định trên những pha riêng rẽ nên không lẫn vào sản
phẩm. Điều này đặc biệt có quan trọng trong sản xuất dược phẩm,trong công
nghệ sản xuất hóa chất tinh khiết và trong phân tích.
Trang 2

Tìm hiểu phương pháp cố định Enzyme bằng chất mang Alginate
• Khi thực hiện bằng phản ứng enzyme cố định có thể dừng phản ứng ở bất kỳ
giai đoạn nào cần thiết,chỉ cần tác enzyme cố định ra khỏi cơ chất.Đối với
những trường hợp yêu cầu sản phẩm chỉ là các sản phẩm trung gian thì điều này
có ý nghĩa quan trọng.
• Có thời gian bảo quản lâu hơn và bền vững hơn đối với các chất kìm hãm cũng
như các tác nhân gây biến tính so với dạng hòa tan.
• Vì được cố định trên giá thể nên enzyme có hoạt tính ổn định hơn so với
enzyme tự do khi có sụ tác động cửa các yếu tố môi trường như: nhiệt độ, pH…
• Enzyme cố định đặc biệt thích hợp với các quy trình công nghê liên tục,tự động
hóa. Enzyme cố định được nạp vào các thiết bị phản ứng như cột,tháp với dòng
cơ chất đi vào liên tục và đầu ra là sản phẩm.
Tuy nhiên bên cạnh những ưu điểm thì enzyme cố định cũng có những nhược
điểm sau:
• Làm hạn chế khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất.Vì vây hoạt tính
riêng(specfic activity) của enzyme cố định thường thấp hơn so với enzyme hòa
tan. Đặc biệt trong trường hợp cơ chất có trọng lượng phân tử lớn như:
protein,tinh bột,chitosan…
• Trường hợp enzyme cố định bằng phương pháp nhốt (entrapment method) trong
khuôn gel thì chỉ phần enzyme nằm ở lớp ngoài của gel là hoạt động.
Enzyme được cố định bằng phương pháp cộng hóa trị thì một lượng đáng kể
enzyme bị mất hoạt tính do chất hoạt hoá và do phản ứng gắn không đặc hiệu xảy ra
ở trung tâm hoạt động của enzyme
5)Vật liệu cố định enzyme
Theo Trevan một chất mang lý tưởng cần có những tính chất sau:
• Giá thành rẻ là yêu cầu đầu tiên của một chất mang được sử dụng trong cố định
bbenzyme.
• Phải có tính chất cơ lý bền vững,ổn định,thì mới chịu đựng được các điều kiện
của môi trường như khuấy trộn,áp lực trong các quy trình sản xuất.
• Về mặt hóa học,chất mang phải bền vững,không tan trong môi trường phản

ứng,chất mang không được làm mất hoạt tính enzyme và không gây ra những
hấp phụ không đặc hiệu
• Chất mang phải có tính kháng khuẩn cao ,bền vững với sự tấn công của vi sinh
vật.
• Chất mang phải có độ trương nở tốt,diện tích bề mặt tiếp xúc lớn . Tính chất này
của chất mang vứa tăng khả năng cố định enzyme,vừa tăng khả năng tiếp xúc
của cơ chất với ezyme,nhớ đó làm tăng hoạt tính enzyme cố định và số lần tái
sử dụng.
• Chất mang cò thể có cấu trúc lỗ xốp ,siêu lỗ,có thể ở dang hạt,dang màng,dạng
phiến mỏng…
∗ Chất mang polymer hữu cơ: tự nhiên và tổng hợp .
a)Nhóm các polymer tự nhiên:
- Polysaccharide:cellulose,agarose,dextran,sephadex,và các dẫn xuất của chúng
Cellulose và các dẫn xuất như CM-Cell,DEAE-Cell
Agarose:ổn định,đắt nên sử dụng chủ yếu trong y học
Alginate,carragenan: tạo gel tốt nhưng không ổn định trong môi trường có
photphat
Trang 3
Tìm hiểu phương pháp cố định Enzyme bằng chất mang Alginate
Tinh bột:phong phú,rẻ nhưng kém trương nở,khả năng cố định kém nên thường
được ghép với các copolymer làm tăng độ trương nở,cải thiện tính chất cơ lý,tăng khả
năng cố định vi sinh vật
Chitin,chitosan: có cấu trúc siêu lỗ,dễ tạo màng,tạo hạt,bền cơ lý,ổn dịnh. Tuy
nhiên kỵ nước,độ trương nở kém nên cải thiện ghép copolymer với các vinyl monomer
ưa nước
-Protein:thường sử dụng gelatin,keratin,albumin. Dễ tạo màng,tạo hạt. Tuy nhiên
kém bền,dễ nhiễm khuẩn hay gây các phản ứng miễn dịch
b) Nhóm các polymer tổng hợp( synthetic polymer):
polyacrylamide,polyester,polyvinylalcohol,polyvinylacetate,polyacrylic,polystyren,polyet
hylen ghép với các vinylmonomer

