BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

KIM SOVANNA

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT
SỐ THƠNG SỐ ĐẾN TÍNH CHẤT VI
NANG ALGINAT-TINH BỘT CHỨA
Sacchoramyces boulardii
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI 2021


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

KIM SOVANNA
MÃ SINH VIÊN: 1601675

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT
SỐ THÔNG SỐ ĐẾN TÍNH CHẤT VI
NANG ALGINAT-TINH BỘT CHỨA
Saccharomyces boulardii
KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. TS. Nguyễn Khắc Tiệp
Nơi thực hiện:
Bộ môn Công Nghiệp Dược

HÀ NỘI 2021

LỜI CẢM ƠN
Với tất cả sự kính trọng và lịng biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cảm ơn đến
TS. Nguyễn Khắc Tiệp và PGS. TS. Đàm Thanh Xuân, những người thầy đã
luân tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi từ những bước đầu tiên cho đến
khi hồn thành khóa luận này.
Đồng thời tơi xin cảm ơn tới các thầy cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên
trong bộ môn Công Nghiệp Dược đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tơi thực hiện khóa
luận này.
Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban giám hiệu cùng tồn thể các thầy cơ
giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dìu dắt, dạy dỗ và tạo điều kiện thuận lợi
cho tôi trong thời gian học tập tại trường.
Cuối cùng, tơi xin cảm ơn gia đình và tất cả người thân, bạn bè đã động
viên, kinh tế, ửng hộ nhiệt tình và giúp đỡ tơi trong suất thời học tập và nghiên
cứu vừa qua.
Hà Nội, ngày 08 tháng 06 năm 2021
Sinh viên
KIM SOVANNA


DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH ẢNH
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
ĐẶT VẤN ĐỀ ...................................................................................................... 1
CHƯƠNG I : TỔNG QUAN .............................................................................. 2
1.1. Tổng quan về vi nang .................................................................................. 2
1.1.1. Đại cương vi nang ................................................................................. 2
1.1.2. Phương pháp tạo vi nang ...................................................................... 4
1.1.3. Tổng quan một số thành phần sử dụng trong vi nang .......................... 5

1.1.4. Một số nghiên cứu sử dụng vi nang alginat phối hợp với tinh bột ....... 8
1.2. Tổng quan về Probiotic ............................................................................... 9
1.2.1. Định nghĩa ............................................................................................. 9
1.2.2. Các nhóm VSV Probiotic ..................................................................... 9
1.2.3. Vai trị của probiotic trong lâm sàng và ứng dụng ............................. 10
1.2.4. Saccharomyces boulardii .................................................................... 10
Chương II: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU .................................................................................................................... 12
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị ........................................................................ 12
2.1.1. Nguyên vật liệu sử dụng ..................................................................... 12
2.1.2. Thiết bị ................................................................................................ 12
2.1.3. Các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu ........................................... 13
2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 13
2.2.1. Khảo sát thời gian đơng tụ hồn tồn của vi nang alginat, alginat - tinh
bột và alginat-tinh bột-chitosan .................................................................... 13


2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ tinh bột và chitosan tới thời gian rã
của vi nang .................................................................................................... 13
2.3. Phương pháp nghiên cứu........................................................................... 14
2.3.1. Phương pháp tiệt khuẩn ...................................................................... 14
2.3.2. Phương pháp tạo vi nang .................................................................... 14
2.3.3. Phương pháp xác định thời gian đơng tụ hồn tồn của vi nang ........ 15
2.3.4. Phương pháp đo kích thước vi nang ................................................... 15
2.3.5. Phương pháp đông khô ....................................................................... 15
2.3.6. Phương pháp đánh giá độ rã của vi nang trong các môi trường mơ
phỏng dịch tiêu hóa ....................................................................................... 15
2.3.7. Phương pháp ni cấy S. boulardii thu sinh khối............................... 16
2.3.8. Phương pháp pha loãng liên tục để xác định số lượng vi sinh vật ..... 16
Chương III: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ........................ 18

3.1. Khảo sát thời gian đơng tụ hồn toàn của vi nang alginat, alginat-tinh bột
và alginat-tinh bột-chitosan.............................................................................. 18
3.1.1. Ảnh hưởng của nồng độ alginat, CaCl2 và kích thước đầu nhỏ giọt đến
thời gian đơng tụ hồn tồn của vi nang ....................................................... 18
3.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ chitosan tới thời gian đơng tụ hồn tồn của
vi nang ........................................................................................................... 20
3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginat, CaCl2, tinh bột và kích thước
đầu nhỏ giọt đến kích thước hạt alginat và alginat – tinh bột....................... 23
3.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ tinh bột và chitosan tới thời gian rã của
vi nang .............................................................................................................. 26
3.2.1. Ảnh hưởng nồng độ tinh bột tới thời gian rã của vi nang................... 26
3.2.2. Ảnh hưởng nồng độ chitosan tới thời gian rã của vi nang.................. 32
3.2.3. Cố định S. boulardii trong vi nang ..................................................... 34


Chương IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT......................................................... 36
4.1. Kết luận ..................................................................................................... 36
4.2. Đề xuất ...................................................................................................... 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 37


