VẬN CHUYỂN ĐIỆN TỬ TRONG CON ĐƯỜNG CHUYỂN ĐỔI
ACETATE THÀNH METHANE TRONG VI KHUẨN CỔ SỐNG Ở BIỂN
METHANOSARCINA ACETI VORANS
Tóm tắt
Phương pháp sắc ký lỏng – hybrid linear ion trap– phương pháp phổ khối cộng hưởng
cyclotron ion biến đổi Fourier (Khối phổ cộng hưởng cyclotron ion biến đổi Fourier là một loại
máy phân tích khối lượng để xác định tỷ lệ khối lượng trên điện tích của các ion dựa trên tần
số cyclotron của các ion trong một từ trường cố định) được sử dụng để xác định sự đa dạng
khác biệt của protein trong các tế bào tăng trưởng acetate so với protein trong các tế bào tăng
trưởng metanol của Methanosarcina acetivorans phân lập ở biển về mặt trao đổi chất đánh dấu
14

N so với 15N. Nhiều hơn 246 protein khác nhau ở M. acetivorans được so sánh với 240 gen

biểu hiện khác nhau đã được báo cáo trước đó của Methanosarcina mazei phân lập nước ngọt
được xác định bằng phiên mã của các tế bào phát triển bằng acetate so với các tế bào phát triển
bằng metanol. Sự khác biệt rõ ràng đã được tiết lộ đối với các protein liên quan đến vận chuyển
điện tử và bảo tồn năng lượng. So với các tế bào phát triển bằng metanol, M. acetivorans phát
triển bằng acetate đã tổng hợp một lượng lớn hơn các tiểu đơn vị được mã hóa trong một đơn
vị phiên mã 8 gen tương đồng với các operon mã hóa phức hợp vận chuyển điện tử Rnf chuyển
vị ion được đặc trưng trước đó từ liên giới Vi khuẩn (domain bacteria). Kết hợp với các phân
tích trình tự và sinh lý học, những kết quả này cho thấy rằng M. acetivorans thay thế phức hợp
H2-evolving Ech hydrogenase của các loài Methanosarcina nước ngọt bằng phức hợp Rnf,
tạo ra gradient ion xuyên màng để tổng hợp ATP. So với các tế bào phát triển bằng metanol,
M. acetivorans phát triển bằng acetate đã tổng hợp một lượng protein lớn hơn được mã hóa
trong một đơn vị phiên mã 7 gen được chú thích cho phức hợp Mrp được báo cáo trước đây là
hoạt động như một antiporter (chất trao đổi) chuyển natri/proton trong liên giới Vi khuẩn. Sự
khác biệt được báo cáo ở đây giữa M. acetivorans và M. mazei có thể là do sự thích nghi của
M. acetivorans với môi trường biển.
Giới thiệu
Việc chuyển đổi sinh khối trong điều kiện kị khí thành khí methane là điều cần thiết

cho chu trình carbon tồn cầu. Hầu hết khí methane được tạo ra bởi quy trình hai bước trong
đó chất hữu cơ phức tạp được lên men thành acetate, chất này sau đó được chuyển đổi thành


khí methane và carbon dioxide. Q trình tương tự cũng là chìa khóa để biến đổi sinh khối thực
vật có thể tái tạo thành khí methane (biomethanation: biometan hố là một q trình trong đó
vật liệu hữu cơ được chuyển đổi bằng vi sinh vật trong điều kiện yếm khí thành khí sinh học)
như một nguồn năng lượng thay thế. Việc sản xuất cây trồng năng lượng tái tạo cho q trình
biometan hố đặc biệt thuận lợi để giảm lượng khí thải CO2 vào khí quyển, vì CO2 được tạo ra
bằng cách đốt cháy khí methane và được tái chế thơng qua q trình quang hợp của thực vật.
Sự hiểu biết về con đường chuyển đổi acetate thành methane là hết sức quan trọng đối với việc
phát triển các thông số quy trình để kiểm sốt và tối ưu hóa q trình biến đổi sinh học quy mơ
lớn của sinh khối tái tạo. Cơ sở cho sự hiểu biết này là việc xác định các protein mới cần thiết
cho con đường hình thành khí methane từ acetate. Cơ sở cho sự hiểu biết này là việc xác định
các protein mới cần thiết cho con đường hình thành khí methane từ acetate. Hồ sơ phiên mã
của loài nước ngọt Methanosarcina mazei (17) đã xác định các gen được điều chỉnh tăng để
đáp ứng với sự phát triển của axetat so với sự phát triển của methanol, cho thấy vai trò của các
protein được mã hóa đặc trưng cho con đường chuyển hóa acetate thành methane. Kết quả cho
thấy con đường ở M. mazei tương tự như con đường được đề xuất trước đây đối với các loài
Methanosarcina nước ngọt khác (8–10, 29). Một phân tích proteomic gần đây của các lồi vi
sinh vật biển Methanosarcina acetivorans sử dụng điện di trên gel hai chiều và matrix -assisted
laser desorption– time of flight tandem mass spectrometry (MS) (gel 2-D/MS) đã xác định
được 34 protein có nhiều hơn ở các tế bào phát triển trong acetate so với các tế bào phát triển
trong methanol (25, 26). Ở đây, chúng tôi báo cáo một phân tích sâu hơn bằng cách sử dụng
sắc ký lỏng (LC)–hybrid linear ion trap –Fourier transform ion cyclotron resonance (FTICR)
MS để xác định các protein phong phú khác nhau từ các tế bào tăng trưởng bằng acetate so với
các tế bào tăng trưởng bằng methanol được đánh dấu chuyển hóa bằng 14N so với 15N tương
ứng. Kết quả cung cấp sự hiểu biết chi tiết hơn về con đường acetate ở loài vi sinh vật biển
này, cho thấy sự khác biệt sâu sắc trong con đường chuyển hóa acetate thành methane của M.
acetivorans so với của M. mazei và các loài Methanosarcina nước ngọt khác.

