ho c
NHÂN DỊNG,
C TRÌNH T VÀ BI U HI N TRONG P.pastoris
M T cDNA XYLANASE M I V A
C PHÂN L P T
A.awamori
1
2
Yinan Yang , Kuixian Shan , Lifeng Ping3 và Jingmei Lu3

i H c ông B c, Tr ng Xuân, Trung Qu c.
i H c Nông Nghi p Cát Lâm, Tr ng Xuân, Trung Qu c.
Vi n Tiêu Chu n và Ch t L ng Nông S n, Vi n Khoa H c Nông Nghi p Chi t
Giang , Hàng Châu, Trung Qu c.

Ch ng SH-2016 có th sinh ra xylanase đ c phân l p và nh n ra là
Aspergillus awamoris D a vào đ c đi m sinh lý và hóa sinh c a chúng c ng
nh k t qu phân tích trình t gen ITS rDNA. T ch ng A. awamori m i
phân l p này nhân dịng gen xylanase có kích th c 591bp và trình t ORF
(open reading frame) đ c d đốn mã hóa cho m t protein có 196 axit
amin v i tr ng l ng kho ng 21kDa. M t plasmid bi u hi n mang gen d i
s ki m soát c a methanol đ c đi u khi n b i m t promotor đi u khi n gen
oxidase r u (AOX1) đã đ c đ a vào P.pastoris và gen xylanase đã đ c
bi u hi n thành công trong môi tr ng s d ng methanol nh là ch t c m
ng. Xylanase đã đ c tinh s ch s d ng c t NI2+-NTA. Các đ c đi m c a
xylanase ting s ch đã đ c kh o sát.
T khóa: Aspergillus awamori, cDNA, nhân dòng, xylanase, bi u hi n
sinh v t nhân chu n, purification and characterization (tinh s ch và phân
tích)
M
U

Xylanase là các glycosidases, xúc tác cho ph n ng n i th y phân liên
k t 1,4- -D-xylosidic trong xylan. Xylanase có ngu n g c t n m, vi khu n
đã thu hút đ c nhi u s chú ý trong nh ng n m g n đây do ti m n ng công
ngh sinh h c c a chúng trong nhi u q trình cơng nghi p khác nhau.
Chúng đ c s n xu t trên qui mô công nghi p ng d ng đ t y tr ng gi y và
công nghi p t y tr ng b t gi y (Polizeli et al.,2005). Cùng v i glucanase,
pectinase, protease, amylase, phytase, Lypase, Glucanase c ng đ c s d ng
r ng rãi làm bi n tính anarabinoxylans trong thành ph n c a th c n, kh đ
nh t c a nguyên li u thô và c i bi n ch t dinh d ng (Silversides et al.,
2006). Trong công nghi p th c ph m, chúng đ c s d ng nh nh ng ph
gia trong b t bánh mì cho vi c c i bi n b t nhão t o đi u ki n thu n l i và
làm t ng ch t l ng s n ph m n ng. trong nghi p lên men, s thêm
xylanase t bên ngồi trong q trình nghi n đã có nh h ng quan tr ng
đ n gi i quy t các v n đ v arabinoxylans nh là đ nh t c a cây c , màng
đ m và đã làm gi m t l l c (Lu et al 2005).
S n xu t xylanase trên quy mô công nghi p d a trên t ng h p sinh
h c nh vi sinh v t. N m s i đã ch ng t là có m t kh n ng l n ti t ra m t


ho c
l ng ng u nhiên xylanase, v i các ch ng Aspergillus (Shah and
Madamwar, 2005), Penicillium (Li et al., 2007a, 2007b) Tricodema (Azin et
al 2007) h u h t đã đ c nghiên c u r ng rãi và đ c ki m tra l i kh n ng
sinh t ng h p xylanase. Có hai mơi tr ng cho nuôi c y ch ng vi sinh v t
sinh xylanase: ni c y chìm và ni c y trên môi tr ng r n. hi n nay,
80%-90% xylanase th ng ph m đ c s n xu t b ng ni c y chìm b i vì
chúng có kh n ng t ng c ng bi u hi n cao h n và m c đ t đ ng hóa cao
h n (Polizeli et al., 2005). Nhi u gen xylanase đã đ c nhân dòng và bi u
hi n trong E.coli ho c P.pastoris: m t s xylanase tái t h p đã đ c kh o
sát và ng d ng r ng rãi.