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Các nguyên liệu sử dụng trong nghiên cứu ........................................ 12
Bảng 2.2. Các thiết bị dùng trong nghiên cứu .................................................... 12
Bảng 2.3. Bảng thiết kế công thức vi nang ......................................................... 14
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của kích thước đầu nhỏ giọt và nồng độ chất đông tụ đến
thời gian đơng tụ hồn tồn của vi nang alginat (n=3) ....................................... 18
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của kích thước đầu nhỏ giọt và nồng độ chất đông tụ đến
thời gian đông tụ hoàn toàn của vi nang alginat - TB (n=3) ............................... 19
Bảng 3.3. Kết quả thời gian đơng tụ hồn toàn của vi nang alginat - TB và

alginat -TB - CTS (n=1) ...................................................................................... 20
Bảng 3.4. Kích thước (mm) của vi nang alginat (n=20) ..................................... 23
Bảng 3.5. Kích thước (mm) vi nang alginat – tinh bột 2% (n=20) ..................... 24
Bảng 3.6. Kích thước (mm) vi nang alginat- tinh bột 10% (n=20) .................... 25
Bảng 3.7. Kết quả thời gian rã (phút) của alginat 6% - tinh bột trong dd đệm
PBS ...................................................................................................................... 27
Bảng 3.8. Kết quả thời gian rã (phút) vi nang của alginat 6% - TB trong dd đệm
PBS pH 6,8 sau lắc dd HCl pH 1,2 30 phút ........................................................ 28
Bảng 3.9. Kết quả thời gian rã vi nang đông khô alginat 3% - TB trong dd đệm
PBS pH 6,8 (sau khi lắc dd HCl pH 1,2 trong 30 phút)...................................... 30
Bảng 3.10. Kết quả thời gian rã vi nang đông khô alginat 3% - TB lắc trong dd
đệm PBS pH 6,8 .................................................................................................. 30
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của thời gian ngâm trong dd đông tụ CaCl2 đến thời gian
rã của vi nang Alg 3% - tinh bột đông khô trong dd đệm PBS (n=1)................. 31
Bảng 3.12. Kết quả thời gian rã của vi nang Alg 3% - TB khi lắc trong dung
dịch đệm PBS pH 6,8 với 2 kích thước đầu nhỏ giọt H1 và H3 ......................... 32
Bảng 3.13. Thời gian rã của vi nang alginat 3% - TB với 2 dung dịch gel hóa
CaCl2 và CaCl2-CTS 1% trong dd đệm PBS pH 6,8 ........................................... 33


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Hình ảnh mơ tả cấu trúc của alginat ..................................................... 5
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học chitosan .................................................................... 8
Hình 1.3. Hình ảnh nấm men Saccharomyces boulardii ................................... 10
Hình 3.1. Hình ảnh hạt nguyên vẹn của alginat 3% - TB - CTS 0,5% trong CaCl2
2% (a) và CaCl2 10% (b) ..................................................................................... 22
Hình 3.2. Đồ thị thời gian rã của alginat 6% - tinh bột trong đệm PBS ............. 27
Hình 3.3. Kết quả thử khả năng giải phóng tinh bột của vi nang Alg-TB sau khi
lắc trong (a) môi trường pH 1,2 và (b) dd đệm PBS pH 6,8 ............................... 29
Hình 3.4. Hình ảnh vi nang alginat 3% - TB ngâm trong (CaCl2 2% + CTS 1%)

trong dd đệm PBS ............................................................................................... 34
Hình 3.5. Xác định số lượng S. boulardii bằng phương pháp đếm trên đĩa thạch
............................................................................................................................. 35


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Alg

: Alginat

CTS

: Chitosan

Dd

: Dung dịch

g

: Gram

ISAPP

: The International Scientific Association of Probiotics and Prebiotics

kl/tt

: khối lượng/thể tích


MT

: Mơi trường

PBS

: Dung dịch đệm Phosphate (Phosphate buffered saline)

ph

: Phút

S. boulardii : Saccharomyces boulardii
TB

: Tinh bột

VK

: Vi khuẩn

VSV

: Vi sinh vật


ĐẶT VẤN ĐỀ
Probiotic là nhóm vi sinh vật được sử dụng khá phổ biến trong lĩnh vực Dược
phẩm và thực phẩm bảo vệ sức khỏe với các tác dụng chủ yếu như: ngăn ngừa
nhiễm khuẩn đường ruột, cải thiện khả năng dung nạp lactose giúp tránh khỏi tình

trạng đầy hơi khó tiêu, khó hấp thu lactose, tăng cường miễn dịch, cân bằng hệ
thống vi sinh vật đường ruột, và ngoài ra cịn có tác dụng phịng bệnh giúp giảm
khả năng mắc ung thư, giảm cholesterol máu. [2].
Probiotic có sẵn trong các chế phẩm sữa chua, kim chi, dưa muối, phô mai … tuy
nhiên, các vi sinh vật này dễ bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như pH, nhiệt độ, ánh
sáng, hàm ẩm, vi sinh vật nhiễm [23]. Những yếu tố này làm giảm số lượng vi
sinh vật sống sót, ngăn cản việc thiết lập cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột. Vi
nang hóa là phương pháp giúp tăng độ ổn định và hoạt tính trao đổi chất của tế
bào khi có sự thay đổi về nhiệt độ, pH, các chất ức chế làm tế bào kéo dài khả
năng tồn tại, chủ yếu để hạn chế các tác động bất lợi tới sự ổn định của probiotic
[35], [41].
Trong quá trình phát triển cơng thức vi nang các yếu tố như nồng độ alginat, kích
thước đầu nhỏ giọt, nồng độ dung dịch gel hóa.. ảnh hưởng trực tiếp tới tính chất
vi nang tạo thành.
Từ lý do trên chúng tôi thực hiện đề tài ″Khảo sát ảnh hưởng của một thông số
đến tính chất của vi nang Alginat-tinh bột chứa Saccharomyces boulardii‶
với các mục tiêu sau:
1.