Vật liệu và phương pháp
Tăng trưởng tế bào.
Các tế bào phát triển từ acetate của M. acetivorans được nuôi cấy như mô tả trước đây
(25). Các tế bào sinh trưởng trong methanol được nuôi cấy như mô tả trước đây (25), ngoại trừ
việc 14NH4Cl được thay thế bằng 15NH4Cl (98%) (Sigma, St. Louis, MO). Các tế bào từ cả hai
môi trường đã được thu trong giai đoạn giữa của sự tăng trưởng theo cấp số nhân ở mật độ


quang học ở 600nm lần lượt là 0,8 và 0,6 đối với các môi trường acetate và methanol, như đã
mô tả trước đây (25).
Chiết xuất protein, điện di trên gel SDS-polyacrylamide (PAGE) và phân hủy
trong gel.
Tế bào từ khoảng 40 ml dịch nuôi cấy được tái huyền phù trong 100 µl Tris-HCl 10
mM chứa 5 mM MgCl2 và 100 U DNase (Roche, Indianapolis, IN) và ủ trên đá trong 20 phút.
Phương pháp xử lý này được thực hiện sau khi bổ sung 900 µl urê 8 M chứa 0,05% sodium
dodecyl sulfate (SDS) và vortex trong 3 phút. Lysate toàn bộ tế bào đã được làm sạch bằng
cách ly tâm ở 13.000 x g trong 20 phút ở 4°C. Nồng độ của chiết xuất protein toàn tế bào, được
xác định bằng xét nghiệm Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA), từ các tế bào tăng trưởng bằng
acetate và methanol lần lượt là 5,8 và 3,5 mg/ml. Chiết xuất toàn tế bào của các tế bào tăng
trưởng bằng acetate và methanol được kết hợp để tạo ra hỗn hợp 1:1 (khối lượng/trọng lượng)
của các protein được đánh dấu

14

N và 15N. Một phần dịch chiết chứa 40 µg của hỗn hợp đã

được pha lỗng thành 45 µl với dung dịch đệm mẫu SDS-PAGE bao gồm 2% (wt/vol) SDS,
25% (vol/vol) glycerol, 100 mM dithiothreitol, 0,01% bromophenol xanh lam và 62,5 mM
Tris-HCl (pH 7). Mẫu được phân giải trong a precast 12-well linear gradient Criterion TrisHCl gel từ 10,5 đến 14% (Bio-Rad, Hercules, CA) được phát triển ở 160 V trong 50 phút. Gel
được nhuộm bằng bạc như mô tả trước đây (32). Các làn (lanes) được cắt thành 10 phân đoạn,

mỗi phân đoạn chứa tổng mật độ gần giống như ước tính bằng cách kiểm tra trực quan với sự
hỗ trợ của nguồn sáng mờ. Mỗi phần được băm riêng thành các khối ~1-mm3 và được rửa,
phân hủy trong gel và các bước chiết xuất peptide như đã mơ tả trước đây (36), ngoại trừ việc
thể tích dung dịch được thêm vào cho mỗi bước đã được điều chỉnh để phù hợp với thể tích
của các miếng gel cho mỗi phần SDS-PAGE Sequencing-grade Trypsin (Promega, Madison,
WI) đã được sử dụng làm enzyme tiêu hóa. Dung dịch chiết xuất peptide thu được cho mỗi
phân đoạn ( ~1,2 ml) được cơ đặc đến thể tích cuối cùng ~ 30 ul trong hệ thống SPD1010
SpeedVac (Thermo Savant, Holbrook, NY) ở 45°C trong ống ly tâm siêu nhỏ 1,5 ml.
Xác định protein và xác định tỷ lệ đa dạng.
Protein được xác định từ chiết xuất peptide của từng phần gel SDS-PAGE một chiều
bằng cách sử dụng chiến lược (strategy) shotgun proteomics tương tự như đã mô tả trước đây
(42). Khoảng 10 µl của dung dịch chiết xuất peptide đã được nạp vào cột 100 dBx 15 cm được
chứa đầy với các hạt MagicC18 5~um (Michrom BioResources, Auburn, CA) theo sau là một


gradient tuyến tính (linear gradient) 75 phút từ 2% đến 35 % (vol/vol) acetonitril trong 0,1%
axit formic sử dụng tốc độ dòng chảy 300-nl/min. Thiết bị Hydrid linear ion trap-FTICR (LTQ
FT MS; Thermo Electron, San Jose, CA) đã được sử dụng để phân tích. Trong một chu kỳ thu
thập dữ liệu, một lần quét biến đổi MS Fourier (FT) có độ phân giải cao duy nhất với sự tích
lũy lên đến 2 x106 ion được theo sau bởi việc thu được phổ MS song song bằng cách sử dụng
linear ion trap (tích lũy 3x104 ion) lên đến bảy trong số các ion mạnh nhất với loại trừ động
học được đặt 1 phút. Một chu kỳ thu thập dữ liệu duy nhất đã hoàn thành trong khoảng 3,5
giây. Mỗi phần SDS-PAGE một chiều được phân tích hai lần. Dữ liệu thu được được tìm kiếm
dựa trên cơ sở dữ liệu NCBI của M. acetivorans C2A trong hai tìm kiếm Sequest riêng biệt,
một tìm kiếm tương ứng với 14N và tìm kiếm kia tương ứng với ghi nhãn 15N. The precursor
ion mass tolerance được đặt thành ±1,4 Da và trypsin được chỉ định là enzyme phân giải protein
với tối đa hai lần phân cắt bị bỏ sót. Để giảm thiểu tỷ lệ nhận dạng âm tính giả, các peptides
được xác định bằng các giá trị tương quan chéo (Xcorr) lớn hơn 1,5 (1) tái tạo LC/hybrid linear
ion trap-FTICR MS chạy ban đầu đã được chọn. Chỉ những peptit có dung sai khối lượng tiền
chất (the precursor mass tolerance) là ±10 ppm sau đó mới được chấp nhận là nhận dạng chính

