BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

ĐỖ THU UN

TỔNG QUAN KỸ THUẬT NHUỘM
HỐ MƠ MIỄN DỊCH DẤU ẤN MSI TRÊN MÁY
VENTANA BENCHMARK XT

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA
KHOÁ 2017 - 2021

HÀ NỘI – 2021


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

ĐỖ THU UN

TỔNG QUAN KỸ THUẬT NHUỘM
HỐ MƠ MIỄN DỊCH DẤU ẤN MSI TRÊN MÁY
VENTANA BENCHMARK XT
Ngành đào tạo: Cử nhân Xét nghiệm Y học
Mã ngành: D720332

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA
KHOÁ 2017 - 2021
Người hướng dẫn khoa học:
ThS. Tạ Hồng Hải Đăng

HÀ NỘI – 2021


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt q trình học tập và hồn thành khoá luận tốt nghiệp, em đã nhận được
sự hướng dẫn, giúp đỡ quý báu của các thầy, cô, anh, chị và các bạn. Với tấm lòng
của người học trò, em xin trân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo đại
học, khoa Xét nghiệm Y học, bộ môn Giải phẫu bệnh lâm sàng trường Đại học Y
Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ em trong q trình học tập và hồn
thành bài luận văn này.
Với lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn trân thành tới:
ThS. Tạ Hồng Hải Đăng – giảng viên trường Đại học Y Hà Nội, người thầy đã
tận tình chỉ bảo động viên, hướng dẫn, giúp đỡ em trong kiến thức chuyên môn và
rèn luyện kỹ năng thực hành, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá
trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận văn này.
Em xin trân thành cảm ơn các thầy, cô, cán bộ, nhân viên khoa Giải phẫu bệnh,
bệnh viện Đại học Y Hà Nội đã nhiệt tình chỉ bảo, giúp đỡ em trong suốt quá trình
học tập và nghiên cứu.
Em xin trân trọng cảm ơn các thầy cơ trong Hội đồng chấm khố luận đã cho em
những đóng góp q báu để hồn thành luận văn này.
Lời cuối cùng con xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới cha, mẹ, những người thân
trong gia đình đã ln là chỗ dựa vững chắc, chăm sóc, cổ vũ, động viên con trong
suốt quá trình học tập, phấn đấu và trưởng thành.
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2021

Đỗ Thu Uyên


LỜI CAM ĐOAN
Em xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng em. Các nội dung được
nêu trong tổng quan là trung thực và chưa từng công bố trong bất cứ cơng trình
khoa học nào.
Đỗ Thu Un


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
AEC

3 – amino – 9 – ethylcarbazone

CC1

Cell Conditioning Solution

CIMP

Kiểu hình methyl hố đảo CpG (CpG island methylator phenotype)

CIN

Mất ổn định NST (chromosomal instability)

CRC

Ung thư đại trực tràng (Colorectal Cancer)


DAB

3,3 – diaminobenzidentetrahydrochlorid

DNA

Deoxyribonucleic acid

EMAST

Thay đổi vi vệ tinh cao ở sự lặp lại bốn nucleotide được chọn

HNPCC

Hội chứng Lynch (ung thư đại trực tràng không polyp di truyền)

HRP

Enzyme peroxidase chiết xuất từ cây cải ngựa (Horseradish
Peroxidase)

IDL

Vịng lặp khơng bắt cặp bổ sung

LOH

Sự mất dị hợp tử (loss of heterozygosity)


MACS

Ổn định vi vệ tinh và nhiễm sắc thể (microsatellite and
chromosomally stable)

MLH1

mutL homolog 1

MLH3

mutL homolog 3

MMR

Hệ thống sửa chữa không phù hợp DNA (DNA Mismatch Repair)

MSH2

mutS homolog 2

MSH3

mutS homolog 3

MSH6

mutS homolog 6

MSI


Sự mất ổn định vi vệ tinh (Microsatellite instability)

MSI-H

MSI mức độ cao


MSI-L

MSI mức độ thấp

MSS

Sự ổn định vi vệ tinh (Microsatellite Stability)

PCR

Phản ứng trùng hợp chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction)

PMS1

postmeiotic segregation increased 1

PMS2

postmeiotic segregation increased 2


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ....................................................................................................... 1
Chương 1: Giới thiệu chung về MSI: ................................................................. 3
1.1. Lịch sử phát hiện dấu ấn MSI: ................................................................. 3
1.2. Vùng vi vệ tinh: .......................................................................................... 5
1.3.

Cơ chế sửa chữa bắt cặp sai DNA: .................................................. 6

1.3.1.

Cơ chế sửa bắt cặp sai DNA của DNA polymerase: .......................... 6

1.3.2.

Cơ chế sửa chữa lỗi ghép cặp sai ở vi khuẩn E.coli – con đường

MutHLS:…………………………………………………………………………7
1.3.3.