đáp ng nh ng ng d ng r ng rãi và nh ng nhu
c u đ c bi t c a th ng tr ng nhi u ch ng m i có th s n xu t ra xylanase
đang đ c tìm ki m ho c nhân dòng và bi u hi n gen xylanase v i nh ng
đ c đi m m i tr thành nh ng h ng đi nóng trong nh ng nghiên c u v
xylanase (Hessing et al., 1994; Polizeli et al., 2005).
Trong bài báo này trình bày m t gen m i mã hóa cho xylanase m i
đ c phân l p t A.awamoris và đã đ c nhân dịng và bi u hi n trong
P.pastoris X33. Sau đó t i u nhi t đ và pH và n đ nh nhi t đ tinh s ch
xylanase đã đ c xác đ nh đ nghiên c u kh n ng ng d ng trong công
nghi p c a chúng.
NGUYÊN LI U VÀ PH
NG PHÁP
CH NG GI NG VÀ NUÔI C Y
Aspergillus sp SH-2016 đã đ c ch n l c t nh ng ch ng thu th p t
các đ a ph ng. Môi tr ng nuôi c y g m có: NH4Cl, 9 gl -1;K2SO4,1 gl -1;
Na2NO3,1 gl -1;MgSO4.7H2O; CaCl2.2H2O 0,3 gl -1;yeast extract,1 gl -1. pH
ban đ u đ c đi u ch nh đ n 8. cho 50 ml mơi tr ng vào bình tam giác
(lo i 250ml) đ c v i 1ml (1x106 bào t /ml) d ch huy n phù đ c chu n
b t m t ng th ch nghiêng Aspergillus sp SH-2016 ni 30°C l c 150
vịng/phút.
E.coli JM109 đã đ c s d ng nh t bào ch đ bi n n p vector
plasmid pMD18-T-xynA và pPICZaA-xynA. E.coli bi n n p đ c nuôi
trong môi tr ng LB l ng (Luria-Bertani). P.pastoris đ c s d ng nh t
bào ch cho s bi u hi n c a pPICZaA-xynA. P.pastoris X33 đã đ c bi n
n p đ c nuôi trên môi tr ng (YPDS) ch n l c r n: cao n m men (1%
v/vv), pepton 2%(w/v) dextrose (D-glucose, 2% w/v), Sorbitol 1%(w/v) và
Zeocin (100 mg ml-1).
Môi tr ng BMGGY. [5g cao n m men, 10 g peptone, 50ml KPO4
1M đ m pH=6.0, 1,7g bazo nito n m men, 5g amoni sulsunfat (NH4)2SO4,
5ml glyxerol đ c kh trùng 121°C trong 30 phút và làm l nh xu ng đ n

nhi t đ phịng, thêm vào mơi tr ng Biotin (500x1ml) và Histidine


ho c
(96x5,2ml)] đ c s d ng đ nuôi c y P.pastoris tái t h p ch a xylanase.
Môi tr ng BMMY [5g cao n m men, 10g peptone, 50ml KPO4 1M đ m
pH6.0, 1,7g base nit n m men và 5g amoni sunfat (NH3)2SO4 đ c h p kh
trùng 121°C trong 30 phút, và đ ngu i xu ng đ n nhi t đ phịng thêm
vào mơi tr ng 2,4ml methanol, Biotin (500x1ml) và Histidin (96x5,2ml)
đ c s d ng cho c m ng và bi u hi n xylanase P.pastoris.
PHÂN L P CH NG S N XU T XYLANASE
Các ch ng khác nhau bao g m Aspergillus sp. SH-2016 đ c phân
l p t các m u đ t, ph ng th c phân l p chi ti t th c hi n theo ph ng
pháp đã đ c Abrusci mô t (Abrusci et al 2005).
XÁC

