Page 1
ĐẠI HỌC HUẾ
ĐẠI HỌC KHOA HỌC HUẾ
KHOA SINH HỌC

BÀI TIỂU LUẬN
TÌM HIỂU KHẢNĂNG CHUYỂN NẠP GEN CỦA
HAI GIỐNG BÔNG VẢI COKER312 VÀ VN36P
BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI KHUẨN
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS
Giảng viên hướng dẫn : PGS. TS. Nguyễn Hoàng Lộc
Sinh viên thực hiện : Giáp Thanh Thản
Lớp : Công Nghệ Sinh Học K33
Huế,1-2013
Page 2
I.MỞ ĐẦU……………………………………………………………… …4
II.TỔNG QUAN TÀI LIỆU……………………………………………… 5
2.1. Sơ lược về cây bông vải………………………………………………….5
2.1.1. Vị trí phân loại…………………………………………………………5
2.1.2. Tính đa dạng………………………………………………………… 5
2.2. Chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens……………… 6
2.2.1. Đặc điểm vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens………………… ….6
2.2.2. Ti-plamid…………………………………………………………… 7
III PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………….………………………….14
3.1.Chuẩn bị vật liệu nuôi cấy………………………………………………14
3.2. Quy trình chuyển nạp gen…………………………………………… 14
3.2.1. Nguồn plasmid……………………………………………………….14
3.2.2. Chuẩn bị vi khuẩn…………………………………………………….15
3.2.3. Lây nhiễm…………………………………………………………….15
3.2.4. Thanh lọc…………………………………………………………… 16
3.3. Các chỉ tiêu theo dõi……………………………………………………17

IV.KẾT LUẬN…………………………………………………………… 17
V.TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………… 18
Page 3
BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT
AMP: Adenosine 5’- monophosphate
ATP: Adenosine 5’- triphosphate
AS: Acetosyringone
Bp: base pair
ctv: cộng tác viên
cs: cộng sự
DNA: Deoxyribonucleotic acid
GUS: enzyme β-glucuronidase
kb: kilobase
lacZ: gen β-galactosidase
LB: Left border
Mb: megabase
MSCo: MS co-culture medium
Ori: origin of replication
PMI: Enzyme Phosphomannose isomerase
Pmi: gen pmi
plasmid Ti: tumour inducing plasmid
RB: Right border
T-DNA: transferred DNA
Vir: gen vir
Vir: virulence
2,4-D: 2,4-dichlorophenoxy acetic acid
v/v: volume/volume
w/v: weight/volume
Page 4
I.MỞ ĐẦU

Cho đến nay hơn 150 loài thực vật khác nhau, trong đó có rất nhiều
loài cây trồng, đã được chuyển gen thành công. Để tạo ra cây biến
đổi gen trong những năm qua một loạt các phương pháp khác nhau
đã được thực hiện. Trong đó, ba phương pháp sau đây được sử
dụng phổ biến:
 Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
 Chuyển gen bằng phương pháp phi sinh học
 Chuyển gen bằng tế bào trần
Từ lâu người ta đã quan tâm nhiều đến việc cải thiện đặc tính di
truyền của các loài cây bông vải. Mặc dù có nhiều giống bông vải
tốt được tạo ra theo các phương pháp lai tạo và chọn lọc truyền
thống, nhưng dường như các giống bông đó khó có thể khai thác
được các nguồn gen có lợi một cách hiệu quả. Việc ứng dụng công
nghệ di truyền thực vật có thể thúc đẩy việc tạo ra các giống cây
bông có nhiều đặc tính ưu việt về đặc tính nông học như tính
kháng sâu bệnh hại, thuốc diệt cỏ và tính chống chịu với các đều
kiện bất lợi của môi trường (rét, khô hạn, phèn, mặn…) và các tính
trạng số lượng cũng như chất lượng của bông và sợi.
Bài tiểu luận này nhằm tìm hiểu khả năng chuyển nạp gen của hai
giống bông vải Coker 312 và VN36P bằng phương pháp vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens.
Page 5
II.TỔNG QUAN TÀI LIỆU:
2.1. Sơ lược về cây bông vải:
2.1.1. Vị trí phân loại:
Cây bông vải thuộc Ngành hiển hoa bí tử (Angiospermatophyta), Lớp song
tử diệp (Dicotyledoneae), Họ Malvaceae, Chi Gossypium.
2.1.2. Tính đa dạng;
Chi Gossypium rất đa dạng, có 39 loài, trong đó có 5 loài được trồng phổ
biến trên thế giới,và có 3 loài được trồng ở Việt Nam: G. arboreum, G. hirsutum,