Bền cơ lý,bền nhiệt,bền vi sinh vật, trơ hóa học,độ trương nở tốt,có thể điều chỉnh
kích thuớ siêu lỗ. Tuy nhiên giá thành cao,quá bền vững nên gây ô nhiễm môi trường khi
khó phân hủy
∗ Chất mang vô cơ:
Gồm sợi bông thủy tinh,silicium oxide SiO
2
,Alluminium oxide Al
2
O
3
,MgO có
cấu trúc lỗ,có khả năng hấp phụ tốt. Nhưng tan trong kie62mpH>7,5 ta khắc phục bằng
cách phủ lớp ziconia bền vững với kiềm
Ngoài ra còn có ceramic,celite(diatomic)
Alginate
a)Nguồn gốc của alginate
Alginate là thuật ngữ dùng cho các muối
acid alginic. Alginate đôi khi còn được gọi
bằng thuậ ngữ “algin”.
Alginate là một polymer sinh học có
nguồn gốc từ tảo biển,có nhiều trong vách tế
bào tảo nâu(Paccophyceae) dưới dạng muối
canxi,magie,natri của acid alginic. Alginate
có nguồn gốc từ biển nên nó rất linh động và
bền. Tuy nhiên,dạng muối canxi và magie
alginate không tan trong nước ,phải qua quá
trình tách chiết Alginate để thu Alginate
dạng bột khô,tan trong nước và loại bỏ
những thành phần khác của tảo biển qua quá
trình kết tủa.

b)Cấu tạo của Alginate
Trang 4
Tìm hiểu phương pháp cố định Enzyme bằng chất mang Alginate
Công thức của acid Alginic là(C
6
H
8
O
6
)
n
từ đó công thức của natri alginate là (C
6
H
7
Na

O
6
)
n,
canxi Alginate(C
6
H
7
Ca
1/2
O
6
)

n.
 Alginate là một polymer được cấu tạo từ 2 monomer là: acid β-D-Mannuronic(M)
và acid α-L_Gluconic (G),với các cầu nối là liên kết 1-4 glucoside,chỉ khác ở nhóm
carboxyl nằm ở trên và dưới mặt phẳng của vòng pyranoza. Chúng tham gia vào
cấu trúc thành và màng tế bào,chúng thường tồn tại ờ dạng ;G-G-G-G…;M-M-M-
M…;M-G-M-G… Sự phân bố của thành phần M,G biến đổi nhiều theo loài, do đó
có nhiều loại Alginate và có tính chất khác nhau
Trang 5
Tìm hiểu phương pháp cố định Enzyme bằng chất mang Alginate
c)Tính chất của Alginate
Việc sử dụng Alginate dựa trên 3 tính chất chính;
• Khi tan trong nước Alginate tạo dung dịch nhớt. Các muối alginate (Na, K,
Mg) đều hòa tan trong nước, tạo cho dung dịch có độ nhớt cao. Độ nhớt
alginate của rong thay đổi nhiều tùy thuộc vào loài, vào giai đoạn sinh trưởng
của rong và kỹ thuật tách chiết alginate. Độ nhớt tăng khi mức độ polymer
hóa tăng, nồng độ alginate tăng và nhiệt độ giảm. Bên cạnh đó, độ nhớt của
alginate lại phụ thuộc rất lớn vào phương pháp tách chiết. Để tăng độ nhớt,
trong quá trình tách chiết alginate, ta có thể bổ sung một số phụ gia cần thiết
để thu được sản phẩm có độ nhớt mong muốn
Ngoài ra, độ nhớt alginate phụ thuộc vào quá trình bảo quản. Khi ở dạng bột
thành phẩm, alginate vẫn tiếp tục bị cắt mạch, sau một thời gian, độ nhớt của
nó giảm đáng kể. Để khắc phục điều này, ta có thể cho vào alginate thành
phẩm một lượng nhỏ canxi sao cho chưa đến ngưỡng tạo gel. Khi sử dụng kết
hợp alginate với các dạng gum khác như pectin sẽ làm tăng đáng kể độ nhớt
của dung dịch.
• Ở điều kiện bình thường, các gốc COO
-
của các phân tử guluronic sẽ hình
thành liên kết hydro với ion H
3

