Bài tiểu luận: Lập thư
viện cADN
Nhóm sinh viên thưc hiên:
1. Trần Thị Vân Anh 6. Trần Trung Hiếu
2. Trần Xuân Bách 7. Nguyễn Quang Huy
3. Trương Thị Hải 8. Cấn Thị Khánh
Huyền
4. Hà Minh Hiền 9. Hoàng Thị Thu
Hường
5. Phùng Thị Thu Hiền 10. Hoàng Thị Yến
Khái quát chung

Ngày nay trái đất đối mặt với biến đổi khí hậu. Thay
đổi khí hậu sẽ làm thay đổi mức độ thiệt hại của khô
hạn, ngập úng, ngập mặn, nhiệt độ cao, tác hại của sâu
bệnh. Chiến lược phát triển chung của ngành nông
nghiệp thế giới là sẽ tập trung vào những nội dung sau:
làm cho cây trồng thích ứng với biến đổi khi hậu; cải
tiến năng suất vượt trội; tạo nền tảng đa dạng di
truyền

Để làm được những điều ấy người ta phải thực hiện
nghiên cứu trình tự genom, cải tiến phương pháp đánh
giá kiểu hình, áp dụng các kĩ thuật di truyền và đặc biệt
là xây dựng thư viện cDNA

Trong nội dung của Hội nghị quốc tế lần thứ 6 ở
ĐBSCL đã chỉ rõ: nước nào xem nhẹ công tác ngân
hàng gen nước đó sẽ phải đối mặt với rất rất nhiều khó
khăn trong công tác chọn giống trong tương lai


Thư viện cDNA giúp chúng ta có được các dòng cDNA mã hóa liên
tục của một gen, tìm ra chúng một cách dễ dàng.

Nhận thấy tầm quan trọng của đề tài chúng tôi xin trình bày những
hiểu biết của mình về Thư viện cDNA
Tổng quan đề tài
I, Thư viện cDNA là gì?

1, Khái niệm

2, Các bước tổng hợp cDNA

3, Các bước lập thư viện cDNA

4, Ưu điểm của việc lập thư viện cDNA
II, Thành tựu
I. Thư viện cDNA (c-DNA
library) là gì?

1. Khái niệm

cDNA (complementary DNA) có nghĩa là ADN bổ trợ.

ADN bổ trợ chính là ADN đựơc tổng hợp từ ARN thông
tin( messenger RNA hay m- RNA) duới sự xúc tác của
enzim phiên mã nguợc (reverse transcriptase).

Thư viện cADN chính là tập hợp lưu trữ các ADN bổ trợ
được tổng hợp từ các ARN thông tin.


Là tập hợp các bản sao cDNA từ tất cả các mARN của một
tế bào. Không giống với thư viện bộ gen thư viện cDNA
được thiết lập từ một tế bào xác định. Trong đó gen cần
nghiên cứu phải biểu hiện thành mARN

Thường nguời ta thiết lập thư viện cADN trên vectơ thực
khuẩn thể lambda( vectơ chèn) trong truờng hợp cần lập
thư viện cADN tổng thể, hay vectơ plasmid trong truờng
hợp cần lập thư viện cADN hạn chế.

Thư viện cADN thường được lập cho eukaryote
1.Các buớc chính để tổng hợp
cDNA
1. Tổng hợp sợi thứ nhất bằng enzyme reverse
transcriptase ( enzim phiên mã nguợc).
2. Biến tính và cắt RNA trong thể lai mRNA-cDNA
tuần tự bằng nhiệt và enzyme RNase H của E. coli.
Thay thế khuôn mẫu là chuỗi RNA bằng chuỗi cDNA
thứ nhất và tổng hợp sợi cDNA thứ hai nhờ DNA
polymerase I của E. coli.
3. Cắt vòng cặp tóc của cDNA sợi đôi nhờ
nuclease S1 và sửa chữa hai đầu bằng đoạn
Klenow.
(1). Tổng hợp sợi cDNA thứ nhất

ARN thông tin của sinh vật bậc cao thuờng có đuôi (3’ end) là một
chuỗi các gốc A (poly-A). Như vậy mồi để tổng hợp sẽ là một chuỗi
các gốc T ( oligo-dT). Enzim xúc tác quá trình này là enzim phiên
mã nguợc (reverse transcriptase). Nguyên liệu: dNTP ( bao gồm
dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