Các gen liên quan đến hoạt động của MMR ở người: ........................ 8
1.3.3.1. Các protein liên quan đến hoạt động của MMR ở người: .............. 8
1.3.3.2. Cơ chế hoạt động của hệ thống MMR ở người: ............................. 9
1.3.3.3. Các dạng mất ổn định vi vệ tinh: .................................................. 11

Chương 2: MSI trong ung thư đại trực tràng: ............................................... 12
2.1. Dịch tễ ung thư đại trực tràng: ............................................................... 12

2.2. Chẩn đoán ung thư đại trực tràng: ........................................................... 13
2.2.1. Chẩn đoán ung thư đại trực tràng: ............................................................. 13


2.2.1.1. Chẩn đoán lâm sàng: .................................................................... 13
2.2.1.2. Chẩn đoán cận lâm sàng: .............................................................. 14
2.2.2. Xét nghiệm chẩn đoán MSI trong ung thư đại trực tràng: ......................... 15
2.2.2.1. Chẩn đoán MSI bằng phản ứng PCR: .......................................... 16
2.2.2.2. Xác định MSI bằng phương pháp hố mơ miễn dịch:.................. 17
2.3. Con đường mất ổn định vi vệ tinh trong ung thư đại trực tràng: .......... 18
2.3.1. Cơ sở phân tử ung thư đại trực tràng: ........................................................ 18
2.3.1.1. Cơ sở phân tử ung thư đại trực tràng: ........................................... 18
2.3.1.2. Hội chứng Lynch: ......................................................................... 20
2.3.2. Giá trị tiên lượng của xét nghiệm MSI trong ung thư đại trực tràng: ........ 21
2.4. Đặc tính ung thư đại trực tràng có MSI: ............................................... 22
Chương 3: Nhuộm MSI trên máy nhuộm hố mơ miễn dịch Ventana
BenchMark XT: ................................................................................................. 24
3.1. Máy nhuộm hố mơ miễn dịch Ventana BenchMark XT: ..................... 26
3.1.1.

Cấu tạo máy nhuộm hố mơ miễn dịch Ventana BenchMark XT:... 27
3.1.1.1. Module nhuộm: ............................................................................ 27
3.1.1.2. Module hoá chất cơ bản:………………………………………...27
3.1.1.3. Module chất thải: ……………………………………………….27
3.1.1.4. Máy tính và phần mềm điều khiển: .............................................. 28

3.1.2.

Các hoá chất cơ bản: ......................................................................... 28


3.1.3.

Bảo dưỡng máy: ................................................................................ 31


3.2. Phương pháp nhuộm MSI trên máy nhuộm hố mơ miễn dịch
Ventana BenchMark XT: ................................................................................. 32
3.2.1. Tẩy paraffin: .............................................................................................. 32
3.2.2. Bộc lộ kháng nguyên: ................................................................................ 33
3.2.3. Khử enzyme nội sinh: ................................................................................ 33
3.2.4. Phủ kháng thể sơ cấp: ................................................................................ 33
3.2.5. Phủ kháng thể thứ cấp: .............................................................................. 34
3.2.6. Phủ chất hiện màu: .................................................................................... 36
3.2.7. Nhuộm nhân: ............................................................................................. 36
3.2.8. Gắn lamen .................................................................................................. 37
3.2.9. Kiểm tra tiêu bản và thực hiện các thủ tục hành chính .............................. 37
3.3. Quy trình nhuộm hố mơ miễn dịch trên máy Ventana BenchMark
XT: …. ................................................................................................................ 37
3.3.1.

Quy trình nhuộm bộ dấu ấn MSI trên máy hố mơ miễn dịch

BenchMark XT: ................................................................................................... 37
3.3.1.1. Quy trình nhuộm hố mơ miễn dịch với dấu ấn MLH1: .............. 37
3.3.1.2. Quy trình nhuộm hố mô miễn dịch với dấu ấn MSH2: .............. 38
3.3.1.3. Quy trình nhuộm hố mơ miễn dịch với dấu ấn MSH6: .............. 38
3.3.1.4. Quy trình nhuộm hố mơ miễn dịch với dấu ấn PMS2: ............... 39
3.3.2.

Chứng âm và chứng dương trong nhuộm hố mơ miễn dịch bộ dấu


ấn MSI: …………………………………………………………………………40


3.3.3.

Phiên giải kết quả xét nghiệm: .......................................................... 41

3.3.4.