Khảo sát thời gian đông tụ hoàn toàn của vi nang alginat, alginat-tinh bột

và alginat-tinh bột-chitosan
2.

Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ tinh bột và chitosan tới thời gian rã của vi

nang

1



CHƯƠNG I : TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về vi nang
1.1.1. Đại cương vi nang
a. Khái niệm
Vi nang là những tiểu phân hình cầu hoặc khơng xác định, kích thước từ 0,1𝜇𝑚
tới 5mm (thường từ 100-500𝜇𝑚) [4]. Vi nang hóa là một trong những phương
pháp được sử dụng rộng rãi hiện nay. Phương pháp sử dụng các hợp chất cao phân
tử (tạo gel) là các polyme có nguồn gốc tự nhiên như gelatin, alginat, chitosan,
cellulose... hoặc có nguồn gốc nhân tạo như polyamid, polystyren, polyacrylat,
polyacrylamid, polyester, polyvinyl pyrrolidon (PVP), polyethylen glycon
(PEG),... với phương pháp vi nang hóa, chúng ta có thể để bẫy, nhốt và bao gói
các tế bào, vi sinh vật sống [6], [19].
b. Đặc điểm
Vi nang và vi nang mang vi sinh vật (VSV) có khả năng giúp tế bào được cách ly
với môi trường xung quanh, bảo vệ và làm giảm sự tổn thương cũng như sự tổn
thất số lượng tế bào vi sinh vật, bằng cách này VSV sẽ được bảo vệ tốt hơn trong
các điều kiện bất lợi như pH thấp, muối mật, nhiệt độ cao,... và có thể giải phóng
tế bào tại nơi mong muốn [26]. Ngoài ra vi nang hóa cũng giúp ổn định hoạt tính
trao đổi chất của tế bào. [29], [41].
Vi nang hóa cho phép cố định một lượng lớn tế bào vi sinh vật [41]. Độ bền cơ
học của lớp màng bao vi nang đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ và giải
phóng vi sinh vật khi cần thiết. Lớp màng phải có độ bền cơ học tương đối để có
thể bảo vệ được các vi sinh vật sống bên trong, tuy nhiên lại không được quá vững
chắc gây ảnh hưởng đến sự giải phóng vi sinh vật cần thiết [6], [26].
Kích thước hạt vi nang cũng là một yếu tố quan trọng. Giữa kích thước hạt, độ
bền vững và khả năng giải phóng tế bào có mối quan hệ với nhau. Kích thước hạt
càng lớn thì độ bền vững của hạt càng cao, khả năng bảo vệ vi sinh vật càng cao,
nhưng giải phóng vi sinh vật khi cần thiết chậm và khó khăn. Ngược lại, kích


2


thước hạt nhỏ thì độ bền cơ học của hạt thấp, khả năng chứa và bảo vệ vi sinh vật
giảm nhưng khả năng giải phóng vi sinh vật thì nhanh và dễ dàng hơn.
Vi sinh vật có thể được giải phóng theo các cơ chế như gây gãy vỡ cấu trúc hoặc
khuếch tán qua cấu trúc bán thấm...[ 26].
c. Ưu điểm của vi nang
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng vi nang giúp bảo vệ vi khuẩn khỏi các yếu tố bất
lợi của môi trường như oxy và điều kiện acid ở dạ dày. Ngoài ra, vi nang làm ổn
định hoạt tính trao đổi chất của tế bào khi có sự thay đổi pH, nhiệt độ hay sự có
mặt của các chất ức chế trong môi trường lên men, do đó làm tăng độ ổn định và
kéo dài khả năng tồn tại của vi khuẩn. Trong vi nang khả năng tồn tại của vi khuẩn
được tăng lên, tạo điều kiện để điều khiển tế bào và cho phép kiểm soát liều lượng.
[6], [26].
Vi nang có khả năng tạo ra mật độ VSV lớn do có thể cố định một lượng lớn tế
bào sống. Trong các ngành thực phẩm có các sản phẩm lên men như bia, rượu,…
thì kỹ thuật vi nang hóa là một trong những phương pháp cố định tế bào VSV
trong công đoạn lên men, từ đó sử dụng VSV tiết kiệm và hiệu quả hơn [29], [38].
d. Nhược điểm của vi nang
Trong quá trình trao đổi chất, tế bào vi sinh vật sinh ra nhiều enzym có những
enzym có thể cho xúc tác các phản ứng khơng mong muốn làm tổn hại đến lớp
bao gói và cả chính tế bào. Để giải quyết vấn đề này phải chọn lựa giống vi sinh
vật thích hợp (có thể biến đổi hoặc xử lý giống) để hạn chế tế bào không tạo ra
các enzym không mong muốn và tăng hoạt tính của các enzym mong muốn [41].
Đa số các vật liệu vi nang hóa như thạch, gelatin… đều là những nguồn dinh
dưỡng mà vi sinh vật có thể tiêu hóa được. Điều naỳ dẫn đến nhược điểm là vi
sinh vật được bao gói bên trong hoặc vi sinh vật tạp nhiễm từ bên ngồi có thể
tiêu hóa vật liệu gói làm cho lớp vi nang bị rách, thủng và như vậy hiệu quả vi
nang hóa sẽ giảm đáng kể.