. Có thể tóm tắt quá trình làm như sau:
Người ta tách riêng mARN nhờ các tổ hợp ologonucleotid chỉ
chứa deoxythimidin (Oligo dT). Người ta gắn các oligo (dT) trong
phiễu chiết. Sau đó chiết xuất toàn bộ ARN của tế bào gồm rARN,
tARN, mARN rồi cho hỗn hợp này chảy qua phễu có gắn xellulo-
oligo (dT)
Các mARN sẽ bị giữ lại trong phễu do hình thành liên kết bổ
sung A-T. Sau đó ta dùng dung dịch muối NaCl để đẩy tARN và
mARN ra khỏi phễu. Cuối cùng dung dịch đệm Tris EDATA cho
chảy qua phễu, các mARN sẽ được giải phóng do liên kết A-T bị
phân giải. Dùng mARN này làm khuôn với sự có mặt của enzyme
sao chép ngược cùng với các nguyên liệu , quá trình tổng hợp DNA
sẽ xảy ra, kết quả sẽ thu được cDNA.
(1). Tổng hợp sợi cDNA thứ nhất
Sau khi tổng hợp xong sợi 1 của ADN bổ trợ, lúc này sợi 1 của
ADN bổ trợ vẫn còn kết cặp với ARN thông tin bởi liên kết hydro
( hỗn hợp 2 sợi ARN và ADN này gọi là heteroduplex)
Nguời ta gây biến tính (đun sôi) thể lai mRNA-cDNA để cắt
RNA bằng RNase H của E. coli tại một số điểm ngẫu nhiên nào đó.
Xử lý enzim Rnase-H để làm đứt sợi
m-RNA trong cặp heteroduplex bao
gồm m-RNA + cADN sợi 1
(2). Tổng hợp sợi cADN thứ 2

Thông thường, đầu tận cùng 3’ của các cDNA sợi
đơn có khả năng tạo thành các cấu trúc vòng cặp tóc
(hairpin loop) và vì thế có thể được sử dụng để làm
mồi (primer) cho quá trình tổng hợp sợi cDNA thứ
hai bằng DNA polymerase I của E. coli hoặc reverse
transcriptase .


Đoạn Klenow của DNA polymerase I thiếu hoạt tính
exonuclease 5'-3' cũng được sử dụng thành công để
tổng hợp sợi cDNA thứ hai.
(3). Cắt vòng cặp tóc của cDNA sợi
đôi

Sau khi tổng hợp cDNA hoàn toàn, sợi thứ nhất và thứ hai
được liên kết cộng hóa trị bởi vòng cặp tóc và vòng cặp tóc
dễ bị cắt bởi nuclease S1. Sau đó, đoạn cDNA được sửa
chữa bằng enzyme Klenow,kết quả là hai đầu tận cùng là
đầu bằng.

Sợi đôi cDNA sau đó được tách thành các tiểu phần theo
kích thước và các phân tử lớn nhất được gắn vào các
plasmid của vi khuẩn. Hoặc là một tập hợp đầy đủ các kích
thước của cDNA sợi đôi được tạo dòng trong bacteriophage l
để xây dựng thư viện cDNA (cDNA library).

Tuy nhiên, việc đưa các đầu bằng vào vector sẽ gây khó
khăn trong việc lấy chúng ra khỏi vector một cách nguyên
vẹn sau này. Do đó các linker thường được nối vào hai đầu
của các cDNA nhờ DNA ligase. Linker là những đoạn
nucleotide ngắn có chứa vị trí nhận biết của một loại RE (ví
dụ: EcoRI) được tổng hợp nhân tạo tương ứng với vị trí nhận
biết RE (ví dụ: EcoRI) của vector. Sau đó, các cDNA mang
linker và vector sẽ được cắt bởi cùng một enzyme (ví dụ:
EcoRI). Nhờ đó các cDNA và vector đều có đầu sole tương
đồng (đầu dính) và cDNA sẽ dễ dàng gắn cũng như lấy ra

khỏi vector một cách nguyên vẹn.
3. Các bước lập thư viện cADN trong
bacteriophage l vector

1. Chọn lọc kích thước của cDNA

2. Gắn các cDNA với các nhánh của bacteriophage l

3. Phân tích các đoạn chèn cDNA

4. Tạo thư viện cDNA hoàn chỉnh

5. Khuếch đại thư viện cDNA
(1). Chọn lọc kích thước của cDNA

cDNA sau khi cắt hạn chế được phân đoạn bằng sắc ký cột
Sepharose để loại bỏ những linker thừa và các phân tử
cDNA có kích thước nhỏ hơn 500 bp. Cột sắc ký thường có
kích thước 27´0,3 cm thích hợp cho việc phân đoạn các
cDNA.
(2). Gắn các cDNA với các nhánh của
bacteriophage l

Thông thường cần phải tiến hành thử một loạt các phản
ứng gắn và phản ứng đóng gói. Trong các phản ứng này, một
lượng không đổi của các nhánh bacteriophage l được gắn
với các lượng khác nhau của cDNA, mục đích là để xác định
lượng cDNA tạo ra ít nhất là 5´ 10
6
bacteriophage tái tổ hợp.