Các kiểu nhuộm màu sai và cách xử trí: ........................................... 42

KẾT LUẬN ........................................................ Error! Bookmark not defined.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình

Tên hình

Số trang

1.1

Nghiên cứu MSI liên quan đến ung thư đại trực tràng từ

5


năm 1990 đến năm 2010
1.2

Cơ chế hoạt động của hệ thống MMR ở người

10

2.1

Cơ sở phân tử ung thư đại trực tràng

20

3.1

Mơ hình lam kính nhuộm hố mơ miễn dịch

32

3.2

Ngun lý phát hiện kháng ngun của bộ OptiView

35

DAB IHC Detection Kit
3.3

Nhuộm hố mơ miễn dịch dấu ấn MLH1 dương tính


41

3.4

Nhuộm hố mơ miễn dịch dấu ấn PMS2 dương tính

41

3.5

Nhuộm hố mơ miễn dịch dấu ấn PMS2 âm tính và dấu

42

ấn MSH6 dương tính


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Microsatellite instability (MSI) hay còn gọi là sự mất ổn định vi vệ tinh là hình
thái mất ổn định của gen, khi đó các đột biến gen sẽ dễ dàng xuất hiện. MSI có thể
gặp trong nhiều ung thư như ung thư kết tràng, ung thư nội mạc tử cung, ung thư
dạ dày và một số bệnh ung thư khác như: ung thư buồng trứng, ung thư tiền liệt
tuyến, ung thư đường gan mật, … Trong đó ung thư gặp phổ biến nhất là ung thư
đại trực tràng. Phần lớn các ung thư đại trực tràng phát triển thông qua con đường
bất ổn định nhiễm sắc thể trong khi đó 12 - 15% phát sinh từ MSI, là hậu quả của
sự suy giảm chức năng của một trong các gen sửa chữa bắt cặp sau DNA
(Mismatch repair - MMR) bao gồm gen MLH1, MSH2, MSH6, PMS2, dẫn đến
sự thay đổi hoạt tính protein, làm bất hoạt hệ thống sửa chữa bắt cặp sau DNA dẫn

đến tích lũy các đột biến ở vùng vệ tinh, gây ra ung thư đại trực tràng có tính chất
di truyền. Đặc biệt ung thư đại trực tràng khơng polyp có tính chất di truyền
(HNPCC), hay còn gọi là hội chứng Lynch phát sinh từ con đường MSI.
Việc xác định MSI có ý nghĩa rất quan trọng, không chỉ để sàng lọc hội chứng
Lynch mà còn giúp phân biệt giữa ung thư đại trực tràng khiếm khuyết hệ thống
sửa chữa bắt cặp sai với ung thư đại trực tràng MSS, nó sẽ cung cấp các thơng tin
có giá trị cho tiên lượng và việc cá thể hóa trong điều trị.
Xác định MSI bằng phương pháp hố mơ miễn dịch ít tốn kém hơn PCR với tính
chính xác cao, độ nhạy cao và độ đặc hiệu tuyệt đối. Hiện nay, các phương pháp
nhuộm hố mơ miễn dịch khác nhau đã được thương mại hoá bởi nhiều hãng như
Dako, Leica, Thermo, Cell Marque, … Nhiều thế hệ máy nhuộm hố mơ miễn
dịch tự động và bán tự động được phát triển và sử dụng rộng rãi như: Leica BOND
– III, Leica Bond Max, Ventana BenchMark ULTRA, … Máy nhuộm hố mơ


2

miễn dịch Ventana BenchMark XT là hệ thống máy với sự linh hoạt cao, đáp ứng
được nhu cầu nhuộm hoá mơ miễn dịch nhiều dấu ấn khác nhau, có thể cài tay các
quy trình nhuộm, dễ dàng xây dựng quy trình nhuộm tối ưu cho từng phịng xét
nghiệm. Nhằm tổng hợp các kiến thức xung quanh MSI và quy trịnh nhuộm dấu
ấn MSI trên máy Ventana BenchMark XT, chúng tôi thực hiện tổng quan tài
liệu:“Tổng quan kỹ thuật nhuộm hoá mô miễn dịch dấu ấn MSI trên máy
Ventana BenchMark XT”, gồm các nội dung chính sau:
1.

Sơ lược về MSI và ung thư đại trực tràng có MSI.

2.


Nhuộm hố mơ miễn dịch dấu ấn MSI trên máy Ventana BenchMark

XT


3

Chương 1: Giới thiệu chung về MSI:
1.1.

Lịch sử phát hiện dấu ấn MSI:

MSI được phát hiện đầu tiên ở vi khuẩn vào những năm 1970 – 1980 và được mô
tả một cách rõ ràng vào đầu những năm 1990 [4]. MSI được gây ra bởi sự bất hoạt
đột biến của các gen liên quan đến quá trình sửa chữa DNA. Căn bệnh đầu tiên ở
người có liên quan rõ ràng với các khiếm khuyết trong quá trình sửa chữa DNA là
bệnh khô da sắc tố, một bệnh lặn hiếm gặp do đột biến bất hoạt cả hai allen trong
các gen liên quan đến sửa chữa cắt bỏ nucleotide.
Năm 1992, Manuel Perucho đã sử dụng phản ứng trùng hợp chuỗi polymerase
(PCR), chiết xuất DNA từ các mô đại tràng và khuếch đại hàng nghìn trình tự bằng
cách sử dụng một số lượng nhỏ mồi PCR được chọn ngẫu nhiên [5]. Khi phân tích
các kết quả thu được, các tác giả đã nhận thấy rằng 12% khối u có các băng điện
di có chiều dài ngắn hơn do DNA di chuyển xa hơn một chút. Họ đã phân tích các
trình tự DNA trong các băng này và phát hiện ra rằng chúng chứa các trình tự lặp
lại đơn giản, chủ yếu ở các vùng polyadenine liên kết với trình tự Alu. Các khối u
này có các đặc điểm lâm sàng và bệnh lý độc đáo. Đầu tiên, các khối u với các đột
biến xóa này có nhiều khả năng phát sinh hơn ở đại tràng gần, ít có khả năng bị
xâm lấn hơn, ít có khả năng có đột biến ở KRAS hoặc p53 , kém biệt hóa hơn và
đến từ những bệnh nhân trẻ tuổi. Dựa trên những phát hiện này, các tác giả kết
luận rằng những đột biến này đại diện cho một con đường duy nhất dẫn đến sự

phát triển của khối u và dự đoán rằng sự sai lệch trong cơ chế sao chép của các tế
bào bình thường gây ra chúng có thể là di truyền, mặc dù họ khơng có bằng chứng
cho điều này [6].
Đồng thời, phịng thí nghiệm của Stephen Thibodeau đang nghiên cứu trình tự lặp
lại dinucleotide để lập bản đồ di truyền và phân tích tính di truyền của sự mất dị


4

hợp tử (LOH – loss of heterozygosity), đồng thời tìm kiếm các gen ức chế khối u
mới trên nhiễm sắc thể 5q, 15q, 17p và 18q trong các khối u đại trực tràng. Họ
quan sát thấy các đột biến mất đoạn trong trình tự lặp lại CA ở những vùng này và
đặt ra thuật ngữ không ổn định của tế bào vi mô (mà họ gọi là MIN). Họ đã phát
hiện ra MSI ở 28% các khối u đại trực tràng và lưu ý rằng những đột biến này
không đồng nhất ở các khối u khác nhau [7]. Quan trọng hơn, họ phát hiện ra rằng
89% khối u có MSI là ở đại tràng gần và những bệnh nhân ung thư đại trực tràng
có MSI có tiên lượng tốt hơn. Giống như Perucho, Thibodeau và cộng sự đã công
nhận rằng điều này đại diện cho một con đường duy nhất để phát triển khối u mà
"không liên quan đến mất dị hợp tử" [8].
Các nghiên cứu từ một tổ chức quốc tế do Bert Vogelstein đứng đầu ở Hoa Kỳ và
Albert de la Chapelle ở Phần Lan đã giúp làm sáng tỏ ý nghĩa lâm sàng của MSI.
Aaltonen và cộng sự đã tìm thấy mối liên kết đáng kể ở nhiễm sắc thể 2p bằng
cách sử dụng dấu ấn D2S123 ở hai dòng họ lớn mắc hội chứng Lynch (khi đó được
gọi là ung thư đại trực tràng khơng polyp di truyền - HNPCC) [9]. Trong quá trình
này họ đã tìm thấy MSI trong 13% trường hợp ung thư đại trực tràng đơn lẻ và lý
giải chính xác rằng các khối u trong ung thư đại trực tràng di truyền và một tập
hợp con các khối u trong ung thư đại trực tràng đơn lẻ có chung một con đường
phát triển khối u chung nhưng duy nhất [10].
Một loạt các cuộc điều tra đã dẫn đến nhận ra rằng MSI phát sinh từ các khiếm
khuyết trong hệ thống sửa chữa không phù hợp DNA (MMR) và việc xác định 4

gen gây ra hội chứng Lynch. Khung thời gian của những khám phá này được minh
họa trong hình dưới đây [11].


5

Hình 1.1: Nghiên cứu MSI liên quan đến ung thư đại trực tràng từ năm
1990 đến năm 2010
1.2.

Vùng vi vệ tinh:

Vùng vi vệ tinh là đoạn DNA gồm các chuỗi từ một đến sáu cặp nucleotide (thường
là hai nucleotide) lặp lại nhiều lần, phổ biến nhất là lặp đoạn CA. Các trình tự vi
vệ tinh thay đổi giữa từng cá thể, tuy nhiên, được xác định giống nhau giữa các tế
bào của cùng một cơ thể và là một dấu ấn đặc trưng cho mỗi người.
Microsatellite instability (MSI) hay còn gọi là sự mất ổn định vi vệ tinh là một
hình thái mất ổn định của gen, khi đó các đột biến gen sẽ dễ xuất hiện. Sự mất ổn
định vi vệ tinh được biểu hiện bởi sự tăng hoặc giảm chiều dài do sự suy giảm
chức năng của hệ thống sửa chữa lỗi ghép cặp sai DNA. Khi những sai sót trong
q trình tái bản DNA khơng được phát hiện và sửa chữa, các sai sót này dần tích
lũy, bên cạnh nguy cơ hình thành nên các đột biến, các sai sót khơng được sửa
chữa ở chuỗi lặp vùng vi vệ tinh cũng dần tích lũy, dẫn đến kéo dài hoặc rút ngắn
đoạn vi vệ tinh.