NH CH NG Aspergillus sp, SH-2016

Xác đ nh ch ng d a vào phân tích đ c đi m hình thái chu n, phân tích
trình t nucleotide ITS rDNA mã hóa cho enzyme đã đ c khuy ch đ i, và
vùng ITS (internal transcribed spacer) bao g m 5.8 S rDNA. Phân tích đ c
đi m hình thái c a ch ng nuôi c y b ng quan sát trên cùng m t kính hi n vi
quang h c và trên cùng m t kính hi n vi đi n t qt. Phân tích trình t ,
DNA nhi m s c th đ c phân l p theo ph ng pháp Doyle(1987). S
khuy ch đ i đã đ c th c hi n v i m i thi t k pITS1 (5’TCCGTAGGTGAACCTGCCG-3’)
và
pITS4
(5’TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) trong máy chu trình nhi t (máy PCR)
(Bio-Rad, USA) d i đi u ki n cho phép: 95°C, 3 phút; 35 chu k 95°C, 30
giây; 53°C, 30 giây; 72°C, 2 phút và cu i cùng gi 10 phút 72°C. M i

ph n ng PCR l y 5µl s n ph m đem ki m tra b ng đi n di trên gel agarose
1%
70V trong 2 gi .
m TAE [0,4 M tris; 50mM NaOAc
(natrioxaloaxetac); 10mM EDTA; pH=7,8] và đ c quan sát tia UV sau khi
đã nhu m ethidiumbromide (0,5µg/ml). s n ph m PCR đ c n i v i vector
pMD18-T (Takara-Nh t B n) theo ph ng pháp Liu và Sun (2004). Vector
thi t k đã đ c chuy n vào t bào E.coli kh bi n theo ph ng pháp Chung
(Chung et al., 1989). Sau đó c y tr i trên mơi tr ng LB có ch a Xgal (5bromo-4-chloro-3-indolyl- -D-galactosidase), IPTG (isopropyl-1-thio- -Dgalactoside) và ampicillin (50µg/ml). ti p theo, ch ng mà đã chuy n thành
công đ c g i là E.coli JM109/pMD18-T-ITS. DNA ITS đã đ c đ c trình
t b ng c hai b kits [
Trình t nh n đ c đã kh o sát và so sánh v i các trình t trong c s d
li u ngân hàng gen (Genbanks) s d ng ch ng trình BLAST. Phân tích
trình t đ c th c hi n nh s d ng các ch ng trình SEQBOOT,


ho c
NEIGHBOR-JOIN và DNASENSE c a Philips (phiên b n 3.572) sau đó
đ c s d ng đ thành l p cây quan h di truy n. Xác minh h th ng d li u
Microseq và so sánh v i các trình t khác th ng đ c s d ng trong các h
th ng DDJB/EMBL/GenBank.
CHU N B RNA T NG S C A Aspergillus sp. SH-2016
Các t bào thu nh n đ c thông qua l c, đ c r a hai l n v i đ m
mu i phosphate (PBS, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM
Na2HPO4.7H2O, 1.4 mM KH2PO4 pH=7.3) Sau đó, làm l nh trong nit l ng,
ground và chuy n vào m t ng nghi m s ch ch a đ m ly gi i (6 M
guanidinium hydrochloride, 37.7 M axit xitric, 0.75 M N-lauroyl sarcosine
sodium, 0.15 M -sulfhydryl ethanol), và acid guanidium phenol chlorofol
theo ph ng pháp c a Chomozynsky và Sachi (1987) đã đ c s d ng đ
phân l p RNA t ng s t Aspergillus sp.SH-2016. poly (A+) RNA đã đ c

ch n l c t RNA t ng s b ng cách s d ng oligo-dT30 (Promega,
Madison, USA).
T NG H P cDNA và KHU CH

I PCR

M ch cDNA đ u tiên đ c t ng h p nh RT-PCR v i olio(dT)15 s
d ng mRNA đ c phân l p t Aspergillus sp.SH-2016 theo manufacture’s
procol (Clontech, mountain view, CA, USA). cDNA c a Aspergillus sp.SH2016 mã hóa cho xylanase đã đ c khu ch đ i nh đ u 3’ race(Rapid
application of cDNA ends) v i m i 5’-GCTCCTGTGCCGGAACCTG-3’ và
oligo(dT)15 đã đ c thi t k d a trên trình t c a đ u t n cùng –NH2 và
cDNA mã hóa cho xylanase đã đ c công b trên ngân hàng gen qu c t
(NCBI). Và c u trúc c a mRNA và m ch cDNA th nh t đ u l n l t đ c
s d ng nh m ch khuân. PCR đã đ c th c hi n trong 50µl s d ng máy
chu trình nhi t (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). S n ph m PCR đã đ c quan
sát trên gel sau khi đã nhu m ethidium bromide 1.5%. k t qu là các đo n
DNA đ c n i v i pMD18-T(takaru, Otsu, Shiga, Nh t B n) nh s d ng
ph ng pháp nhân dòng T/A. vector đã thi t k đ c chuy n vào t bào
E.coli kh bi n theo ph ng pháp c a Chung (Chung et al.,1989) và sau đó
c y tr i trên mơi tr ng LB có ch a X-gal, IPTG và ampicillin (50µgml -1).
Tieepstheo, các ch ng d ng tính, đ c nh n ra là E.coli JM109/pMD18-TxynA đã đ c thu nh n. DNA đã đ c đ c trình t . Trình t đã đ c thu
nh n đ c phân tích nh s d ng ph n m n DNAMEN (b n 4.0 Lynnon,
Biosoft, CANADA) sau đó đ c kh o sát và so sánh v i các trình t trong
c s d li u c a ngân hàng gen s d ng ch ng trình BLAST.