O
+
có trong dung dịch. Khi ta đưa vào môi
trường các ion kim loại như Ca
2+
, Ba
2+
, các cation này sẽ thay vào vị trí của
H
3
O
+
, nối các chuỗi guluronic lại với nhau, tạo thành một cấu trúc mạng lưới
không tan trong nước, cấu trúc này được gọi là gel.
Quá trình tạo gel của alginate được tiến hành ở các điều kiện bình thường về nhiệt
độ và áp suất. Cấu trúc gel tạo thành bền ở nhiệt độ trong khoảng 0 – 100
0
C. Vì
thế, sự gia nhiệt hầu như ít làm hư cấu trúc gel. Tuy vậy, gel có thể dễ dàng
Trang 6
Tìm hiểu phương pháp cố định Enzyme bằng chất mang Alginate
hòa tan trở lại khi nhúng vào dung dịch chứa hàm lượng Na
+
, K
+
hay Mg
+
cao.
Do vậy, nên duy trì tỉ lệ Na
+

/Ca
2+
<= 25:1 để giúp cấu trúc gel được ổn định.
Khả năng tạo gel của alginate với các cation là không giống nhau, độ bền gel
tăng dần theo thứ tự Ca
2+
< Sr
2+
< Ba
2+
. Trong đó, Ca
2+
là tác nhân tạo gel được
sử dụng nhiều nhất do tính phổ biến và không độc hại của nó.
• Alginate tạo dạng màng mỏng (films) của natri hoặc canxi Alginate với dạng
sợi fibres) củz canxi Alginate. Tính chất này của alginate được ứng dụng
trong việc tạo nên các lớp phủ bên ngoài.
d) Sản xuất Alginate
Trước khi đem trích ly để thu alginate, nguyên liệu sẽ được rửa bằng acid để loại
bỏ các chất khô hòa tan.Sau đó rửa qua nước để làm sạch.Tiếp đó mang đi nghiền.Trích ly
alginate được thực hiện bằng cách ngâm nguyên liệu trong dung dịch kiềm (NaOH). Dung
dịch sau trích ly sẽ mang đi lọc để loại bỏ các cặn không hòa tan.
Trang 7
Tìm hiểu phương pháp cố định Enzyme bằng chất mang Alginate
Sau đó, dịch lọc sẽ được mang đi tạo tủa với CaCl
2
thu Calci Alginate. Calci
Alginate được xử lý acid để loại bỏ ion Ca
2+
.Tiếp đến, để thu được sản phẩm là muối

alginate của cation nào, ta sẽ cho acid alginic tác dụng với muối cacbonat của cation đó.
Trong các sản phẩm tạo thành, chiếm số lượng lớn nhất là natri alginate, còn lại là một số
muối alginate của kali, canxi Ở công đoạn này, cần kiểm soát thông số pH, hàm lượng
axit alginic, muối cacbonate còn sót trong sản phẩm cuối cùng.
Cuối cùng, alginate sẽ được mang đi sấy khô.Quá trình này sẽ quyết định hàm
lượng chất khô sau cùng của sản phẩm cũng như cỡ hạt tạo thành.
Trang 8
Tìm hiểu phương pháp cố định Enzyme bằng chất mang Alginate
Trang 9
RONG
MƠ
RỬA NƯỚC
VÀ ACID
NGHIỀN
TRÍCH LY BẰNG
BASE
LỌC
DỊCH
LỌC
KẾT TỦA
VỚI CACL
2
AGINATE
CALCI
XỬ LÝ
ACID
XỬ LÝ
NA
2
CO