3


1.1.2. Phương pháp tạo vi nang
Việc lựa chọn các phương pháp vi nang hóa phụ thuộc vào mục đích, ngun liệu
làm vi nang, kích thước vi nang [26]…. các phương pháp vi nang hóa có thể được
phân loại như sau:
- Phương pháp hóa lý (bao gồm đông tụ đơn giản và phức hợp): các polyme khơng
tương thích, bốc hơi dung môi, sử dụng chất lỏng siêu tới hạn…
- Phương pháp vật lý (cơ học): ly tâm, bao tầng sôi, xát hạt tầng sơi, máy quay
trịn, nồi bao viên thơng thường, phun sấy, phun kết tụ, ly tâm…
-Phương pháp hóa học: polyme hóa (tương tác các polyme, polyme hóa bề mặt…)
1.1.2.1. Phương pháp tách pha đông tụ
Nguyên tắc: Các pha được tách nhờ sự thay đổi nhiệt độ, hóa muối hoặc khi thêm
một dung môi thứ hai vào hệ vi sinh [23].
Cơ chế :
- Đơng tụ đơn giản: là q trình loại nước của các chất keo thân nước dung trong
hệ, làm giảm độ tan của các chất keo. Phương pháp này thường chỉ dùng một loại
polyme như gelatin, polyvinyl alcol, carboxymethyl cellulose…
- Đơng tụ phức tạp: là q trình tương tác giữa các phân tử tích điện âm và dương
của hai hay nhiều hợp chất cao phân tử. Sự tương tác này thường do sự thay đổi
nồng độ của các hợp chất cao phân tử hoặc thay đổi pH. Các polyme càng có sự
khác nhau về điểm đẳng điện càng dễ dàng tạo thành hạt đông tụ [5].
Phương pháp tách pha đơng tụ có những ưu điểm: đơn giản, dễ làm, chi phí thấp,
khơng sử dụng nhiệt độ/ dung mơi làm ảnh hưởng đến hoạt tính của VSV được
bao gói, bao được một lượng lớn VSV. Tuy nhiên phương pháp này cũng có nhược
điểm là có thể gây thất thốt VSV bao gói làm giảm hiệu suất.
1.1.2.2. Kỹ thuật tách pha đông tụ
Nguyên tắc: Vi nang được tạo từ liên kết chéo của các polyme với ion kim loại

hóa trị II: Ca2+ , Mg2+…[9].
Cơ chế có thể được chia thành 2 cơ chế như sau:

4


- Rắn hóa nhũ tương: Hỗn dịch polyme chứa dược chất được thêm lượng lớn tá
dược dầu thể lỏng như dầu đậu nành, parafin lỏng… và chất diện hoạt để tạo nhũ
tương N/D. Sau đó thêm các tác nhân gây đông tụ vào nhũ tương như dung dịch
các ion kim loại hóa trị II như Ca2+, Mg2+… các ion này sẽ khuếch tán từ pha dầu
sang pha nước và tương tác với các polyme ở pha nước tạo thành liên kết chéo tạo
thành vi nang [4].
- Đông tụ: Hỗn dịch polyme chất mang và dược chất khi được rơi tự do hoặc bị
nén bởi một áp lực khi qua một đầu sẽ tạo thành giọt chất lỏng hình cầu và khi
tiếp xúc với dung dịch chứa các tác nhân đông tụ như: Ion kim loại hóa trị II,
chitosan, glutarat… sẽ hình thành các liên kết chéo để tạo thành vi nang [34].
1.1.3. Tổng quan một số thành phần sử dụng trong vi nang
1.1.3.1. Alginat
a. Cấu tạo
Alginat là tên gọi chung cho các muối của acid alginic. Acid alginic là một acid
hữu cơ có trong họ tảo nâu (thuộc họ Rhaephyceae). Alginat là một polyme có
các monome là hai acid manuronic (viết tắt là M) và acid guluronic (viết tắt là G)
gắn với nhau bằng liên kết 1-4 glycosid [19]. Alginat có tỷ lệ khối G cao (tỷ số
M/G thấp) tạo gel cứng hơn. Ngược lại, alginat chủ yếu là khối M thì gel hình
thành mềm hơn và đàn hồi hơn. [31].

Hình 1.1. Hình ảnh mơ tả cấu trúc của alginat [𝟏𝟗]
b. Đặc điểm, tính chất liên quan đến bào chế vi nang
Alginat có tính ưa nước, tương hợp sinh học cao, rẻ tiền và được ứng dụng rộng
rãi trong nhiều lĩnh vực. Alginat có hai tính chất quan trọng là độ nhớt dung dịch