xác. Trong khoảng 15% số lần nhận dạng peptide, đồng vị thứ hai ban đầu được chỉ định làm
ion tiền chất, dẫn đến sự dịch chuyển khối lượng 1-Da. Trong những trường hợp này, sự dịch
chuyển đã được hiệu chỉnh cho đỉnh đơn đồng vị trước khi áp dụng giới hạn độ chính xác khối
lượng tiền chất 10 ppm. Độ phong phú tương đối của các peptit đã xác định sau đó được tính
tốn bằng chương trình do phịng thí nghiệm phát triển (2) xác định tỷ lệ diện tích đỉnh sắc ký
(chromatographic peak areas) của các cặp peptit được đánh dấu đồng vị. Để định lượng thành
cơng, phải tìm được cặp peptit 14N15N đồng rửa giải với ít nhất một peptit được xác định bằng
cách sử dụng tiêu chí tìm kiếm cơ sở dữ liệu được chỉ định ở trên và sự chênh lệch khối lượng
giữa các peptit tương ứng với số lượng nguyên tử nitơ trong chuỗi peptit. Trong bước tiếp theo,
tỷ lệ phong phú tương đối của protein được tính bằng cách lấy trung bình tỷ lệ phong phú
peptide đã xác định. Điều quan trọng là, sự kết hợp của dung sai khối lượng tiền chất (±10
ppm), các giá trị Sequest Xcorr và sự hiện diện của một cặp đỉnh kết hợp đã cung cấp khả năng
nhận dạng protein có độ tin cậy cao.
Phân tích sắc tố tế bào.
Các phần màng tế bào và tế bào chất được phân tách theo cách tương tự như mô tả trước
đây (21). Các tế bào được tái tạo huyền phù trong dung dịch đệm Tris-HCl 50 mM (pH 8,0)
chứa DNase I (10 ug/ml) và được phá vỡ bằng cách cho chúng 2 lần đi qua máy ép tế bào áp


lực của Pháp (French pressure cell press: là một thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm sinh
học để phá vỡ màng sinh chất của tế bào bằng cách đưa chúng qua một van hẹp dưới áp suất
cao) ở 1,38x108 Pa. Các mảnh vụn của tế bào được tách ra bằng cách ly tâm ở 10.000 x g trong
20 phút ở 4°C. Dịch chiết tế bào được tách thành các phần màng tế bào và tế bào chất bằng
cách ly tâm ở 100.000 μg trong 60 phút ở 4°C. Dung dịch nổi phía trên được loại bỏ và màng
chứa pellet được rửa một lần bằng dung dịch đệm được mô tả ở trên và được nối lại trong cùng
một dung dịch đệm. Nhuộm heme của các protein được phân tách bằng SDS-PAGE được thực
hiện bằng cách sử dụng o-dianisidine (Sigma) như đã mô tả trước đây (35). Band 55-kDa được
tiết lộ bằng cách nhuộm heme của phần màng từ các tế bào tăng trưởng acetate đã được cắt bỏ
và chịu sự tiêu hóa trong gel và chiết xuất peptide như mơ tả ở trên. Các peptide được phân
tích bằng LC/hydrid linear ion trap-FTICR MS. Reduced-minus-oxidized-difference của các

phân đoạn màng thu được ở nhiệt độ phịng như đã mơ tả trước đây (22) bằng cách sử dụng
máy đo quang phổ Beckman DU-7400. Các mẫu được oxy hóa trong khơng khí và sau đó khử
bằng một vài hạt dithionite.
RT-PCR.
Phiên mã ngược (RT)-PCR đã được thực hiện như mơ tả trước đó (24), với các sửa
đổi. RNA tổng số được phân lập từ các tế bào M. acetivorans tăng trưởng bằng axetat hoặc
metanol bằng cách sử dụng bộ RNeasy Total RNA Mini (QIAGEN). RNA tinh khiết được xử
lý hai lần bằng DNase I không chứa RNase (QIAGEN) và một lần bằng RQ1 DNase (Promega)
để loại bỏ DNA gây ô nhiễm. RT-PCR được thực hiện với bộ Access RT-PCR (Promega) sử
dụng 50 đến 100 ng RNA tổng số đã tinh chế (trình tự mồi và cặp mồi được sử dụng lần lượt
được liệt kê trong Bảng S1 và S2 trong tài liệu bổ sung). PCR đối chứng được thực hiện mà
không cần bổ sung RT với bốn bộ mồi khác nhau để xác nhận việc loại bỏ hoàn toàn DNA.


