BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ QUỲNH NHƯ

SÀNG LỌC CHỦNG NẤM MEN TỪ
TỰ NHIÊN CÓ KHẢ NĂNG TĂNG CƯỜNG
HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA
DỊCH CHIẾT CÂY BẠC HÀ Á
(MENTHA ARVENSIS L.)

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2021


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ QUỲNH NHƯ
MSV: 1601581

SÀNG LỌC CHỦNG NẤM MEN TỪ
TỰ NHIÊN CÓ KHẢ NĂNG TĂNG CƯỜNG
HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA
DỊCH CHIẾT CÂY BẠC HÀ Á
(MENTHA ARVENSIS L.)
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
TS. Đỗ Ngọc Quang

Nơi thực hiện:
Bộ môn Vi sinh và Sinh học Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI - 2021


LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến TS Đỗ Ngọc
Quang - Giảng viên bộ môn Vi sinh & Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội, người
trực tiếp hướng dẫn tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp. Thầy là người đã dìu dắt tơi từ
những ngày đầu làm nghiên cứu và ln theo sát, tận tình chỉ bảo tơi khơng chỉ kiến
thức chun mơn mà cịn kinh nghiệm làm việc quý báu cho công việc sau này.
Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, anh chị kỹ thuật viên ờ bộ môn
Vi sinh & Sinh học đã luôn quan tâm giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tơi trong
suốt q trình thực hiện đề tài.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến bạn Nguyễn Thị Thu Huyền – thành viên
trong nhóm nghiên cứu ở bộ môn Vi sinh & Sinh học đã hỗ trợ tơi rất nhiều trong thời
gian thực hiện khố luận.
Và cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt đến gia đình và bạn bè thân thiết,
những người đã luôn ở bên chia sẻ, hỗ trợ tôi những lúc khó khăn, là nguồn động viên
tinh thần quý báu giúp tơi hồn thành khố luận tốt nghiệp.


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .......................................................... iv
DANH MỤC CÁC BẢNG........................................................................................................... v
DANH MỤC CÁC HÌNH ........................................................................................................... vi
ĐẶT VẤN ĐỀ ...............................................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN........................................................................................................2
1.1. Đại cương về cây bạc hà Á...............................................................................................2

1.1.1. Tên khoa học và phân loại ........................................................................................2
1.1.2. Mơ tả và phân bố .......................................................................................................2
1.1.3. Thành phần hố học...................................................................................................3
1.1.4. Tác dụng của bạc hà Á ..............................................................................................4
1.1.5. Công dụng của bạc hà Á ...........................................................................................5
1.2. Phương pháp lên men tự nhiên ........................................................................................5
1.2.1. Tổng quan về phương pháp lên men .......................................................................5
1.2.2. Phân lo ại lên men.......................................................................................................6
1.2.3. Điều kiện lên men ......................................................................................................6
1.2.4. Ứng dụng của phương pháp lên men trong việc nâng cao giá trị của dược liệu7
1.3. Hệ vi sinh vật nội sinh trên thực vật ............................................................................ 10
1.3.1. Khái niệm vi sinh vật nội sinh............................................................................... 10
1.3.2. Các loại vi sinh vật nội sinh .................................................................................. 11
1.3.3. Vai trò và ứng dụng của vi sinh vật nội sinh....................................................... 12
1.4. Một số phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn ........................................................ 14
1.4.1. Phương pháp khuếch tán........................................................................................ 14
1.4.2. Phương pháp pha loãng.......................................................................................... 14
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................... 16
2.1. Nguyên liệu, thiết bị ....................................................................................................... 16
2.1.1. Nguyên liệu ............................................................................................................. 16
2.1.2. Chủng vi khuẩn kiểm định..................................................................................... 16
2.1.3. Thiết bị ..................................................................................................................... 16
2.1.4. Dung mơi, hố chất................................................................................................. 17
2.2. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................................... 17


2.3. Phương pháp nghiên c ứu ............................................................................................... 18
2.3.1. Nuôi cấy các vi sinh vật có nguồn gốc từ tự nhiên............................................. 18
2.3.2. Lên men dịch chiết bạc hà ...................................................................................... 18
2.3.3. Xác định hoạt tính kháng khuẩn ............................................................................ 18