và khả năng tạo gel [19].
5


Độ nhớt dung dịch alginat phụ thuộc vào số lượng nhánh phân tử alginat. Ngoài
ra, độ nhớt của dung dịch còn thay đổi tùy theo nồng độ, nhiệt độ, pH và sự có
mặt của ion kim loại [11], [25].
Dung dịch alginat có khả năng tạo gel khi phản ứng với các ion kim loại hóa trị
II, III, sự tạo gel được giải thích qua mơ hình vỉ trứng. Bình thường trong dung
dịch alginat tồn tại block M là các dải dẹp và block G là các dải gấp khúc. Khi có
mặt ion kim loại đá hóa trị (Ca2+, Ba2+, Sr2+,…) ở nồng độ thích hợp thì sự tạo gel
xảy ra. Các phân tử alginat sắp xếp lại song song nhau, các phân gấp khúc tạo
thành khoảng không gian giống như chỗ đặt trứng [21]. Các ion Ca2+ khớp vào
các khoảng trống này tạo nên mạng lưới không gian 3 chiều. Với cấu trúc gel này
khi sử dụng làm màng bao, chúng có vai trò như 1 tấm chắn chống lại những yếu
tố bất lợi của môi trường và cho phép giải phóng vi sinh vật được bao theo hướng
kiểm sốt được [19].
c. Ưu nhược điểm của alginat sử dụng làm vật liệu trong vi nang probiotic
Alginat là nguyên liệu an tồn, khơng độc, dễ sử dụng và giá thành rẻ. Alginat gel
hóa nhanh chóng ở pH trung tính và nhiệt độ thường, thích hợp cho các tế bào
sống và phân tử sinh học nhạy cảm như protein và acid nucleic [39]. Alginat dễ
dàng tạo gel bao bọc các tế bào vi khuẩn, lớp gel tạo thành có độ ổn định cao. Q
trình vi nang hóa vi khuẩn bằng alginat thực hiện dễ dàng, đơn giản, có thể thực
hiện ở nhiệt độ thường nên ít ảnh hưởng đến vi khuẩn sống và gel tạo thành có
tính thuận nghịch giúp giải phóng tế bào bên trong. Hạt vi nang hình thành đẹp và
tương đối đồng đều [11].
Tuy nhiên, sử dụng alginat để vi nang hóa tế bào vi sinh vật cũng có một số nhược
điểm. Độ bền gel phụ thuộc một số ion hóa trị I và các chất tạo phức với ion Ca2+.
Gel alginat rã khi các cation hóa trị II phối hợp được thay thế bằng các cation hóa
trị I hoặc các chất tạo phức với Ca2+ . Sự tương tác giữa alginat và các cation hóa

trị I dẫn đến hiện tượng hòa tan của gel [14].

6


1.1.3.2. Chitosan
a. Nguồn gốc:
Chitosan là một polyaminosaccharid sinh học có nguồn gốc thiên nhiên thu được
từ phản ứng deacetyl hóa của chitin, một polyme tự nhiên chuỗi dài của Nacetylglucosamine và dẫn xuất đường glucose. Chitin là thành phần chính của
thành tế bào nấm, xương loài động vật chân đốt như tôm, cua, côn trùng. Độ nhớt
của dung dịch chitosan tăng lên khi tăng nồng độ chitosan, giảm nhiệt độ và phụ
thuộc mức độ deacetyl hóa của chitosan. [37].
Nhóm amino của chitosan có pKa xấp xỉ 6,5. Chitosan mang điện tích dương, có
tính base yếu, thấm nước, tan trong hầu hết các dung dịch acid hữu cơ ở pH nhỏ
hơn 6,5 như acid formic, acid acetic, acid tartaric và acid citric, nhưng không tan
trong acid sulfuric và acid phosphoric. Các muối glutamat, clorid của chitosan tan
trong nước. Chitosan không tan trong mơi trường kiềm, mơi trường trung bình.
Đặc tính này được ứng dụng để chế tạo vi cầu, vi nang chitosan. Tính chất tích
điện dương giúp cho chitosan hoạt động như một chất bám dính sinh học, có khả
năng bám vào các bề mặt tích điện âm như màng nhầy. Chitosan có rất nhiều loại
có khối lượng phân tử và mức độ deacetyl hóa khác nhau, đây là những yếu tố
ảnh hưởng đến kích thước phân tử, sự hình thành, kết tập phân tử và ứng dụng
của chitosan [37].

chitin

7


Hình 1.2. Cấu trúc hóa học chitosan [𝟑𝟕]

1.1.3.3. Tinh bột
Tinh bột là một polysaccharid tự nhiên, có tính tương hợp sinh học. Tinh bột có
thể được sử dụng tá dược bảo vệ trong q trình đơng khơ theo cơ chế làm giảm
lượng tinh thể nước gắn với màng tế bào trong mẫu [33].
Ưu điểm của tinh bột là không độc, không sinh đáp ứng miễn dịch, được sử dụng
làm tá dược độn phổ biến, giá rẻ và có thể được phân hủy bởi α-amylase [6], khi
tạo vi nang calci alginat, tinh bột được phối hợp như tá dược độn rắn, góp phần
cải thiện thể chất của vi nang sau đơng khô, giúp tế bào ổn định hơn, cải thiện khả
năng sống sót của VSV trong q trình đơng khơ và bảo quản [8], [9].
Ứng dụng trong bào chế dược phẩm tinh bột là một tá dược đa năng được sử dụng
chủ yếu trong các chế phẩm thuốc rắn (viên nang, viên nén), ngồi ra cịn được
sử dụng trong các chế phẩm bơi ngồi ra (thuốc mỡ). Tinh bột có thể đóng vai trị
làm tá dược độn, tá dược dính, tá dược rã và tá dược trơn trong thành phần thuốc
rắn.
1.1.4. Một số nghiên cứu sử dụng vi nang alginat phối hợp với tinh bột
Vi nang calci alginat đã được biết đến, nghiên cứu và ứng dụng trong khoảng thời
gian rất dài. Từ những năm đầu thập niên chín mươi của thế kỷ XX Sheu và
Marshall (1993) đã sử dụng calci alginat để cố định và bảo quản lactobacilli [35].
Sang thế kỷ XXI Chandramouli V và cộng sự (2003) đã sử dụng vi nang calci
alginat để bảo vệ và làm tăng khả năng sống sót của vi khuẩn Lactobacillus
acidophilus khi đi qua dạ dày [13]. Tác giả Đàm Thanh xuân và cộng sự đã đánh
giá vai trò của tinh bột và sữa gầy đến quá trình probiotic chứa vi khuẩn L.
acidophilus ATCC 4356 [8].
8


1.2. Tổng quan về Probiotic
1.2.1. Định nghĩa
Probiotic hay còn gọi là lợi khuẩn là nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau, có lợi cho
sự phát triển của nhiều lồi vật chủ theo phương thức sống cộng sinh tự nhiên