3
SẤY KHÔ
AGINATE
NATRI
KHÔ
AGINATE
NATRI
NGHIỀN
THU TỦA
Tìm hiểu phương pháp cố định Enzyme bằng chất mang Alginate
e) Ứng dụng của Alginate
*Trong công nghiệp thực phẩm:
- Alginate được dụng trong nước sốt,siro, kem
- Alginate gíup lớp đường phủ trên bề mặt bánh ngọt không thay đổi hình dạng, do đó
việc nướng bánh dễ dàng hơn.
- Những dịch nhũ tương có chứa nước và dầu như nước sốt, nước gia vị trong salad ít
bị phân lớp nếu có thêm propylene glycol alginate ( PGA ) vì chất này bền trong môi
trường acid yếu. Alginate giúp cải thiện độ đặc, tăng độ mịn của sữa chua còn PGA
dung để làm bền cho protein sữa trong điều kiện acid.
- Một lượng nhỏ PGA cho bọt bia bền vững lâu tan.
*Trong dược và y học:
- Nếu một tia dung dịch natri alginate đưa vào một bồn chứa dung dịch CaCl
2
, canxi
alginate được tạo thành dạng sợi. Sợi polymer được kéo dài rất bền. Các sợi này được
sử lý tạo thành vải không dính dung băng bó vết thương. Chúng được hấp thụ bởi
dịch cơ thể do canxi trong vải sợi được thay cho natri từ dịch cơ thể tạo ra natri
alginate tan, do đó chúng có đặc tính hàn vết thương rất tốt.
- Bột acid alginic nở ra khi ở trong nước nên được dung trong thực phẩm ăn kiên như
bánh quy. Ngoài ra alginate còn được dung để điều khiển sự phóng thích của thuốc và

những chất hóa học khác.
6)Các phương pháp cố định enzyme
a)Phương pháp hấp phụ
 Sử dụng chất mang có tính hấp
phụ cao như than hoạt tính hay
silicagel,oxit nhôm,gốm sứ…
các phân tử enzyme hấp phụ
lên bề mặt của chất hấp phụ
nhưng do lực hấp phụ nhưng
do lực hấp phụ yếu nên
enzyme dễ bị rơi khỏi chất
mang. Có thể cải thiện :dùng
các chất mang có các nhóm
tích điện và enzyme dược gắn
với chất nang nhờ lực ion
nhưng có nhược điểm là
enzyme dễ bị rửa giải nếu nồng
độ muối trong dung dịch cao.
b)Phương pháp tạo khuôn gel:
 Sử dụng cac polymer có khả
năng tạo gel (như
polyacrylamide,alginate,caranan…) và dồng hóa (trùng hợp) chúng với enzyme
tạo khuôn gel nhốt các enzyme bên trong.Sau khi nhốt các enzyme ,tạo thành
Trang 10
Tìm hiểu phương pháp cố định Enzyme bằng chất mang Alginate
dạng hạt phương pháp này bền hơn nhưng có nhược điểm la những enzyme khi
tiếp xúc với cơ chất
c)Phương pháp liên kết đồng hóa trị
 Xử lý chất mang gắn cho nó nhưng nhóm chức sao cho nó có thể liên kết đồng
hóa trị với enzyme tăng độ bền vững các chất mang sử dụng :

DEAE_Cellulose,CM_Cellulose, agarose,silleagel, bentonit….Tham gia vào các
liên kết đồng hóa trị gồm các nhóm chức của enzyme như : gồm có _SE của
eystein,-OH của serin,-NH2 của lisin,-COOH của acid glutamic,aspartic, nhóm
imidazol của histidin, indol của tryptophan…