G.barbadense
2.1.2.1. Gossypium arboretum:
Loài G. arboretum (loài bông Cỏ) có dạng hình thoáng, thân mảnh, lá nhỏ,
lông ít, rễ cộc nhỏ với bộ rễ ăn nông, chịu được mưa, cuống quả dài rủ xuống, đầu
quả quay xuống đất, vỏ quả mỏng, chín sớm, hạn chế được hiện tượng thối quả khi
gặp mưa lúc bông nở. Về phẩm chất xơ bông Cỏ : thô, tỉ lệ xơ thấp, độ mịn kém
Cỏ hiện có ở Việt Nam thuộc 2 loài phụ: G. arboreum ssp neglectum và
G.arboreum ssp nanking.
2.1.2.2. Gossypium hirsutum:
Loài Gossypium hirsutum (loài bông Luồi) thường là cây hàng năm, cây
cao, lá to, mặt lá phẳng. Cành lá khỏe, số lượng lá nhiều, quả tròn, mặt quả nhẵn,
trọng lượng hạt bông trung bình trong một quả đạt 5 - 6g. Bông Luồi có nhiều
loài phụ như : G.hirsutum ssp. Mexicanum, G.hirsutum ssp. punctatum,
G.hirsutum ssp. panicultum…
2.1.2.3. Gossypium barbadense:
Loài Gossypium barbadense còn gọi là bông Hải Đảo, cây tương đối to,
chín muộn, lá to, khía sâu, màu xanh đậm. Thân cành lá gần như không có lông,
đài không có răng cưa rõ rệt và thường chỉ gợn hình làn sóng. Hạt thường nhẵn,
không có xơ ngắn, xơ dài màu trắng hoặc cà phê sữa. Bông Hải Đảo có nhiều loài
phụ như: G. barbadense ssp. darwinii, G. barbadense ssp. ruderale, G.
barbadense ssp. ventiforlum.
2.1.2.4. Gossypium herbaceum:
Loài này phân bố chủ yếu ở các sa mạc, khí hậu khô nóng như vùng Trung
Á, TâyBắc Trung Quốc, Châu Phi, chưa thấy trồng ở Việt Nam.
Page 6
2.1.2.5. Gossypium tricuspidatum:
Loài này khá giống loài G. hirsutum, cây và lá to, chín hơi muộn, xơ dài và
mịn. Loài này đòi hỏi đất tốt, nhiều nước, nhiệt độ cao, chống chịu sâu bệnh khá
và được trồng nhiều ở Nam Mỹ. Loài bông này không có ở Việt Nam
2.2. Chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens:

Chuyển nạp gen là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen lạ đã được thiết kế ở
dạng DNAtái tổ hợp vào bộ gen của sinh vật đang nghiên cứu. Những thành tựu
của kỹ thuật nuôi cấy mô và kỹ thuật tái tổ hợp DNA đã mở ra triển vọng đối với
chuyển nạp gen ở thực vật bậc cao, tạo ra những tính trạng di truyền mới như
kháng sâu bệnh hại, thuốc diệt cỏ… Sự chuyển nạp gen thành công trên cây trồng
đã được ghi nhận bằng cách sử dụng plasmid Ti, thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens để đưa gen mong muốn vào trong bộ gen cây trồng.
Phương pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để chuyển nạp gen còn
được gọi là phương pháp chuyển nạp gen gián tiếp.
2.2.1. Đặc điểm vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens:
Giống Agrobacterium được chia làm một số loài dựa trên triệu chứng gây
bệnh và kí chủ. Một số loài thuộc chi Agrobacterium như: A. radiobacter ( loài
nay không gây bệnh cho cây), A. tumefaciens và A. rhizogens gây bệnh khối u và
bệnh cổ rễ…
Hình 2.1. Khối u do Agrobacterium tumefaciens gây ra trên thực vật. A:
một khối u lớn trên thân cây hoa Hồng; B: các khối u trên cành Nho (Deacon và
ctv, 2005).
Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn hình que, gram âm, có khả năng di
động, không sinh bào tử và có quan hệ gần gũi với vi khuẩn cố định đạm
Rhizobium. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn hiếu khí, có 5- 11
lông roi, vi khuẩn này phát triển tối ưu ở nhiệt 29
0
C trong môi trường có bổ sung
mangan và succinate như là nguồn cacbon duy nhất. Agrobacterium tumefaciens là
Page 7
vi khuẩn gây bệnh khối u trên cây (chủ yếu là cây hai lá mầm) khi xâm nhiễm vào
cây. Bộ nhiễm sắc thể vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens dạng vòng có kích
thước là 2,6Mb. Ngoài ra vi khuẩn còn mang plasmid lớn có kích thước 200 -
800 kb, chính plamid này là nguyên nhân gây ra khối u trên cây khi vi khuẩn này
xâm nhập. Plasmid này có tên gọi là Plasmid Ti, hầu hết các gen gây khối u đều