2.3.4. Phân lập nấm men từ dịch lên men có hoạt tính kháng khuẩn........................... 19
2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu ...................................................................................... 19
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ ............................................................................................................ 20
3.1. Phân lập các chủng vi sinh vật từ cơ chất trong tự nhiên .......................................... 20
3.2. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết bạc hà lên men bổ sung hỗn hợp vi sinh vật
phân lập từ tự nhiên ............................................................................................................... 20
3.2.1. Xác định hoạt tính kháng S. aureus....................................................................... 21
3.2.2. Xác định hoạt tính kháng P. aeruginosa............................................................... 23
3.2.3. Xác định hoạt tính kháng B. subtilis...................................................................... 25
3.2.4. Xác định hoạt tính kháng E. coli............................................................................ 27
3.3. Sàng lọc các chủng nấm men có hoạt tính .................................................................. 28
3.4. Hoạt tính của dịch chiết bạc hà lên men bổ sung nấm men thuần khiết.................. 29
3.5. Bàn luận ........................................................................................................................... 32
3.5.1. Về kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết bạc hà lên men bổ sung
hỗn hợp vi sinh vật trên S. aureus .................................................................................... 32
3.5.2. Về kết quả thử hoạt tính kháng P. aeruginosa của dịch chiết bạc hà lên men
bổ sung hỗn hợp vi sinh vật............................................................................................... 33
3.5.3. Về kết quả thử hoạt tính kháng B. subtilis của dịch chiết bạc hà lên men bổ
sung hỗn hợp vi sinh vật .................................................................................................... 33
3.5.4. Về kết quả thử hoạt tính kháng S. aureus của dịch chiết bạc hà lên men bổ
sung nấm men thuần chủng ............................................................................................... 33
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................................... 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

S. aureus


Staphylococcus aureus

P. aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa

B. subtilis

Bacillus subtilis

E. coli

Escherichia coli


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Phân loại thực vật của Mentha arvensis L. .........................................................2
Bảng 2.1. Chủng vi khuẩn kiểm định ................................................................................. 16
Bảng 3.1. Đường kính vịng vơ khuẩn của dịch lên men trên S. aureus ........................ 21
Bảng 3.2.Đường kính vịng vô khuẩn của dịch lên men trên P. aeruginosa ................. 24
Bảng 3.3. Đường kính vịng vơ khuẩn của dịch lên men trên B. subtilis ....................... 25
Bảng 3.4. Đặc điểm chủng nấm men tăng cường hoạt tính kháng S. aureus của dịch
chiết bạc hà............................................................................................................................. 29
Bảng 3.5. Đường kính vịng vơ khuẩn của dịch lên men từ dịch chiết bạc hà bổ sung
dịch nấm men thuần khiết trên S. aureus ........................................................................... 30
Bảng 3.6. Kết quả hậu kiểm LSD........................................................................................ 32


