ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

*****

Bùi Thị Thùy Dung

PHÂN LẬP CÁC CHẤT TỪ DỊCH CHIẾT VI KHUẨN LAM
CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ TĂNG TRƢỞNG
MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO UNG THƢ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2016


Bùi Thị Thùy Dung

PHÂN LẬP CÁC CHẤT TỪ DỊCH CHIẾT VI KHUẨN LAM
CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ TĂNG TRƢỞNG
MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO UNG THƢ

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Cán bộ hƣớng dẫn: TS. Phạm Thị Lƣơng Hằng
PGS. TS. Hoàng Thị Mỹ Nhung


Luận văn cao học

2016

LỜ I CẢ M ƠN

Bùi Thị Thùy
Dung

Lời đầu tiên, tôi xin gƣ̉ i lời cảm ơn sâu sắc nhất tới TS. Phạm Thị Lƣơng
Hằng và PGS.TS. Hoàng Thị Mỹ Nhung, ngƣơì đã trƣc tiế p hƣơ ng
́
dân
điều kiên thuân lơ , giúp đỡ tôi trong suốt qua trình
i hoc

, tạo moi

tâ và hoaǹ thaǹ h luân
p

văn. Cac cô không chỉ là những ngƣời truyền đạt cho tôi những kiến thức mà cịn
hỗ trợ tơi rất nhiều về vật chất. Tôi thấy mình thật may mắn khi đƣợc là học trị
của cac cơ.
Tơi xin gƣ̉ i lơì cam
̉ ơn chân thaǹ h nhất tơí ThS. Bùi Thị Vân Khánh, ThS.
Nguyê Đắ c Tu , nhƣñ g ngƣơi chi ̣, ngƣơi anh tân tinh hƣơ ng
́
̀
̀
́
̀

n
dân
thuâṭ đầ u tiên khi bƣớ c chân và o phò ng thí
nghiêm
cho tôi nhƣ̃ ng kinh
nghiêm

trong công
viêc

trong
cuôc

tôi nhƣñ g ki

. Anh, chị không chỉ truyền đạt
mà cả nhƣ̃ ng kinh
nghiêm

quý baú

sống, đó sẽ là nhƣn
̃ g haǹ h trang mà tôi sẽ luôn mang theo sau naỳ .
Xin gửi lời cảm ơn đến CN. Nguyễn Thị Thu Hà, CN. Hà Hữu Cƣờng,

CN. Nguyễn Thị Loan, CN. Vũ Anh Công đã nhiệt tình giúp đỡ tơi trong qua
trình làm thí nghiệm.
Xin gƣ̉ i lờ i cả m ơn sâu sắ c nhấ t tớ i cá c thầ y cô và cá n bô ̣ trong Khoa Sinh
học, đăc biêṭ la cac thầy cô trong
̀ ́

hoc

Bô ̣môn Sinh

tế bào và Bộ môn Sinh lí

Thực vật và Hóa sinh đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành lu ận
văn này.
Và, tôi xin chân thaǹ h cam
̉ ơn cać anh chi ̣, cac bạn và cac em trong Phịng
thí nghiệm Ni cấy Tế bào ngƣời và động vật cũng nhƣ Phòng thí nghiệm
iii


Luận văn cao học
Bùi Thị Thùy
Nuôi cấy Mô thực vật và Vi tảo đã luôn đồng hành , quan
tâm và giúp đỡ tôi
2016
Dung
trong thời gian tham gia nghiên cƣ́ u taị đây . Sƣ̣ quan tâm , chia sẻ của cac bạn
và
cac em là động lực lớn lao với tôi trong những lúc mệt mỏi và khó khăn nhất . Tôi
sẽ không bao giờ quên thời gian làm việc đầ y ắp tiếng cƣơì cuǹ g cać ban
gia đinh
̀ lớn ở trƣờng Đại học khoa học tự nhiên Hà Nội.

iv

trong hai



Xin gửi lời cảm ơn đến Quỹ phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia
(NAFOSTED) đã tài trợ kinh phí cho nghiên cứu này trong đề tài mang mã số
106.16-2012.24
Cuối cùng, tôi xin gƣ̉ i lòng biết ơn sâu sắc và lớn lao nhất đến gia đình tôi ,
nhƣñ g ngƣơì đã hy sinh cả vâṭ chất và tinh thần , luôn yêu thƣơng , ủng hộ, đôn g
viên và tôn tron g moi quyêt́ đin h cuả tôi . Mỗi khi nghĩ về gia điǹ h tôi nhƣ đƣơc
tiếp thêm sƣ́ c man h để vƣ̃ng tin hoàn thành tốt luận văn này.

Hà Nội, tháng 12 năm 2016
Học viên

Bùi Thị Thuỳ Dung


BẢNG KÍ HIỆU CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT
Tƣ̀ viết tắ t Tên tiếng Anh

Tên tiếng Việt

ED50

Median effective dose

Liều có hiệu quả ở 50% số
động vật thí nghiệm

EtOAc


Ethyl acetate

Dung mơi ethyl acetate

HCT116

Human colon carcinoma cell

Dòng tế bào ung thƣ
đại trực tràng

HepG2

Hepatocellular carcinoma G2

Dịng tế bào ung thƣ gan

IC50

Half maximal inhibitory
concetration

Nờng độ ức chế 50% số tế
bào

LC/MS

Liquid chromatography–mass
spectrometry


Sắc kí lỏng - khối phổ

LD50

Median lethal dose 50%

Liều gây chết trung bình

MCF7

Breast adenocarcinoma cell

Dòng tế bào ung thƣ vú

MeOH

Methanol

Dung môi methanol

Minimal inhibitory
MIC

concentration

Nồng độ ức chế tối thiểu

n-Hex

n-Hexan


Dung môi n-Hexan

OD

Optical Density

Mật độ quang học

SRB

Sulforhodamine B

Sulforhodamine B

TLC

Thin-layer chromatography

Sắc kí bản mỏng

MỤC LỤC


MỞ ĐẦU............................................................................................................... 1
Chƣơng 1- TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................... 2
1.1. Vi khuẩn lam.................................................................................................. 2
1.1.1. Đặc điểm hình thai và sinh lí của vi khuẩn lam...................................2
1.1.2. Phân loại vi khuẩn lam.........................................................................3