nằm trên plasmid này. Khi rễ cây xuất hiện vết thương thì tế bào vi khuẩn sẽ di
chuyển về phía vết thương và xâm nhập vào cây qua vết thương đó. Vi khuẩn độc
mang một hoặc nhiều plasmid, một trong số đó là Plasmid Ti. Plasmid Ti mang
các gen để xác định kí chủ và triệu chứng khi nhiễm vào cây. Những vi khuẩn
không mang Plasmid Ti thì được xem như là vi khuẩn không độc và không có khả
năng gây bệnh khối u cho cây. Khối u đầu tiên xuất hiện nhỏ màu trắng, ban đầu
được tìm thấy ở gốc cây. Các khối u lớn dần và xuất hiện các vết lốm đốm nâu đen
do các tế bào ngoại biên chết đi. Các khối u có thể mền và xốp và có thể bị vỡ vụn
khi chạm vào, nhưng cũng có thể cứng và xuất hiện các u nhỏ. Các khối u có
đường kính đến 30 cmnhưng phổ biến là 5 – 10 cm. Cây bị nhiễm vi khuẩn sẽ trở
nên còi cọc, lá úa vàng và rất nhạy cảm với các điều kiện môi trường. Khi xâm
nhiễm vào cây một phần gen trên Plasmid Ti sẽ gắn vào bộ gen của cây làm cho
các tế bào phát triển mạnh và sản xuất ra một chất đặc biệt gọi là Opine. Vi khuẩn
sẽ sử dụng chất này như một nguồn cacbon
2.2.2. Ti-plamid
Plasmid Ti là một DNA vòng tách rời với nhiễm sắc thể của vi khuẩn và có
khả năng nhân lên một cách độc lập trong tế bào vi khuẩn. Việc xác định Plasmid
Ti như một nguyên lý tạo bướu TIP (tumor inducing principle) đã đánh dấu bước
khởi động của một giai đoạn mới trong nghiên cứu về Agrobacterium
tumefaciens. Điều này đã mở ra khả năng nghiên cứu cấu trúc và chức năng của
plasmid bằng kỹ thuật di truyền phân tử.
Plasmid Ti có cấu trúc bao gồm: đoạn T- DNA mang các gen tổng hợp các
hormone thực vật và vùng gen vir, ngoài ra còn có một số gen mã hoá cho việc tái
sinh plasmid, cho việc tiêu hoá opine. Trong cấu trúc của Plasmid Ti , hai yếu tố
quan trọng cần cho sự chuyển gen vào cây là đoạn T- DNA bao gồm cả trình tự 25
bp ở hai cánh của đoạn T- DNA và gen vir.
Page 8
Hình 2.2.Ti-plasmid của
Agrobacterium dạng
nopalin. T-DNA: Transfer-

DNA, LB: Bờ trái. RB: Bờ
phải, ori: khởi đầu sao
chép của A.tumefaciens.
noc: Phân giải nopalin,
nos: Tổng hợp nopalin.
tmr: Tổng hợp cytokinin,
tms: Tổng hợp auxin, tra:
Vận chuyển tiếp hợp, vir:
Vùng virulence (vùng độc
tính) (Trần Thị Lê và cs,
2006) .
2.2.2.1 Chức năng của T-DNA:
T-DNA là một đoạn DNA có kích thước 10-30 kb, trong đó có chứa gen mã
hoá cho việc tổng hợp auxin, cytokinin, opine và các gen gây khối u. Trong
Plasmid Ti, vị trí của T-DNA được giới hạn bởi bờ phải và bờ trái. Trình tự
nucleotide của bờ phải và bờ trái tương tự nhau và đều có kích thước 25bp. Tuy
nhiên, bờ trái của T-DNA có thể được bỏ qua trong chuyển nạp T-DNA, trong khi
đó bờ phải lại cần thiết và tiến trình chuyển nạp diễn ra với bờ phải trước và tiến
dần về phía trái. Việc đảo ngược bờ phải sẽ làm yếu đi khả năng tạo khối u ( Zhu
và ctv, 2000).
T-DNA mã hóa một vài protein và các protein này biểu hiện trong tế bào
cây được chuyển gen làm kiểu hình cây thay đổi lớn. Các gen trên T-DNA có thể
biểu hiện trong tế bào cây bằng cách mô phỏng các gen của cơ thể đa bào. T-DNA
mã hóa cho 13 protein và những vùng không sao mã của các gen được chuyển
mang nhiều đặc điểm của các gen trong cây, yếu tố tăng cường sao mã, các vị trí
gắn đuôi poly A của cơ thể đa bào. Một nhóm các gen của T-DNA điều khiển tổng
hợp các hormone sinh trưởng của cây, những hormon này làm các tế bào tăng sinh
và làm thay đổi hình dạng bên ngoài. Sản phẩm của gen iaaM và gen iaaH điều
khiển sự chuyển hoá tryptophan thông qua indolacetamin thành indolacetic axit
(auxin). Sản phẩm của gen ipt giúp gắn kết isopentenyl pyrophosphat với AMP và