ho c
THI T K
XYLANASE


VECTOR BI U HI N C A cDNA MÃ HÓA CHO

guanidinium hydrochloride o n ORF c a xylanase đ c thu nh n nh s
d ng DNA polymerase ch u nhi t (Takara, Otsu, Shiga, Nh t B n) v i s có
m t c a các m i 5’ATTGAATTCGCACCTGTTCCTGAGCCTG-3’ (có v
trí
nh n
bi t
c a
E.coR
I)
và
5’GGTCTCGAGTGATGAAATTGTAACGGAG-3’(có v trí nh n bi t c a
Xhol) đ c thi t k theo trình t c a vector pMD18-T-xynA. S n ph m
PCR và vector pPICZaA (Novogen, New Canaan, CT, USA) đã đ c s lý
v i enzyme gi i h n E.coR I và Xhol, và thu h i l i nh đi n di trên gel
agarose sau đó đ c n i l i nh T4-DNA ligase. Plasmid pPICZaA đã n i
đ c bi n n p vào E.coli JM109.ch n l c nh ng khu n l c đ n và chuy n
sang môi tr ng LB l ng(3ml) v i 100µg ampicillin và qua đêm 37°C
l c m nh 200 vịng/phút. Gi ng ni c y đ c s d ng đ tách plasmid
trong môi tr ng ki m y u (Sambrock et al.,2001). Plasmid đã đ c s lý
v i E.coR I và Xhol v i m c đích nh n bi t các plamid tái t h p đã đ c
tái t h p thành cơng. Sau đó m t plasmid mang đo n gen cDNA
(pPICZaA-xynA) đ c thu đ c, plasmid đã tái t h p đ c t o dòng và
chuy n vào P.pastoris X33 nh t o l b ng đi n (electroporation), ch ng đã
bi n n p đ c ch n l c trên môi tr ng YPDS.
THAO TÁC DNA và BI N N P
Thao tác DNA, phân l p plasmid, và đi n di trên gel agarose đ
th c hi n theo Sambrock (Sambrock et al.,2001). Bi n n p vào E.coli đ
th c hi n theo Chung (Chung et al.,1989).


c
c

TINH S CH và BI U HI N PROTEIN
T t c các b c tinh s ch đ c th c hi n 4°C . Môi các khu n l c
đ n đ c ch n l a chuy n vào 5ml BMGY tr c khi nuôi c y, và đ c
qua đêm 30°C. Sau đó, ly tâm 6000 vòng trong 10 phút. Các t bào đ c
chuy n vào môi tr ng BMMY 25ml v a cho c m ng và bi u hi n (for 3
d) thêm vào mơi tr ng 250µl methanol, 3 l n m t ngày. Sau khi bi u hi n,
d ch lên men l ng đ c ly tâm 8000 vịng/10 phút 4°C. Ph n d ch n i có
ch a protein xylanase thô đ c chuy n vào c t NI2+-NTA. Ph ng pháp
r a và thôi c t đ c th c hi n theo h ng d n c a nhà s n xu t. Protein đã
tinh s ch đ c b o qu n -80°C tr c khi đi n di SDS-PAGE và phân tích
các đ c đi m hóa sinh. N ng đ protein đ c th c hi n theo ph ng pháp
Bradford (Bradford, 1976) s d ng abumin huy t thanh bò làm chu n.