1.2. Tiềm năng phat triển dƣợc phẩm điều trị ung thƣ từ vi khuẩn lam................4
1.3. Cac hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học từ vi khuẩn lam.....................9
1.4. Phân tach cac hợp chất thiên nhiên từ vi khuẩn lam.....................................13
Chƣơng 2- VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...........................15
2.1. Vật liệu.........................................................................................................15
2.1.1. Cac chủng vi khuẩn lam....................................................................15
2.1.2. Dịng tế bào.......................................................................................16
2.2. Cac nội dung chính trong nghiên cứu...........................................................17
2.3. Cac phƣơng phap nghiên cứu.......................................................................17
2.3.1. Đanh gia khả năng ức chế sự tăng sinh tế bào...................................17
2.3.2. Chuẩn bị dịch chiết từ sinh khối vi khuẩn lam Nostoc sp. APD4......19
2.3.3. Phƣơng phap sắc kí cột silica gel......................................................20
2.3.5. Phƣơng phap LC/MS........................................................................21
Chƣơng 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.........................................................22
3.1. Đanh gia khả năng ức chế tăng sinh tế bào ung thƣ.....................................22
3.1.1. Kết quả hoạt hóa tế bào......................................................................22
3.1.2. Xac định chỉ số IC50 của cac dịch chiết từ vi khuẩn lam....................22

3.2. Phân lập cac chất có hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào từ vi khuẩn lam Nostoc
sp. APD4.............................................................................................................29
3.2.1. Sự phân tach bằng cột sắc ký silica gel..............................................29
3.2.2. Sự phân tach bằng cột sắc kí sillica gel lần 2.....................................32
3.2.3. Sự phân tach bằng cột sắc kí silica gel lần 3......................................35

3.3. Xac định khối lƣợng phân tử của hoạt chất bằng phƣơng phap LC/MS......37


KẾT LUẬN.........................................................................................................43
KIẾN NGHỊ........................................................................................................44
TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................... 45

PHỤ LỤC

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của Cryptophycin 1 [36]..............................................5


Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của Borophycin [17]...................................................7
Hình 2.1. Cac chủng vi khuẩn lam dùng trong nghiên cứu....................................16
Hình 3.1. Cac dòng tế bào ung thƣ dùng trong phép thử hoạt tính........................22
Hình 3.2. Tế bào MCF7 ở mẫu đối chứng sau 48h thử nghiệm.............................23
Hình 3.3. Tế bào MCF7 dƣới tac dụng của dịch chiết APD4- EtOAc..................24
Hình 3.4. Tế bào HCT116 dƣới tac dụng của dịch chiết APD4- EtOAc...............24
Hình 3.5. Tế bào HepG2 dƣới tac dụng của dịch chiết APD4- EtOAc.................24
Hình 3.6. Đƣờng cong đap ứng liều của cac dịch chiết có hoạt tính trên hai dịng tế
bào MCF7 và HCT116..........................................................................................27
Hình 3.7. Đƣờng cong đap ứng liều của dòng tế bào MCF7 đối với Taxol...........28
Hình 3.8. Cac phân đoạn rửa giải từ dịch chiết APD4-Met...................................30
Hình 3.9. Hình dạng tế bào MCF7 khi đƣợc ủ với phân đoạn DE5......................32
Hình 3.10. Sắc kí cột silica gel cho phân đoạn có hoạt tính (DM-E).....................33
Hình 3.11. Tế bào MCF7 khi ủ với phân đoạn DP1 và DP5 ở nờng độ 50µg/ml . 34
Hình 3.12. Sắc ký đồ TLC của phân đoạn DP1 và DP5.......................................35
Hình 3.13. Tế bào MCF7 dƣới tac dụng của phân đoạn DF4................................36
Hình 3.14. Sắc kí đờ của phân đoạn DF2 ở bƣớc sóng 256nm.............................37
Hình 3.15. Sắc kí đờ của phân đoạn DF4 ở bƣớc sóng 256nm.............................38
Hình 3.16. Phổ khối lƣợng của hợp chất P3 xuất hiện ở phút 23,6.......................39
Hình 3.17. Kết quả tra cứu hợp chất có trọng lƣợng phân tử từ 795-796 dalton
thang 10/2016........................................................................................................40
Hình 3.18. Công thức cấu tạo của Apratoxin E [26].............................................41

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Một số chất có khả năng khang ung thƣ đƣợc phân lập từ vi khuẩn lam
[39].......................................................................................................................... 8
Bảng 2.1. Cac chủng vi khuẩn lam dùng trong thí nghiệm đanh gia hoạt tính.......15


Bảng 3.1. Gia trị tăng sinh A% của cac dịch chiết có hoạt tính ức chế sự tăng sinh
tế bào dòng MCF7.................................................................................................25
Bảng 3.2. Gia trị tăng sinh A% của cac dịch chiết có hoạt tính ức chế sự tăng sinh
tế bào dòng HCT116.............................................................................................26
Bảng 3.3. Gia trị IC50 của một số dịch chiết có hoạt tính.......................................27
Bảng 3.4. Gia trị IC50 của Taxol trên ba dòng tế bào MCF7, HCT116 và HepG2 28
Bảng 3.5. Khối lƣợng cac phân đoạn từ dịch chiết của chủng APD4....................31
Bảng 3..6. Khối lƣợng khô của cac phân đoạn thu đƣợc từ cột silica gel lần 2....34
Bảng 3.7. Khối lƣợng cac phân đoạn thu đƣợc từ cột sắc ký silica gel lần 3........36
Bảng 3.8. Tỷ lệ tƣơng đối về hàm lƣợng của cac chất trong phân đoạn DF4.......38