Kết quả và thảo luận
Xác định protein
Các phân tích gel/MS 2-D trước đó của M. acetivorans phân lập ở biển đã xác định
được tổng cộng 412 gen sản phẩm. Việc xác định cường độ điểm được chỉ định rằng có 34 sản
phẩm gen khác nhau giữa các tế bào phát triển bằng axetat và metanol. Để có được một phân
tích định tính và định lượng sâu hơn, chúng tơi sử dụng cột ion tuyến tính LC/lai-FTICR MS
để phân tích tế bào phát triển bằng axetat và metanol được dán nhãn chuyển hóa bằng 14N và
15

N tương ứng. Tổng cộng có 1.081 protein được phát hiện (dữ liệu chưa được công bố), chiếm

21% trong số 4.524 gen được báo cáo trong bộ gen. Trong số 1.081 protein được phát hiện,
246 đã được tìm thấy có sự khác biệt gấp 3 lần giữa tế bào phát triển bằng axetat và metanol
được xác định bằng hai hoặc nhiều cặp peptit hơn. 246 protein này được coi là có thể đóng vai
trị cụ thể đối với sự tăng trưởng hoặc hình thành khí mê-tan từ metanol hoặc axetat. Lịch sử
phiên mã gần đây của chủng phân lập nước ngọt M. mazei đã phát hiện 3.371 gen được biểu

hiện, 240 trong số đó cho thấy sự biểu hiện khác biệt gấp 2,5 lần giữa tế bào phát triển bằng
axetat và metanol.
Trong số 246 protein khác nhau được xác định cho M. acetivorans, 60 được mã hóa bởi
các gen tương đồng ≥2,5 lần được biểu hiện chuyên biệt ở M. mazei. Trong số 60 protein này
từ M. acetivorans, các mơ hình phong phú khác nhau cho 57 protein phù hợp với hồ sơ phiên
mã của M. mazei. Hơn nữa, các phương pháp được báo cáo ở đây cho M. acetivorans đã xác
định được 20 loại protein đa dạng khác nhau trước đây được xác định bởi gel/MS 2-D so với
các mẫu phân tích của tất cả 20 protein đều phù hợp với kết quả gel/MS 2-D. Những kết quả
này là một bằng chứng xác nhận mạnh mẽ các phương pháp thử nghiệm được sử dụng trong
nghiên cứu này. Ở đây, chúng tôi tập trung vào các protein chọn lọc có tính đa dạng khác biệt
cao đã xác định được hai phức hợp enzyme được đề xuất liên quan đến chức năng vận chuyển
điện tử ở M. acetivorans phát triển bằng axetat.
Con đường chuyển đổi acetate thành metan trong M.acetivorans.


Lịch sử phiên mã của các tế bào M. mazei phát triển bằng acetate so sánh với methanol
cho thấy con đường chuyển đổi acetate thành metan tương tự như trước đây được xác định đối
với các loài Methanosarcina nước ngọt khác. Tuy nhiên, M. acetivorans được phân lập từ trầm
tích biển trong đó nó có chức năng chuyển đổi acetate thành metan trong q trình phân hủy
kỵ khí của tảo bẹ khổng lồ. Do đó, so sánh bản sao của các chủng phân lập nước ngọt M. Mazei
với protein của M. acetivorans có giá trị để xác định các enzyme lõi thiết yếu trong đường dẫn
acetate và cách đánh giá tính linh hoạt trao đổi chất để đáp ứng với môi trường. Phương pháp
thử nghiệm tiên tiến được sử dụng trong nghiên cứu này đã xác định một số protein khơng
được xác định trong phân tích gel/MS 2-D trước đó, dẫn đến sự hiểu biết chi tiết hơn về con
đường như trong Hình 1. Con đường tổng thể có thể được chia thành hai phần. Phần đầu tiên
liên quan đến việc chuyển đổi nhóm methyl của acetate thành metan, được gọi là phản ứng của
một carbon được xúc tác bởi các enzyme thể hiện màu xanh trong hình 1.

Hình 1. Con đường được đề xuất để chuyển đổi acetate thành metan bởi M. acetivorans.
ACK, acetate kinase; PTA, phosphotransacetylase; COA-SH, Coenzyme A; Thmpt,

tetrahydromethanopterin; FDR, giảm ferredoxin; FDO, oxy hóa ferredoxin; CDH, CO
dehydrogenase/acetyl CoA synthase; Com-sh, coenzyme m; MTR, methyl-THMPT: comSHYLTransferase; COB-SH, Coenzyme B; Cam, anhydrase carbonic; MA-RNF, M.


Acetivorans RNF; MP, methanophenazine; HDR-DE, heterodisulfide reductase; MRP, nhiều
sức cản/pH điều chỉnh Na+ /H+ đối vận (antiporter); ATP, H -Transporting ATP synthase. Phản
ứng chuyển carbon được xúc tác bởi các enzyme thể hiện màu xanh lam (xem văn bản). Phản
ứng truyền electron được xúc tác bởi các enzyme thể hiện màu xanh lá cây.
(i) Các phản ứng một carbon dẫn đến metan.
Các kết quả thể hiện trong Bảng 1 phù hợp với vai trò được đề xuất trước đây đối với
acetate kinase, phosphotransacetylase, CO dehydrogenase/acetyl coenzyme A (COA), methyltetrahydromethanopterin (THMPT) bởi các phân tích gel 2-D/MS. Tuy nhiên, các phương pháp
tiên tiến được sử dụng trong nghiên cứu này tiếp tục cho thấy anhydrase carbonic (CAM;
MA2536) có nhiều hơn trong các tế bào M. acetivorans phát triển trong môi trường acetate,
tương ứng với sự tăng điều hòa của gen mã hóa enzyme trong M. Mazei. Sự tham gia của
enzyme này trong việc chuyển đổi acetate thành metan lần đầu tiên được báo cáo cho
Methanosarcina thermophila và trước đây được đề xuất để tạo điều kiện cho việc loại bỏ CO2
khỏi tế bào bằng cách chuyển đổi nó thành bicarbonate bên ngồi tế bào (Hình 1).
Bảng 1. Sự đa dạng của các protein đóng vai trị trong con đường chuyển hóa Acetate thành
Methane trong M. acetivorans.