DANH MỤC CÁC HÌNH


Hình 1.1. Bạc hà Á tươi (a), sấy lạnh (b) ..............................................................................3
Hình 3.1. Dịch vi sinh vật phân lập từ trà xanh (a), bạc hà (b), hoa cúc (c), vỏ cam (d)
................................................................................................................................................. 20
Hình 3.2. Kết quả xác định hoạt tính kháng S. aureus của dịch chiết bạc hà lên men
bằng vi sinh vật phân lập từ tự nhiên .................................................................................. 21
Hình 3.3. Phân tích ANOVA đường kính vịng vơ khuẩn kháng S. aureus của dịch
chiết bạc hà lên men khi có và khơng bổ sung các hỗn hợp vi sinh vật ......................... 22
Hình 3.4. Phân tích ANOVA đường kính vịng vơ khuẩn kháng S. aureus của dịch
chiết bạc hà lên men bổ sung các hỗn hợp vi sinh vật khác nhau ................................... 23
Hình 3.5. Kết quả xác định hoạt tính kháng P. aeruginosa ............................................. 23
Hình 3.6. Phân tích ANOVA đường kính vịng vơ khuẩn của dịch chiết bạc hà lên men
bổ sung dịch nấm men trên P. aeruginosa ......................................................................... 24
Hình 3.7. Kết quả xác định hoạt tính kháng B. subtilis của dịch chiết bạc hà lên men
bằng vi sinh vật phân lập từ tự nhiên .................................................................................. 25
Hình 3.8. Phân tích ANOVA đường kính vịng vơ khuẩn kháng B. subtilis của dịch
chiết bạc hà lên men khi có và khơng bổ sung các hỗn hợp vi sinh vật ......................... 26
Hình 3.9. Phân tích ANOVA đường kính vịng vơ khuẩn kháng B. subtilis của dịch
chiết bạc hà lên men bổ sung các hỗn hợp vi sinh vật khác nhau ................................... 27
Hình 3.10. Kết quả xác định hoạt tính kháng E. coli của dịch chiết bạc hà lên men
bằng vi sinh vật phân lập từ tự nhiên .................................................................................. 28
Hình 3.11. Khuẩn lạc của các chủng nấm men phân lập từ dịch chiết bạc hà lên men bổ
sung dịch nấm men hoa cúc (a), vỏ cam (b), trà xanh (c) ................................................ 29
Hình 3.12. Kết quả xác định hoạt tính kháng S. aureus của dịch chiết bạc hà lên men
bổ sung nấm men thuần khiết .............................................................................................. 30
Hình 3.13. Phân tích ANOVA đường kính vịng vô khuẩn của dịch chiết bạc hà lên
men bổ sung dịch nấm men thuần khiết trên S. aureus .................................................... 31


ĐẶT VẤN ĐỀ


Bạc hà Á (Mentha arvensis L.), thuộc họ Lamiaceae là một nguyên liệu được sử
dụng rộng rãi trong chế biến thực phẩm và vị thuốc được dùng để điều trị ho, cảm
cúm, nhức đầu, sổ mũi, sốt, đau họng; khó tiêu, đầy bụng, đau bụng. Ngồi ra, bạc hà
Á đã được chứng minh có hoạt tính kháng khuẩn trên một số vi khuẩn gây bệnh như
Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aer uginosa, Bacillus subtilis
[4]. Nếu kháng sinh thường liên quan đến phản ứng dị ứng, quá mẫn thì các hoạt chất
kháng khuẩn tự nhiên ít gây tác dụng khơng mong muốn hơn. Do đó, xu hướng tìm
kiếm các hoạt chất này ngày càng tăng lên khi số lượng vi khuẩn đa kháng, toàn kháng
với kháng sinh xuất hiện ngày càng nhiều [30].
Hiện nay, nhiều sản phẩm lên men tự nhiên, ví dụ như các loại trà có nguồn gốc
thảo dược, ngày càng được chú ý như một dạng sản phẩm hỗ trợ sức khoẻ với nhiều
tác dụng như chống oxy hoá, cải thiện chức năng gan, tăng cường hệ miễn dịch, giảm
tiến triển bệnh ung thư, tim mạch, tiểu đường [13, 21, 24]. Một số nghiên cứu cũng
cho thấy phương pháp lên men bằng vi sinh vật tự nhiên làm tăng tác dụng đề kháng
đối với vi khuẩn gây bệnh như Escherichia coli, Vibrio cholerae, Shigella flexneri và
Staphylococcus aureus của dịch chiết thảo dược [7, 22, 32].
Với định hướng tăng cường hiệu quả kháng khuẩn của dịch chiết cây bạc hà Á
(Mentha arvensis L.), chúng tôi đã thực hiện đề tài “Sàng lọc chủng nấm men từ tự
nhiên có khả năng tăng cường hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết cây bạc hà Á
(Mentha arvensis L.)” với mục tiêu:
- Sàng lọc các vi sinh vật từ tự nhiên có khả năng sinh trưởng trong mơi trường chứa
dịch chiết cây bạc hà.
- Phân lập chủng nấm men có khả năng lên men tăng cường hoạt tính kháng khuẩn của
dịch chiết cây bạc hà.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Đại cương về cây bạc hà Á
1.1.1. Tên khoa học và phân loại
- Tên khoa học: Mentha arvensis L., tên tiếng Việt: Bạc hà Á.
- Tên khác: Bạc hà Nam – Nhân đơn thảo (Trung Quốc), Mentha (Pháp), Peppermint
(Anh)
- Phân loại thực vật:
Bảng 1.1. Phân loại thực vật của Mentha arvensis L.
Giới

Plantae

Ngành

Magnolyophita

Lớp

Magnolyopsida

Bộ

Lamiales

Họ

Lamiaceae Lindl.