được tìm thấy trong hệ sinh vật đường ruột của người và động vật [40].
Thuật ngữ probiotic có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp, trong đó ″biotic‶ bắt nguồn từ
chữ ″life″ có nghĩa là ″sự sống″ và ″pro‶ có nghĩa là thân thiện nên probiotic có
thể được hiểu là ‶sự sống thân thiện″ [22].
Thuật ngữ này ban đầu được sử dụng để mơ tả các chất được sản xuất bởi một
VSV kích thích sự phát triển của VSV khác, sau đó được sử dụng để mơ tả các
chiết xuất mơ kích thích sự phát triển của VSV và bổ sung trong thức ăn chăn
ni góp phần vào sự cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột của động vật. Năm 2002,
Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và tổ chức Nông lương thế giới (FAO) đã đưa ra
định nghĩa ngắn gọn và hoàn chỉnh nhất về probiotic như sau ″Probiotic là những
vi sinh vật sống mà khi đưa vào cơ thể với một lượng đủ lớn sẽ đem lại tác động
có lợi cho sức khỏe vật chủ″ [16]. Định nghĩa về probiotic này cũng được Hiệp
hội khoa học quốc tế về probiotic và prebiotics (ISAPP) áp dụng và được sử dụng
trong hầu hết các ấn phẩm khoa học [18].
1.2.2. Các nhóm VSV Probiotic
Nhóm vi sinh vật thường được sử dụng trong các chế phẩm probiotic là:
- Nhóm vi khuẩn lactic: gồm 2 chi phổ biến là chi Lactobacillus và
Bifidobacterium, ngồi ra cịn có Streptococcus.
- Nhóm vi khuẩn khơng phải vi khuẩn lactic:
+ Chi Propionibacterium: P. freudenreichii, P. cyclohexanicum…
+ Chi Bacillus: B. subtilis, B. clausii…
+Chi Brevibacillus: B. laterosporus …
+ Chi Sporolactobacillus: S. laevolacticus… [20]
- Nhóm nấm men: chủ yếu là chi Saccharomyces đại diện là S. cerevisiae.

9


1.2.3. Vai trò của probiotic trong lâm sàng và ứng dụng
Các nghiên cứu về vai trò, tác dụng và ứng dụng của probiotic vào công nghệ

dược phẩm phát triển rộng rãi trong 2 thập kỉ qua [12], [36]. Hiện nay hiểu biết
của các nhà khoa học về probiotic càng rộng rãi và tiêu biểu là một số vai trò sinh
học thường được nhắc tới là :
- Kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn, virus, nấm có hại [27].
- Phịng và chữa một số bệnh đường tiêu hóa như táo bón, tiêu chảy, viêm loét dạ
dày, tá tràng [32].
- Giúp hạ cholesterol máu [40].
- Tăng cường miễn dịch, chống lại tác nhân gây ung thư [30].
- Ngăn ngừa ung thư ruột kết [28].
- Ngồi ra cịn một số vai trị khác nhau: Chống dị ứng, giảm nguy cơ sỏi thận,
tăng cường hệ miễn dịch [33].
1.2.4. Saccharomyces boulardii
Saccharomyces boulardii thuộc giới Nấm (Fungi), Ngành Ascomycota, Phân
ngành Saccharomycotina, lớp Saccharomycetes, Bộ Saccharomycetales, Họ
Saccharomycetaceae, Chi Saccharomyces [2].

Hình 1.3. Hình ảnh nấm men Saccharomyces boulardii [𝟏𝟓]
Nấm men có hình cầu hay hình trứng, có kích thước từ 5-15µm, sinh sản bằng
cách mọc chồi và khơng sinh bào tử như S. cerevisiae. Hình dạng nấm men không
ổn định và phụ thuộc tuổi giống, điều kiện ngoại cảnh. Khi nuôi cấy trong môi
10


trường giàu dinh dưỡng, hiếu khí Saccharomyces thường có hình bầu dục và trong
điều kiện yếm khí thường có hình tròn hơn.
Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển là 26-30℃, chúng phát triển chậm hoặc ngừng
hẳn nếu nhiệt độ trên 46℃, pH tối ưu khoảng 4,5-6, phát triển mạnh mẽ trong môi
trường giàu dinh dưỡng hydrocacbon, nito, photspho và các nguyên tố vi lượng
natri, kali [17]…
S. boulardii tạo ra proteion ức chế vi khuẩn gây bệnh và nội độc tố của chúng, các

nghiên cứu đã chỉ ra rằng S. boulardii có các tác dụng sau[15] :
- Dự phịng tiêu chảy liên quan đến kháng sinh ở người lớn và trẻ em.
- Nhiễm trùng do Clostridium difficile
- Tiêu chảy liên quan đến HIV/AIDS.
- Loại bỏ các vi khuẩn Helicobacter pylori nhiễm trùng.
- Điều trị viêm dạ dày cấp tính.