Luận văn cao học
2016

Bùi Thị Thùy
Dung

MỞ ĐẦU
Sự xuất hiện của bệnh ung thƣ đã và đang là mối đe dọa tính mạng con
ngƣời hàng đầu trên thế giới vớ i tỷ lệ mắc phải ngày càng tăng . Theo số liêu baó
cao của Viện nghiên cứu quốc tế về ung thƣ , trong năm 2012, trên toàn thế giới
có hơn 8,2 triệu ngƣời chết vì cac loại bệnh ung thƣ khac nhau. Cac chuyên gia
cảnh bao nếu con ngƣời không sớm tìm đƣợc biện phap hữu hiệu để ngăn chặn
tốc độ phat triển nhƣ hiện nay của căn bệnh này thì tới năm 2035, ung thƣ


sẽ

cƣớp đi sƣ ̣ số ng củ a ít nh ất 24 triệu ngƣờ i [14]. Hóa trị và xạ trị từ lâu là phƣơng
phap đƣợc sử dụng phổ biến trong điều trị ung thƣ, tuy nhiên hai phƣơng

phap

này có nhiều tac dụng phụ, ảnh hƣởng xấu tới sức khỏe ngƣời bệnh, hoặc ngƣời
bệnh có thể tử vong trƣớc khi tiêu diệt đƣợc tận gốc cac tế bào ung thƣ. Bởi vâỵ ,
viê tìm ra
c môt

loaị thuốc đăc hiê điều tri ̣ung thƣ và an tồn v ới ngƣời bệnh là
u

mơt vấn đề r ất cấp bach hiên nay . Trong công cuộc tìm kiếm đó, cac hợp chất từ
́
thiên nhiên đƣợc quan tâm nhiều hơn cả bởi chúng đã có mặt trong cac bài thuốc
dân gian từ lâu và có độ an toàn cao.
Vi khuẩn lam là nguồn giàu cac hợp chất có hoạt tính sinh học với tiềm
năng dƣợc phẩm có ý nghĩa quan trọng. Chúng cho thấy khả năng chống lại cac
khối u, khang virus, khang khuẩn, khang nấm. Một số hợp chất đƣợc phân lập và
tinh sạch từ vi khuẩn lam đã cho kết quả bƣớc đầu thành công trong cac thử
nghiệm điều trị ung thƣ lâm sàng. Cac hợp chất này đƣợc xem là hợp chất tiên
phong cho sự phat triển, tổng hợp cac hợp chất dẫn với hoạt tính sinh học tốt hơn.
Từ cac kiến thức nhƣ trên, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Phân lập
chất từ dịch chiết vi khuẩn lam có khả năng ức chế tăng trƣởng một số

cac


dịng tế

bào ung thƣ” với mục đích:
1. Đánh giá được khả năng ức chế tăng trưởng của dịch chiết từ 9 chủng vi
khuẩn lam lên 3 dòng tế bào ung thư phổ biến ở Việt Nam.
11


Luận văn cao học
Bùi Thị Thùy
2. Tìm ra được hợp chất có khả năng kháng ung thư từDung
dịch chiết vi khuẩn lam
2016

12


Chƣơng 1- TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Vi khuẩn lam

1.1.1.

Đặc điểm hình thái và sinh lí của vi khuẩn lam
Vi khuẩn lam là vi khuẩn quang hợp cổ xƣa, xuất hiện trên trai đất từ 3,5 tỉ

năm về trƣớc. Bằng việc tạo ra khí oxy nhƣ một sản phẩm phụ của qua trình quang
hợp, vi khuẩn lam đƣợc cho là đã chuyển đổi khí quyển ở thời kì sơ khai từ tính

khử sang tính ơ-xi hóa, từ đó làm thay đổi thành phần sự sống trên Trai Đất. Chính
vì vậy, chúng đƣợc xem là nhóm sinh vật tiên phong trong qua trình sản xuất ra khí
oxy giúp hình thành sự sống trên Trai Đất ngày nay.
Vi khuẩn lam trƣớc đây còn đƣợc biết đến với tên gọi là tảo lam bởi chúng
có cơ chế quang hợp giống tảo (nhóm sinh vật nhân chuẩn) với sắc tố quang hợp
nằm trên màng thylakoid. Tuy nhiên, cấu tạo tế bào của chúng giống với sinh vật
nhân sơ (Prokaryote) hơn là sinh vật nhân chuẩn (Eukaryote) vì chúng không có
màng nhân, vật liệu di truyền không liên kết với protein histone, thiếu màng bao
quanh cac bào quan nhƣ bộ may Golgi, lục lạp, ty thể, lƣới nội chất. Vi khuẩn lam
có ribosome 70S và có cấu trúc thành tế bào gồm cac lớp peptidoglycan. Màu
xanh của vi khuẩn lam là do sự kết hợp của chlorophyll a (xanh lục) và cac sắc tố
phụ phycocyanin (xanh lam), allophycocyanin (xanh lam), phycoerythin (màu đỏ).
Cac sắc tố này kết hợp với nhau theo tỷ lệ và thành phần nhất định để thích ứng
với mơi trƣờng sống [9].
Vi khuẩn lam có hai hệ thống quang hệ I và II nằm trên màng thylakoid (trừ
chi Gleobacter). Trong quang hệ II có phycobiliprotein có chức năng giống cac sắc
tố “ăng-ten” bắt giữ năng lƣợng sang cho chlorophyll a. Năng lƣợng anh sang sau
đó sẽ đƣợc chuyển từ quang hệ II sang quang hệ I - nơi chúng đƣợc chuyển thành
năng lƣợng hóa học trong đó có phân tử cao năng lƣợng nhƣ ATP và NADPH+H.
Phân tử cao năng này sẽ đƣợc sử dụng để cố định CO 2 thành carbohydrate thông
qua chu trình Calvin. Vi khuẩn lam thực hiện quang hợp trong điều kiện hiếu khí
với H2O là chất cho điện tử và O2 là sản phẩm phụ đƣợc tạo ra.


Tuy nhiên, một số chủng vi khuẩn lam có thể sống trong điều kiện kị khí bằng
cach sử dụng quang hệ I và chất cho điện tử H2S, H2 hoặc cac hợp chất hữu cơ [9].
Vi khuẩn lam có thể đƣợc tìm thấy gần nhƣ trong mọi môi trƣờng sống trên
đất liền nhƣ đất, đa ẩm, đa trong cac hoang mạc thậm chí kể ca cac loại đa tại châu
Nam Cực và trong môi trƣờng nƣớc nhƣ trong cac đại dƣơng, môi trƣờng nƣớc
ngọt [8].