Chi

Mentha L.


Lồi

Mentha arvensis

1.1.2. Mơ tả và phân bố
Bạc hà Á là cây cỏ sống lâu năm, thân vng mọc đứng hay hơi bị, trên thân có nhiều
lơng. Lá mọc đối, mép có răng cưa, mặt trên và mặt dưới của lá đều có lơng che chở và
lơng bài tiết. Hoa mọc vịng ở kẽ lá, cánh hoa hình mơi màu tím hay hồng nhạt. Ít khi
thấy có quả và hạt.
Bạc hà Á ở nước ta thường mọc hoang, một số được trồng để làm thuốc. Các vùng
trồng có quy mơ tương đối lớn như làng Nghĩa Trai (Hưng Yên); Đại Yên, Gia Lâm
(Hà Nội); Sapa; Tam Đảo (Vĩnh Phúc); Phú Quốc,…

2


Hình 1.1. Bạc hà Á tươi (a), sấy lạnh (b)
Nguồn: amkhaseed.com (a), beemart.vn (b)
1.1.3. Thành phần hố học
Các nhóm hợp chất được phát hiện trong bạc hà Á gồm tinh dầu, flavonoid, coumarin,
các hợp chất phenolic và các hợp chất khác.
Tinh dầu tập trung nhiều ở lông tiết của lá, là thành phần chính và đem lại giá trị kinh
tế cao. Tỷ lệ tinh dầu trong bạc hà thường từ 0,5 đến 1%, có khi lên tới 1,3 đến 1,5%
[1]. Tinh dầu thường là chất lỏng không màu, vàng nhạt hay vàng xanh.
Thành phần chủ yếu trong tinh dầu bao gồm:
- Menthol C10H19OH có trong tinh dầu với tỷ lệ 40-50%, chủ yếu ở dạng tự do, một
phần nhỏ ở dạng kết hợp với acid acetic.
- Menthon C10H18O có hàm lượng từ 10-20% trong tinh dầu bạc hà.


Menthol

Menthon

3


Ngồi ra, trong cây bạc hà cịn có các thành phần khác như flavonoid (luteolin,
menthoside, rutin, hesperidin), phenolic acid (caffeic acid, chlorogenic, rosmarinic),
steroid, vitamin K, eugenol… [10]
1.1.4. Tác dụng của bạc hà Á
1.1.4.1. Hoạt tính kháng khuẩn
Một số cơng trình nghiên cứu về tác dụng kháng khuẩn của cây bạc hà Á trên thế giới
như: Cơng trình nghiên cứu của Eidla và cộng sự (2009), Rachel và Meera (2011) cho
thấy hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết bạc hà trong ethanol trên vi khuẩn S. aureus,
E. coli, P. aeruginosa, K. pneumoniae, S. flexineri. Trong đó S. aureus nhạy cảm nhất
(đường kính vịng vơ khuẩn là 9 – 21 mm với nồng độ 0,3 - 10%). Hoạt tính kháng
khuẩn trên P. aeruginosa yếu nhất và đường kính vịng vơ khuẩn trong khoảng 7 – 12
mm ở nồng độ 0,6 - 10%, ở nồng độ 0,3% khơng thấy vịng vơ khuẩn. Trong một số
nghiên cứu khác, đường kính vịng vơ khuẩn của E. coli, K. pneumoniae và S. flexneri
dao động từ 7 – 14 mm ở nồng độ 0,3 - 10% [4, 11]. Nghiên cứu thử hoạt tính kháng
khuẩn trên cây bạc hà của Nripendra và cộng sự (2014) bằng phương pháp khuếch tán
đĩa thạch cho thấy dịch chiết bạc hà trong ethanol có hoạt tính kháng khuẩn với vi
khuẩn Gram dương (S. aureus, S. pyogenus), Gram âm (Salmonella typhi, Salmonella
paratyphi, Shigella boydii) nhưng khơng có hoạt tính kháng khuẩn trên Escherichia
coli và Shigella flexneri. Trong đó, đường kính vịng vơ khuẩn của S. aureus là 8mm
với nồng độ 250 µg/khoanh giấy và 17 mm với nồng độ 500 µg/khoanh giấy [10].
1.1.4.2. Tác dụng khác
- Chống viêm: Một số thí nghiệm chứng minh tác dụng này của bạc hà Á trên chuột.
Tiến hành thí nghiệm so sánh tác dụng chống viêm của dịch chiết nước và ethanol từ

