ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐỖ THỊ THU HẰNG

TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐỘC TỐ NHÓM ALKALOID
TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ
LỎNG KHỐI PHỔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2015



ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐỖ THỊ THU HẰNG
TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐỘC TỐ NHÓM ALKALOID
TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ
LỎNG KHỐI PHỔ

Chun ngành: Hóa phân tích
Mã Số: 60440118
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Ngƣời Hƣớng Dẫn Khoa Học: PGS TS. Lê Thị Hồng Hảo

Hà Nội – 2015

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này lời đầu tiên cho em gửi lời cảm ơn sâu sắc tới
PGS TS. Lê Thị Hồng Hảo, Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia
– Bộ Y tế đã tận tình hƣớng dẫn, đóng góp những ý kiến q báu và tạo mọi điều kiện
giúp đỡ em trong suốt q trình thực hiện đề tài.
Em xin bày tỏ lịng biết ơn tới các thầy cô giáo giảng dạy tại khoa Hố học,
đặc biệt là các thầy cơ trong bộ mơn Hố Phân Tích, đã cho em những kiến thức
q giá, tạo điều kiện cho em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm
An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tơi đƣợc học
tập và hồn thành đề tài này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các đồng nghiệp tại labo Hóa – Viện kiểm
nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã giúp đỡ tơi rất nhiều trong q trình
làm thực nghiệm.
Cuối cùng tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã ln động viên,
chia sẻ mọi khó khăn cùng tôi.

Hà Nội, năm 2015
Học viên

Đỗ Thị Thu Hằng


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
BẢNG KÍ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT
MỞ ĐẦU................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN..................................................................................... 3
1.1. Tổng quan về nhóm alkaloid............................................................................. 3

1.1.1. Lịch sử phát hiện............................................................................................ 3
1.1.2. Khái quát về nhóm alkaloid............................................................................ 3
1.1.3. Cấu tạo của một số alkaloid độc..................................................................... 6
1.1.4. Tác dụng và độc tính của một số alkaloid....................................................... 7
1.2. Các phƣơng pháp xác định............................................................................. 13
1.2.1. Phƣơng pháp điện di mao quản....................................................................13
1.2.2. Phƣơng pháp sắc ký lỏng với detector UV...................................................14
1.2.3. Phƣơng pháp sắc ký lỏng với detector khối phổ...........................................16
1.3. Sắc ký lỏng khối phổ...................................................................................... 18
1.3.1. Nguyên tắc chung của sắc ký lỏng................................................................ 18
1.3.2. Detector khối phổ (Mass spectrometry – MS).............................................. 18
1.3.2.4. Bộ phận phát hiện.......................................................................................22
1.3.3. Phân tích định tính và định lƣợng bằng LC-MS/MS....................................22
1.4. Lấy mẫu.......................................................................................................... 23
1.5. Đánh giá phƣơng pháp phân tích.................................................................... 23
CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.........................26
2.1 Đối tƣợng và mục tiêu nghiên cứu................................................................. 26
2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu................................................................................... 26
2.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng trong nghiên cứu..................................... 27
2.3.1 Thiết bị............................................................................................................ 27
2.3.2 Dụng cụ........................................................................................................... 27
2.3.3 Chất chuẩn...................................................................................................... 28
2.3.4 Các loại hóa chất, dung môi khác................................................................... 29


MỤC LỤC
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................... 30
3.1. Tối ƣu điều kiện tách và xác định các alkaloid trên thiết bị LC/MS/MS........30
3.1.1. Tối ƣu các điều kiện của detector khối phổ (MS/MS)..................................30
3.1.2. Tối ƣu các điều kiện chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).....................33

3.2. Tối ƣu quá trình xử lý mẫu............................................................................. 42
3.2.1. Khảo sát dung môi chiết............................................................................... 43
3.2.2. Khảo sát dung dịch kiềm hóa........................................................................ 45
3.2.3. Khảo sát thể tích dung dịch kiềm hóa........................................................... 46
3.3. Đánh giá phƣơng pháp phân tích.................................................................... 48
3.3.1. Tính đặc hiệu/chọn lọc.................................................................................. 48
3.3.2. Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đƣờng chuẩn..........................................49
3.3.3. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lƣợng (LOQ) của phƣơng pháp...51
3.3.4. Đánh giá độ lặp lại và độ thu hồi.................................................................. 52
3.4. Phân tích mẫu thực.......................................................................................... 57
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................. 59
KẾT LUẬN............................................................................................................. 59
KIẾN NGHỊ............................................................................................................ 60
TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................................... 61
PHỤ LỤC................................................................................................................ 65


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Cấu trúc hoá học của một số alkaloid độc đƣợc xác định trong đề tài......6
Bảng 1.2. Các giá trị LD50 của các chất phân tích......................................................8
Bảng3.1: Các mảnh ion định lƣợng và định tính của các alkaloid..........................30
Bảng 3.2: Các thông số tối ƣu MS/MS đối với chế đô ̣ ion dƣơng ..........................33
Bảng 3.3: Các hệ dung môi pha động khảo sát........................................................34
Bảng 3.4: Diện tích các alkaloid khi sử dụng các hệ dung môi khác nhau..............36
Bảng3.5: Các chƣơng trình gradient khảo sát.........................................................37
Bảng3.6: Ảnh hƣởng nồng độ amoniacetat tới diện tích píc các alkaloid...............41
Bảng 3.7 : Ảnh hƣởng của dung môi chiết đến hiệu suất chiết các alkaloid...........44
Bảng 3.8 : Ảnh hƣởng của dung dịch kiềm hóa đến hiệu suất chiết các alkaloid....45
Bảng 3.9: Ảnh hƣởng của thể tích dung dịch kiềm hóa đến hiệu suất chiết các
alkaloid.................................................................................................................... 46