Vi khuẩn lam đã và đang đƣợc nghiên cứu trong một số lĩnh vực, đem lại
gia trị kinh tế vô cùng to lớn nhƣ:
 Làm phân bón sinh học cho lúa và cac cây trồng khac bởi nhiều chủng vi khuẩn lam
có cac tế bào dị hình, có khả năng cố định nitơ khí quyển giúp tăng năng suất cây
trồng.
 Vi khuẩn lam là một nguồn protein đơn bào có ý nghĩa quan trọng. Cac chủng không
độc nhƣ Spirulina sp. đã đƣợc nuôi trên quy mô lớn để làm thực phẩm bổ sung cho
ngƣời và làm thức ăn giàu protein cho gia súc.
 Cac chất chuyển hóa thứ cấp từ vi khuẩn lam là nguồn dƣợc liệu quan trọng cho việc
phat triển thuốc và điều trị bệnh.
1.1.2. Phân loại vi khuẩn lam
Phân loại sinh học là một phƣơng phap theo đó cac nhà sinh học lập nhóm
và phân loại cac loài sinh vật theo những nguyên tắc nhất định. Mỗi nhóm sinh vật
có tên gọi riêng và đƣợc phân định dựa trên những đặc điểm xac định về hình thai,
trình tự DNA,…Căn cứ vào mối quan hệ giữa cac nhóm, ngƣời ta sắp xếp chúng
theo thứ tự bằng hoặc phân cấp cao hơn trên cây phân loại.
Dựa trên hệ thống phân loại vi khuẩn của Bergey, vi khuẩn lam đƣợc chia
thành 5 bộ [41]:
 Bộ Chroococcales: Dạng đơn bào, tế bào dạng đơn lẻ hoặc tập trung lại thành đam.
Cac tế bào phân chia theo 1; 2 hoặc 3 mặt phẳng đối xứng hoặc nảy chồi. Ví dụ
cac chi: Microcystis, Prochlorococcus, Prochloron, Synechoccus.


 Bộ Pleurocapsales: Dạng đơn bào, tế bào dạng đơn lẻ hoặc tập trung lại thành đam.
Ví dụ cac chi: Chroococcidiopsos, Myxosarcina, Pleurocapsa.
 Bộ Oscillatoriales: Dạng sợi đơn, không có tế bào dị hình. Ví dụ cac chi:
Oscillatoria, Spirulina, Lyngbya, Trichodesmium, Planktothrix.
 Bộ Nostocales: Dạng sợi, không phân nhanh, có tế bào dị hình, có khả năng cố định
nitơ. Ví dụ cac chi: Nostoc, Calothrix, Nodularia.
 Bộ Stigonematales: Dạng sợi, phân nhanh, có tế bào dị hình để cố định nitơ. Ví dụ

cac chi: Fischerella, Hapalosiphon, Westiellopsis.
Sự phân loại vi khuẩn lam truyền thống thƣờng dựa trên hình thai của
chúng. Tuy nhiên, chỉ dựa vào tiêu chí hình thai có thể khơng chính xac vì một số
chủng vi khuẩn lam có sự thay đổi về hình thai khi đap ứng với cac điều kiện môi
trƣờng khac nhau. Sử dụng cac trình tự DNA 16S để làm thƣớc đo phân loại đang
là hƣớng đi nhiều tiềm năng vì DNA không bị ảnh hƣởng bởi cac điều kiện môi
trƣờng. Sự kết hợp giữa phƣơng phap truyền thống và phƣơng phap hiện đại giúp
qua trình phân loại vi khuẩn lam chuẩn xac hơn.
1.2.

Tiềm năng phát triển dƣợc phẩm điều trị ung thƣ từ vi khuẩn lam
Trong số 974 hợp chất mới đƣợc giới thiệu làm thuốc trên thế giới những

năm 1981-2006, 63% có nguồn gốc từ cac sản phẩm thiên nhiên. Trong đó, 6% là
cac sản phẩm thiên nhiên, 33% là cac dẫn xuất tổng hợp dựa trên cac kiến thức thu
đƣợc từ cac sản phẩm tự nhiên và 24% là sản phẩm bắt chƣớc sản phẩm tự nhiên.
Bên cạnh đó, đối với cac dƣợc phẩm điều trị ung thƣ, 78% là sản phẩm tự nhiên
hoặc có nguồn gốc từ cac sản phẩm tự nhiên [29]. Đại đa số cac sản phẩm tự nhiên
bắt nguồn từ nấm, vi khuẩn và thực vật. Hiện nay, cac nhà khoa học đang nghiên
cứu phat triển nguồn dƣợc phẩm từ hợp chất thiên nhiên theo hai hƣớng, đó là:
phân tích sâu hơn cac hợp chất có mặt trong nguồn tài nguyên cũ đã đƣợc biết đến
và hƣớng tới nguồn tài nguyên mới dồi dào, phong phú hơn. Trong đó, vi khuẩn
lam đang là đối tƣợng tiềm năng đƣợc chú ý theo hƣớng nghiên cứu thứ hai.