d)Phương pháp bao gói trong màng bán thấm(bao vi thể):
Dùng các màng bán thấm tạo thành các dạng microcapsule
*Các phương pháp hoạt hóa chất mang
Có nhiều phương pháp hoạt hóa chất mang, sau đây là một số phương pháp chính
∗ Hoạt hóa chất mang bằng cyanoge halogenur
Chất mang này có bản chất là polysaccharide (có nhóm –OH) thường được hoạt hóa
sơ bộ bằng cyanoge halogenur. Môi trường xảy ra phản ứng là môi trường kiềm, chất
mang hoạt hóa có khả năng liên kết cộng hóa trị với nhóm –NH
2
của phân tử enzym.
∗ Hoạt hóa chất mang bằng phương pháp azide
Đây là phương pháp hàng đầu hiện nay. Các chất mang chứa nhóm chức COOH của
CM-cellulose, polyacrylamide và nylon có thể hoạt hóa theo phương pháp này.
∗ Hoạt hóa chất mang bằng ethyl choroformate
Phương pháp này tạo ra các sản phẩm không gây độc nên dùng để thay thế cho
phương pháp hoạt hóa bằng cyanogenbromide.
∗ Hoạt hóa chất mang bằng glutaraldehyde
Các chất có mang nhóm –NH
2
(polysaccharide, chitin, chitosan, cellulose…) đều có
thể sử dung phương pháp này.
Glutaraldehyde là chất có chứa hai nhóm aldehyde (-CHO) hoạt hóa. Một nhóm sẽ
gắn vào –NH
2
của enzym.

∗ Hoạt hóa chất mang bằng phản ứng diazo1
Phương pháp này cho những chất mang có nhóm amin. Muối diazo của chất mang
họat hóa có thể phản ứng không chỉ với nhóm amin mà cả với nhóm phenol. Phản
ứng cộng hóa trị xảy ra nhanh chóng ở nhiệt độ thông thường và môi trường nước
trung tính.
∗ Hoạt hóa chất mang bằng carbodiimide
Các chất dẫn xuất của carbodimide thường được dùng cho những chất mang có chứa
nhóm carbonyl. Khi có mặt chất này enzym dễ dàng liên kiết cộng hóa trị với chất
mang và diciclohexildimimide sẽ chuyển thành diciclohexilure không tan trong hầu
hết các dung môi hữu cơ. Phản ứng xảy ra trong pH yếu (pH 5.0) nên chỉ phù hợp với
enzym như amylase, pepsin, cellulose.
∗ Hoạt hóa chất mang bằng 3-aminopropyltriethoxysilane
Cho phép hoạt hóa những loại vật liệu trơ như thủy tinh có thể gắn với enzym
Trang 11
Tìm hiểu phương pháp cố định Enzyme bằng chất mang Alginate
Alginate là một polymer tự nhiên được ứng dụng nhiều trong công nghệ cố định
tế bào mà kỹ thuật của phương pháp này dựa trên khả năng tạo gel của natri alginate
trong dung dịch chứa các cation đa hóa trị. Đây là một phương pháp hữu ích, được sử
dụng cho nhiều loại tế bào ngay cả những tế bào có cấu trúc dễ bị tổn thương như tế bào
thực vật và động vật. Đặc điểm của phương pháp này là thao tác dễ dàng, nguyên liệu dễ
kiếm và điều kiện thực hiện rất nhẹ nhàng.
Phương pháp cố định enzym trên Canxi-alginate
∗ Kỹ thuật cố định enzyme
Kỹ thuật thực hiện khá đơn giản và có thể tiến hành như sau:
- Hòa tan alginate vào nước cất, khuấy cho đến khi natri algiante tan hoàn toàn,
thu được dung dịch có nồng độ natri alginate có thể từ 0.5-8% tùy thuộc vào độ nhớt của
loại alginate sử dụng.
- Cho vào dung dịch trên một lượng enzyme đã xác định trước và khuấy đều.
- Nhỏ dung dịch này vào dung dịch CaCl
2

2%. Để quá trình tạo gel diễn ra ổn định, dung
dịch CaCl
2
phải được khuấy trộn liên tục. Gel được tạo thành ở nhiệt độ phòng ngay khi
dung dịch natri alginate được nhỏ vào dung dịch canxi clorua. Khoảng cách để nhỏ thích
hợp nhất là 10cm. Để tạo hạt có kích cỡ từ 0.5-2mm, có thể dùng kim hoặc ống tiêm. Hạt
tạo thành sẽ cứng từ 1-2 giờ. Sau đó hạt sẽ được rửa sạch bằng nước vô khuẩn
Trang 12
Tìm hiểu phương pháp cố định Enzyme bằng chất mang Alginate