ho c
CÁC PHÂN TÍCH HO H

XYLANASE

Ho t đ xylanase đ c xác đ nh b ng cách đo l ng đ ng kh đ c
gi i phóng t th y phân xylan lúa mì, y n m ch (1% w/v) s d ng ph ng
pháp axit dinitrosalisilic (Miller,1959). H n h p ph n ng g m có 1ml dung
d ch hịa tan xylan lúa mì y n m ch 1% trong đ m nitrate 50mM, pH=5
thêm vào 1ml enzyme tinh s ch d ng l ng;
50°C trong 30 phút. M t
đ n v xylanase đ c đ nh ngh a là l ng enzyme c n thi t đ phân gi i

1µmol xylose t xylan trong vịng m t phút d i đi u ki n phòng thí
nghi m.
NG KÝ TRÌNH T
Trình t nucleotide đ
EU846238 và EU846238.

c đ ng ký trên ngân hàng gen v i mã s

K T QU
NH N BI T CH NG Aspergillus sp.SH-2016 SINH XYLANASE
Nh n bi t ch ng Aspergillus sp.SH-2016 trên c s phân tích chi ti t
các đ c đi m hình thái sinh lý và trình t gen ITS rDNA (gen có mã s đ ng
ký trên ngân hàng: EU846237). K t qu phân tích đã ch ra r ng ch ng này
gi ng v i ch ng A.awamori (t ng đ ng, 99%/582bps, d a trên ITS rDNA.
///theo phân tích các đ c đi m hình thái sinh lý c ng nh so sánh trình t gen
ITS rDNA th y r ng ch ng Asperrgillus sp.SH-2016 r t gi ng v i ch ng
Aspergillus awamori nên đ t tên là Aspergillus awamori SH-2016.
RT-PCR và KHU CH

I cDNA

S n
ph m
đ c
khu ch
đ i
v i
m i
5’GCTCCTGTGCCGGAACCTG-3’ và oligo(dT)15 đ c dùng đi n di trên
gel agarose. Các đo n này đ c khôi ph c và n i v i plasmid pMD18-TxynA và đ c chuy n vào t bào E.coli JM109 kh bi n. m t s dòng d ng

tính (khu n l c khơng màu) đã đ c thu nh n. ba dịng trong s đó đã đ c
thu nh n đ chu n b m ch đ n cho đ c trình t . K t qu thu đ c m t trình
t kho n 1.6 kb. Phân tích trình t s d ng ph n m n DNAMEN (phiên b n
4.0, Lynnon Biosoft, CANADA) đã ch ra r ng đo n đ c khu ch đ i ch a
m t khung đ c m đ y đ g m 591bp mã hóa cho 196 axit amin. So sánh
trình t t ng đ ng th y r ng trình t này gi ng v i m t s gen xylanase đã
đ c công b (X78115,D14848). Aligment result also suggested that the
part or cDNA not containing the upstream sequence has been obtained. Tuy


ho c
nhiên v m t khách quan đã nhân dòng đ c gen cDNA c u trúc mã hóa cho
xylanase. Ph ng pháp này d dàng h n và r ti n h n là thi t k th vi n
cDNA. Ti p theo, c p m i v i đi m nh n bi t c a E.coR I và Xhol l n l t
đ c thi t k và khu ch đ i PCR đã đ c đi u khi n đ ch n l a vector tái
t h p pMD18-T-xynA và k t qu là, s n ph m PCR đã đ c dùng cho gel
agarose và đ c đ c trình t .
S

BI U HI N và TINH S CH XYLANASE

R t nhi u protein c n ph i hình thành các c u n i disulfide n đ nh đ
các n p g p t o thành d ng nguyên th . N u khơng có s hình thành các c u
n i disulfide n đ nh, nh ng protein này có b đào th i ho c tích l y nh
nh ng th n nh p (th vùi). ó là đi u không d dàng bi u hi n gen c a
sinh v t nhân chu n trong t bào sinh v t nhân s . Th m chí n u gen này có
th bi u hi n thì các s n ph m này th ng khơng hịa tan và khơng thành
d ng ho t đ ng trong môi tr ng n i bào.
t o đi u ki n thu n l i cho s
bi u hi n c a xylanase trong các t bào ch không đ ng nh t (t bào có