6

1.3.


Cơ chế sửa chữa bắt cặp sai DNA:

Khi DNA nhân đôi, chuỗi DNA được tổng hợp mới sao chép nguyên bản chuỗi
DNA gốc (thành phần, trình tự các nucleotide) nhờ cơ chế ghép cặp tương ứng các
nucleotide theo quy tắc bổ sung (A-T và G-X). Khi xuất hiện ghép cặp “lỗi” hay
vi phạm quy tắc bổ sung, tế bào có một số các cơ chế giúp phát hiện và sửa chữa
kịp thời các lỗi này, đảm bảo vật liệu di truyền được chuyển giao nguyên vẹn đến
thế hệ tế bào sau. Khâu đầu tiên trong quá trình sửa chữa lỗi ghép cặp sai DNA
được đảm nhiệm bởi chính enzyme DNA polymerase, đây là enzyme chủ chốt
trong quá trình tổng hợp DNA.
1.3.1. Cơ chế sửa bắt cặp sai DNA của DNA polymerase:
DNA polymerase là enzyme xúc tác quá trình tổng hợp chuỗi polynucleotide theo
nguyên tắc bổ sung (A liên kết với T bằng 2 liên kết Hidro và G liên kết với X
bằng 3 liên kết Hidro). Sự bắt cặp cẩn thận của DNA polymerase đảm bảo cho sự
chính xác của tái bản. Trước khi thực hiện phản ứng polymer hóa nối các
nucleotide, nucleotide triphosphate tự do phải bắt cặp với base bổ sung trên sợi
khuôn mẫu. Nếu sự bắt cặp sai xảy ra, DNA polymerase sẽ loại bỏ nucleotide bắt
cặp sai trước khi hình thành liên kết phosphodieste giữa nucleotide này với mạch
DNA đang được tổng hợp.
Quá trình xúc tác tổng hợp mạch mới trong nhân đôi DNA của DNA polymerase
xảy ra theo chiều 5’ – 3’. Ngồi hoạt tính polymerase 5’ – 3’, enzyme này cịn có
hoạt tính exonuclease 3’ – 5’. Đây là hoạt tính enzyme cắt mạch DNA từ tận cùng
đầu mút theo chiều 3' - 5'. Khi bắt gặp một cặp base bắt cặp không theo nguyên
tắc bổ sung, DNA polymerase sẽ đảo ngược chiều đi của nó và cắt bỏ base khơng
ăn khớp. Sau khi cắt đi base, polymerase có thể lắp lại chính xác base cần thiết và
tiếp tục tái bản DNA.


7


Ở vi khuẩn, cả ba loại enzyme DNA polymerase (I, II và III) đều có khả năng đọc
sửa, sử dụng hoạt tính exonuclease 3' - 5'. Ở sinh vật nhân thực, chỉ những enzyme
polymerase đảm nhận chức năng kéo dài mạch mới có khả năng đọc sửa [12].
Mức độ đọc sửa trong q trình nhân đơi DNA xác định tần số đột biến và là khác
nhau giữa những loài khác nhau [13]. Ví dụ, sự mất đi khả năng đọc sửa do các
đột biến trong gen mã hóa DNA polymerase epsilon dẫn đến hệ quả là tạo ra một
kiểu gen siêu đột biến với hơn 100 đột biến trên mỗi megabase (1.000.000 cặp
base) của DNA trong tiến trình ung thư đại trực tràng ở người [14].
Hoạt động bắt cặp và sửa lỗi của DNA polymerase được thực hiện vô cùng nghiêm
ngặt. Chính vì thế sự hoạt động của DNA polymerase có độ chính xác cao, với tỷ
lệ lỗi nội tại là ít hơn một lỗi cho mỗi 107 nucleotide [15]. Một tỷ lệ nhỏ các
nucleotide bắt cặp sai mà không được sửa chữa bởi DNA polymerase có thể sẽ
được sửa chữa bằng các cơ chế sửa sai khác của tế bào. Trong đó sửa sai bằng hệ
thống MMR là một khâu quan trọng trong quá trình sửa chữa lỗi ghép cặp sai trong
nhân đôi DNA. Cơ chế sửa chữa bắt cặp sai được phát hiện đầu tiên ở vi khuẩn E.
coli được gọi là con đường MutHLS.
1.3.2. Cơ chế sửa chữa lỗi ghép cặp sai ở vi khuẩn E.coli – con đường
MutHLS:
Con đường sửa chữa sự không phù hợp của E. coli MutHLS là một con đường sửa
chữa DNA chung giúp nhận biết và sửa chữa tất cả các cặp sai một cơ sở ngoại trừ
X – X.
Giai đoạn đầu của MMR liên quan đến 3 gen là mutS, mutL và mutH mã hóa cho
3 protein tương ứng là MutS, MutL, MutH. MutS phát hiện ra những vị trí bắt cặp
sai cũng như thêm vào hoặc xóa bỏ một đến bốn nucleotide. MutL tạo thành một
phức hợp với MutS kích hoạt endonuclease MutH và DNA helicase II (sản phẩm