Bảng 3.10: Đƣờng chuẩn các alkaloid....................................................................50
Bảng 3.11: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của các alkaloid.................51
Bảng 3.12: Độ lặp lại và hiệu suất thu hồi của các Alkaloid trên nền mẫu thực phẩm
chức năng tại nồng độ 50-500 µg/kg (0,05-0,5 mg/kg)..........................................53
Bảng 3.13: Độ lặp lại và hiệu suất thu hồi của các Alkaloid trên nền mẫu thực phẩm
chức năng tại nồng độ 0,1-1 mg/kg........................................................................54
Bảng 3.14: Độ lặp lại và hiệu suất thu hồi của các Alkaloid trên nền mẫu thực phẩm
chức năng tại nồng độ 0,2-2 mg/kg........................................................................55
Bảng 3.15: Bảng kết quả phân tích mẫu thực..........................................................57


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Chế độ ion hóa phun điện tử ESI.............................................................. 19
Hình 1.2: Cấu tạo của bộ phân tích khối tứ cực chập ba........................................... 21
Hình 3.1: Sắc đồ tỷ lệ các ion của koumin và atropin............................................... 31
Hình 3.2: Sắc đồ ion tổng khi sử dụng hệ dung môi pha động 1..............................34
Hình 3.3: Sắc đồ ion tổng khi sử dụng hệ dung mơi pha động 2..............................35
Hình 3.4: Sắc đồ ion tổng khi sử dụng hệ dung mơi pha động 3..............................35
Hình 3.5: Sắc đồ ion tổng khi sử dụng hệ dung mơi pha động 4..............................35
Hình 3.7: Sắc đồ ion tổng khi sử dụng chƣơng trình gradient 2............................... 37
Hình 3.8: Sắc đồ ion tổng khi sử dụng chƣơng trình gradient 3............................... 38
Hình 3.9: Sắc đồ ion tổng khi sử dụng chƣơng trình gradient 4............................... 38
Hình 3.10: Sắc đồ ion tổng khi sử dụng chƣơng trình gradient 5............................. 38
Hình 3.11: Sắc đồ ion tổng tại tốc độ dịng 0,6 mL/phút.......................................... 40
Hình 3.13: Sắc đồ ion tổng tại tốc độ dịng 0,4 mL/phút.......................................... 40
Hình 3.14: Biểu đồ sự phụ thuộc diện tích píc của các alkaloid vào nồng độ
amoniacetat trong pha động..................................................................................... 42
Hình 3.15: Sơ đồ quy trình chiế t
mâu


dƣ̣ kiến......................................................... 43

Hình 3.16 : Biểu đồ ảnh hƣởng của dung môi chiết đến hiệu suất chiết các alkaloid
......................................................................................................................................................................... 44

Hình 3.17 : Biểu đồ ảnh hƣởng của dung dịch kiềm hóa đến hiệu suất chiết các
alkaloid..................................................................................................................... 46
Hình 3.18 : Quy trình chiết mâu tối ƣu.................................................................... 47
Hình 3.19 : Sắc đồ chuẩn alkaloid, mẫu trắng và mẫu trắng thêm chuẩn.................48
Hình 3.20: Mối tƣơng quan giữa diện tích pic và nồng độ Atropin trong khoảng 0,5100 ng/mL................................................................................................................ 49
Hình 3.21: Mối tƣơng quan giữa diện tích pic và nồng độ aconitin trong khoảng 51000 ng/mL.............................................................................................................. 49
Hình 3.22: Đƣờng chuẩn Scopolamin (R2 = 0,9999)............................................... 50


Hình 3.23: Sắc đồ của nicotin tại giới hạn phát hiện LOD 1,0 µg/kg (S/N = 3,6)

51

Hình 3.24: Sắc đồ của Brucin tại giới hạn định lƣợng LOQ 10 µg/kg (S/N = 11,5)52
Hình 3.26: Sắc đồ atropin trong mẫu thực phẩm chức năng thêm chuẩn tại mức
nồng độ 0,1 mg/kg.................................................................................................... 55
Hình 3.27: Sắc đồ scopolamin trong mẫu thực phẩm chức năng thêm chuẩn tại mức
nồng độ 0,2 mg/kg.................................................................................................... 56
Hình 3.28: Sắc đồ mẫu phát hiện brucin................................................................... 58
Hình 3.29: Sắc đồ mẫu phát hiện strychnin.............................................................. 58