So sanh với cac loại thuốc từ vi khuẩn nói chung, vi khuẩn lam nổi trội hơn
hẳn nhờ có mặt những hợp chất tiềm năng khang ung thƣ. Cac nhà nghiên cứu đã
chỉ ra 6% đến 10% dịch chiết từ vi khuẩn lam đang đƣợc nuôi cấy có khả năng tiêu
diệt tế bào ung thƣ ở ngƣời, 0,8% trong tổng số 2000 dịch chiết vi khuẩn lam có
độc tính đối với cac khối u rắn [27]. Theo bao cao của Patterson, ông và cộng sự

đã tiến hành sàng lọc trên quy mô lớn sử dụng 1000 chủng vi khuẩn lam từ cac
môi trƣờng sống khac nhau. Qua trình sàng lọc đã cho thấy khoảng 7% dịch chiết
có khả năng ức chế sự tăng sinh của dòng tế bào ung thƣ KB [31].
Cac nghiên cứu của Gerwick và cộng sự tập trung vào việc sàng lọc cac hợp
chất khang ung thƣ của cac chủng vi khuẩn lam sống trong môi trƣờng nƣớc biển.
Kết quả nghiên cứu cho thấy có tới 40% cac chất từ vi khuẩn lam thu đƣợc có hoạt
khả năng chống lại ung thƣ, ngăn ngừa khối u. Chúng cũng là nguồn giàu cac hợp
chất peptide và polyketide, cac hợp chất có hoạt tính sinh học mạnh có thể là
nguồn hợp chất tạo dƣợc phẩm khang ung thƣ mới [16].
Một số lƣợng lớn cac hợp chất đƣợc phân lập từ vi khuẩn lam có hoạt tính
ức chế sự trùng hợp tubulin đang là đối tƣợng đƣợc nghiên cứu để phat triển thuốc
khang ung thƣ.
Đƣợc phân lập từ vi khuẩn lam Nostoc sp. ATCC 53789, Cryptophycin là
một trong những ứng cử viên đƣợc phat hiện sớm và có tiềm năng cao cho loại
dƣợc phẩm mới chống ung thƣ. Ở nhóm Cryptophycin có hơn 25 thành viên

có

hoạt động mạnh gây bất ổn tubulin, trong đó Crytophycin 1 có hoạt tính mạnh
nhất [36].

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của Cryptophycin 1 [36].


Curacin A đƣợc phân lập từ chủng vi khuẩn lam Lyngbya majuscule có khả
năng ức chế sự tăng sinh tế bào và có độc tính mạnh với cac tế bào ung thƣ đại
tràng, thận và vú. Chúng hoạt động bằng cach liên kết với vị trí bam trên tubulin
ngăn cản sự tổng hợp vi ống, từ đó ức chế sự phân chia và tăng sinh tế bào. Tuy
nhiên Curacin A ít tan trong nƣớc vì vậy khi tiến hành thử nghiệm trên mô hình in
vivo đã gặp nhiều khó khăn. Để khắc phục hiện tƣợng trên, cac nhà khoa học đã

tìm cach tổng hợp hợp chất có đặc tính sinh học tƣợng tự Curacin A với tính tan
tốt hơn [15, 40].
Dolastatin 10 đƣợc phân lập lần đầu tiên vào năm 1987 bởi Pettit từ loại
sinh vật biển Dolabella auricularia và đƣợc Luesch phân lập từ vi khuẩn lam
Symploca sp. năm 2001. Dolastatin 10 ức chế ức tăng sinh tế bào trong cac thử
nghiệm in vivo ở cac bệnh bạch cầu, u lympho [35].
Một thành viên khac trong nhóm Dolastatin là Dolastatin 15 cịn đƣợc dùng
trong thử nghiệm trên mơ hình in vitro với hoạt tính sinh học tƣơng tự là ức chế
tăng sinh tế bào và ức chế sự gia tăng kích thƣớc khối u động vật. Tuy nhiên, hợp
chất này có hiệu suất tổng hợp rất thấp và khả năng tan trong nƣớc hạn chế. Chính
điều này đã thơi thúc cac nhà khoa học tổng hợp thành công cac chất có hoạt tính
sinh học tƣơng tự Dolastatin 15 với hiệu suất tổng hợp cao, tính tan ổn định, đó là:
ILX-651 và LU3793. Cac chất này đã đƣợc thử nghiệm lâm sàng tại pha II. Nhìn
chung, cac hợp chất Dolastatin có cơ chế hoạt động ức chế qua trình lắp rap vi ống
khi bam vào tubulin. Ngồi ra, chúng cịn tham gia vào qua trình apoptosis thông
qua sự can thiệp vào protein Bcl-2 [35].
Hai chất có khả năng gây độc đến tế bào đƣợc nhiều nghiên cứu đề cập đến
đó là: Borophycin và Apratoxin A. Borophycin là phức hợp của boron và
polyketide đƣợc phân lập từ vi khuẩn lam Nostoc linckia và Nostoc
spongiaeforme. Borophycin có khả năng khang ung thƣ ở dòng tế bào ung thƣ
biểu bì và ung thƣ đại trực tràng ở ngƣời [17].


Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của Borophycin [17].
Apratoxin A là chất chuyển hóa thứ cấp đƣợc phân lập lần đầu tiên từ vi
khuẩn lam Lyngbya majuscule. Apratoxin A có cấu trúc hỗn hợp peptidepolyketide dạng vịng, gờm một vịng thiazoline. Đây là chất có khả năng gây độc
mạnh đối với tế bào ung thƣ bởi khả năng kích thích tế bào phân chia bị bắt giữ ở
pha G1, gây ra qua trình apoptosis (chết theo chƣơng trình). Mặc dù chất này có
khả năng gây độc ở 60 dòng tế bào khối u nhƣng cac nhà nghiên cứu vẫn chƣa tìm
ra cơ chế hoạt động của chúng [4].

Theo nghiên cứu của Martins và cộng sự khi cho tế bào HL-60 tiếp xúc với
dịch chiết của cac chủng vi khuẩn lam Synechocytis sp. và Synechococcus sp. đã
có hiện tƣợng apoptosis xuất hiện ở tế bào thử nghiệm. Cụ thể, có sự biến đổi ở
phần màng tế bào, tế bào bị co rút và bắt đầu xuất hiện hiện tƣợng phân mảnh
nhân. Bên cạnh đó, một glycoside đƣợc phân lập từ Lyngbya sp. hay Anabaena sp.
cũng tham gia vào qua trình thúc đẩy tế bào ung thƣ tham gia vào chu trình
apoptosis với dấu hiệu ban đầu là ngƣng tụ chất nhiễm sắc và phân mảnh nhân.
Cac sản phẩm từ dịch chiết vi khuẩn lam (Bảng 1.1) còn gây ảnh hƣởng đến sự
sinh trƣởng và phat triển của cac dòng tế bào ung thƣ, đƣa chúng vào chu trình
chết tế bào thông qua cac hoạt động nhƣ: bắt giữ tế bào trong chu kì tế bào, làm
rối loạn chức năng ty thể, lạp thể, gây ra cac hoạt động oxi hóa, thay đổi caspase
để ngăn chặn không cho chúng tham gia vào cac qua trình cắt nối hay thay đổi họ
protein Bcl-2 và thay đổi hoạt động của cac kênh vận chuyển trên màng ty thể, đây
đều là những con đƣờng trực tiếp dẫn tới apoptosis [7].


