January 20, 2014

Chuyển gen
và vaccine thực vật
Prof. Chu Hoang Mau Ph.D.
Genetic and Molecular Biologist
Vice President
Thainguyen University
Mobile: 0913383289 Mail:
January 20, 2014
Nội dung

Chuyển gen

Vaccine thực vật
January 20, 2014
Chuyển gen

Khái niệm

Vector chuyển gen và tế bào chủ

Quy trình chuyển gen
January 20, 2014
Khái niệm
Chuyển gen (transgenesis): Đưa một đoạn DNA
ngoại lai vào hệ gen (genome) của một cơ thể đa
bào. Đoạn DNA ngoại lai sẽ có mặt ở hầu hết các tế
bào và được truyền lại cho thế hệ sau.
Khái niệm chuyển gen chỉ được sử dụng cho thực
vật và động vật.

Nấm men, vi khuẩn và tế bào nuôi cấy mang một
đoạn DNA ngoại lai được gọi là các tế bào tái tổ hợp
(recombinant cell) hoặc tế bào biến nạp (transformed
cell).
January 20, 2014
Khái niệm

Chuyển gen khác với liệu pháp gen (gene therapy).
Có trường hợp các tế bào mầm không mang DNA
ngoại lai. Thuật ngữ liệu pháp gen mầm (germinal
gene therapy) cũng được sử dụng. Các tế bào mầm
này mang DNA ngoại lai và được truyền lại cho thế
hệ sau.

Thuật ngữ GMO (Genetically modified organism)-
Sinh vật biến đổi gen, được sử dụng chủ yếu để chỉ
các thực vật chuyển gen được gieo trồng để cung
cấp lương thực, thực phẩm
January 20, 2014
Khái niệm

Ðộng vật (Thực vật) chuyển gen là động vật (thực vật) có
gen ngoại lai (gen chuyển) xen vào DNA genome của nó.

Gen ngoại lai này phải được truyền lại cho tất cả mọi tế bào,
kể cả các tế bào sinh sản mầm.

Nếu dòng tế bào mầm bị biến đổi, các tính trạng bị biến đổi
này sẽ được truyền cho các thế hệ kế tiếp thông qua sinh
sản


Nếu chỉ có dòng tế bào sinh dưỡng bị biến đổi, chỉ có cơ thể
mang các tế bào sinh dưỡng đó bị ảnh hưởng và không di
truyền lại cho thế hệ sau.

Việc chuyển gen ngoại lai vào động vật (thực vật) chỉ thành
công khi các gen này di truyền lại cho thế hệ sau
January 20, 2014
Khái niệm: Gen chuyển

Gen chuyển (transgene) là gen ngoại lai được
chuyển từ một cơ thể sang một cơ thể mới bằng kỹ
thuật di truyền.

Các gen chuyển được sử dụng để tạo động vật, thực
vật chuyển gen có nguồn gốc từ các loài sinh vật
khác nhau
January 20, 2014
Nguyên tắc cơ bản trong việc tạo động (thực
vật) chuyển gen

Nguyên tắc cơ bản trong việc tạo động vật (thực vật)
chuyển gen là đưa một hoặc vài gen ngoại lai vào
động vật (thực vật) (do con người chủ động tạo ra).

Các gen ngoại lai này phải được truyền thông qua
dòng mầm vì vậy mọi tế bào kể các tế bào mầm sinh
sản của động vật (thực vật) đều chứa vật chất di
truyền đã được sửa đổi như nhau.
January 20, 2014

Cơ chế hợp nhất của DNA ngoại lai vào
genome

Sự hợp nhất của đoạn DNA ngoại lai vào genome
được thực hiện với sự tham gia của các cơ chế sửa
sai DNA của tế bào

Sự hợp nhất của đoạn DNA ngoại lai vào genome
diễn ra theo cơ chế tái tổ hợp tương và không tương
đồng
January 20, 2014
DNA ngoại lai hợp nhất vào genome nhờ quá trình tái tổ
hợp không tương đồng
January 20, 2014
Cơ chế thay thế gen bằng tái tổ hợp tương
đồng
January 20, 2014
Vector chuyển gen

Vector là một phân tử DNA có khả năng mang một đoạn DNA
ngoại lai và khi xâm nhập vào loại tế bào chủ thích hợp thì có khả
năng tự tái bản không phụ thuộc vào sự sao chép của hệ gen tế
bào chủ.

Nói cách khác, vector là một phương tiện truyền thông tin di
truyền trong cơ thể hoặc giữa các cơ thể khác nhau.

Tế bào chủ thường là E.coli cho nên phần lớn các vector là các
phân tử DNA dạng vòng nhỏ (plasmid) hoặc là bacteriophage.


Vector có thể được cắt ở một vị trí xác định bằng một enzym hạn
chế và được nối với một đoạn DNA tương hợp khác nhờ enzym.
January 20, 2014
Các đặc tính của vector

Vector phải đủ lớn để mang DNA ngoại lai nhưng
không quá lớn.

Vector phải chứa các trình tự kiểm soát (control
sequences) như khởi điểm tái bản (origin of
replication), promoter.

Vector phải mang một hoặc nhiều vị trí nhận biết của
enzym hạn chế.