ngu n g c khác nhau) chúng tơi đã bi u hi n xylanase này trong P.pastoris.
ng th i, pPICZaA vector v i trình t tín hi u là nhân t
đã đ c s
d ng cho s bi u hi n. Các s n ph m đ c bi u hi n trong t bào ch có th
đ c v n chuy n ra môi tr ng và trình t tín hi u c t nh h th ng nh n
bi t tín hi u c a t bào ch sau đó s n ph m đ c bi u hi n sau khi protein
tái t o l i các n p g p thành d ng ho t đ ng. C u trúc c a gen xylanase
(đ c đ ng ký trên ngân hàng gen v i mã s : EU846238) đã đ c x lý v i
enzyme gi i h n đ c nhân dòng s d ng vector bi u hi n pPICZaA. B n
đ plasmid tái t h p đ c ch ra trong hình 4. sau đó, plasmid này đ c
chuy n vào các t bào E.coli JM109 kh bi n và đ c nhân dịng. Sau khi ly
trích, plasmid tái t h p ch a đ ng c u trúc gen mã hóa xylanase đã đ c
nhân dịng. K t qu đ c trình t plasmid tái t h p đã ch ra r ng gen đích đã
đ c thu nh n.cu i cùng plasmid pPICZaA-T-xynA đã đ c t o dòng nh
Sac I và đ c chuy n vào P.pastoris X33 và m t s ch ng bi n n p thành
công đã đ c thu nh n trên môi tr ng ch n l c nh ng khu n l c đ n đ c
chuy n sang môi tr ng BMMY sau đó kho ng 24 gi r i thu nh n t bào
nh ly tâm 6000 vòng trong 5 phút. Các t bào đ c tái sinh l l ng trong
môi tr ng BMGY và đ c c m ng b i 250µl methanol thêm vào ba l n
trên m t ngày. Sau c m ng, ta thu d ch n i nh ly tâm 6000 vòng và ho t
đ c a enzyme đã đ c xác đ nh. Kêt qu ch ra trong b ng 1. K t qu này
ch ra r ng ho t tính c a xylanase đã đ c bi u hi n thành công trong nghiên
c u này. Sau khi bi u hi n xylanase đã đ c tinh s ch s d ng c t NI2+NTA. Enzyme đã đ c gi
4°C trong glycerol 20 % trong vài tu n. đi n di


ho c
SDS-PAGE enzyme tinh s ch đã thu đ
21kDa.
NH H


c m t b ng có kích th

cx px

NG C A pH T I HO T TÍNH C A XYLANASE

Các ph n gi ng nhau c a enzyme tinh s ch đ
đ m khác nhau

c hòa tan trong các

Sau đó đo ho t đ t ng đ i cịn l i đ đánh giá s nh h ng c a pH trong
các đi u ki n thí nghi m chu n. Trong thí nghi m này đ m g m có axit
xitric NaHPO (pH 3.4-8.0) và Tris-HCl (pH=7.2-9.1) v i n ng đ 100mM
s d ng cho m i l n. sau khi v i các đ m pH khác nhau đã khám phá ra
r ng xylanase th hi n trong kho ng pH=3-8 nh ng th hi n ho t tính cao
nh t pH=4. K t qu chi ti t hình 6.


ho c
NH H

NG C A NHI T

T I HO T TÍNH C A XYLANASE

ánh giá nh h ng c a nhi t đ lên ho t tính c a enzyme, enzyme
đã đ c s lý tr c các nhi t đ khác nhau t 20-85°C. Ho t tính d (còn
l i) t ng đ i đã đ c xác đ nh trong các đi u ki n chu n phịng thí nghi m.

Ho t tính c a enzyme mà đã th nghi m d i các đi u ki n ph n ng g n
nh là 100%. Ho t tính c a enzyme gi m ch m t 20-60°C, gi m m nh
70°C, và g n nh m t ho t tính 85°C. nh v y enzyme này đã nh y c m
v i nhi t đ . Chi ti t xem hình 7.
NH H NG C A ION KIM LO I VÀ CÁC TÁC NHÂN KHÁC
HO T TÍNH C A XYLANASE