8

của gen uvrD) đảm bảo sự tháo xoắn và tách hai mạch đơn ở những vị trí cần thiết

trên DNA.
1.3.3. Các gen liên quan đến hoạt động của MMR ở người:
Cơ chế sửa chữa bắt cặp sai ở động vật có vú cũng hoạt động tương tự như cơ chế
hoạt động ở vi khuẩn (E. coli). Ở người đã xác định được các gen có liên quan đến
hoạt động của sửa chữa bắt cặp sai gồm có các gen human mutL homolog 1
(hMLH1), human mutL homolog 3 (hMLH3), human mutS homolog 2 (hMSH2),
human mutS homolog 3 (hMSH3), human mutS homolog 6 (hMSH6), human
postmeiotic segregation increased 2 (hPMS2), human postmeiotic segregation
increased 1 (hPMS1) [16].
1.3.3.1.

Các protein liên quan đến hoạt động của MMR ở người:

Ở sinh vật nhân chuẩn, có hai phức hợp chính có chức năng tương tự MutS ở E.coli
là MSH2/MSH6 (MutSα) và MSH2/MSH3 (MutSβ). Con đường MutSα chủ yếu
tham gia vào quá trình sữa chữa thay thế base và các đột biến dich khung vòng
nhỏ. Con đường MutSβ cũng tham gia vào quá trình sửa chữa đột biến dịch khung
vịng nhỏ, ngồi việc sửa chữa vịng lặp lớn (khoảng 10 vịng nucleotide). Tuy
nhiên, MutSβ khơng sửa chữa các đột biến thay thế base. Sự tiến hóa của các dạng
tương đồng đa dạng của MutS đã làm tăng khả năng của tế bào trong việc nhận ra
và sửa chữa các lỗi tổng hợp trong DNA và tăng tính trung thực của quá trình sao
chép ở các sinh vật bậc cao.
Sinh vật nhân chuẩn có năm MutL homolog được ký hiệu là MLH1, MLH3, PMS1
và PMS2. Ở người, sự tổ hợp của các phân tử trên tạo nên ba tổ hợp khác nhau có
chức năng tương tự như MutL ở nhân sơ là MutLα, MutLβ và MutLγ. Phức hợp
MutLα được tạo ra từ các tiểu đơn vị MLH1 và PMS2, dị tử MutLβ được tạo ra từ
MLH1 và PMS1, trong khi MutLγ được tạo ra từ MLH1 và MLH3. MutLα hoạt


9


động như một endonuclease liên kết với các protein cần thiết khác, MutSα và
PCNA tham gia vào quá trình cắt bỏ đoạn DNA sai sót. Các vai trị do MutLβ và
MutLγ đảm nhận trong việc sửa chữa lỗi ghép cặp sai DNA vẫn chưa được tìm
hiểu rõ ràng ở người. Vì phân tử MLH1 là thành phần khơng thể thiếu để tạo nên
các phân tử giống MutL ở E.coli nên mất MLH1 dẫn đến mất toàn bộ hoạt động
của MMR, nhưng mất PMS2 có thể được bù đắp một phần bằng MLH3.
Ở sinh vật nhân thực khơng có phân tử tương đồng về chức năng với MutH ở
E.coli. Chức năng endonuclease của MutH được đảm nhận bởi các phân tử có chức
năng tương tự với MutL ở sinh vật nhân thực.
1.3.3.2.
-

Cơ chế hoạt động của hệ thống MMR ở người:

MSH2 – MSH6 (MutSα) nhận ra các cặp base đơn không khớp. Bước này

yêu cầu năng lượng từ một phân tử adenosine triphoshpate (ATP) bởi MSH2.
-

Phức hợp MutSa khuếch tán ra khỏi vị trí bắt cặp sai, sau đó liên kết với

phức hợp MLH1-PMS2 (MutLα) tạo thành phức hợp protein sửa chữa ghép cặp
sai MMR.
-

Phức hợp này di chuyển dọc theo chuỗi DNA mới cho đến khi nó gặp phức

hợp DNA polymerase.
-


Kẹp trượt protein DNA MMR tương tác với exonuclease-1, kháng nguyên

nhân tế bào tăng sinh (PCNA) và DNA polymerase.
-

Phức hợp này đưa DNA polymerase quay trở lại vị trí của sự không phù

hợp. Cuối cùng, phức hợp rời khỏi DNA và quá trình tái tổng hợp xảy ra, sửa chữa
lỗi.