Page 9
các enzyme trong cây được cho là chuyển hoá isopentenyl-AMP thành cytokinin
zeatin bằng cách loại bỏ nhóm phosphoribosyl và loại bỏ phân tử hydro của một
nhóm methyl của isopentenyl. Hai gentrên T-DNA khác được cho là có chức năng
trong tạo khối u là 5 và tml (cũng còn gọi là 6b). Sản phẩm của gen 5 điều khiển
sinh tổng hợp indole-3-lactate, đó là một chất đồng đẳng với auxin. Trong khi đó
gen tml làm tăng mức độ nhạy cảm của các tế bào cây với phytohormon bằng một
cơ chế chưa được giải thích. Gen tml có thể kích thích tạo các khối u ngay cả khi
vắng mặt các gen gây khối u khác.
Một nhóm gen được chuyển thứ hai đều khiển sản xuất nguồn dinh dưỡng
cho vi khuẩn, đó là các opine. Đây là một dạng kết hợp giữa một aminoacid với
một keto acid hoặc một đường . Các tế bào chuyển gen tổng hợp và tiết ra một số
lượng lớn các opine. Các opine này hấp dẫn vi khuẩn mang kiểu gen tiêu biểu (bên
ngoài vùng T-DNA và thường trên plasmid độc) cần cho việc phân giải các opine
được tổng hợp từ khối u. Dựa trên các kiểu opine đựơc tạo ra từ các khối u mà
phân chia nhóm vi khuẩn Agrobacterium thành các chủng như là: octopine,
nopaline, succinamopine và leucinopine.
Hiện có ít nhất là 20 loại opine khác nhau, mỗi chủng tạo ra và phân giải
một nhóm opine chuyên biệt. Gen ocs mã hóa cho octopine synthase, enzyme này
gắn pyruvate với arginine, lysine, histidine hoặc ornithine để tạo ra octopine,
lysopine, histopine hoặc octopinic acid và tất cả những opine này đều được phát
hiện trong các khối u. Sản phẩm của gen mas2’ được cho là làm kết nối glutamine
hoặc glutamic acid với glucose (mặc dù đều này chưa đựơc chứng minh bằng thực
nghiệm), trong khi đó sản phẩm của mas1’ lại làm giảm bớt các dạng trung gian
mannopine và mannopinic acid. Sản phẩm của gen ags sẽ làm lacto hóa
mannopine thành agropine. Mannopine và agropine cũng có thể lactate hóa thành
agropinic acid . Bởi vậy, các khối u được tạo ra bởi Plasmid Ti kiểu octopine có
thể tạo 4 loại octopine và 4 kiểu thuộc nhóm mannityl opine.
Page 10
Hình 2.3. Sơ đồ biểu diễn quá trình di chuyển T-DNA của Ti-plasmid. 1: T-