11


Chương II: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị
2.1.1. Nguyên vật liệu sử dụng
Bảng 2.1. Các nguyên liệu sử dụng trong nghiên cứu
Tên hóa chất

Nguồn gốc

Tên hóa chất

Nguồn gốc

Tinh bột

Việt Nam

Glucose

Trung Quốc


Natri alginat

Ấn độ

Cao nấm men

Merk- Đức

Calci clorid

Trung Quốc

(NH4)2SO4

Trung Quốc

Chitosan

Trung Quốc

MgSO4.4H2O

Trung Quốc

HCl

Trung Quốc

KH2PO4


Trung Quốc

Natri citrat

Trung Quốc

KH2PO4

Trung Quốc

Na2HPO4

Trung Quốc

Thạch (Agar)

Việt nam

2.1.2. Thiết bị
Bảng 2.2. Các thiết bị dùng trong nghiên cứu
Thiết bị

Nguồn gốc

Thiết bị

Nguồn gốc

Máy khuấy từ


Hàn Quốc (Wisd)

Tủ lạnh bảo quản

Hàn Quốc (LG)

Máy lắc ổn nhiệt

Trung Quốc

Tủ lạnh sâu -70

Hàn Quốc (LG)

(KWF)

độ

Cân kỹ thuật

Đức (Satorious)

Máy ly tâm

Đức (Satorious)

Nồi hấp tiệt

Nhật (ALP)


Máy đo đường

Tây Ban Nha

kính vịng vơ

(Caliper)

khuẩn

khuẩn
Máy đơng khơ

Đức (Christ

Tủ ấm

Đức (Memmert)

Alpha)
Dụng cụ: Bình nón, cốc có mỏ, ống đong, ống ly tâm, ống nghiệm có nút xốy,
pipet, đĩa petri…
12


2.1.3. Các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu
Môi trường nhân giống (MTNG)
Glucose


80g

MgSO4

1g

Cao nấm men

5g

KH2PO4

2g

(NH4)2SO4

3g

Nước cất vừa đủ 1000ml

pH

6,5-7

Môi trường thạch nghiêng giữ giống (MTT): MTNG + 2% thạch agar
(20g/1000ml)
Dung dịch sử dụng


Dung dịch đệm Phosphat pH=6,8 (Theo DĐVN V, PL -107) : Hòa tan 28,8g


dinatri hydrophosphat và 11,45g kali dihydrophosphat trong nước cất vừa đủ
1000ml. [1].


Dung dịch HCl pH=1,2 : Hút HCl (1M) 8,5ml cho vào nước cất 1000ml.



Dung dịch Natri citrat 2% (kl/tt): Cân chính xác 4g natri citrate cho vào

bình nón chứa nước cất 20ml hịa tan hồn tồn rồi đậy nút bơng.


Dung dịch Lugol 1%: Cân chính xác iod 1g, kali iodid 2g và nước tinh khiết

(mới đun sơi để nguội) vừa đủ 100ml. Hịa tan kali iodid và iod trong khoảng 3ml
nước, khuấy kỹ cho tan rồi cho nước vừa đủ 100ml.
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Khảo sát thời gian đơng tụ hồn tồn của vi nang alginat, alginat - tinh
bột và alginat-tinh bột-chitosan


Ảnh hưởng của nồng độ alginat, CaCl2 và kích thước đầu nhỏ giọt đến thời

gian đơng tụ hồn tồn của vi nang


Ảnh hưởng của nồng độ chitosan đến thời gian đông tụ hoàn toàn của vi


nang


Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginat, CaCl2, tinh bột và kích thước đầu

nhỏ giọt đến kích thước hạt alginat và alginat - tinh bột
2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ tinh bột và chitosan tới thời gian rã
của vi nang


Ảnh hưởng của nồng độ tinh bột tới thời gian rã của vi nang
13




Ảnh hưởng của nồng độ chitosan tới thời gian rã của vi nang



Cố định S. boulardii trong vi nang

2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp tiệt khuẩn
Nguyên vật liệu cần tiệt khuẩn được gói bằng giấy báo hoặc đựng trong bình nón,
đậy kín bằng nút bơng, sau đó tiệt trùng trong nồi hấp tiệt khuẩn ở 115℃ trong 20
phút.
2.3.2. Phương pháp tạo vi nang
Bảng 2.3. Bảng thiết kế công thức vi nang
Nồng độ (%)


Tinh bột

Natri alginat

Chitosan

Calci clorid

2, 4, 6, 8 và

3, 6 và 10

0,5 và 1

2 và 10

10
Chuẩn bị các dung dịch :


Tiệt khuẩn tinh bột: thực hiện theo phương pháp Tyndall. Cân một lượng

tinh bột nhất định cho vào bình nón, đậy kín bằng nút bơng, đun cách thủy ở 7080℃ trong 1 giờ, ủ bình trong tủ ấm ở nhiệt độ 37℃ trong 24 giờ. Lặp lại thao tác
trong 3 ngày liên tục.


Dung dịch alginat (kl/tt): cân chính xác (g) natri alginat, phân tán đều trong

nước cất. Để yên 30 phút cho alginat trương nở, đem hấp tiệt trùng ở 115℃ trong

20 phút cho alginat đồng nhất.


Hỗn dịch alginat – tinh bột (kl/tt): cân chính xác (g) tinh bột, phân tán vào

dung dịch alginat, đồng nhất hóa bằng máy khuấy từ trong 20 phút thu được hỗn
dịch alginat- tinh bột


Dung dịch calci clorid 2% và 10%: cân chính xác 2.00g, 10.00g calci clorid

cho vào bình nón chứa 100 ml nước cất, hịa tan rồi đậy nút bơng.