Tất cả các enzyme được đề xuất để xúc tác chuyển đổi nhóm methyl của actetate thành
metan bởi M. acetivorans (Hình 1) đã được xác định ở các lồi Methanosarcina nước ngọt
khác và gần đây bằng cách phân lập M. Mazei nước ngọt. Do đó, các enzyme và phản ứng này
có thể được coi là cốt lõi đối với con đường chuyển đổi acetate thành metan bởi các loài
Methanosarcina trong môi trương nước ngọt và ở biển. Tuy nhiên, các kết quả được trình bày
trong phần tiếp theo cho thấy sự khác biệt đáng kể trong các phản ứng vận chuyển điện tử trong
con đường acetate của M. acetivorans so với các loài Methanosarcina nước ngọt khác.
(ii) Vận chuyển điện tử và bảo toàn năng lượng. Sự phong phú của Cdh trong các tế
bào phát triển trong axetat so với trong các tế bào phát triển trong metanol đã được báo cáo

trước đó (25, 26) và được xác nhận ở đây cho thấy rằng bước vận chuyển điện tử đầu tiên được
đề xuất cho M. acetivorans cũng giống như bước đối với M. mazei và các loài Methanosarcina
nước ngọt khác, trong đó Cdh oxy hóa nhóm carbonyl của acetyl-CoA và cho điện tử cho
ferredoxin (40, 41). Tuy nhiên, như được nêu chi tiết bên dưới trong các phần tiếp theo, sự vận
chuyển điện tử từ ferredoxin đã khử sang CoM-S-S-CoB được đề xuất ở đây cho M. acetivorans
(Hình 1) về cơ bản khác với sự vận chuyển của các loài nước ngọt. Ở các loài nước ngọt,
ferredoxin khử được đề xuất để tặng điện tử cho Ech hydrogenase gắn màng tạo ra H2 và bơm
proton ra ngoài màng (15, 28, 29). H2 bị oxy hóa bởi một hydrogenase khác tặng điện tử cho
methanophenazine trong màng. Cuối cùng, methanophenazine đã khử sẽ tặng các electron cho
heterodisulfide reductase làm giảm CoM-S-S-CoB, kèm theo sự đẩy ra của các proton. Tuy
nhiên, bộ gen của M. acetivorans khơng chứa gen mã hóa Ech hydrogenase chức năng (11, 18),
cho thấy các thành phần vận chuyển điện tử thay thế liên quan đến việc chuyển điện tử sang
CoM-S-S-CoB.
Các phân tích gel/MS 2-D trước đây chỉ ra rằng sản phẩm của MA0659 có trong các tế
bào M. acetivorans được nuôi cấy bằng axetat; tuy nhiên, mức độ phong phú so với các tế bào
phát triển bằng metanol không được xác định, điều này ngăn cản việc đề xuất vai trò của sản
phẩm này trong việc chuyển đổi một trong hai cơ chất thành metan (25). Tuy nhiên, người ta
đưa ra giả thuyết rằng MA0659 mã hóa một trong sáu tiểu đơn vị của phức hợp được mã hóa
bởi cụm gen MA0659- 0664 với khả năng thay thế chức năng bơm ion của Ech hydrogenase.
Ở đây, chúng tôi chỉ ra rằng các sản phẩm của MA0659, MA0661 và MA0664 có nhiều hơn
gấp nhiều lần trong các tế bào phát triển trong axetat so với các tế bào M. acetivorans phát triển
trong metanol (Bảng 1), hỗ trợ vai trò trong con đường axetat. Hơn nữa, phân tích RT-PCR
cho thấy MA0658 và MA0665 được đồng phiên mã với MA0659-664 (Hình 2). Cuối cùng,
việc xóa các gen đồng phiên mã tạo ra một đột biến của M. acetivorans không thể phát triển


trong axetat (P. C. W. Metcalf, Đại học Illinois). Những kết quả này cho thấy một cách mạnh
mẽ rằng MA0658-0665 mã hóa phức hợp tám tiểu đơn vị hoạt động trong quá trình phát triển
của M. acetivorans trong axetat. Đáng chú ý, bộ gen của M. mazei không chứa các gen tương
đồng với MA0658-0665 (18), hỗ trợ thêm cho vai trị của phức hợp đặc trưng cho M.

acetivorans.

Hình 2. Lập bản đồ phiên mã cụm gen M. acetivorans bằng RT-PCR. (A)
MA4566-MA4572. (B) MA0658-MA0665. Mũi tên đại diện gen và hướng phiên mã. Các
sản phẩm RT-PCR dự đoán được thể hiện bằng các dòng bên dưới gen và được dán nhãn
bằng các chữ cái. Dự đốn kích thước sản phẩm RT-PCR được hiển thị trong ngoặc đơn.
Các chữ cái phía trên các làn gel tương ứng với các sản phẩm RT-PCR dự đoán. RT-PCR
được thực hiện với tổng số RNA từ các tế bào M. acetivorans được nuôi cấy bằng axetat.
Mặc dù MA0659-0664 được chú thích là mã hóa cho các tiểu đơn vị của sodium
translocating NADH:ubiquinone oxyoreductase (Nqr), nhưng việc tìm kiếm cơ sở dữ liệu cho
thấy rằng các trình tự axit amin có sự tương đồng lớn hơn với các tiểu đơn vị của phức hợp Rnf
(cố định đạm Rhodobacter) có liên quan, và bản sắc lớn nhất là với cụm gen rnf được chú thích
cho Clostridium tetani (Hình 3). Phức hợp Rnf lần đầu tiên được mô tả trong Rhodobacter
capsulatus (34), nơi nó được đề xuất để mã hóa phức hợp liên kết màng sáu tiểu đơn vị (20)
(RnfABCDGE) oxy hóa NADH và khử một ferredoxin sau đó tặng điện tử cho nitrogenase