DNA với bờ phải và bờ trái được chèn vào Ti-plasmid. 2: Sợi đơn được cắt ra
nhờ protein được mã hóa bởi gen virD2. 3: Sợi đơn của T-DNA được giải phóng
và kết hợp với protein do virD2 và virE2 mã hóa, chỗ đứt ở sợi đơn thứ hai được
tổng hợp bổ sung. 4: Lấp đầy chỗ trống trong Ti-plasmid (đường gạch nối đậm).
Sợi T-DNA tự do được vận chuyển vào tế bào thực vật ở dạng phức hệ DNA-
protein.( Trần Thị Lệ và cs, 2006).
2.2.2.2 Chức năng của các gen vir:
Vùng vir trên Plasmid Ti có khoảng 25 gen được nhận biết trong 7 đơn vị
phiên mã là: virA, virB, virC, virD, virE, virG, virF và vùng này có kích thước
Page 11
khoảng 30- 40 kbp. Những gen vir này mã hoá cho các vai trò như: nhận ra tế bào
thực vật, tấn công vào tế bào thực vật, gia công đoạn T-DNA, chuyển nạp đoạn T-
DNA và có lẽ có cả vai trò trong sự xâm nhập của T-DNA vào tế bào kí chủ.
Các gen vir có vai trò trong việc nhận diện ra vết thương của cây thông qua
dấu hiệu hoá học tiết từ vết thương. Các tín hiệu hoá học từ vết thương ở tế bào
cây chủ tạo ra được nhận biết trước tiên bởi VirA protein, rồi đến VirG protein để
làm kích hoạt các gen độc khác ở vùng vir, tạo ra các protein cần thiết. Gen vir
được kích hoạt tối đa ở pH acid với sự hiện diện của các hợp chất phenol như là
acetosyringone (AS), chất mà được giải phóng khi tế bào cây bị tổn thương. Biểu
hiện cơ bản của gen virA tổng hợp nên protein nằm trong màng tế bào, protein
VirA đáp ứng với sự trao đổi chất của vết thương của cây. VirA có thể đáp ứng
nhạy cảm với sự thay đổi của môi trường. Với một nồng độ AS thích hợp VirA có
thể được kích thích bởi đường, các opine khối u hoặc amino acid(Zhu và ctv,
2000). Protein VirA sẽ tự phosphoryl hoá, sự tự phosphoryl hoá này sẽ làm protein
nội bào VirG được phosphoryl hoá bởi aspartic acid còn lại sau khi VirA tự
phosphoryl hoá và kích hoạt sao mã cho tất cả các gen vir. Các promoter của gen
vir có kích thước khoảng 12bp trong trình tự “vir box”.
Các gen vir có vai trò trong việc tạo sợi đơn T-DNA trong vi khuẩn và đưa
sợi đơn T-DNA vào trong tế bào cây. Các protein được mã hoá bởi gen virD và
virE thực hiện chức năng tạo ra phức hợp T-DNA. Protein VirD2 là một

endonuclease, protein này sẽ cắt T- DNA tại vị trí nucleotide thứ 3 và thứ 4 trên
trình tự bờ vai 25 bp để tạo ra phân tử sợi đơn T-DNA và liên kết đồng hoá trị với
đầu 5’ của sợi đơn T-DNA. Protein VirD2 được tinhsạch từ oligonucleotide sợi
đơn mang các trình tự bờ vai ở vị trí tương đồng. Protein VirE2 là một protein gắn
trên sợi đơn DNA , nó sẽ bảo vệ T-DNA khỏi sự phân giải của các enzyme
nuclease trong tế bào cây, protein VirE2 là protein chiếm số lượng nhiều nhất.
Protein VirE2 và VirD2 mang trình tự định vị nhân, trình tự này giúp thúc đẩy sự
hấp thu phức hợp T-DNA vào nhân. Hai sản phẩm của gen vir khác cũng được cho
là có chức năng trong việc tạo gia công T-DNA là: VirC1 và VirC2. VirC1 đã
được thấy gắn kết vào vùng “overdrive”, vùng này nằm gần bờ phải, và bởi vậy
giúp tăng cường sự cắt T-DNA ở vị trí bờ vai của VirD1/VirD2 endonuclease.
Một số tác giả khác cho rằng VirC1 và VirC2 không cần cho tạo sợi đơn T-DNA
nhưng khi vắng mặt hai protein này thì hiệu quả chuyển nạp T-DNA vào cây khá
thấp. Do đó đề nghị rằng chúng có chức năng trong việc xuất T-DNA (Zhu và ctv,
2000). Ngoài ra, Protein VirD2 được cho làcó chức năng trong sự hòa hợp T-
DNA, bởi nó gắn vào đầu 5’ của T-DNA, đưa T-DNAvào nhân tế bào và lưu lại
cùng với T-DNA trong các bước hòa hợp. Hai giả thuyết về chức năng của protein
VirD2 trong sự hòa hợp T-DNA đã được đề nghị: VirD2 hoạt động như một
integrase và VirD2 hoạt động như một ligase .
Page 12
Hệ thống chuyển nạp T-DNA được mã hóa bởi operon virB, operon này
mang 11 gen. Sự chuyển phức hợp T-DNA dựa trên chiên mao (pili) do operon
virB mã hoá và đột biến ở bất kì gen nào trong số 11 gen của operon này đều làm
mất khả năng tạo pili và tạo khối u và tạo khối u . Các protein VirB đều khiển tạo
chiên mao và VirB2 là tiểu phần chính của chiên mao này. Hai protein VirB là
VirB4 và VirB11 có hoạt tính ATPase và được cho là cung cấp năng lượng cho
việc xuất các tiểu phần protein khác, cho vận chuyển T-DNA. Hệ thống VirB đưa
T-DNA tới tế bào chất của tế bào cây, nơi đây các bước cần cho chuyển T-DNA
vào nhân và hòa hợp với DNA của cây được thực hiện (Zhu và ctv, 2000).
Hình 2.4. Mô hình chuyển nạp T-DNA từ tế bào vi khuẩn vào tế bào cây