BẢNG KÍ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT
Kí hiệu


Tiếng Anh

Tiếng Việt

ACN

Acetonitrile

acetonitril

Atmospheric pressure chemical

Chế độ ion hóa ở áp suất khí

ionization

quyển

CE

Collision energy

Năng lƣợng va chạm

ESI

Eelectrospray ionization

Chế độ ion hóa phun điện tử


EU

European Union

Châu Âu

HPLC

High performance liquid

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

APCI

chromatography
IUPAC

International Union of Pure and

Liên minh quốc tế về hóa học

Applied Chemistry

cơ bản và ứng dụng

LD50

Lethal Dose


Liều gây chết trung bình

LOD

Limit of deterction

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of quantity

Giới hạn định lƣợng

MeOH

Methanol

Methanol

ODS

Octadecylsilan

Octadecylsilan

RSD

Relative standard deviation


Độ lệch chuẩn tƣơng đối

SD

Standard deviation

Độ lệch chuẩn

SPE

Solid phase extraction

Chiết pha rắn

UPLC-

Ultral performance liquid

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng kết

MS/MS

chromatography tandem mass

nối khối phổ

spectrometry
UV

Ultraviolet


Tử ngoại


Luận văn Thạc sỹ khoa học

Đỗ Thị Thu Hằng- K23 Hóa học

MỞ ĐẦU

Việt Nam là nƣớc nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, rất thuận lợi cho sự phát
triển của thực vật và đây đƣợc coi là một kho tàng vô giá về nguồn cây thuốc và
dƣợc liệu quý. Trong đó alkaloid là những thành phần hoạt tính chính của nhiều cây
thuốc. Alkaloid là amin nguồn gốc tự nhiên do thực vật tạo ra, nhƣng các amin do
động vật và nấm tạo ra cũng đƣợc gọi là các alkaloid. Cấu trúc bao gồm carbon,
hydro, nitơ, và thƣờng có oxy. Các alkaloid là bazơ hữu cơ tƣơng tự nhƣ kiềm (bazơ
vô cơ); tên có nghĩa là nhƣ kiềm. Alkaloid xuất hiện chủ yếu trong các chi khác
nhau của thực vật có hạt, chẳng hạn nhƣ cây thuốc phiện và cây thuốc lá, mã tiền….
Chúng có thể đƣợc tìm thấy trong hầu hết các bộ phận của các loại thực vật này, bao
gồm cả lá, rễ, hạt, và vỏ cây. Mỗi một phần của thực vật thƣờng có chứa một số chất
hóa học liên quan đến alkaloid. Chức năng của alkaloids trong chuyển hóa thực vật
chƣa đƣợc biết, nhƣng hầu hết các alkaloid có ảnh hƣởng rõ rệt đến hệ thống thần
kinh của ngƣời và động vật khác. Trong số hàng trăm alkaloid đƣợc tìm thấy trong
tự nhiên, chỉ có khoảng 30 chất đƣợc sử dụng thƣơng mại. Một số alkaloid, chẳng
hạn nhƣ nicotin, đƣợc sử dụng trong thuốc trừ sâu, và một số khác đƣợc sử dụng
làm thuốc thử hóa học. Tuy nhiên, các alkaloid đƣợc sử dụng chủ yếu trong y học,
bởi vì chúng có thể tác động một cách nhanh chóng trên các khu vực cụ thể của hệ
thần kinh. Alkaloid là những thành phần hoạt tính chính của nhiều thuốc gây mê,
thuốc an thần, các chất kích thích và thuốc an thần. Chúng đƣợc dùng bằng đƣờng
uống và tiêm. Ngoại trừ dƣới sự giám sát của bác sĩ, sử dụng các alkaloid là nguy

hiểm, bởi vì hầu hết hình thành thói quen (ví dụ, gần nhƣ tất cả các chất ma tuý là
alkaloid) và dùng liều lƣợng lớn có thể là độc hại.
Trong dân gian ta thƣờng sử dụng các cây thảo dƣợc nhƣ cà độc dƣợc, mã
tiền, củ ấu tàu… dùng để chữa bệnh nhƣng trong các loại cây này có chứa một hàm
lƣợng khơng nhỏ các chất độc nhóm alkaloid. Hiện nay, một số loại thực phẩm chức

Trƣờng Đại học KHTN

11


năng có nguồn gốc thảo dƣợc cũng sử dụng các loại cây này hoặc có thành phần
đƣợc chiết xuất từ cây thuốc có các hoạt chất nhƣ các alkaloid, terpenoid,
phenolic… đƣợc biết đến nhƣ là các hợp chất thứ cấp. Sử dụng các loại thực phẩm
chức năng này có thể là con dao hai lƣỡi, dùng với liều lƣợng vừa phải có tác dụng
chữa một số bệnh song dùng khơng đúng cách hoặc quá liều có thể dẫn đến ngộ độc
hoặc các biến chứng. Vì vậy sử dụng những thực phẩm chức năng có chứa các
alkaloid độc này phải cẩn trọng và phải đƣợc sự quản lý và cho phép của các cơ
quan chức năng. Tuy nhiên, ở Việt Nam việc xác định đồng thời các alkaloid đôc̣
trong thực phẩm chức năng vẫn chƣa đƣợc nghiên cứu. Do vậy, để góp phần kiểm
sốt các nguy cơ tiềm ẩn để đảm bảo an toàn cho ngƣời tiêu dùng và giúp cơ quan
chức năng quản lý đƣa ra các khuyến cáo nhằm giảm nguy cơ ngộ độc do sử dụng
các thực phẩm chức năng có ngồn gốc thảo dƣợc. Chúng tơi đã tiến hành đề tài:
“Tách và xác định một số độc tố nhóm alkaloids trong thực phẩm chức năng
bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ”.


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1.


Tổng quan về nhóm alkaloid

1.1.1.

Lịch sử phát hiện
Năm 1804- 1805, các nhà hóa học Pháp và Đức đã phân lập đƣợc morphin

và điều chế đƣợc dạng muối của nó. Đồng thời đã chứng minh đƣợc morphin là
hoạt chất chính của cây thuốc phiện có tác dụng sinh lý rõ rệt. Năm 1980, từ vỏ cây
canhkina, đã chiết và kết tinh đƣợc một chất đặt tên là “cinchonino” sau đó hai nhà
hóa học Pháp đã xác định cinchonino là hỗn hợp của hai alkaloid là quinin và
cinchonin. Năm 1918, phát hiện ra alkaloid của hạt mã tiền là strychnin và brucin;
phát hiện ra cafein trong chè, cà phê. Sau đó tiếp tục phát hiện ra nicotin trong thuốc
lá, atropin trong cà độc dƣợc, theobromin trong cacao, codein trong thuốc phiện,
cocain trong lá coca. Giữa năm 1973, ngƣời ta đã xác định đƣợc 4959 alkaloid khác
nhau trong đó có 3293 chất đã xác định đƣợc cơng thức hóa học. Hiện nay đã phát
hiện ra đƣợc rất nhiều alkaloid và cũng đã đƣợc đƣa vào ứng dụng trong y học ngày
một tăng [15].
1.1.2.

Khái quát về nhóm alkaloid

1.1.2.1. Khái niệm
Alkaloid có nguồn gốc từ chữ: alcali tiếng Ả rập là kiềm. Alkaloid là:
-

Những hợp chất hữu cơ có chứa dị vịng nitơ, có tính bazơ thƣờng gặp ở trong nhiều
lồi thực vật và đơi khi cịn tìm thấy trong một vài lồi động vật.