Bảng 1.1. Một số chất có khả năng khang ung thƣ đƣợc phân lập từ
vi khuẩn lam [37].
STT

Tên chất

Từ vi khuẩn lam

Dòng tế bào tac động

1

Ankaraholide A


Geitlerinema sp.

Cac dòng tế bào ung
thƣ: phổi H460, vú
MDA-MB 435, đại
trƣc tràng LoVo, vòm
họng KB

2

3

Apratoxin A-G

Belamide A

Lyngbya majuscule

Ung thƣ mau U2OS,

Lyngbya sp.

cổ tử cung HeLa, phổi

Lyngbya sordida

H460, đại trực tràng

Lyngbya bouilloni


HCT116.

Symploca sp.

Ung thƣ đại trực tràng
HCT116

4

Calothrixin A

Calothrix sp.

Ung thƣ cổ tử cung
HeLa

5

Caylobolide A

Lyngbya majuscula

Ung thƣ đại trực tràng
HCT116

6

Dolastatin 10

Symploca sp.


Ung thƣ phổi cac
dòng: H69, H82,
H446 và H510, ung
thƣ mau lympho.

7

Cryptophycin 1

Nostoc sp.

Ung thƣ vú ở ngƣời
MDA-MB-435, ung
thƣ phổi A549.

8

Curacin A

Lyngbya majuscula

Ung thƣ phổi A549

9

Symplostatin 1

Symploca hydnoides


Ung thƣ vú ở ngƣời
MDA-MB-435


10

Malevamide D

Symploca hydnoides

Ung thƣ phổi A549,
HT29, ung thƣ da
SKMEL-28.

1.3.

Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học từ vi khuẩn lam
Hợp chất tự nhiên (hay hợp chất thiên nhiên) là cac chất hóa học có nguồn

từ tự nhiên hoặc đƣợc con ngƣời tach ra từ cac loài động vật, thực vật có trong tự
nhiên có thể có hoạt tính sinh học hoặc tac dụng dƣợc học dùng để làm thuốc [5].
Chúng là nguồn cung cấp cac cấu trúc dẫn đƣờng để tổng hợp cac chất tƣơng tự
nhƣng đạt hiệu quả dƣợc lí và an tồn cao hơn, đƣợc xem là mốc khởi đầu trong
qua trình tổng hợp và sản xuất thuốc.
Vào năm 1891, Albrecht Kossel đề xuất chia cac hợp chất tự nhiên thành
hai nhóm chính, đó là: cac hợp chất sơ cấp và cac hợp chất thứ cấp [22]. Trong đó,
cac hợp chất thứ cấp không thực sự cần thiết cho sự sống của bản thân sinh vật
nhƣng chúng gây tac động đến cac sinh vật khac, làm tăng khả năng cạnh tranh
của cac sinh vật trong môi trƣờng sống. Do có khả năng điều chỉnh con đƣờng
truyền và sinh hóa tín hiệu, một vài chất chuyển hóa thứ cấp có tính chất dƣợc liệu

hữu ích.
Cac hợp chất sinh học của vi khuẩn lam cung cấp một nguồn dƣợc liệu mới,
nhiều tiềm năng. Sự đa dạng và mới lạ của cac chất tìm thấy trong vi khuẩn lam
đƣợc so sanh với xạ khuẩn- nhóm vi khuẩn cung cấp nhiều dƣợc phẩm quan trọng
[3, 34]. Cac chất đƣợc tìm thấy trong vi khuẩn lam gồm nhiều nhóm chất khac
nhau bao gồm: alkaloid, terpenoid, polyketide và peptide không phụ thuộc
ribosome. Phần lớn cac sản phẩm này đƣợc sản xuất thông qua con đƣờng sinh
tổng hợp polyketide (PKS) và peptide không phụ thuộc vào ribosome (NRPS)
hoặc phối hợp cả hai [24]. Cac nhóm chất từ vi khuẩn lam thể hiện nhiều hoạt tính
sinh học khac nhau: khang khuẩn, khang ung thƣ, khang virus, ức chế miễn dịch,


ức chế hoạt động của proteinase, đây đều là những mục tiêu nghiên cứu quan trọng
của sinh y học.
1.3.1. Nhóm các chất alkaloid
Sự phân lập và định tính alkaloid đƣợc bắt đầu từ rất sớm, vào những năm
1960. Đây là nhóm cac chất có độc tính cao, chỉ với liều vài milligram đã có thể
gây tử vong cho ngƣời. Cac alkaloid có tac dụng sinh học rất đa dạng, chủ yếu làm
dƣợc phẩm nhƣ: cac thuốc ức chế thần kinh trung ƣơng (morphin, scopolamine,
L- tetrahydropalmatin), cac thuốc điều trị bệnh tim (ajmalin), cac thuốc điều trị
bệnh cao huyết ap (reserpine, ajmalixin),…Mỗi alkaloid khac nhau có hoạt tính
sinh học khac nhau, trong đó, vài chục alkaloid đƣợc sử dụng rộng rãi trong y học
và trong nông nghiệp [1].
Anatoxin-a là sản phẩm đƣợc phat hiện vào những năm đầu của thập niên
1960 và đƣợc phân lập lần đầu tiên vào năm 1972 bởi J. P. Devlin từ chủng vi
khuẩn lam Anabeana flos aquae. Chúng đƣợc biết đến với cai tên “Yếu tố gây chết
nhanh” (Very Fast Death Factor), bởi chúng có khả năng gây độc nhanh và mạnh
lên hệ thần kinh làm co giật và tử vong do liệt hô hấp. Bằng cach liên kết với thụ
thể nicotinic acetylcholine (nAchR) trên màng tế bào thần kinh, Anatoxin-a thay
đổi hoạt động của cac kênh vận chuyển ion qua màng làm cho cac cation không