(nguồn Zhu và ctv, 2000)
2.2.2.3 Cơ chế lây nhiễm:
Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens sống phổ biến ở xung quanh và trên
bề mặt rễ cây. Vùng mà vi khuẩn sống gọi là vùng rễ, nơi mà vi khuẩn tồn tại nhờ
việc sử dụng chất dinh dưỡng do mô rễ tạo ra. Vi khuẩn chỉ xâm nhiễm vào cây
khi cây bị tổn thương do nhiều nguyên nhân khác nhau. Trong đều kiện tự nhiên,
các tế bào vi khuẩn di chuyển đến vị trí vết thương nhờ các dấu hiệu hoá học. Đều
này có được là do đáp ứng giải phóng đường và các thành phần phổ biến khác
trong rễ. Tuy nhiên, các chủng vi khuẩn mang Plasmid Ti sẽ đáp ứng mạnh hơn
bởi vì chúng xác định các hợp chất vết thương (hợp chất phenolic) như
Page 13
acetosyringone. Chất này có tác dụng rất mạnh dù ở nồng độ thấp (10-7M). Bởi
vậy, một trong những chức năng của Plasmid Ti là mã hoá các thụ thể (receptor)
nhận biết các chất hoá học. Những thụ thể này nằm trên màng tế bào vi khuẩn và
có thể giúp cho vi khuẩn nhận biết ra các vùng bị tổn thương. Acetosyringone
đóng vai trò quan trọng trong tiến trình xâm nhiễm. Ở nồng độ cao (10^-5 – 10^-
4M) hơn nó sẽ kích hoạt các gen vir trên Plasmid Ti (Valentine, 2003 )
Hình 2.5. Quá trình tạo phức hợp sợi đơn T-DNA (Valentine, 2003 )
Sau khi được kích hoạt, các gen vir sẽ đều khiển quá trình tạo sợi đơn T-
DNA. Quá trình tạo sợi đơn T-DNA được thực hiện trong tế bào vi khuẩn và do
các protein VirD1 và VirD2 thực hiện. Sau đó protein VirD2 gắn vào sợi đơn T-
DNA để tạo thành phức hợp T- DNA. Phức hợp T-DNA-VirD2 cùng với protein
VirE2 được chuyển vào trong tế bào cây thông qua hệ thống chuyển nạp được mã
hoá bởi các gen virB. Cùng với một số thành phần trong tế chất của tế bào cây, các
protein của vi khuẩn sẽ tiếp tục đưa phức hợp T-DNA vào trong nhân tế bào.
(Valentine, 2003 )
Trong nhân tế bào cây, T-DNA được kết nạp vào bộ gen của cây không
theo một quy luật tái tổ hợp nào cả, đầu tiên đầu 3’ của T-DNA nhận diện các
đoạn tương đồng với DNA của cây và gắn vào. Sau đó nucleotide gắn với VirD2
tìm các đoạn vi tương đồng (microhomology) trên DNA cây và gắn vào. Sự gắn

kết này mang cầu nối phosphotyrosine có ái lực điện tử của đầu 5’ đến gần đầu 3’
nucleophilic của DNA cây mà bị tách ra. Cuối cùng sự gắn kết trên sợi DNA của
cây được hoàn thành và cây chuẩn bị một cơ chế sinh tổng hợp đoạn T-DNA dẫn
đến sự hòa hợp của T-DNA hoàn thành. Cuối cùng, sau khi sự kết nạp hoàn thành
Page 14
các gen trên T-DNA hoạt động tổng hợp nên các sản phẩm cần thiết cho vi khuẩn
(Valentine, 2003 ).
Hình 2.6. Quá trình kết nạp T-DNA vào bộ gen của tế bào cây (Valentine, 2003 )
III PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:
3.1.Chuẩn bị vật liệu nuôi cấy:
Hạt của các giống bông vải được đốt lớp xơ bao quanh bằng axit sunfurit
đậm đặc (H2SO4 98%), rồi rửa dưới vòi nước máy nhiều lần cho đến khi sạch hết
axit và bột than, sau đó sấy trong tủ sấy ở 40
0
C khoảng 48 giờ để đạt độ ẩm 14%.
Sau khi sấy, hạt được khử trùng bề mặt với cồn 70
0
trong 2 phút rồi rửa
bằng nước cất vô trùng (3 lần), tiếp theo hột được khử trùng tiếp bằng HgCl2
0,1% (w/v) có vài giọt Tween 20, lắc ở tốc độ 100 vòng/phút thực hiện 2 lần mỗi
lần 10 phút (giữa 2 lần khử trùng bằng HgCl2 có rửa lại 3 lần bằng nước cất vô
trùng), sau đó hạt được rửa nhiều lần với nước cất vô trùng (6 lần) rồi được bảo
hoà qua đêm trong nước cất.
Sau khi bảo hòa qua đêm, hạt tiếp tục được khử trùng bằng HgCl
2
0,1% có
vài giọt Tween 20 (thực hiện 2 lần mỗi lần 5 phút). Sau đó những hạt nứt nanh
được bóc vỏ trong đều kiện vô trùng và cấy vào môi trường nảy mầm MSG (phụ
lục 1) và nuôi ở nhiệt độ 28 - 290C, độ ẩm tương đối bằng 50%.
Sau 5-7 ngày ta loại bỏ những keo bị tạp nhiễm, chọn những cây không bị