-


Có phản ứng kiềm cho các muối với acid và các muối này dễ kết tinh.

-

Có hoạt tính sinh học rất quan trọng.

-

Có một số phản ứng chung là tạo “tủa“ cần thiết cho sự xác định chúng. Chúng là
một nhóm hợp chất thiên nhiên quan trọng về nhiều mặt. Đặc biệt trong lĩnh vực y
học, chúng cung cấp nhiều loại thuốc có giá trị chữa bệnh cao và độc đáo [15] [16].


1.1.2.2. Cấu tạo hóa học
Về mặt hóa học, sự phong phú và đa dạng của alkaloid đã trở thành một
chuyên nghành, chiếm một vị trí quan trọng trong lĩnh vực nghiên cứu và trong tạp
chí thơng tin về hóa học. Đối với việc nghiên cứu alkaloid còn quan trọng hơn bởi
vì chúng có trong hệ thực vật nhiệt đới phong phú là nguồn cung cấp alkaloid chủ
yếu. Về mặt cấu trúc hóa học, chúng có ít nhất 1 ngun tử N trong phân tử, chủ
yếu nằm trong vịng. Sự có mặt của nguyên tử của N trong cấu trúc quyết định tính
bazơ của alkaloid và là chỗ dựa rất quan trọng cho các nhà hóa học trong nghiên
cứu alkaloid [15].
1.1.2.3. Phân loại
Các alkaloid đã biết có đến trên 250 dạng cấu trúc khác nhau với hơn 5.500
hợp chất alkaloid trong tự nhiên. Vì vậy cách phân loại dựa vào cấu trúc nhân cơ
bản trƣớc đây (khoảng 20 nhóm cấu trúc) chƣa đáp ứng đƣợc nên ngày càng có xu
hƣớng chia chúng thành những nhóm nhỏ: nhóm alkaloid Ecgotamia, Harmin,
Yohimbin, Strychnin, Echitamin. Nhóm alkaloid có nhân isoquinolin đƣợc chia
thành


các

nhóm:

Benzyliaoquinolin,

Apocphin,

Protobecberin,

Benzophenanthridin…Có ý kiến xếp các hợp chất có N ngồi vịng nhƣ Colchicin,
Hordenin, là các protoalkaloid [15] [27].
1.1.2.4. Sự phân bố
Cromwell (1995) ƣớc tính alkaloid phân bố trong khoảng 1 phần 7 lồi thực
vật có hoa. Một ƣớc tính khác (Hegnauer, 1963) cho rằng alkaloid có từ 12%-20%
trong tổng số cây có nhựa. Cịn Willaman và Schubert (1955) thì cho rằng trong hơn
300 họ của nghành hạt kín thì 1/3 họ có chứa alkaloid. Nhiều tổng kết cho thấy đại
đa số cây có chứa alkaloid là cây hai lá mầm. Chỉ có một số ít cây chứa alkaloid là
cây 1 lá mầm và nghành hạt trần. Theo thống kê đến nay thì cây thuộc thảo và cây
bụi có nhiều alkaloid hơn cây gỗ, và trọng lƣợng phân tử của alkaloid trong cây gỗ
thƣờng bé hơn trọng lƣợng phân tử cây thuộc thảo. Cây một năm có nhiều alkaloid
hơn cây lƣu niên (Levin, 1976). Alkaloid khơng có trong lồi sống ở nƣớc ngoại trừ


họ sen (Nympheaceae) (Mc.Nair.1943). Thực ra rất nhiều lồi có alkaloid nhƣng chỉ
ở mức độ dạng vết hoặc ở tỷ lệ phần vạn, mƣời vạn. Để giới hạn với ý nghĩa thực
tiễn, một cây đƣợc xem là có alkaloid phải chứa ít nhất là 0.05% alkaloid so với
dƣợc liệu khơ. Mối liên quan giữa alkaloid với các chất khác trong 1 cây cũng đã
đƣợc nghiên cứu. Cây có chứa alkaloid đều vắng mặt tinh dầu và ngƣợc lại

(Trelibs,1955) [27].
1.1.2.5. Tính chất
Alkaloid là các bazơ yếu, do sự có mặt của nguyên tử N. Nhƣng độ kiềm
của alkaloid không giống nhau do ảnh hƣởng khác nhau của lớp điện tích nguyên tử
N gây ra và ảnh hƣởng của các nhóm chức khác. Nói chung tính bazơ giảm dần
theo thứ tự amoni bậc 4, amoni bậc 1, amoni bậc 2, amoni bậc 3.
Hầu hết các alkaloid bazơ thực tế không tan trong nƣớc nhƣng tan trong các
dung môi hữu cơ nhƣ CHCl3, eter và các ancol bậc thấp (methanol, ethanol,
butanol). Một số nhóm alkaloid có thêm các nhóm phân cực nên tan đƣợc một phần
trong nƣớc hoặc trong kiềm. Ví dụ: Morphine, Cephalin, do có nhóm OH phenol
nên tan trong dung dịch kiềm và các bazơ của chúng thì gần nhƣ là không tan trong
eter. Ngƣợc lại với bazơ, các muối alkaloid nói chung tan đƣợc trong nƣớc và cồn
nhƣng hầu nhƣ không tan trong dung môi hữu cơ nhƣ: CHCl3, eter, benzene. Có
một số trƣờng hợp ngoại lệ nhƣ Ephedrin, Cochicin, Ecgovonin, các bazơ của chúng
tan đƣợc trong nƣớc nhƣng cũng khá tan trong dung môi hữu cơ và các muối của
chúng thì ngƣợc lại. Alkaloid có N – Bậc 4 và N – oxide bazơ của alkaloid có N
– Bậc 4 và N – oxide khác tan trong nƣớc và trong kiềm ít tan trong dung mơi hữu cơ.
Các muối của chúng có độ hịa tan khác nhau tùy thuộc vào gốc acid tạo ra chúng.
Vì vậy có thể chiết chúng bằng dung dịch kiềm và kết tủa dƣới dạng muối có độ hịa
tan thấp nhất. Đối với các alkaloid N – oxide thì dùng phản ứng khử. Oxy bằng bột
kẽm trong môi trƣờng HCl để chúng chuyển thành alkaloid dạng thƣờng sau đó kết
tủa bằng kiềm và chiết bằng dung môi hữu cơ [14].