10

Hình 1.2: Cơ chế hoạt động của hệ thống MMR ở người
Sự sao chép trượt trong quá trình tái bản DNA trong một trình tự lặp lại tạo ra một
vịng lặp không bắt cặp bổ sung (IDL) hoặc các đột biến thay thế có thể được hệ
thống MMR nhận ra và sửa chữa. Nếu những vị trí này khơng được sửa chữa,
trong lần nhân đôi thứ hai, sợi bố mẹ ban đầu được sao chép chính xác, nhưng sợi
con được tổng hợp sai (với đột biến bắt cặp không theo nguyên tắc bổ sung hoặc
IDL) chứa một đột biến. Các cặp base bắt cặp không theo nguyên tắc bổ sung đơn
lẻ dẫn đến đột biến điểm, trong khi IDL dẫn đến đột biến dịch khung thường dẫn


11

đến đột biến vơ nghĩa xi dịng. Điều này dẫn đến việc tạo ra một protein bị cắt
ngắn, khơng có chức năng. Đây là cơ sở tạo thành các MSI.
1.3.3.3.
-


Các dạng mất ổn định vi vệ tinh:

Các khối u có biểu hiện mất bộc lộ một protein MMR được gọi chung là

dMMR và được coi là MSI – H. Theo quy định hướng dẫn của Bethesda, trong
trường hợp này, trên 30% của bộ dấu ấn MSI bị đột biến.
-

Những người có các protein MMR nguyên vẹn có thể được phân loại là

pMMR bao gồm MSS (Microsatellite Stability – Sự ổn định vi vệ tinh) và MSI –
L. Những khối u dạng MSI – L thường khơng có sự khác biệt về mặt lâm sàng và
giải phẫu bệnh so với các khối u dạng MSS. Các khối u dạng MSI – L và MSS chỉ
khác nhau ở mức độ MSI.
+ Khi có ít hơn 30% các dấu ấn MSI bị đột biến, khối u sẽ được xếp vào
nhóm MSI – L.
+ Khi khơng có sự mất ổn định vi vệ tinh, khối u sẽ được xếp vào nhóm
MSS và được coi là khối u có ổn định vi vệ tinh.
-

Ngồi hai dạng trên, có một loại MSI khác được gọi là “thay đổi vi vệ tinh

cao ở sự lặp lại bốn nucleotide được chọn” (EMAST). EMAST được tìm thấy
thường xuyên nhất trong các khối u không phải đại trực tràng và gắn liền với đột
biến gen p53. Khơng có bằng chứng cho thấy nó được gây ra bởi sự bất hoạt đột
biến của hệ thống MMR [17].


12


Chương 2: MSI trong ung thư đại trực tràng:
Việc xác định tình trạng mất ổn định vi vệ tinh là hết sức cần thiết giúp các nhà
lâm sàng lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp. Trong ung thư đại trực tràng, giai
đoạn bệnh theo TNM là yếu tố quan trọng trong điều trị và tiên lượng. Trên các
bệnh nhân giai đoạn III, hóa trị bổ trợ sau mổ đã được chứng minh có hiệu quả,
tuy nhiên đối với các bệnh nhân giai đoạn II, việc sử dụng hóa chất sau mổ còn
nhiều tranh cãi, nhất là với các bệnh nhân có các đặc điểm nguy cơ cao trên mơ
bệnh học. Xác định tình trạng mất ổn định vệ tinh trên các bệnh nhân này giúp lựa
chọn đối tượng hóa chất sau mổ. Theo hường dẫn điều trị gần đây của Hội ung thư
chây Âu, MSI nên được đánh giá trên các bệnh nhân ung thư đại tràng giai đoạn
II giúp quyết định điều trị sau mổ.
Trên thế giới theo các nghiên cứu gần đây của các tác giả S. Popat và cộng sự
(2005), D. Klingbiel và cộng sự (2015), Hisato và cộng sự (2015), các bệnh nhân
ung thư đại trực tràng ở giai đoạn II với tình tràng mất ổn định vệ tinh có tiên
lượng tốt và khơng đáp ứng với hóa chất 5 - FU sau mổ, điều này có nghĩa các
bệnh nhân trong nhóm này được khuyến cáo chỉ cần điều trị bằng phẫu thuật.
Những bệnh nhân ở giai đoạn III được điều trị hóa chất bổ trợ với liệu trình
FOLFOX để thay thế cho phác đồ 5 - FU cho kết quả khả quan.
2.1.