lá, thân và rễ của Mentha arvensis với thuốc chứng natri diclofenac. Kết quả cho thấy
cả dịch chiết ethanol và nước đều có tác dụng chống viêm cấp và mạn trên chuột [12].
- Chống oxy hoá: Nghiên cứu của Biswas (2014) cho thấy tác dụng dọn các gốc tự do
của dịch chiết bạc hà Á [10]. Năm 2016, Amina và cộng sự nghiên cứu về tác dụng
chống oxy hố của 6 lồi Mentha trong họ Lamiacea bao gồm Mentha aquatica,
Mentha arvensis, Mentha piperita, Mentha pulegium, Mentha rotundifolia và Mentha
villosa. Kết quả cho thấy các chiết xuất methanol của các loài bạc hà này rất giàu
phenolic và thể hiện hoạt tính chống oxy hóa mạnh mẽ [8].

4


1.1.5. Công dụng của bạc hà Á
Trong cuộc sống hiện đại ngày nay, bạc hà Á và tinh dầu bạc hà Á còn được ứng dụng
vào rất nhiều lĩnh vực khác nhau như:
- Trong thực phẩm, lá bạc hà được dùng để trang trí trên thức ăn, loại rau ăn kèm thay
thế rau thơm, rau húng. Ngồi ra cịn có thể xay nhuyễn lấy nước làm nước sốt bạc hà
và làm si-rô, nước giải khát vị bạc hà, làm bánh kem, kẹo…
- Trong mỹ phẩm, tinh dầu bạc hà rất có giá trị trong việc điều trị mụn nhờ tính kháng
khuẩn cao. Đồng thời lại làm mát da và làm sáng các vùng da bị sậm màu. Đối với da
nhờn, thì bạc hà cịn có tác dụng làm giảm bóng nhờn, săn chắc mà không bị khô da.
- Trong dược phẩm, bạc hà được sử dụng chủ yếu để kết tinh thu menthol. Từ đó điều
chế miếng dán giảm đau, hạ sốt, thuốc trị ho, đau họng, dầu gió,…
1.2. Phương pháp lên men tự nhiên
1.2.1. Tổng quan về phương pháp lên men
Loài người đã biết sử dụng các sản phẩm lên men từ thời xa xưa. Điển hình như rượu
vang đã xuất hiện ở Ai Cập khoảng 10 ngàn năm trước Công nguyên hay bia xuất hiện
ở Babilon cách đây khoảng 7000 năm, rượu xuất hiện ở Trung Quốc khoảng 2000 năm
trước Cơng ngun. Suốt thời gian dài, q trình lên men được thực hiện thủ cơng
trong các gia đình trước khi Louise Paster lần đầu tiên nghiên cứu về cơ sở của quá