1.1.3.

Cấu tạo của một số alkaloid độc

Bảng 1.1. Cấu trúc hoá học của một số alkaloid độc đƣợc xác định trong đề tài.
STT


Alkaloid

Công thức
phân tử

Khối
lƣợng
phân tử
(g/mol)

pKa

C23H26N2O4

394,46

8,28

C21H22N2O2

334,41

8,26

C34H47NO11

645,74

5,88


C17H23NO3

289,37

4,35

Brucin
1

10,11Dimethoxystrychnine
Strychnin
(4aR,5aS,8aR,13aS,15aS,
15bR)4a,5,5a,7,8,13a,15,15a,15

2

b,16-decahydro-2H-4,6methanoindolo[3,2,1ij]oxepino[2,3,4de]pyrrolo[2,3h]quinoline-14-one

Aconitin
3
Acetylbenzoylaconine

Atropin
(RS)-(8-Methyl-84

azabicyclo[3.2.1]oct-3-yl)
3-hydroxy-2phenylpropanoate

Công thức cấu tạo



Scopolamin

5

(–)-(S)-3-hydroxy-2phenylpropionic
acid(1R,2R,4S,7S,9S)-9methyl-3-oxa-9azatricyclo[3.3.1.02,4]no
n-7-yl ester

C17H21NO4

303,35

7,75

C20H22N2O

306,41

_

C22H25N O6

399,44

12,35

C10H14N2


162,23

8,5

Koumin
7,20(2H,19H)6

Cyclovobasan, 1,2,18,19tetradehydro-3,17-epoxy, (3R,7alpha,20alpha)Colchicin
N-[(7S)-1,2,3,10Tetramethoxy-9-oxo-

7

5,6,7,9tetrahydrobenzo[a]heptal
en-7-yl]acetamide
Nicotin
(−)-1-Methyl-2-(38

pyridyl)pyrrolidine,(S)-3(1-Methyl-2-pyrrolidinyl)
pyridine

1.1.4.

Tác dụng và độc tính của một số alkaloid

Các chất trong nghiên cứu này thuộc nhóm alkaloid chúng có tác dụng lên hệ
thần kinh, tim mạch và hô hấp [3] [12]. Khi dùng với hàm lƣợng nhỏ chúng có tác
dụng chữa bệnh nhƣng khi dùng với hàm lƣợng lớn gây ngộ độc có thể dẫn đến tử
vong vì đây đều là các alkaloid độc. Bảng 1.2 giới thiệu giá trị LD50 (liều lƣợng
chất độc gây chết cho một nửa số cá thể trong nghiên cứu) [24].



Bảng 1.2. Các giá trị LD50 của các chất phân tích.
Tên chất
Brucin
Strychnin
Colchicin
Koumin
Scopolamin
Nicotin
Aconitin
Atropin

LD50 trên chuột đƣờng LD50 trên chuột đƣờng
uống (mg/kg)
tiêm (mg/kg)
150
12
2,2
0,16
5,886
100
1270
650
3
1
0,12
75
30

1.1.4.1. Brucin và strychnin

Brucin và strychnin đều là alkaloid đắng, brucin có liên quan chặt chẽ với
strychnin. Hai chất này xuất hiện ở một số loài thực vật, đƣợc biết đến nhiều nhất là
alkaloid chính trong vỏ, lá, hạt cây mã tiền đƣợc tìm thấy ở Đơng Nam Á. Hạt chứa
khoảng 1,5% strychnin, cịn hoa khơ chứa khoảng 1,023 %, ngay cả vỏ cây cũng
chứa các hợp chất độc, bao gồm cả brucin [5]. Strychnin là một alkaloid khơng
màu, ít tan trong dầu lửa và trong nƣớc, không tan trong ethyl eter. Strychnin trích
từ hạt cây mã tiền hay nhân, rất độc, chất strychnin đƣợc ghi vào bảng A của các
dƣợc điển
Trong y học dân gian, mã tiền dùng nhƣ thuốc bổ lành bệnh và kích thích sự
thèm ăn và là một loại thuốc vi lƣợng đồng căn, đƣợc dùng cho những vấn đề tiêu
hóa thơng thƣờng, nhạy cảm với nhiệt độ lạnh, cáu kỉnh khó chịu và sử dụng nhƣ
thuốc bổ cho hệ thống tuần hoàn trƣờng hợp bị chứng suy tim.
Strychnin dạng tinh thể sử dụng làm thuốc trừ sâu, đặc biệt là để giết chết
động vật có xƣơng sống nhỏ nhƣ các loài chim và động vật gặm nhấm. Strychnin
gây co giật cơ bắp và cuối cùng chết vì ngạt.