(23, 34) . Q trình đó được giả thuyết rằng sự vận chuyển điện tử ngược không thuận lợi về
mặt nhiệt động được thúc đẩy bởi một gradient điện hóa (27, 33). Trước đây quá trình này đã
được đề xuất (23) rằng phức hợp Rnf là một họ liên kết năng lượng mới cũng có thể hoạt động
để tạo ra một gradient điện hóa để tổng hợp ATP, phù hợp với chức năng được đề xuất ở M.
acetivorans. Ví dụ, trước đây người ta đã đề xuất rằng phức hợp Rnf của C. tetani, được mã
hóa bởi cụm gen như trong Hình 3, oxy hóa ferredoxin và làm giảm NAD kết hợp với q trình
loại natri ra bên ngồi màng tế bào (5).

Hình 3. Tổ chức gen và so sánh trình tự các
gen của M. acetivorans với các gen rnf và
mrp từ miền Bacteria. (A) So sánh đơn vị
phiên mã M. acetivorans MA0658-0665 với
cụm C. tetani rnfCDGEAB (5). (B) So sánh

đơn vị phiên mã M. acetivorans MA45664572 với operon B. subtilis mrpABCDEFG
(19). Các số trong ngoặc đơn là phần trăm
danh tính giữa các protein được mã hóa bởi
các gen như được chỉ định bởi các mũi tên.

Hình 4. Cấu trúc liên kết và chức năng được
dự đoán cho MA0658-0665 sản phẩm gen
của M. acetivorans. Fdr, giảm ferredoxin;
Fdo bị oxy hóa ferredoxin; Cyt c, sắc tố c;
MP, methanophenazin.

Các tiểu đơn vị của phức hợp Rnf từ R. capsulatus (Rc-Rnf) đã được phân tích đặc
trưng trước đó (20, 23), dự đốn chức năng cho các tiểu đơn vị của phức hợp M. acetivorans
Rnf (Ma-Rnf) được mã hóa bởi MA0658-0665 (Hình 4). Các sản phẩm của MA0660/
MA0662/MA0663 chia sẻ trình tự nhận dạng và bảo tồn của các phân đoạn kỵ nước (không
hiển thị) với RnfD/RnfE/RnfA được đề xuất trước đây bao gồm kênh ion của phức hợp RcRnf. Do đó, các sản phẩm của MA0660/MA0662/MA0663 được giả thuyết là nằm trong một
phức hợp con gắn màng có chức năng như một kênh ion để chuyển vị trí của proton hoặc natri
bên ngồi màng (Hình 4), tạo ra một gradient ion điều khiển quá trình tổng hợp ATP (Hình 1).
Trình tự axit amin của MA0664/MA0659/MA0661 tương đồng với RnfB/RnfC/RnfG (Hình


5), mà trước đây đã được đề xuất nằm trong một phức hợp con chuyển điện tử trong R.
capsulatus, đề xuất một chức năng tương tự cho các sản phẩm của MA0664/
MA0659/MA0661.

Hình 5. So sánh trình tự axit amin suy ra từ MA0658-0665 với trình tự của tiểu đơn vị Rnf từ
Rhodobacter capsulatus (21). Dư lượng giống hệt nhau được chỉ định dấu hoa thị. Các họa tiết
Cysteine tương phản ngược lại trong bảng A và B. Threonine được quy định là cộng hóa trị liên kết
FMN được biểu thị bằng mũi tên bên dưới trình tự trong bảng C. Các số bên phải biểu thị vị trí axit
amin. Trình tự bị cắt ngắn được chỉ định bởi . Trình tự đã được căn chỉnh với ClustalW.