N

Nh ng nh h ng c a các ion kim lo i khác nhau và các tác nhân
khác đ n ho t tính c a xylanase tinh s ch đã đ c ki m tra b ng cách
nh ng enzyme này v i s có m t c a các tác nhân 40°C trong 1 gi . Ho t
tính t ng đ i đã đ c kh o sát theo ph ng pháp chu n. Ho t tính c a
xylanase tinh s ch đã b c ch b i m t s ion kim lo i nh Hg2+, Cu2+,
Ag+, Fe2+, Co2+, Mn2+, và Zn2+. Tuy nhiên, Ca2+ và Mg2+ có th tác
đ ng t i xylanase. Xylanase đã b nh h ng m nh nh t b i EDTA, kìm
hãm 83.4%. K t qu chi ti t ch ra trong b ng 2.
XÁC

NH CÁC THÔNG S

NG H C

Giá tr km cân b ng Michaelis và Vmax c a xylanase đã đ c xác
đ nh b i th nghi m enzyme tinh s ch v i gia t ng ng u nhiên n ng đ
xylan lúa mì t 0,5-0,8mg.nhi t đ , pH, và l ng enzyme đã đ c gi cùng
đi u ki n nh ho t tính enzyme chu n đã đ c mơ t
trên. Giá tr km và
Vmax cho xylanase đã đ c tính tốn d a trên đ th Lineweaver-Burk (t
1979). Các giá tr km và Vmax đã đ c tính tốn là 6.6mg/ml và 982µmol

kh đ ng xylose min-1, mg-1, protein theo th t . trong s th y phân xylan
lúa mì.
TH O LU N
Xylanase là polimer sinh h c giàu th hai ch sau cellulose. Và là m t
lo i polysaccharide hemicellulose chính đ c tìm th y thành t bào th c
v t (Timell, 1967).xylanase đã thu hút đ c nhi u nghiên c u b i vì ti m
n ng ng d ng trong công nghi p c a chúng. VD: xylanase đ c s d ng đ
làm t ng ch t l ng và t ng k t c u c a các s n ph m bánh mì, kh đ c
m t l ng Clo c n thi t đ làm tr ng b t gi y và làm gia t ng ch t l ng
dinh d ng trong kh u ph n n c a gia c m (Gilbert và Hazewood, 1993).


ho c
Nghiên c u này nh m m c tiêu phân l p các ch ng vi sinh v t có th
s n xu t xylanase cho nhu c u công nghi p. Các ch ng vi sinh v t khác nhau
đ c phân l p t m u đ t nh nuôi c y làm giàu. Ch ng Aspergillus
awamori SH-2016 có kh n ng sinh m t l ng l n xylanase đã đ c phân
l p và l a ch n nh là m t ch ng t t nh t cho nh ng nghiên c u ti p theo
c a chúng tơi. Nói chung, các vi sinh v t đ c gi ng nhau trong nh ng đ c
đi m hình thái.


ho c


ho c


ho c
Tuy nhiên, nh ng ph ng pháp nh n bi t này th ng là có v n đ vì

có th có s khác nhau hình thái/biotypes (morpho/biotypes) trong cùng m t
loài duy nh t. ng i ta c ng m t nhi u th i gian và k n ng c n thi t.
ph ng pháp phân tích trình t DNA là m t ph ng pháp khách quan,
reproducible, và là ph ng pháp nh n bi t nhanh chóng vì v y đ c ng i
ta s d ng r ng rãi. Trong cách ti p c n sinh h c phân t này, chi n l c
c a chúng tôi đã nh n bi t đ c s i n m kh trùng nh k t qu so sánh trình
t rDNA c ng nh phân tích cây phát sinh đ c th c hi n trong m t s pha
c a các gi i pháp phân lo i khác nhau (Liu et al., 2008).
Ph ng pháp PCR đã đ c s d ng r ng rãi cho vi c phân tích vùng
riboxom đ c tr ng c a các loài n m khác nhau (Gardes và Bruns, 1993).
C u trúc riboxom c a c th c v t và n m là c m nh ng vùng gen l p l i
(Erland et al., 1994). Tách vùng ITS t gen 17S và 25S có th đ c khu ch
đ i nh các m i đ c hi u đ c neo hai đ n v này. a hình vùng ITS hay
đ c s d ng đ phân lo i nh ng ngày nay nó th ng đ c s d ng đ nh n
bi t các loài n m gi ng nhau.trong nghiên c u này chúng tôi đã k t h p
ph ng pháp so sánh đ c đi m hình thái, sinh lý đ nh n ra v trí di truy n
c a các ch ng sinh xylanase đ c phân l p. ngày nay, có nhi u gen xylanase
đã đ c phân l p và đ c phân tích đ c đi m (Ghost et al., 1993; Haltrich et
al., 1996; Ito et al., 1993; Ziaie-Shikolaee et al., 2008). H n n a m t s sinh
h c phân t c a nh ng enzyme này đã đ c nghiên c u (Alam et al., 1994;
Eliger et al., 1994; Patel và Ray et al 1994; Tsujibo et al., 1990; Wang et
al.,1993; Moreau et al., 1994; Kulkarni et al., 1999). Trong nghiên c u này,
m t ch ng m i A.awamori SH-2016 m i đ c phân l p và nh n ra là có th
sinh xylanase, gen mã hóa xylanase đã đ c nhân dịng và bi u hi n thành
cơng, gen mà đã sinh m t l ng l n xylanase.
M t s ion có th nh h ng đ n ho t tính c a xylanase, m t s ion
kim lo i đã ch ra r ng có nh h ng b n v ng trong các ph n ng có m t
xylanase xúc tác. M t trong các đ c đi m thú v c a enzyme này là pH t t
nh t cho xylanase tái t h p kho ng 5.0. khi đó có ho t đ ng th y phân hi u
qu , lúa mì g n 4.5. pH na là kho ng ho t đ ng t t nh t c a xylanase đã