Đứng trên quan điểm dƣợc lý, strychnin là một chất kích thích chủ yếu vào
tủy sống, đây là hệ thống thần kinh trung ƣơng. Nó làm tăng cảm nhận giác quan
nhƣ: vị giác, khứu giác, thị giác. Với lƣợng vừa phải trung bình, hoạt động tác dụng
vào trung tâm hơ hấp nằm trong hành tủy ( bulle rachidien ) và gia tăng biên độ hô
hấp. Chất strychnin đƣợc sử dụng trong chữa trị những chứng rối loạn chức năng cơ
vòng ( sphinctériens ) nhất định, sự suy hô hấp và viêm đa thần kinh nghiện rƣợu.
Khi dùng với một liều rất nhỏ, theo Stille ( Système de Madica et thérapeutique,
1864 ): dùng trong rối loạn tiêu hóa, để gia tăng bài tiết dịch vị ở dạ dày, ở miệng ở
gan và ở tụy tạng. Nhƣng khi dùng quá liều có thể dẫn đến ngộ độc. Khi ngộ độc
strychnin, đƣợc thể hiện bởi những cơn động kinh co giật và đôi khi đƣa đến tử
vong vì ngạt thở.Vì vậy, strychnin khơng cịn sử dụng trong y học hiện đại, mặc dù
nó đã đƣợc sử dụng rộng rãi trong y học thời trƣớc thế chiến thứ hai. Liều duǹ g lam
̀

thuốc của strychnin sulfat là 1 mg/mL [12] [13].
Chất brucin gần giống nhƣ strychnin trong chức năng, nhƣng nhẹ hơn, ít độc
hơn, nó chỉ làm tê liệt hệ thần kinh vận động ngoại vi. Cho mục đích y tế, brucin
đƣợc sử dụng chủ yếu trong việc điều tiết huyết áp cao và bệnh tim tƣơng đối lành
tính khác. Brucin khơng phải là chất độc hại nhƣng một ngƣời tiêu thụ hơn 2 mg
brucin tinh khiết gần nhƣ chắc chắn sẽ bị các triệu chứng tƣơng tự nhƣ ngộ độc
strychnin và có thể gây tử vong ở liều lƣợng lớn [16] [27] [31].
1.1.4.2. Aconitin
Aconitin là một alkaloid độc có trong củ ấu tàu, còn gọi là củ gấu tàu, là rễ
củ của cây ô đầu Việt Nam, tên khoa học là Aconitum fortunei. Cây thƣờng mọc
hoang ở các vùng núi cao biên giới phía Bắc nƣớc ta: Lào Cai, Tun Quang, Hà
Giang... Ơ đầu đƣợc xếp vào loại thuốc rất độc (bảng A). Độc tính của aconitin rất
mạnh: Chỉ cần một liều từ 0,02 - 0,05 mg cho 1kg thể trọng là có thể gây chết
ngƣời. Ở nhiệt độ cao, aconitin bị phân hủy thành benzoylaconin và sau đó là
aconin kém độc hơn aconitin khoảng 1.000 đến 2.000 lần. Loại độc tố này thƣờng
đƣợc dùng để tẩm vào đầu tên khi săn thú rừng, kể cả…voi.


Trong Đông y, ấu tàu đƣợc dùng ngâm rƣợu để xoa bóp khi bị đau nhức, tê
mỏi chân tay. Tây y dùng làm thuốc ho, chữa chứng ra mồ hôi nhiều. Thƣờng chỉ
dùng làm thuốc uống khi đã qua chế biến cẩn thận và đƣợc dùng với liều nhỏ, có sự
chỉ định và theo dõi thận trọng của thầy thuốc.
Củ ấu tàu ngâm rƣợu chỉ dùng để xoa bóp. Nguy cơ bị ngộ độc thƣờng là
trong những trƣờng hợp uống nhầm tƣởng là rƣợu thuốc, để trong tầm với của trẻ,
khi dùng quá liều chỉ định của thầy thuốc. Ở một số tỉnh vùng cao nhƣ Lào Cai, Hà
Giang,… ngƣời dân thƣờng nấu cháo củ ấu tàu dùng nhƣ món đặc sản vùng cao.
Tuy nhiên nếu ăn những món ăn có củ ấu tàu chế biến chƣa đúng cách sẽ gây ngộ
độc. Biểu hiện của ngộ độc : Sau khi ăn, aconitin ngấm rất nhanh qua niêm mạc dạ
dày, ruột để vào máu gây nên các triệu chứng nhƣ tê miệng lƣỡi, nói khó, tê mỏi
chân tay, chuột rút, đau đầu, nhìn mờ, buồn nơn, nơn, ỉa chảy, nặng hơn có thể liệt cơ

hơ hấp, loạn nhịp tim,… Nếu khơng đƣợc điều trị kịp thời bệnh nhân sẽ tử vong
[16] [17].
1.1.4.3. Atropin
Atropin là một alkaloid tự nhiên chiết xuất từ cây bac̣ h anh
belladonna), cây cà đôc

dƣơ
c

(Datura meterl), giô

g cây
đôc

(Atropa

(Mandragora

officinarum) và các bộ phận của cây họ cà (Solanaceae). Atropin làm giãn đồng tử,
tăng nhịp tim, và làm giảm tiết nƣớc bọt và dịch tiết khác. Atropin đƣợc xếp vào
thuốc độc bảng A, liều độc atropin tác động lên não làm say có khi phát điên, hơ
hấp tăng, sốt, cuối cùng thần kinh trung ƣơng bị ức chế và tê liệt.
Atropin là một trong các alkaloid chính trong cây cà độc dƣợc có ở Việt
Nam, với hàm lƣợng cao nhất ở lá và hột. Hàm lƣợng toàn phần các alkaloid từ 0,20,5%, chủ yếu là scopolamin, hyoscyamin, atropin và các saponin, flavonoid,
tanin... Tác dụng dƣợc lý của cà độc dƣợc chủ yếu là do các alkaloid: làm giãn phế
quản, giãn đồng tử, giảm nhu động ruột và bao tử nếu những cơ quan này co thắt,
làm khô nƣớc bọt, dịch vị, mồ hôi. Theo Đông y, hoa cà độc dƣợc có vị cay, tính ơn,
có độc, có tác dụng ngừa suyễn, giảm ho, chống đau, chống co giật, phong thấp đau



nhức. Lá là vị thuốc ngừa cơn hen, giảm đau bao tử, chống say tàu xe. Ngồi ra cịn
điều trị phong tê thấp, đau dây thần kinh toạ, đau răng... Ngƣời ta thƣờng dùng