Trình tự axit amin của MA0664 giống với trình tự của RnfB (Hình 5A), trước đây được
chứng minh là có chứa ít nhất một cụm [2Fe-2S] và được cho là tương tác với ferredoxin. Do
đó, sản phẩm MA0664 được giả thuyết là tương tác với ferredoxin (Hình 4). Đề xuất này được
hỗ trợ bởi trình tự axit amin MA0664, chứa bốn motif cysteine có khả năng nối bốn cụm [4Fe4S], ba trong số đó được bảo tồn giống với RnfB (Hình 5A). Những kết quả này phù hợp với
vai trị của sản phẩm MA0664 là tạo thành một “dây” dẫn điện tử lưu huỳnh sắt có nguồn gốc
từ các cụm ferredoxin sắt-lưu huỳnh. Sản phẩm của MA0659 có sự đồng nhất với RnfC (Hình
5B), trước đây được đề xuất là có chức năng oxy hóa NADH và chứa hai cụm [4Fe-4S] cùng
với flavin mononucleotide (FMN), mặc dù trình tự axit amin của MA0659 khơng có sự đồng
thuận của motif gắn với FMN. Trình tự axit amin của MA0659 cũng có hai motif cysteine phù
hợp với sự gắn của hai cụm [4Fe-4S] (Hình 5B). Do đó, sản phẩm của MA0659 được cho là sẽ
mở rộng quá trình chuyển điện tử trung gian “dây” sắt-lưu huỳnh giữa ferredoxin và MA0661
(Hình 4). Sản phẩm của MA0661 chia sẻ đặc điểm nhận dạng với tiểu đơn vị RnfG (Hình 5C),
mở rộng thành một motif (ETPGLGX37-43GAT) cũng được bảo tồn với tiểu đơn vị NqrC của
lồi Vibrio (23) trong đó threonine đầu C của motif liên kết cộng hóa trị FMN (3, 14, 30). Do
đó, sản phẩm của MA0661 được giả thuyết là có chứa FMN, nhận electron từ sản phẩm của
MA0659 (Hình 4).
Mặc dù MA0658 (18) được dự đoán là một protein, nhưng kiểm tra kỹ hơn sẽ chỉ ra
năm motif CXXCH và một motif CXXXCH phù hợp với một cytochrome đa sắc tố loại c mà
có liên kết cộng hóa trị các heme với phối tử trục histidine. Kết quả SDS-PAGE dung dịch ly
giải toàn tế bào đã xác định được hai dải protein trong các tế bào phát triển bằng axetat và
metanol nhuộm màu dương tính với heme, một dải xấp xỉ 25 kDa và dải cịn lại 55 kDa (Hình
6A). Sản phẩm của MA0658 có khối lượng phân tử được tính tốn là 55 kDa và protein 55kDa nhuộm heme có nhiều trong các tế bào tăng trưởng axetat hơn trong các tế bào tăng trưởng
metanol, phù hợp với sự phong phú hơn của các sản phẩm khác được mã hóa bởi MA06580665 cụm gen đồng phiên mã. Những kết quả này chỉ ra rằng protein 55-kDa nhuộm heme
được mã hóa bởi MA0658 và chứa heme liên kết cộng hóa trị được dự đốn từ trình tự axit
amin. SDS-PAGE và nhuộm heme của các phần tế bào chất và màng tế bào phát triển axetat
(Hình 6B) chỉ ra rằng sản phẩm của MA0658 có liên quan đến màng. Phân tích LC/bẫy ion
tuyến tính lai-FTICR MS của dải protein 55-kDa đã xác định được hai peptit
(Y121GLYDFDAR129 và S481IAVTYDKPRPVEVET EPAL500) dành riêng cho sản phẩm

MA0658. Hơn nữa, phổ sai biệt giảm-trừ-oxy hóa cho thấy mức độ phổ biến của cytochrom
loại c552 trong phần màng của các tế bào phát triển axetat (Hình 6C). Những kết quả này chỉ


ra rằng sản phẩm của MA0658 là một cytochrom c gắn màng. Do đó, người ta đưa ra giả thuyết
rằng cytochrom c làm trung gian chuyển điện tử từ sản phẩm của MA0661 sang
methanophenazine (Hình 4) trong quá trình tăng trưởng với axetat.

Hình 6. Phân tích các cytochrom loại c ở M. acetivorans. (A) Các protein được phân
tách bằng SDS-PAGE và nhuộm heme từ các dung dịch ly giải toàn tế bào (35 µg) tế
bào tăng trưởng axetat (AC) và tăng trưởng metanol (ME). (B) Các protein được nhuộm
heme và phân tách bằng SDS-PAGE (18 µg) từ phân số tế bào chất (AC-CF) và màng
(AC-MF) của các tế bào phát triển axetat. (C) Phổ chênh lệch khử-trừ-oxy hóa của phân
số màng của các tế bào phát triển bằng axetat và metanol. Mỗi hỗn dịch mem brane
chứa 2 mg/ml protein. Mũi tên chỉ các khối lượng phân tử gần đúng của mỗi dải được
xác định sau khi nhuộm với Coomassie brilliant blue R.
Trình tự axit amin của MA0665 khơng liên quan đến bất kỳ loại protein nào có chức
năng đã biết (18). Tuy nhiên, sản phẩm của MA0665 thuộc về một họ (UPF0132) gồm các
protein nhỏ tích hợp màng được xác định trong tất cả các Archaea sinh khí mê-tan mà bộ gen
đã được giải trình tự (18). Do đó, mặc dù khơng thể dự đốn chức năng, nhưng sản phẩm của
MA0665 được cho là có liên kết với màng (Hình 4).
Như đã thảo luận ở trên, các kết quả được trình bày ở đây chỉ ra rằng bước cuối cùng
trong quá trình vận chuyển điện tử đối với M. acetivorans phát triển bằng axetat là quá trình


khử heterodisulfide CoM-S-SCoB (Hình 1). Các sản phẩm của MA0687 và MA0688, được
chú thích để mã hóa hai tiểu đơn vị heterodisulfide reductase (HdrDE type) (18), được tìm thấy
trong các tế bào phát triển axetat (Bảng 1), cho thấy sự tổng hợp của enzyme. Hơn nữa, các
phân tích RT-PCR (Hình 2) cho thấy quá trình đồng phiên mã của MA0687-0688 trong các tế
bào phát triển bằng axetat. HdrDE type có chức năng làm giảm CoM-S-S-CoB trong quá trình