trình lên men vào giữa thế kỉ XIX. Từ đó ngành cơng nghiệp lên men phát triển thành
một ngành kinh tế độc lập và ngày càng hoàn thiện, chiếm tỉ trọng lớn trong nền kinh
tế nhiều quốc gia [2].
Lên men là sự chuyển hoá carbohydrat và một số hợp chất hữu cơ khác thành chất mới
dưới sự tác dụng của enzym do vi sinh vật gây ra. Như vậy, tác nhân chính của q
trình lên men là các tế bào vi sinh vật hoặc enzym của chúng. Có rất nhiều q trình
lên men khác nhau và thường được gọi bằng tên của sản phẩm thu được. Ví dụ: lên
men rượu, rượu vang, lên men bia, lên men lactic, citric,… Các sản phẩm lên men này
do hoạt động sống của vi sinh vật tạo ra. Trong lên men bia, rượu,… tác nhân chính là
nấm men rượu; lên men citric là nấm mốc; lên men lactic, acetic, aceton nhờ vi khuẩn
[2].
Mục đích của q trình lên men là chuyển hố cơ chất trong mơi trường dinh dưỡng
thành các sản phẩm cần thiết nhờ vi sinh vật. Nhờ lên men, hương vị trong thực phẩm

5


ngày càng đa dạng và mới mẻ bởi vì mỗi quá trình lên men sử dụng cơ chất, hệ vi sinh
vật và điều kiện lên men khác nhau sẽ cho ra các sản phẩm khác nhau với hương vị
khác nhau.
Các sản phẩm của q trình lên men đóng góp vai trị quan trọng trong đời sống xã
hội. Khơng chỉ được sử dụng làm thực phẩm, sản phẩm lên men còn được ứng dụng
trong nhiều ngành công nghiệp để tạo ra các nguyên vật liệu thiết yếu cho cuộc sống
con người. Ví dụ: sản phẩm lên men trong lĩnh vực thực phẩm (sữa chua, pho-mát,
nước mắm, tương), thực phẩm chức năng (vitamin); trong nông nghiệp (thuốc trừ sâu
vi sinh); trong ngành dược (vaccine, enzyme, kháng sinh,…), hóa chất cơng nghiệp
(acetone, buthanol, acid citric,…), nhiên liệu sinh học…
1.2.2. Phân loại lên men
Dựa vào các tiêu chí khác nhau mà lên men có thể được phân loại như sau:
- Dựa vào loại vi sinh vật dùng để lên men, ta có lên men bằng vi khuẩn, bằng nấm

men, hay bằng nấm mốc. Cũng có khi người ta sử dụng phối hợp hai hay nhiều loại vi
sinh vật.
- Tùy theo vai trò của oxy khi lên men, ta có lên men hiếu khí và lên men kỵ khí. Tuy
vậy cũng có trường hợp, trong q trình lên men, có giai đoạn hiếu khí và cũng có giai
đoạn kỵ khí.
- Dựa vào tính liên tục của q trình lên men: ta có thể tiến hành lên men liên tục, bán
liên tục hoặc gián đoạn.
- Dựa vào sản phẩm chính thu được từ q trình lên men: lên men ethanol, lên men
lactic, lên men butyric,… Những q trình lên men này có thể biểu diễn bằng các
phương trình sau:
+ Lên men ethanol: Glucose = 2 Ethanol + CO2 + 118 kJ
+ Lên men lactic: Glucose = 2 Lactate + 94 kJ
+ Lên men butyric: Glucose = Butyric + 2CO2 + 2 H2O
1.2.3. Điều kiện lên men
Hiệu suất lên men (được đánh giá bằng nồng độ sản phẩm) và chất lượng sản phẩm lên
men là những tiêu chí quan trọng nhất trong q trình lên men dược liệu vì chúng
quyết định phần lớn đến hiệu quả điều trị. Q trình lên men dược liệu nếu khơng thực
hiện ở điều kiện tối ưu có thể làm giảm chất lượng và hiệu suất của sản phẩm. Vì vậy,