lá cuộn thành điếu hay thái nhỏ vấn thành điếu thuốc để hút (chữa ho, hen suyễn),
dùng lá hơ nóng đắp điều trị đau nhức, tê thấp, hoặc phơi khô tán bột mịn.Vì cây có
độc tính cao nên chỉ dùng theo sự hƣớng dẫn của thầy thuốc. Khi bị ngộ độc, có
hiện tƣợng giãn đồng tử, mờ mắt, tim đập nhanh, giãn phế quản, môi miệng khô,
khô cổ đến mức khơng nuốt và khơng nói đƣợc. Chất độc tác động vào hệ thần kinh
trung ƣơng, có thể gây tử vong do hôn mê [27] [31].
Atropin là alkaloid kháng thụ thể đối giao cảm M (Muscarin), tác dụng lên cả
trung ƣơng và ngoại biên. Atropin đƣợc dùng để ức chế tác dụng của hệ thần kinh
đối giao cảm. Với liều điều trị, Atropin có tác dụng yếu lên thụ thể Nicotin [12] [13].
1.1.4.4. Scopolamin
Scopolamin hay còn gọi là “hơi thở của quỷ” hoặc gọi tên khác là
Burundanga là một loại ma túy hay

ma

dƣợc

đƣợc

bào

chế

từ cây

Borrachero ở Colombia và có tác dụng gây mê đồng thời có khả năng làm mất đi

thần trí của con ngƣời và đƣa con ngƣời vào trạng thái bị thôi miên. Cây Borrachero
thuộc họ cà độc dƣợc và gần giống với cây loa kèn trắng. Scopolamin có đặc điểm
là không màu, không mùi và không vị nhƣng lại có khả năng tạo ra những giấc mơ
kỳ lạ cho con ngƣời khi hít phải thuốc này. Do cấu trúc hố học, thuốc có thể gây ra
tình trạng hoang tƣởng ảo giác rất mạnh. Đặc biệt, Scopolamin sẽ ngăn chặn ngay từ
giai đoạn đầu, khơng để kí ức đƣợc hình thành, những sự kiện xảy ra trong thời gian
thuốc ảnh hƣởng tới thần kinh con ngƣời sẽ không đƣợc ghi lại đến khi thuốc hết tác
dụng, ngƣời ta vẫn không tài nào nhớ nổi chuyện gì đã xảy ra, nó có thể gây ra tình
trạng mất trí nhớ ở mức độ tƣơng tự nhƣ thuốc an

thần diazepam. Nếu sử

dụng với liều cao thì có thể gây chết ngƣời, Scopolamin cịn làm con tim đập nhanh
hơn và gây ra tình trạng kích động. Scopolamin có thể biến ngƣời ta thành dạng
khơng có nhận thức giống nhƣ các thây ma sống/xác sốngnên ngƣời chịu ảnh
hƣởng của thuốc khơng thể nhớ chuyện gì đã xảy ra [12] [13] [31].
Scopolamin là một loại thuốc kháng cholinergic. Scopolamin có nhiều tác
dụng trong cơ thể bao gồm giảm sự tiết dịch, làm chậm dạ dày và ruột, làm giãn


nở con ngƣơi. Scopolamin đƣợc sử dụng để làm giảm buồn nơn, nơn, chóng mặt và
liên quan đến say tàu xe và phục hồi từ gây mê sau phẫu thuật. Scopolamin cũng
có thể đƣợc sử dụng trong điều trị bệnh Parkinson, hội chứng ruột kích thích, viêm
túi thừa [27].
1.1.4.5. Koumin
Koumin là một trong các alkaloid độc đƣợc tìm thấy trong lá ngón.Độc tính
của lá ngón là do các alkaloid chứa trong toàn bộ cây, trật tự độc giảm từ rễ, lá,
hoa, quả và thân cây. Tới 17 đơn phân alkaloid đã đƣợc chiết ra từ lá ngón trong đó
hàm lƣợng koumin là cao nhất. Ngƣời bị ngộ độc lá ngón có các triệu chứng khát
nƣớc, đau họng, chóng mặt, hoa mắt, buồn nơn… sau đó bị mỏi cơ, thân nhiệt hạ,

huyết áp hạ, răng cắn chặt, sùi bọt mép, đau bụng dữ dội, tim đập yếu, khó thở,
đồng tử giãn và chết rất nhanh do ngừng hô hấp. Tại Trung Quốc, nó đƣợc sử dụng
để điều trị eczema, bệnh trĩ, nhiễm trùng răng, phong (hủi), nhọt ngoài da, chống tổn
thƣơng và co thắt, nhƣng do độc tính cao nên chỉ hạn chế trong các ứng dụng ngoài
da [5] [27] [31].
1.1.4.6. Colchicin
Colchicin là chất độc tự nhiên đƣợc chiết xuất từ thực vật thuộc chi Colchicum
(nghệ tây) và từ cây tỏi độc. Nó đƣợc sử dụng để điều trị các bệnh thấp khớp, đặc
biệt là bệnh gút.Ngoài bệnh gút, colchicin đƣợc sử dụng để điều trị sốt, viêm màng
ngoài tim. Hiện nay ngƣời ta thấy conchicin gây hạ nhiệt, tăng huyết áp, tăng nhu
động một cách thái quá. Trên điểm nối thần kinh cơ (jonction neuro- musculaire),
conchicin gây nghẽn biểu hiện bằng tê liệt và nếu kéo dài biểu hiện teo cơ xƣơng.
Do tác dụng củacolchicin nên dùng tỏi độc có thể có những hiện tƣợng ngộ độc nhƣ:
nơn mửa, đi lỏng, đau bụng. Liều chết trung bình là 0.03mg đối với kg thể trọng,
1centigam đã gây cho ngƣời những hiện tƣợng ngộ độc, sự bài tiết chất độc của
conchicin chậm do đó những ngƣời viêm thận hay thiểu năng thận không nên dùng.
Liều dùng làm thuốc của colchicin là 1 mg, khi tiêm hàng ngày liều cao
hơn 1 mg thì colchicin sẽ tích tu ̣ ở mô và có thể
dân

đế n ngô ̣ đôc .