thể đi qua màng, cuối cùng dẫn đến tắc nghẽn sự truyền tín hiệu xung thần kinh
[10].
Cylindrospermopsin là một alkaloid tự nhiên mang độc tính đƣợc phân lập
từ cac lồi vi khuẩn lam: Cylindrospermopsis raciborskii, Umezakia natans,
Aphanizomenon ovalisporum, Anabaena bergii và Raphidiopsis curvata. Cấu trúc
hóa học của chất này đƣợc phat hiện vào năm 1992, bao gồm một trycyclic
guanidine liên kết với hydroxymethyluracil. Dựa trên cấu trúc nucleotide và khả
năng phản ứng của guanine và nhóm sulphate của Cyclindrospermopsin, cac nhà
nghiên cứu chỉ ra rằng, chất này có khả năng liên kết với DNA/RNA của đối
tƣợng thí nghiệm. Cụ thể, có sự liên kết giữa chúng với DNA ở gan chuột trong


mô hình nghiên cứu in vivo, Cyclindrospermopsin gây ra sự pha vỡ DNA ở gan
đồng thời làm tăng số lƣợng cac nucleic nhỏ ở tế bào ung thƣ mau lympho dịng
WIL2-NS [38].
1.3.2. Nhóm các chất terpenoid
Cac terpenoid có vai trị và chức năng đa dạng trong cac hoạt động sinh
học. Chúng có thể là cac hormones (gibberellins, abscisic acid), cac sắc tố quang
hợp (phytol, carotenoids), cac chất dẫn truyền điện tử (ubiquinone, plastoquinon)
hay cac chất tham gia cấu trúc màng tế bào (phytosterol). Ngồi cac chức năng về
sinh lí, trao đổi chất và xây dựng cấu trúc, một số hợp chất terpenoid đặc biệt, chủ
yếu thuộc gia đình terpenoid có mạch cacbon C10, C15, C20 còn tham gia vào qua
trình “giao tiếp” và “phịng vệ” nhƣ: chất hấp dẫn cơn trùng thụ phấn, hỗ trợ qua
trình phat tan hạt giống, khang sinh, tạo chất độc đối với động vật ăn cỏ.
Ở vi khuẩn lam, terpenoid đƣợc tổng hợp bằng con đƣờng methylerythritolphosphate (MEP). Nghiên cứu của Kaneko và cộng sự cho thấy, cac gen mã hóa
cho mỗi enzyme tham gia vào con đƣờng sinh tổng hợp MEP đã đƣợc tìm thấy
trong genome của Synechocystis sp. cũng nhƣ trong genome của nhiều loài vi
khuẩn lam khac [30].
Đƣợc phân lập từ vi khuẩn lam Tolypothrix nodosa, Tolypodiol là một
diterpenoid đã đƣợc nhận diện bằng NMR và phân tích khối phổ. Tolypodiol thể

hiện hoạt tính khang viêm mạnh ở tai chuột với ED50 bằng 30µg/tai [32].
1.3.3. Nhóm các chất polyketide.
Là nhóm cac sản phẩm thứ cấp có sự đa dạng về cấu trúc và chức năng
đƣợc phân lập từ nguồn sinh vật khac nhau: vi khuẩn, nấm, thực vật, côn trùng.
Cac sản phẩm phân lập có đặc tính dƣợc lí quan trọng nhƣ: khang khuẩn, khang
nấm, chống kí sinh trùng, chống khối u với phổ hoạt động rộng, có tac dụng trên
nhiều đối tƣợng
Ở vi khuẩn lam, polyketide đƣợc tổng hợp bởi chuỗi cac phản ứng liên tục
đƣợc xúc tac bởi cac enzyme polyketide synthenase (PKS)- đây là nhóm lớn cac


đa enzyme chứa nhóm phối hợp với vị trí hoạt động. Cac phản ứng diễn ra theo
từng bƣớc bằng cach hoạt hóa 2; 3; 4-cacbon khởi đầu nhƣ acetyl-CoA, propionyl,
CoA, butyryl-CoA thành malonyl-, methylmalonyl- và ethylmalonyl- CoA. Cac
gen PKS đƣợc phat hiện ở vi khuẩn lam nhờ nghiên cứu đột biến gen transposon ở
tế bào dị hình có khả năng cố định ni-tơ [11].
Coibacin A-D là một polyketide đƣợc phân lập từ một loài vi khuẩn lam
Oscillatoria sp. ở biển Panama. Nghiên cứu đã chứng minh, Coibacin A-D có khả
năng ức chế tăng sinh dòng tế bào ung thƣ H460 với gia trị IC50 từ 11,4-34,5µM.
Chúng cũng có khả năng khang viêm dựa trên khảo nghiệm nitric oxide, trong đó,
Coibacin B thể hiện khả năng khang viêm mạnh nhất. Ngoài ra, sự có mặt của
Coibacin A còn làm giảm cac cytokine nhƣ TNF-α và IL-6 ở tế bào chuột
RAW264.7 đã đƣợc kích thích bằng lipopolysaccharide [2].
1.3.4. Nhóm các chất peptide không phụ thuộc ribosome
Là sản phẩm của hệ thống sinh tổng hợp của cac enzyme nonribosomal
peptides synthetase. Cac peptide không phụ thuộc ribosome bao gồm D- và Lamino acid, protein và axit amin, axit hydroxyl, ornithine, acid β-amin và cac
thành phần dị biệt khac. Chúng có thể đƣợc sửa đổi bởi glycosyl hóa, N-methyl
hóa, hoặc acyl hóa. Ngoài sự đa dạng về cấu trúc, cac peptide không phụ thuộc
ribosome có phổ rộng cac hoạt động sinh học, một trong số đó có nhiều hữu ích
trong y học, nơng nghiệp và nghiên cứu sinh học. Cac peptide không phụ thuộc

ribosome bao gồm cac khang sinh nổi tiếng, chất ức chế miễn dịch, tac nhân khang
u và cac độc tố [25].
Microcystin là là chất chuyển hóa đầu tiên khẳng định có tồn tại con đƣờng
chuyển hóa không phụ thuộc ribosome. Theo bao cao của Chorus và Bartram,
Microcystin là sản phẩm của cac vi khuẩn lam Microcytis aeruginosa, Anabaena
flos-aquae, Oscillatoria agardhii và một số loài thuộc chi Nostoc [19]. Chúng đặc
biệt ức chế protein phosphatase loại 1 và 2A ở sinh vật nhân thực Eukaryote.