 Các lưu ý trong kỹ thuật cố định tế bào nấm men bằng alginate:
- Nên cho natri alginate vào nước hoặc môi trường, và không làm ngược lại để
quá trình hòa tan diễn ra hoàn toàn. Nếu cần thiết, dung dịch này sẽ được hấp tiệt trùng ở
121
0
C trong vòng 20 phút. .
Trang 13
KHUẤY ĐỀU
AGINATE
NATRI
ENZYME
GLUCOAMYLASE
NƯỚC
KHUẤY ĐỀU
NHỎ TỪNG GIỌT
VÀO DUNG DỊCH
CACL
2
KHUẤY ĐỀU
VỚT

PHƠI KHÔ
DUNG
DỊCH
AGINATE
RỬA HẠT
ENZYME
THÀNH
PHẨM
EZYME CỐ
ĐỊNH
TẠO HẠT
Tìm hiểu phương pháp cố định Enzyme bằng chất mang Alginate
- Trong quá trình tạo hạt, việc lựa chọn khoảng cách từ vòi nhỏ giọt đến bề mặt
dung dịch CaCl
2
cần lưu ý các vấn đề sau:
+ Nếu vòi tạo hạt tiếp xúc với bề mặt dung dịch thì gel tạo thành ở dạng khối mà
không phải dạng hạt.
+ Nếu khoảng cách nhỏ giọt quá lớn, hạt tạo thành sẽ không tròn, không đều và
xuất hiện các hạt có kích thước rất nhỏ. Ngoài ra, việc lựa chọn khoảng cách phải lưu ý
đến độ nhớt của dung dịch natri alginate tạo thành.
+ Cần lưu ý đến việc tăng mực chất lỏng của dung dịch CaCl
2
cũng như duy trì
nồng độ Ca
2+
ở trong bình bởi vì khi hạt gel hình thành ngày càng nhiều sẽ làm giảm
mực chất lỏng và nồng độ của ion Ca
2+.
*Xác định hàm lượng enzym được cố định và không được cố định

Protein hấp thu ánh sáng ở bước sóng 280 nm. Đo mật độ quang của dung dịch
CaCl
2
ở bước sóng 280nm để xác định hàm luợng protein có trong dung dịch (hàm
luợng protein không được cố định ) từ đó suy ra hàm lượng protein được cố định
trong hạt.
* Xác định hoạt độ của enzyme không được cố định và enzyme được cố định
- Sau khi vớt hạt và rửa hạt,định lại dung dịch CaCl
2
ở một thể tích nhất định V(ml)
- Xác định lại hoạt độ cuả enzyme cố định bằng cách cho enzyme phản ứng cơ chất
ứng
*Xác định khả năng tái sử dụng của enzym glucoamylase cố định :
- Cân hạt enzym cố định ( ở nồng độ Alginate tối ưu )cho vào erlen, thêm vào hồ
tinh bột và đệm acetate. Để hỗn hợp thủy phân trong (sau mỗi phút lắc nhẹ erlen
một lần )
- Rút dung dịch thủy phân ra khỏi hạt, rửa hạt với nước cất. Phần nước rửa cho vào
dịch thủy phân, đem dịch thủy phân đo lượng đường glucose sinh ra
- Tiếp tục cho hat enzym phản ứng với hồ tinh bột.
- Lặp lại các bước trên 10 lần để xem xét khả năng tái sử dụng của enzym cố định.
- Số lần tái sử dụng thông qua lượng đường glucose tạo thành sau mỗi lần sử dụng
Trang 14
Tìm hiểu phương pháp cố định Enzyme bằng chất mang Alginate
III) NHẬN XÉT
Cố định enzyme trên Calci-Alginate
• Nồng độ Alginate tối ưu để cố
định enzyme glucoamylase là
3%
• Hiệu suất cố định protein ở
nồng độ Alginate 3% là