tạp nhiễm làm nguồn vật liệu thí nghiệm. Từ cây mầm in vitro 5 - 7 ngày tuổi đã
được nuôi cấy, các trụ hạ diệp được cắt thành những đoạn dài khoảng 0,5 cm dùng
làm vật liệu cho nghiên cứu chuyển nạp gen.
3.2. Quy trình chuyển nạp gen
3.2.1. Nguồn plasmid:
Page 15
Nguồn plasmid được sử dụng để nghiên cứu là vector pManCa (Hoa và
Bong, 2003) mang gen pmi (phosphomannose isomerase) giúp tế bào vi khuẩn
biến dưỡng đường mannose và gen chỉ thị gus trong chủng vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens LBA 4404.
Hình 3.1. Sơ đồ vector pManCa mang gen pmi và gen gus
3.2.2. Chuẩn bị vi khuẩn:
Chủng vi khuẩn LBA4404 mang vector pManCa từ ống tồn trữ trong
glycerol (50%, v/v) ở nhiệt độ -800C được nuôi cấy trên môi trường đặc ABG (có
50 mg/l kanamycin và ủ ở 28
0
C trong 72 giờ.
Trên môi trường đặc ABG chọn một khuẩn lạc phát triển tốt đem nuôi cấy
trong 3ml môi trường lỏng YEP có bổ sung 50mg/l kanamycin và nuôi qua đêm
(24-28 giờ) ở 28
0
C trên máy lắc với tốc độ 200vòng/phút. Sau khi nuôi cấy 24-28
giờ, cấy chuyền sang 50 ml môi trường YEP có kanamycin 50mg/l và nuôi cấy
khoảng 16- 18 giờ ở 28
0
C, lắc 200 vòng/phút đến khi OD600 đạt khoảng 0,5 - 1.
3.2.3. Lây nhiễm (đồng nuôi cấy):
Page 16
Chủ yếu dựa theo quy trình của Chen và ctv, 2000 (US Patent số: WO
00/77230 A1) với một vài thay đổi: OD600 pha loãng là 0,5, thời gian ngâm mẫu

trong dịch vi khuẩn là 30 phút và lây nhiễm trên môi trường không có giấy thấm
(Chen và ctv tiến hành thí nghiệm với OD600 pha loãng là 0,3, thời gian 5 phút và
lây nhiễm trên môi trường có giấy thấm).
Vi khuẩn sau khi chuẩn bị được đem li tâm với tốc độ 5000 vòng/phút trong
10 phút. Sau khi li tâm, phần lắng được pha loãng bằng môi trường lây nhiễm
không có phytagel (có bổ sung AS) và lắc với tốc độ 220 vòng/phút ở 28
0
C trong
1giờ để chuẩn bị cho lây nhiễm.
Từ cây mầm in vitro đã được chuẩn bị ta cắt lấy đoạn trụ hạ diệp, sau đó
đoạn cắt trụ hạ diệp được cắt thành những mẫu dài khoảng 0,5 cm rồi ngâm trong
dịch vi khuẩn pha loãng (OD600 ~ 0,5) khoảng 30 phút. Sau khi lây nhiễm các
mẫu cấy được chuyển vào đĩa petri có giấy thấm tuyệt trùng cho khô mẫu sau đó
cấy sang đĩa petri có môi trường đồng nuôi cấy MSCo.
Các đĩa mẫu sau đó được giữ trong tủ nuôi ở 210C trong đều kiện chiếu
sáng liên tục khoảng 72 giờ.
3.2.4. Thanh lọc:
Sau khi đồng nuôi cấy với vi khuẩn, mẫu cấy được rửa vi khuẩn bằng nước
cất vô trùng 2 lần để loại bỏ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens bám trên bề mặt
mẫu cấy và kháng sinh carbernicillin 500 mg/l để ức chế vi khuẩn mọc trở lại. Sau
khi rửa, mẫu cấy được đặt lên đĩa petri có giấy thấm vô trùng trong vài phút cho
khô mẫu. Sau đó mẫu cấy được cấy chuyền lên môi trường thanh lọc MMS1 có tác
nhân thanh lọc là đường mannose và glucose ở các nồng độ khác nhau theo sự
tăng dần nồng độ mannose (2,5% w/v, 30% w/v và 35% w/v) và giảm dần nồng độ
glucose (10% w/v, 5% w/v và 0% w/v) qua 3 lần thanh lọc, mỗi lần cách nhau 2
tuần.
Bảng 3.1. Nồng độ đường mannose và glucose ở các lần thanh lọc
1
Mannose
Glucose