Dịch tễ ung thư đại trực tràng:

Ung thư đại trực tràng là bệnh lý khá phổ biến trên thế giới, mỗi năm có gần
800.000 người mới mắc ung thư đại tràng và khoảng nửa triệu người chết vì bệnh
này. Ung thư đại trực tràng phần lớn xảy ra ở các nước phát triển, trong đó tỉ lệ
mắc cao nhất ở Australia, New Zealand, các nước Châu Âu và Bắc Mỹ. Ở Bắc Mỹ
và Châu Âu, số người chết vì bệnh đứng thứ 2 sau ung thư vú và phổi ở nữ. Tại
Mỹ, bệnh ung thư đại trực tràng đứng thứ năm sau ung thư phổi, ung thư tuyến



13

tiền liệt, ung thư bàng quang và ung thư tuyến giáp, số người tử vong do ung thư
đại trực tràng ước tính khoảng 50.830 người, đứng thứ hai về tỷ lệ tử vong chỉ sau
ung thư phổi [18],[19]. Tại châu Á, tỷ lệ mắc ung thư đại trực tràng tăng nhanh ở
các quốc gia như Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc và Singapore [20],[21],[22].
Ở Việt Nam, theo số liệu công bố của tổ chức ghi nhận ung thư toàn cầu, mỗi năm
Việt Nam có 8.768 bệnh nhân mắc mới, 5.976 bệnh nhân chết do bệnh ung thư đại
trực tràng [23]. Ở Việt Nam, ung thư đại trực tràng mắc hàng thứ ba ở nam và thứ
sáu ở nữ, đồng thời ung thư đại trực tràng cũng đứng thứ năm sau ung thư dạ dày,
ung thư phổi, ung thư vú và ung thư vòm [24]. Biểu hiện lâm sàng của ung thư đại
trực tràng ở giai đoạn sớm không rõ ràng nên đa số bệnh nhân được phát hiện ở
giai đoạn muộn. Có nhiều yếu tố khác nhau tác động đến quá trình chuyển dạng
từ niêm mạc bình thường trở thành ác tính. Trong đó, mơi trường và di truyền là
các yếu tố đóng vai trị quan trọng [25].
2.2. Chẩn đốn ung thư đại trực tràng:
2.2.1. Chẩn đoán ung thư đại trực tràng:
2.2.1.1. Chẩn đoán lâm sàng:
- Triệu chứng cơ năng: bao gồm rối loạn lưu thơng ruột, táo bón hoặc ỉa chảy.
Trong đó, triệu chứng hay gặp nhất là đi ngoài ra nhầy máu. Bệnh nhân sẽ cảm
thấy đau bụng, mỗi kiểu đau khác nhau sẽ định hướng chẩn đoán các bệnh khác
nhau: u đại tràng phải đau kiểu Koernig, u đại tràng trái đau kiểu tắc ruột, u đại
tràng sigma đau hạ vị kèm đi ngoài nhiều lần. Ngoài ra cịn có các biến chứng của
u như bán tắc, tắc ruột, thủng u gây viêm phúc mạc. Bệnh nhân có thể gặp một số
triệu chứng do di căn xa như tự sờ thấy hạch thượng đòn, chướng bụng.


14


- Triệu chứng thực thể: Khi khám bụng, có thể sờ thấy u qua thành bụng hoặc qua
thăm khám trực tràng nếu u ở trực tràng, ống hậu môn. Bệnh nhân có thể tự sờ
thấy u. Khi khám trực tràng, có thể phát hiện khối u ở trực tràng thấp và trực tràng
giữa. Khám toàn thân để phát hiện di căn gan, hạch ngoại vi, dịch cổ trướng, di
căn buồng trứng ở phụ nữ, giúp đánh giá mức độ tiến triển bệnh.
- Triệu chứng tồn thân: nổi hạch thượng địn (thường gặp bên trái), thiếu máu,
gầy sút (người bệnh có thể gầy sút 5-10kg trong vòng 2-4 tháng), suy nhược do
bệnh tiến triển lâu làm hao mòn sức sống của bệnh nhân.
2.2.1.2. Chẩn đoán cận lâm sàng:
- Nội soi: Soi đại trực tràng ống mềm là phương pháp quan trọng để chẩn đoán
ung thư đại trực tràng, cho biết vị trí, đặc điểm khối u và bẩm sinh thiết.
- Chẩn đốn hình ảnh: Chụp X-quang chụp bụng khơng chuẩn bị, chụp cắt lớp vi
tính, chụp cộng hưởng từ, siêu âm.
- Y học hạt nhân:
+ Chụp hình phóng xạ khối u đặc hiệu (chụp hình miễn dịch phóng xạRadioimmunoscintigraphy: RIS). Sử dụng các kháng thể đơn dịng đánh dấu
phóng xạ chụp SPECT giúp phát hiện u nguyên phát và tổn thương di căn.
+ Chụp hình khối u theo nguyên tắc chuyển hóa (PET, PET/CT, PET/MRI)
với F18-FDG phát hiện u nguyên phát, di căn hạch, di căn xa, giúp đánh giá chính
xác giai đoạn bệnh, mô phỏng lập kế hoạch xạ trị (với ung thư trực tràng).
+ Chụp xạ hình, SPECT xương với Tc99m-MDP giúp phát hiện tổn thương
di căn xương
+ Chụp xạ hình, SPECT gan với Tc99m-SC giúp phát hiện tổn thương di
căn gan.
- Xét nghiệm sinh hóa - huyết học