39,56% so với tổng lượng
Protein ban đầu
• Hiệu suất hoạt độ enzyme cố
định ở nồng độ Alginate 3% là
46,33% so với tổng hoạt độ
enzyme ban đầu
• Ở nồng độ Alginate 3% sau 8
lần tái sử dụng hàm lượng
glucose sinh ra giảm còn
55,19% so với lần sử dụng đầu tiên
Trang 15
ENZYME CỐ ĐỊNH
ENZYME CỐ ĐỊNH
3D
Tìm hiểu phương pháp cố định Enzyme bằng chất mang Alginate
IV) ỨNG DỤNG CỦA ENZYME CỐ ĐỊNH
Ngày nay emzym cố định được sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau.
• Ứng dụng trong nghiên cứu cơ bản sinh hóa
- Enzym cố định đã trở thành công cụ hữu hiệu trong nghiên cứu cơ bản sinh hóa.
Enzym cơ bản nghiên cứu mối liên hệ giữa enzyme và coenzyme, giữa enzym và cơ
chất, cấu trúc của enzyme và cả sự biến tính của enzyme.
• Ứng dụng trong phân tích sinh hóa
- Năm 1967, điện cực enzyme ra đời là điệc cực gắn glucooxydase cố định, được ứng
dụng trong phân tích tự động định lượng hàm lượng glucose. Dựa trên nguyên tắc này
nhiều loại điệcn cực ra đời: Clark dùng điện cực alcohoxydoredustate để xác định
nồng độ cồn.Kaestu tạo điện cực urease đo nồng urea trong máu,cholesterroloxydase
để đo nồng độ cholesterol.
• Ứng dụng trong y học.
- Enzym cố định được ứng dụng nhiều trong lĩnh vực y học, trong chuẩn đóan cũng
như trong điều trị. Urease được ứng dụng trong máy chạy thận nhân đạo. Chế phẩm

asparaginase dùng trong trị bệnh ung thư. Peroxydase cố định trên polystyrene cùng
với kháng thể hoặc kháng nguyên gây bệnh giúp chuẩn đoán
- Bệnh nhanh chóng và chính xác. Ngòai ra một số chế phẩm enzyme còn được dùng
trong sản xuất thuốc kháng sinh pennisilin và sản xuất dịch truyền acid amin…
• Ứng dụng trong dược học
- Một số enzym cố định như : aminoacylase, aminipeptidase, aminotransferase được sử
dụng trong các quy trình sản xuất dịch truyền acid amin, Aspartase, formate
dehydrogensae, được dùng trong sản xuất acid amin. Đặt biệt trong sản xuất thuốc
kháng sinh penicillin acylase.
• Ứng dụng trong công nghiệp
- Công nghiệp là lĩnh vực mà enzym
cố định đã và đang được ứng dụng
nhiều nhất. Các quy trình công
nghiệp như: công nghiệp rượu bia,
nước giải khát, công nghiệp chế biến
sữa, công nghiệp dệt , công nghiệp
vải sợi sản xuất hóa chất, chế biến
cacao đều sử dụng enzym cố định
trong quá trình sản xuất.
- Trong công nghịêp nước giải khát sử
dụng glucoisomerase cố định để sản
xuất phổ siro-fructose từ tinh bột,
hàng năm đã cho ra hàng triệu tấn
chế phẩm.
- Chế phẩm lactase cố định đã được
ứng dụng trong công nghiệp chế biến
Trang 16
Tìm hiểu phương pháp cố định Enzyme bằng chất mang Alginate
sữa. Lactase cố định dùng để thủy phân đường lactose trong sữa, sản xuất “sữa phi
lactose” cho người bệnh và trẻ em suy dinh dưỡng để dễ tiêu hóa hơn.

- Trong công nghịêp sản xuất rượu bia, người ta sử dụng các chế phẩm amylase, tế bào
nấm men cố định với quy mô rất lớn, chế phẩm catalase cố định dùng làm giảm hàm
luợng peroxide trong rượu
- Enzyme racemase cố định dùng để chuyển toàn bộ dạng D-acid amin thành L-acid
amin, làm tăng giá trị dinh dưỡng cho sản phẩm.
• Ứng dụng trong xử lý môi trường
- Trong công nghiệp thực phẩm, nước thải rất giàu chất hữu cơ, vì vậy một công đoạn
của xử lý chất thải là xử lý sinh học. Ở giai đoạn này nước thải sẽ được xử lý bằng
enzym cố định như: amylase, protease, cellulase để sử lý bã thải hữu cơ. Tuy vậy,
hiện nay cách vi sinh vật cố định được sử dụng trong xử lý môi trường biến hơn cả.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Công Nghệ Enzyme –Nguyễn Đức Lượng
Internet google.com.vn
vi.Wikipelidia.org
Trang 17