Dung dịch chitosan trong calci clorid: cân (g) calci clorid, cân (g) chitosan

rồi hịa tan cả hai trong dung dịch có chứa nước cất vừa đủ rồi đậy nút bông.
Tạo vi nang bằng kỹ thuật nhỏ giọt: dùng pipet Pasteur hút hỗn dịch (alginat, tinh
bột, VSV) đã khuấy trộn đồng nhất nhỏ từ từ xuống dung dịch calci clorid (hoặc
14


dung dịch hỗn hợp chitosan- calci clorid tùy từng thí nghiệm), ngâm hạt trong thời
gian thích hợp. Sử dụng các đầu nhỏ giọt có kích cỡ khác nhau để tạo vi nang có
đường kính khác nhau.
H1: Đầu nhỏ giọt là kim tiêm (cỡ kim 25G x 1’’, d= 0,241mm)
H2: Đầu nhỏ giọt pipet Pasteur (d= 2mm)
H3: Đầu nhỏ giọt ống tiêm (d= 4mm)
2.3.3. Phương pháp xác định thời gian đông tụ hoàn toàn của vi nang
Để xác định được vi nang đơng tụ hồn tồn, vi nang ngâm trong dd CaCl2 trong

thời gian thích hợp, sau thời gian 5 phút lại lấy 1 mẫu vi nang cát quan sát hình
thái bên trong. Vi nang đơng tụ hồn tồn phải có chất đặc hồn tồn, cầu đều,
chắc và khó vỡ.
2.3.4. Phương pháp đo kích thước vi nang
Xác định kích thước đường kính vi nang: sử dụng máy đo đường kính vịng vô
khuẩn Caliper (Tây Ban Nha): cho vi nang lên phiến kính, quan sát hình dạng và
xác định đường kính của vi nang.
2.3.5. Phương pháp đông khô
Giai đoạn tiền đông: vi nang được đựng trong đĩa petri hoặc lọ thủy tinh đã rửa
sạch và tiệt khuẩn, sau đó đông lạnh vi nang ở nhiệt độ -70℃ trong 24h để nước
trong vi nang chuyển sang thể rắn hồn tồn.
Giai đoạn làm khơ bay hơi nước: các vi nang được tiền đông 8-12h ở tủ lạnh ở
nhiệt độ 70℃, sau đó được làm khô trong không gian lạnh của máy đông khô ở
nhiệt độ khoảng -50℃, áp suất 0,100 mbar trong 24h. Sau 24h lấy mẫu vi nang ra
khỏi thiết bị, chuyển các loại nguyên liệu từ đĩa petri vào lọ thủy tinh kín, bảo
quản ở nhiệt độ khoảng 2-8℃, độ ẩm tương đối 30%.
2.3.6. Phương pháp đánh giá độ rã của vi nang trong các mơi trường mơ
phỏng dịch tiêu hóa
Chuẩn bị các môi trường: mô phỏng dịch ruột dd đệm PBS pH 6,8 và mô phỏng
dịch dạ dày dd HCl pH 1,2.

15


Cân 1g vi nang tươi hoặc 0,1 vi nang đông khơ cho vào bình nón chứa 10ml dung
dịch mơi trường, lắc trong máy lắc ổn nhiệt ở tốc độ 75 vòng/phút nhiệt độ 37℃.
Quan sát 15 phút/lần lắc trong thời gian 2 giờ để theo dõi độ rã vi nang. Tiến hành
2 thí nghiệm:
o Lắc vi nang trong đệm PBS pH 6,8, quan sát độ rã vi nang 15ph/lần.
o Lắc vi nang trong dd HCl pH1,2 trong 30 phút rồi rửa 3 lần bằng nước cất,

lắc tiếp trong đệm PBS pH 6,8. Quan sát độ rã vi nang 15ph/lần.
2.3.7. Phương pháp ni cấy S. boulardii thu sinh khối
- Hoạt hóa chủng giống S. boulardii: Hoạt hóa VSV từ ống giống bảo quản trong
thạch nghiêng. Pha 100ml MTNG lỏng vào 10 ống nghiệm (10 ml/ống), nút kín,
hấp tiệt trùng bằng phương pháp nhiệt ẩm ở 121℃ trong 20 phút, để nguội. Tiến
hành cấy giống vào các ống nghiệm trên, ủ 24h trong tủ ấm 30℃.
- Nhân giống S. boulardii: Chuẩn bị 100ml MTNG lỏng cho vào bình nón, nút
bơng kín, đem hấp tiệt trùng bằng nhiệt ẩm ở 121℃ trong 20 phút, để nguội, cấy
1 ống nghiệm giống đã hoạt hóa vào bình nón, ni cấy ở nhiệt độ 30℃, điều kiện
cấp khí lắc 150v/p.
- Thu sinh khối tế bào: Hỗn dịch nhân giống sau 24h được ly tâm, ống ly tâm đã
được tiệt khuẩn. Ly tâm ở điều kiện 4000 vòng/phút trong 20 phút, loại dịch nổi
thu nhần sinh khối VSV.
2.3.8. Phương pháp pha loãng liên tục để xác định số lượng vi sinh vật
Nguyên tắc: Chuẩn bị lượng ống nghiệm tương ứng với nồng độ pha loãng. Cho
vào mỗi ống 9 ml nước cất, hấp tiệt trùng ở 1,0atm/20 phút. Để nguội đến nhiệt
độ phịng. Hút chính xác 1 ml dung dịch cần pha loãng vào ống nghiệm thứ nhất
được 10,00ml có nồng độ pha lỗng 10-1, tiếp tục pha loãng đến ống thứ n. Ta
được nồng độ pha loãng 10-n.
- Xác định số lượng tế bào trong mẫu thử: Cân chính xác 1,00g vi nang
đơng khơ chứa VSV cho vào bình nón chứa 100ml natri citrat 2% đã được
hấp tiệt trùng. Hòa tan bằng cách lắc trong máy lắc ổn nhiệt 37℃ tốc độ 75
vòng/phút, lắc vi nang trong 20 phút, vi nang tan hoàn toàn trong natri citrat
16