Vector phải mang các gen marker chọn lọc (thường
là các gen kháng chất kháng sinh).
January 20, 2014
Các loại vector dùng trong chuyển gen ở
động vật

Vector thẳng tối thiểu (Minimum linear vectors)

Vector transposon

Vector retrovirus
January 20, 2014
Sử dụng vector retrovirus để tạo động vật chuyển
gen
January 20, 2014

Các loại vector dùng trong chuyển gen ở
Thực vật khi sử dụng Agrobacterium

Sự gây ra các khối u do Agrobacterium

Agrobacterium tumefaciens và A. rhizogenes là hai loài vi
khuẩn sống trong đất gây ra bệnh khối u hình chóp (crown
gall) và bệnh lông rễ (hairy root) ở các vị trí tổn thương của
thực vật hai lá mầm

Sự sinh trưởng khối u có thể tiếp diễn khi vắng mặt vi khuẩn
và mô khối u có thể được sinh trưởng vô trùng bằng nuôi
cấy mô trong các môi trường thiếu sự bổ sung auxin và
cytokinin ngoại sinh mà bình thường là cần thiết để xúc tiến
sự sinh trưởng của mô thực vật in vitro.
January 20, 2014
Bệnh khối u hình chóp ở cây mâm xôi
(Rubus) do A.tumefaciens gây ra
January 20, 2014
Ti-plasmid của Agrobacterium
tumefaciens
Ti-plasmid có kích thước khoảng 200-250 kb. Chúng
được duy trì ổn định trong Agrobacterium ở nhiệt độ
dưới 30
o
C.
Trong khi hình thành khối u, T-DNA được chuyển
vào tế bào thực vật và hợp nhất với genome nhân. T-
DNA ổn định trong genome nhân
T-DNA được phiên mã trong các tế bào khối u tạo ra

nhiều mRNA polyadenyl.
January 20, 2014
Cơ chế chuyển T-DNA
January 20, 2014
Chuyển gen ở động vật
Ðộng vật chuyển gen:
Ðộng vật chuyển gen là động vật có gen ngoại lai
(gen chuyển) xen vào trong DNA genome của
nó.
Gen ngoại lai này phải được truyền lại cho tất cả
mọi tế bào, kể cả các tế bào mầm.
Việc chuyển gen ngoại lai vào động vật chỉ thành
công khi các gen này di truyền lại cho thế hệ sau.
January 20, 2014
Kỹ thuật chuyển gen ở động vật
1. Tách chiết ADN, phân lập gen mong muốn
2. Tạo tổ hợp gen biểu hiện trong tế bào động vật
3. Tạo cơ sở vật liệu biến nạp gen
4. Chuyển gen vào phôi động vật (vi tiêm, tế bào gốc
phôi, vector virus)
5. Nuôi cấy phôi trong ống nghiệm (đối với động vật
bậc cao
6. Kiểm tra động vật được sinh ra từ phôi chuyển gen
7. Tạo nguồn động vật chuyển gen một cách liên tục
January 20, 2014
Chuyển gen ở thực vật

Quá trình đưa một DNA ngoại lai vào hệ gen của một
sinh vật được gọi là quá trình biến nạp
(transformation).


Những cây được biến nạp được gọi là cây biến đổi
gen (genetically modified plant-GMP)

Nguyên liệu để thực hiện sự biến nạp là các tế bào
thực vật riêng lẽ, các mô hoặc cây hoàn chỉnh.
January 20, 2014
Kỹ thuật chuyển gen ở thực vật
1. Xác định gen liên quan đến tính trạng cần quan tâm.
2. Phân lập gen
3. Gắn gen vào vector biểu hiện để biến nạp.
4. Biến nạp vào E. coli.
5. Tách chiết DNA plasmid.
6. Biến nạp vào mô hoặc tế bào thực vật bằng một trong các
phương pháp khác nhau đa kể trên.
7. Chọn lọc các thể biến nạp trên môi trường chọn lọc.
8. Tái sinh cây biến nạp.
9. Phân tích để xác nhận cá thể chuyển gen (PCR hoặc
Southern blot) và đánh giá mức độ biểu hiện của chúng
(Northern blot, Western blot )
January 20, 2014
Kh¸i niÖm miÔn dÞch

Miễn dịch là khả năng tự vệ của cơ thể bằng sự thích ứng bảo vệ
tự nhiên, cũng như
khả năng chủ động
khả năng chủ động của cơ thể chống lại bất kỳ
một vật lạ
một vật lạ xâm nhập vào cơ thể.


Khoa học nghiên cứu về miễn dịch nói chung được gọi là
Khoa học nghiên cứu về miễn dịch nói chung được gọi là
miễn dịch
miễn dịch
học
học
(immunology). Nếu nghiên cứu về cơ chế tác động phân tử và
(immunology). Nếu nghiên cứu về cơ chế tác động phân tử và
ảnh hưởng của yếu tố di truyền (hệ gen) lên miễn dịch, thi gọi là
ảnh hưởng của yếu tố di truyền (hệ gen) lên miễn dịch, thi gọi là
miễn dịch học phân tử
miễn dịch học phân tử
(molecular immunology).
(molecular immunology).
January 20, 2014
Khái niệm

Miễn dịch học là lĩnh vực khoa học đa dạng và rộng
lớn, bao gồm:

Nghiên cứu các
quy luật và cơ chế
quy luật và cơ chế bảo vệ của cơ
thể trong quá trình sống.

Nghiên cứu
cơ năng tác động của hệ thần kinh
cơ năng tác động của hệ thần kinh
trung ương
trung ương trong việc điều hòa miễn dịch.


Nghiên cứu các khả năng
đáp ứng miễn dịch
đáp ứng miễn dịch, các
yếu tố miễn dịch của cơ thể đáp ứng theo các loại
hình:
miễn dịch dịch thể
miễn dịch dịch thể,
miễn dịch qua trung gian
miễn dịch qua trung gian
tế bào
tế bào và
miễn dịch thực bào
miễn dịch thực bào.