Colchicin đƣợc hấp thu ở ống tiêu hóa và đi vào vịng tuần hồn ruột-gan.
Nồng độ đỉnh huyết tƣơng xuất hiện sau khi uống 2 giờ. Colchicin ngấm vào các
mô, nhất là niêm mạc ruột, gan, thận, lách, trừ cơ tim, cơ vân và phổi. Colchicin
đƣợc đào thải chủ yếu theo phân và nƣớc tiểu (10-20%). Khi tiêm hàng ngày liều
cao hơn 1 mg thì colchicin sẽ tích tụ ở mơ và có thể dẫn đến ngộ độc.
Colchicin có nhiều tác dụng: chống bệnh gout, chống viêm không đặc hiệu,
chống phân bào, làm tăng sức bền mao mạch, kích thích tuyến vỏ thƣơng thận, phân

hủy tế bào lympho, ức chế phó giao cảm, kích thích giao cảm, chống ngứa, gây ỉa
chảy, ức chế in vitro khả năng ngƣng tập kết tập tiểu cầu [27] [31].
1.1.4.7. Nicotin
Nicotin là một alkaloid đƣợc tìm thấy trong các họ cây bac̣ h anh , cây họ Cà
(Solanaceae), chủ yếu là trong cây thuốc lá, và với hàm lƣợng thấp hơn trong cà
chua, khoai tây, cà tím, và tiêu xanh. Nicotin đƣợc tạo ra trong rễ và tích tụ trong lá
của cây. Nó chiếm khoảng 0,6-3,0% trọng lƣợng khơ của cây thuốc lá. Nó có chức
năng nhƣ một chất độc thần kinh rất mạnh với ảnh hƣởng rõ rệt đến các lồi cơn
trùng, do đó nicotin đƣợc sử dụng rộng rãi nhƣ một loại thuốc trừ sâu. Các chất
tƣơng tự nicotin nhƣ imidacloprid hiện đang sử dụng rộng rãi làm thuốc bảo vệ thực
vật. Với liều lƣợng nhỏ hơn (trung bình khoảng 1 mg nicotin hấp thụ), chất này hoạt
động nhƣ một chất kích thích trong động vật có vú, trong khi lƣợng cao (30-60 mg)
có thể gây tử vong. Hiệu ứng kích thích nàycó thể là một yếu tố chính đóng góp
vào các thuộc tính phụ thuộc hình thành của ngƣời hút thuốc lá (gây nghiện).Theo
Hiệp hội tim mạch Mỹ, nghiện thuốc lá có lịch sử là một trong những thói nghiện
ngập khó khăn nhất để phá vỡ, các đặc điểm dƣợc lý và hành vi để xác định nghiện
thuốc lá cũng tƣơng tự nhƣ nghiện heroin và cocain [24] [27] [31].
1.2.
1.2.1.

Các phƣơng pháp xác định
Phương pháp điện di mao quản
Đây là phƣơng pháp tách các chất phân tích là các ion hoặc các chất khơng

ion nhƣng có mối liên hệ chặt chẽ với các ion trong một ống mao quản hẹp chứa


đầy dung dịch đệm, đặt trong điện trƣờng. Do độ linh động điện di của các ion khác
nhau, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.
Tác giả Hua-Tao Feng và Sam F.Y Li và cộng sự đã phát triển phƣơng pháp

xác định 5 alkaloid độc trong hai loại thuốc thảo dƣợc phổ biến bằng phƣơng pháp
điện di mao quản. Các chất aconitin, mesaconitin, hypaconitin, benzoylaconin,
benzoylmesaconin đƣợc phân tích chỉ trong 15 phút bằng đệm có chứa amonium
acetat 40 mM và acid acetic 0,1% acid trong methanol 80%. Khoảng tuyến tính từ
2 ÷ 200 mg/L. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp từ 0,85 đến 1,90 mg/L. Độ thu
hồi trong khoảng 95 ÷ 108,8% [22].
Cũng sử dụng phƣơng pháp điện di mao quản để phân tích alkaloid nhƣng
với kỹ thuật sắc ký điện động micell (micellar electrokinetic chromatography,
MEKC). Đây là phƣơng pháp điện di trong đó các chất đƣợc tách ra bởi sự phân bố
khác nhau của chúng trong các micell (đƣợc xem nhƣ là một pha tĩnh giả) và dung
dịch đệm (pha động). Trong MEKC, các chất hoạt động bề mặt đƣợc thêm vào dung
dịch đệm ở nồng độ lớn hơn nồng độ micell tới hạn. Trong phần lớn trƣờng hợp,
MEKC đƣợc tiên hành trong môi trƣờng kiềm. Natri dodecyl sulfat (SDS) là chất
hoạt động bề mặt thƣờng sử dụng nhất.
Nhóm tác giả Yu L, Xu Y, Feng H đã xây dựng phƣơng pháp xác định các
độc tố alkaloid nhóm pyrrolizidin trong thuốc thảo dƣợc truyền thống Trung Quốc.
Các chất senkirkin, senecionin, retrorsin và seneciphyllin đƣợc tách bằng dung dịch
đệm có chứa borat 20 mM, SDS 30 mM và methanol 20 % ở pH 9,1. Giới hạn phát
hiện của các chất trong khoảng 1,19 ÷ 2,70 µg/mL; giá trị RSD đều nhỏ hơn 5 %.
[34]
1.2.2.

Phương pháp sắc ký lỏng với detector UV
Phƣơng pháp sắc ký lỏng rất phù hợp cho việc xác định các alkaloid nên nó

đƣợc sử dụng rộng rãi. Các tác giả nghiên cứu bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng trên
nhiều loại detector khác nhau trong đó có detector UV. Nguyên lý: chất phân tích
sau khi tách khỏi cột sắc ký bằng hệ pha động đƣợc dẫn vào flowcell đo đƣợc chiếu