Phản ứng gắn cần được thiết kế sao cho tối thiểu một
bacteriophage tái tổ hợp đơn sẽ chứa nhiều hơn một phân tử
cDNA bằng cách dùng tỷ lệ của các nhánh được phosphoryl
hóa và cDNA để chỉ 5% bacteriophage được tái tổ hợp. Nếu
sử dụng các nhánh dephosphoryl hóa, thì các bacteriophage
không tái tổ hợp bị ức chế hiệu quả, và vì thế không thể xác
định lượng cDNA cần thiết để tạo ra một quần thể
bacteriophage chứa 5% thể tái tổ hợp.
(3). Phân tích các đoạn chèn
cDNA
Thu thập khoảng mười hai plaque của bacteriophage tái tổ hợp
và chuẩn bị DNA để cắt bằng RE thích hợp.
Phân tích kích thước của các đoạn chèn cDNA bằng điện di
trên agarose gel 1%, dùng DNA marker có các đoạn từ 500 bp
tới 5 kb.
Nếu các bacteriophage tái tổ hợp chứa các đoạn chèn có kích
thước khác nhau và nếu kích thước trung bình của chúng xấp xỉ
1 kb hoặc lớn hơn, thì có thể tiến hành các bước tiếp theo (ví dụ:
tạo ra thư viện cDNA hoàn chỉnh).
Nếu kích thước trung bình của các đoạn chèn nhỏ hơn 1 kb
một cách rõ rệt, thì chất lượng của thư viện là không cao. Trong
trường hợp này cần quay lại phân tích chất lượng của mRNA
khởi đầu và các phản ứng tổng hợp cDNA.
(4). Tạo thư viện cDNA hoàn chỉnh

Nếu sử dụng các nhánh dephosphoryl hóa để xây dựng thư viện cDNA,
thì tính toán lượng cDNA cho kết quả tăng gấp 10 lần số lượng của các
plaque không tái tổ hợp. Nếu sử dụng các nhánh phosphoryl hóa, thì tính
toán lượng cDNA cho kết quả quần thể bacteriophage chứa xấp xỉ 5% các

thể tái tổ hợp.

Thiết kế một phản ứng gắn quy mô lớn, tăng số lượng của tất cả các thành
phần ở một tỷ lệ thích hợp.

Chắc chắn rằng thiết kế phản ứng gắn đối chứng chỉ chứa các nhánh của
bacteriophage l mà không chứa cDNA. Đóng gói tất cả các hỗn hợp gắn
bằng cách thiết kế một chuỗi các phản ứng gắn, mỗi phản ứng chứa 0,5
mg các nhánh của bacteriophage . Gộp các tiểu thể đóng gói và xác định
độ chuẩn của bacteriophage gốc trên các chủng vi khuẩn thích hợp.
(5). Khuếch đại thư viện cDNA

Vector lgt10.

Để thiết lập một sự cung cấp lâu dài của thư viện, thì
nó cần phải được khuếch đại bằng sự sinh trưởng trên
chủng E. coli thích hợp (chẳng hạn chủng BNN102)
trên đĩa agar. Nếu thư viện chỉ được sàng lọc một lần,
bước khuếch đại này có thể bỏ qua và các
bacteriophage có thể được dàn mỏng trực tiếp trên
chủng BNN102 ở một mật độ tối ưu để tiến hành sàng
lọc.

Vector lgt11 và các dẫn xuất của nó và lZAP, lZAPII. Các thư
viện cDNA được xây dựng trong các vector biểu hiện lgt11,
lgt18, lgt20 và lgt22 phải được khuếch đại trên chủng E. coli
Y1090hsdR (hoặc nếu là vector lZAP thì trên chủng BB4, vector
lZAPII thì trên chủng XL1-Blue). Các chủng này là không hoàn
hảo cho sự cắt hạn chế kiểm soát vật chủ nhưng lại mang một hệ
thống methyl hóa hoạt động. Các vị trí tiềm tàng cho phản ứng

cắt hạn chế bằng hệ thống EcoK sẽ được methyl hóa trong suốt
quá trình khuếch đại sao cho, nếu cần thiết, các thể tái tổ hợp có
thể được dùng để gây nhiễm chủng E. coli khả biến-cắt hạn chế.
Trong suốt quá trình khuếch đại, điều quan trọng là ức chế sản
xuất các protein độc tố tiềm tàng bới các bacteriophage tái tổ
hợp.
4. Ưu điểm

Các dòng cDNA chứa trình tự mã hóa liên tục của một gen.

Nhiều gen ở eukaryote là gián đoạn, có chứa nhiều đoạn
intron. Sau khi cắt tiền thân mRNA (pre-mRNA) và nối lại, các
đoạn intron đã bị loại và mRNA hoàn thiện (mature mRNA) có
trình tự mã hóa liên tục được tạo thành. Do cDNA được phiên
mã ngược từ khuôn mẫu mRNA hoàn thiện nên các dòng cDNA
có thể tổng hợp protein cần thiết với số lượng lớn như mong
muốn.

Nhiều protein được tổng hợp với số lượng lớn bởi những tế bào
chuyên hóa và như vậy trong các tế bào này mRNA của protein
đó sẽ có tỷ lệ cao và thư viện cDNA được tạo ra từ các tế bào
này sẽ có nhiều cDNA mã hóa cho các protein tương ứng. Sự
dồi dào cDNA của một vài loại mRNA nào đó làm giảm nhẹ
đáng kể việc xác định đúng dòng mong muốn từ thư viện gen.