6


phải tiêu chuẩn hóa các điều kiện lên men bao gồm loại môi trường nuôi cấy vi sinh
vật, pH của môi trường, bản chất của dung môi, nhiệt độ lên men, thời gian lên men,
loại vi sinh vật, tải lượng vi sinh vật [20]. pH được xem là một trong những thông số
môi trường quan trọng nhất ảnh hưởng đến q trình lên men. pH có liên quan chặt
chẽ đến sự phát triển của vi sinh vật trong quá trình lên men. pH mơi trường ảnh
hưởng đến q trình trao đổi chất của vi sinh vật, làm thay đổi diện tích của màng tế
bào chất, dẫn đến thay đổi tính thẩm thấu của màng tế bào. Mỗi loài vi sinh vật có pH
tối ưu, cực tiểu, cực đại riêng: Vi khuẩn và xạ khuẩn thích hợp với pH ở vùng trung

tính và kiềm (trừ các vi khuẩn sinh axit hữu cơ). Trong khi đó nấm men và nấm mốc
thích hợp với pH từ 3- 6. Giống như pH, nhiệt độ cũng đóng một vai trị quan trọng
trong q trình lên men dược liệu. Duy trì nhiệt độ lý tưởng trong lên men tạo điều
kiện cho sự phát triển của vi sinh vật và hoạt động của enzym, từ đó tăng cường hiệu
suất và chất lượng sản phẩm. Các nhà khoa học cho rằng một số thành phần có hoạt
tính sinh học trong dịch lên men có thể bị phân hủy hoặc tiếp tục chuyển hóa bởi vi
sinh vật khi tăng nhiệt độ hoặc kéo dài thời gian lên men [2]. Các yếu tố cịn lại có ảnh
hưởng nhất định đến quá trình lên men.
1.2.4. Ứng dụng của phương pháp lên men trong việc nâng cao giá trị của dược liệu
Dược liệu đã được sử dụng trong một thời gian dài để điều hòa miễn dịch, chống viêm,
chống tiểu đường, chống nhiễm trùng và chống dị ứng. Để nâng cao hiệu quả hoặc
giảm thiểu tác dụng phụ của dược liệu, lên men là một phương pháp có vai trị quan
trọng đã được chứng minh thông qua sản xuất và làm giàu các chất chuyển hóa có hoạt
tính sinh học và có vai trò quan trọng trong y học như isoflavone, saponin, phytosterol
và phenol [23]. Tuy nhiên, nhiều thành phần của dược liệu tồn tại ở dạng glycoside
phân cực cao nên sự hấp thụ những thành phần này qua thành ruột non bị hạn chế và
các chất này cần các vi khuẩn đường ruột biến đổi thành chất chuyển hóa có hoạt tính.
Do đó, tác dụng của dược liệu phụ thuộc vào hệ vi sinh vật đường ruột của người.
Trong khi đó, mỗi cơ thể lại có một hệ vi sinh vật đường ruột khác nhau, dẫn đến q
trình chuyển hố dược liệu khác nhau. Nếu một người khơng có vi khuẩn đường ruột
để chuyển hoá tiền chất trong dược liệu thành chất có hoạt tính thì khơng thể phát huy
tác dụng của dược liệu. Để khắc phục nhược điểm này, người ta đã sử dụng hệ vi sinh
vật từ bên ngoài (tức là q trình lên men) để chuyển hố tiền chất trong dược liệu

7


thành chất có hoạt tính, từ đó thúc đẩy sự hấp thu và phát huy tác dụng tối đa của dược
liệu.
1.2.4.1. Cơ chế tăng cường hoạt tính sinh học của phương pháp lên men đối với dược