đ c phân l p t vi khu n.đi u này đã g i ý m t l n n a r ng xylanase t
Aspergillus awamori SH-2016 có th có l i đ tiêu hóa l ng xylan d có
trong d dày đ ng v t d i đi u ki n acid.
ng th i enzyme này nh y c m
v i nhi t đ .
c i thi n tính ch u nhi t và ho t tính c a xylanase ng d ng
trong cơng nghi p xylanase có th đ c c i bi n nh thi t k h p lý protein
ho c c i bi n tr c ti p s ti n hóa phân t c a protein (Miyazaki et al., 2006;
Liu et al., 2006) đang đ c ti p t c trong các nghiên c u ti p theo c a chúng


ho c
tơi. Các thí nghi m xác đ nh đ c đi m đã thu đ c m t l ng l n thông tin
liên quan đ n sinh hóa c a xylanase này đã đ a ra m t kh n ng cho lo i
xylanase này có th ng d ng trên cơng nghi p.
Có nhi u lo i n m men trong công nghi p đã đ c s d ng nh
nh ng h th ng tái t h p đ s n xu t xylanase (Damaso et al., 2003).
Nh ng lo i sinh v t này có th thao tác di truy n d dàng v i kh n ng th c
hi n nhi u c i bi n sau d ch mã trong nhi u sinh v t nhân chu n (Cereghino
et al., 2002). M t trong nh ng h th ng th ng đ c s d ng là n m men
Pichia pastoris. Nh ng sinh v t này chi m t l phân b trong t bào ch đ
cho bi u hi n và s n xu t xylanase(Berrin et al., 2000). Quan tr ng nh t nó
có th phát tri n thu n l i trong môi tr ng đ n gi n và r ti n và không ti t
b t k m t lo i xylanase n i bào nào (Berrin et al., 2000). Trong thí nghi m
này, xylanase t A. awamori SH-2016 đã đ c nhân dòng và bi u hi n thành
công Pichia pastoris. S bi u hi n quá m c c a lo i xylanase này s làm
cho s hi u bi t v c u trúc c a enzyme đ c d dàng h n và có th d n đ n
s n xu t m t l ng l n xylanase xúc tác sinh h c hi u qu .
L IC M N
Nghiên c u này đ c s h tr c a ch ng trình nghiên c u c a s

khoa h c công ngh t nh Cát Lâm (No[S ]. 2000567-1) và Qu Khoa h c t
nhiên c a T nh Chi t Giang (s Y506136).

L I NG

I D CH:

ây là l n đ u tiên, mình d ch t p chí ch c h n có r t nhi u l i và nhi u ch
ch a đ t v l i ki n th c ti ng anh c a mình cịn r t h n ch vì v y r t mong
đ c s góp ý nh n sét c a các b n, anh ch , th y cơ…
Nh ng ch mà mình d ch ch a đ
M i ý ki n đóng góp xin g i v :

c ng ý đã có đánh d u b ng màu khác.

Email:
Ho c:
Cám n các b n !