Microcystis có thể gây tổn thƣơng gan nghiêm trọng do sự vận chuyển tích cực
của chúng vào tế bào gan và cũng là nguyên nhân gây ngộ độc cho con ngƣời [28].
1.4.

Phân tách các hợp chất thiên nhiên từ vi khuẩn lam
Sự phat triển của kĩ thuật sắc kí đã giúp một bƣớc tiến lớn cho qua trình

phân tach cac hợp chất thiên nhiên có trong vi khuẩn lam
Cac hợp chất thiên nhiên từ vi khuẩn lam đƣợc tồn tại trong một hỗn hợp
phức tạp gồm nhiều chất với cấu tạo khac nhau. Với cac hợp chất quan tâm khac
nhau, ngƣời ta sẽ sử dụng cac phƣơng phap khac nhau để thu đƣợc hiệu quả tối
ƣu nhất. Ví dụ ở loài vi khuẩn lam Spirulina sp., cac chất có khả năng chống ô-xi
hóa đƣợc phân tach bằng cach sử dụng sắc kí cột có điều chỉnh tốc độ chảy và ap
suất dung môi trong khi phƣơng phap chƣng cất đƣợc sử dụng để thu lấy cac chất
có khả năng khang virus. Sự phân tach cac hợp chất này phụ thuộc vào cac yếu
tố nhƣ: tính tan trong dung mơi, độ ổn định của chất, lƣợng chất có trong hỗn hợp
[23].
Cac hợp chất thiên nhiên có cấu trúc hóa học khac nhau đƣợc phân tach từ
chủng vi khuẩn lam Spirulina platensis bằng phƣơng phap chiết lỏng cao ap (PLEPressurized Liquid Extraction). Cac yếu tố nhƣ: dung môi phân cực (methanol,
ethanol, n- hexan, nƣớc), nhiệt độ tach chiết, thời gian và sự phân bố mẫu bên
trong tế bào tach chiết đƣợc tối ƣu. Bằng cach kết hợp PLE với cac kĩ thuật sắc kí

khac nhƣ: sắc kí bản mỏng TLC để kiểm tra độ phân tach của cac băng chất, sắc kí
lỏng hiệu năng cao kết hợp với đầu dò (HPLC-DAD) để xac định chất đƣợc phân
tach ở mỗi băng, cac chất đƣợc phat hiện có thể là α- và β-carotene, βcryptoxanthin,…Ngoài ra, TLC còn đƣợc dùng phối hợp với phƣơng phap điện di
mao quản kết hợp khối phổ (EC/MS- Capillary electrophoresis - Mass
spectrometry) để tăng hiệu quả tach chiết lƣợng chất giàu phycobiliprotein trong
thời gian ngắn nhất [18].
Hàm lƣợng carotenoid có mặt trong loài vi khuẩn lam S. platensis đƣợc xac
định bằng phƣơng phap chiết siêu tới hạn (SFE- Supercritical fluid extraction).


Đây là phƣơng phap sử dụng dung môi CO 2 ở nhiệt độ và ap suất vƣợt qua giới
hạn của chất. Kết quả cho thấy, hàm lƣợng carotenoid thu đƣợc từ loài vi khuẩn
lam này cao hơn hẳn khi sử dụng cac phƣơng phap khac [18].
Nhƣ vậy, ngoài cac phƣơng phap tach chiết truyền thống nhƣ: chiết lỏngrắn (SLE- Solid liquid extraction), chiết lỏng-lỏng (LLE- Liquid–liquid extraction)
với nhƣợc điểm sử dụng một lƣợng lớn dung môi và tốn nhiều thời gian tach chiết
nhƣng hiệu quả tach chiết không cao thì sự ra đời của một số phƣơng phap

mới

nhƣ: chiết lỏng cao ap, chiết chất lỏng siêu tới hạn,…để tăng hiệu quả tach chiết
và phân đoạn cac hợp chất thiên nhiên từ vi khuẩn lam. Ngoài ra, ngƣời ta cũng có
thể dùng phối hợp cac phƣơng phap phân tích để đem lại hiệu quả nghiên cứu tốt
nhất nhƣ: sắc kí lỏng hiệu năng cao kết hợp với khối phổ (LC/MS- Liquid
chromatography- mass spectrometry), sắc kí khí kết hợp khối phổ GC/MS (Gas
chromatography- mass spectrometry), sắc kí lỏng hiệu năng cao kết hợp hai lần
khối phổ (LC/MS-MS- Liquid chromatography- mass spectrometry/mass
spectrometry) nhằm dự đoan khối lƣợng và cấu trúc của phân tử hợp chất quan
tâm.
Lịch sử nghiên cứu việc phân lập cac chất tinh khiết từ vi khuẩn lam có
những hƣớng đi thay đổi tiến bộ theo thời gian, thay vì sử dụng phƣơng phap vật

lí, hóa học để tìm ra nhiệt độ sôi, sự khac biệt so với cac chất đã biết và xac định
khối lƣợng phân tử cần một lƣợng mẫu lớn, thời gian xử lí mẫu lâu, phức tạp thì
cac phƣơng phap hiện đại đƣợc sử dụng nhƣ khối phổ, công hƣởng từ hạt nhân
giúp xac định chất quan tâm nhanh chóng, dễ dàng với 1 lƣợng mẫu nhỏ giúp
qua trình phân tach chất đạt hiệu quả tối đa.