I
II
III
25g/l
30g/l
35g/l
10g/l
5g/l
0g/l
Sau khi thanh lọc thì các mô sẹo chuyển gen giả định (biến dưỡng đường
mannose) xuất hiện. Tỉ lệ mô sẹo chuyển gen giả định được theo dõi. Từ các mô
Page 17
sẹo sống sót sau khi thanh lọc, ta chọn ra những mô sẹo phát triển tốt, có màu
xanh hơi vàng và rời rạc để tách nhỏ và cấy chuyền lên môi trường phát sinh phôi
MMS2.
3.3. Các chỉ tiêu theo dõi:
Sự biến đổi hình thái mô sẹo trong quá trình lây nhiễm và chọn lọc: Trong
nghiên cứu này chúng tôi tiến hành theo dõi sự thay đổi hình thái mô sẹo qua các
giai đoạn là sau 2 tuần trên môi trường thanh lọc lần 1, thanh lọc lần 2 và thanh lọc
lần 3. Tỉ lệ mẫu sống sót và hình thành mô sẹo: Sau các lần thanh lọc tỉ lệ mẫu
sống sót và hình thành mô sẹo được chúng tôi theo dõi và ghi nhận. Từ tỉ lệ này
chúng ta có thể so sánh được sự khác nhau giữa các giống đồng thời cũng đánh giá
được hiệu quả của hệ thống thanh lọc đang thực hiện.
IV.KẾT LUẬN:
Bông vải là một trong những cây trồng quan trọng ở nước ta. Với sự phát
triển của công nghệ sinh học, các gen mong muốn có thể chuyển vào cây bông vải
nhằm nâng cao năng suất, chất lượng xơ cũng như khả năng kháng sâu bệnh bằng
các phương pháp khác nhau trong đó phương pháp chuyển nạp gen bằng vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens được sử dụng phổ biến nhất. Trong qui trình chuyển
nạp gen vào cây trồng, hệ thống chọn lọc thông thuờng nhất là dùng các chất

kháng sinh làm tác nhân chọn lọc. Việc chuyển nạp gen đánh dấu chọn lọc kháng
chất kháng sinh vào cây trồng để sử dụng chất kháng sinh làm tác nhân chọn lọc
đã gây nên những lo ngại về tính an toàn sinh học của cây biến đổi gen.
Để hoàn thiện qui trình chọn lọc mannose đối với bông vải cần tiếp tục
nghiên cứu thêm về các mức liều lượng đường mannose và glucose ở mỗi vòng
thanh lọc và thời gian chọn lọc để nâng cao hiệu quả chọn lọc, giảm thiểu điều
kiện cho hiện tượng thoát mẫu.
Page 18
V.TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Ngô Việt Duy,2005. Nghiên cứu khả năng chuyển nạp gen của hai giống
vải COKER312 và VN36P bằng vi khuẩn Agrobaterrium tumefaciens . Đại
học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
2. Trần Thị Lệ (chủ biên), Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Quốc Dung,2006. Giáo
trình công nghệ gen trong nông nghiệp. Đại học Huế.
3. Deacon J., Robertson A and Isbister A, 2005. The Microbial World:
Biology and Control of Crown Gall (Agrobacterium tumefaciens). Institute
of Cell and Molecular Biology, The University of Edinburgh.
4. Valentine L., 2003. Agrobacterium tumefaciens and the Plant: The David
and Goliath of Modern Genetics. Plant Physiology 133: 948-955.
5. Zhu J., Oger P.M., Schrammeijer B., Hooykaas P.J.J, Farrand S.K and
Winans S. C, 2000. The Bases of Crown Gall Tumorigensis. Journal of
Bacteriology 182:3885- 3895.