chuyển đổi metanol thành metan ở tất cả các loài Methanosarcina đã được nghiên cứu trước
đây (6). Do đó, giả sử rằng HdrDE type cũng có chức năng trong con đường metanol đối với
M. acetivorans, thì mức độ phong phú tương đối được tìm thấy trong các tế bào tăng trưởng
axetat so với loại được tìm thấy trong các tế bào tăng trưởng metanol (Bảng 1) cho thấy rằng
HdrDE type là yếu tố đóng góp chính cho hoạt tính của heterodisulfide reductase trong các tế
bào phát triển axetat. HdrDE type đã được đặc trưng từ M. thermophila nuôi cấy trong axetat
(37) và Methanosarcina barkeri (16). Ở những loài nước ngọt này, HdrDE type được liên kết
với một hydrogenase (Vho) được đề xuất là oxy hóa H2 và khử methanophenazine, chất này
tặng điện tử cho HdrDE. Tuy nhiên, trong trường hợp khơng có Ech hydrogenase ở M.
acetivorans, người ta đưa ra giả thuyết rằng methanophenazine làm trung gian chuyển điện tử
trực tiếp từ phức hợp Ma-Rnf sang HdrDE mà khơng có sự tham gia của H2 và hydrogenase
(Hình 1).
Sơ đồ vận chuyển điện tử được đề xuất trong quá trình chuyển đổi axetat thành mêtan
bởi M. acetivorans (Hình 1 và 4) phù hợp với việc khơng có Ech hydrogenase có chức năng
được mã hóa trong bộ gen (18) và với các đặc điểm sinh hóa trước đây cho thấy H2 là khơng
phải là vật trung gian cho loài này (31). Hơn nữa, một phân tích di truyền gần đây đã kết luận
rằng M. acetivorans sử dụng sơ đồ vận chuyển điện tử bảo tồn năng lượng chưa biết về cơ bản
khác với sơ đồ của các lồi Methanosarcina nước ngọt ở chỗ nó khơng liên quan đến H2 (13).
Sự không liên quan của H2 với tư cách là chất mang điện tử bắt buộc tương thích với mơi
trường biển mà từ đó M. acetivorans được phân lập (38). Trong mơi trường biển, các lồi khử
sunfat lấn át các lồi sinh khí mê-tan về H2 (44). Trừ khi H2 đã tiến hóa được dẫn truyền bên
trong theo một cơ chế chưa biết, một lượng đáng kể có thể bị mất đi đối với các lồi khử sunfat.
Do đó, M. acetivorans có thể đã phát triển một sơ đồ vận chuyển điện tử không liên quan đến
H2, trái ngược với các loài nước ngọt. Người ta cũng muốn giả định rằng phức hợp Ma-Rnf
bơm natri để tạo ra một gradient natri trực tiếp hoặc gián tiếp thúc đẩy quá trình tổng hợp ATP,
phù hợp với sự giống nhau của Ma-Rnf với phức hợp Nqr bơm natri của các loài sinh vật biển
(4, 43). Thật vậy, vai trò bơm natri trước đây đã được đề xuất (5) cho phức hợp Rnf tương đồng
của C. tetani (Hình 3).



Bộ gen của M. acetivorans được chú thích bằng cụm bảy gen (MA4566-72) mã hóa cho
phức hợp Mrp (điều hịa đa kháng/pH) mà các sản phẩm của hai gen (MA4567 và MA4568)
có nhiều hơn đáng kể trong các tế bào phát triển bằng axetat , cho thấy vai trò của phức hợp
Mrp này trong quá trình tăng trưởng với axetat. Phân tích RT-PCR cho thấy sự biểu hiện của
gen MA4566-72 trong một đơn vị phiên mã (Hình 2). Sự tương đồng của các gen mã hóa phức
hợp Mrp được tìm thấy ở nhiều loài khác nhau từ domain Bacteria, bao gồm cả Bacillus subtilis
(Hình 3B). Đây là bằng chứng đầu tiên được báo cáo về sự tổng hợp phức hợp Mrp trong
domain Archaea. Một chức năng của Mrp trong B. subtilis là chức năng của một chất phản
chuyển natri/proton thứ cấp (19); do đó, một chức năng khả thi đối với Mrp của M. acetivorans
là chuyển đổi gradient natri thành gradient proton thúc đẩy quá trình tổng hợp ATP bằng enzym
tổng hợp ATP synthase loại A1A0 chuyển vị proton (Hình 1) có nhiều trong các tế bào phát
triển bằng acetate (Bảng 1) ). Trước đây người ta đã lưu ý (19) rằng các tiểu đơn vị của phức
hợp Mrp từ domain Bacteria có tính đồng nhất cao với một số tiểu đơn vị NADH
dehydrogenase chuyển vị proton và hệ thống hydrolyase hình thành từ Escherichia coli, và
người ta đưa ra giả thuyết rằng phức hợp Mrp có thể hoạt động như một phức hợp loại ion sơ
cấp được cung cấp năng lượng bởi sự vận chuyển điện tử. Bộ gen của M. mazei khơng được
chú thích để mã hóa phức hợp Mrp (18), phù hợp với vai trò của phức hợp cụ thể đối với M.
acetivorans và môi trường biển. Rõ ràng, các kết quả được trình bày ở đây mời điều tra các
chức năng tiềm năng này.
Kết luận. So sánh tồn cầu đầu tiên về điều hịa biểu hiện gene và q trình tổng hợp
protein giữa các lồi methanoarchaeal đã đứa ra gợi ý về những khác biệt lớn trong con đường
chuyển đổi axetat thành mêtan giữa các loài nước ngọt và sinh vật biển. Kết quả cho thấy sự
thích nghi của M. acetivorans với mơi trường biển sử dụng hai phức hợp protein đa tiểu đơn
vị, cũng được tìm thấy trong domain Bacteria, để vận chuyển điện tử và bảo tồn năng lượng.