liệu
Các cơ chế của q trình lên men vi sinh vật và chuyển hóa dược liệu có thể được tóm
tắt như sau [20]:
- Vi sinh vật trong quá trình phát triển tạo ra nhiều loại enzym sinh học như protease,
amylase, cellulase, esterase và amidase. Các enzym này tham gia phân hủy các tiền
chất trong dược liệu và chuyển đổi chúng thành các chất chuyển hố có hoạt tính.
- Vi sinh vật có thể sử dụng các hoạt chất trong dược liệu làm chất nền để tổng hợp các
hợp chất mới, đồng thời các chất chuyển hóa này và dược liệu cũng có thể tương tác
với nhau để tạo thành hợp chất mới.
- Một số chất trong dược liệu có thể tác động đến con đường trao đổi chất của vi sinh
vật, từ đó có thể sản xuất các hợp chất mới.
- Khi vi sinh vật tiêu thụ các thành phần khơng phải có hoạt tính như protein, đường và
một số chất khác, dịch chiết dược liệu có thể được cơ đặc lại và tăng nồng độ hoạt chất
trong dịch chiết.
1.2.4.2. Một số nghiên cứu về vai trò của lên men trong việc tăng cường hoạt tính sinh
học của dược liệu
Dược liệu rất giàu thành phần hóa học và q trình lên men dẫn đến sự biến đổi các
tiền chất trong dược liệu thành các hợp chất mới, từ đó tăng cường hoạt tính và làm
giảm độc tính của dược liệu. Một số tác dụng quan trọng của dược liệu lên men được
báo cáo trong nghiên cứu của Hussain và cộng sự (2016) như tác dụng kháng khuẩn,
chống oxy hoá, chống viêm, chống dị ứng, chống béo phì, bảo vệ gan [20].
Nghiên cứu của hai nhà khoa học Hàn Quốc năm 2016 về hoạt tính kháng vi khuẩn
Gram dương S. aureus và Bacillus cereus của dược liệu Curcuma aromatica lên men
và không lên men cho thấy sau khi lên men đường kính vịng vơ khuẩn tăng lên đáng
kể còn giá trị MIC giảm xuống [28].
Nghiên cứu của Keller (2013) cho thấy Camellia sinensis lên men có hoạt tính kháng
khuẩn trên Shigella sonnei và S. aureus.

8



Năm 2012, Houda và cộng sự đã sử dụng phương pháp khuếch tán thạch để thử hoạt
tính kháng khuẩn của 5 loại dược liệu lên men bao gồm Thymus vulgaris, Lippia
citriodora, Rosmarinus officinalis, Foeniculum vulgare và Mentha piperita. Kết quả
cho thấy ngoại trừ Thymus vulgaris, dịch chiết lên men của 4 lồi dược liệu cịn lại đều
tăng cường hoạt tính kháng S. aureus, P. aeruginosa, Salmonella typhimurium,
Escherichia coli so với trước khi lên men [6].
Năm 2011, Ryu và cộng sự đã đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và hiệu quả của 7 loại
dược liệu Hàn Quốc đối với chủng vi khuẩn P. aeruginosa đa kháng bằng phương
pháp khuếch tán đĩa thạch. Kết quả cho thấy trong số các dược liệu thử nghiệm, khả
năng ức chế P. aeruginosa đa kháng của Lonicera japonica, Gardenia jasminoides,
Galla rhois và Scultellaria baicalensis tăng lên đáng kể sau lên men [29].
Năm 2014, một nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của chiết xuất Galla rhois lên
men trên 6 vi khuẩn gây bệnh đã được thực hiện. Kết quả cho thấy chiết xuất Galla
rhois lên men bởi Lactobacillus delbrueckii và Saccharomyces cerevisiae có hoạt tính
kháng Bacillus subtilis và Vibrio parahaemolyticus hiệu quả hơn so với chiết xuất
không lên men.
Năm 2010, hai nhà khoa học Yuan và Chung đã phát hiện ra vai trò bảo vệ của nhân
sâm lên men đối với sự tăng đường huyết do streptozotocin gây ra ở chuột nhờ tác
dụng bảo tồn tế bào β đảo tuỵ và đề xuất nhân sâm lên men như một tác nhân phòng
ngừa đái tháo đường [38]. Ngồi ra cịn rất nhiều nghiên cứu khác về tác dụng của
nhân sâm lên men như tăng cường tác dụng kháng virus cúm (H1N1, H3N2, H5N1 và
H7N9) so với nhân sâm không lên men [35], điều trị các triệu chứng tiêu chảy nhiễm
khuẩn, viêm ruột kết và khôi phục hệ vi sinh vật đường ruột về trạng thái ban đầu [27],
tác dụng chống oxy hố, cải thiện tình trạng suy giảm trí nhớ, phục hồi chức năng
nhận thức trong bệnh Alzheimer [27]. Năm 2013, Wen và cộng sự đã nghiên cứu sử
dụng Aspergillus oryzae NCH 42, một loại nấm sản xuất tannase ngoại bào để lên men
4 loại thảo dược của Trung Quốc bao gồm Trichosanthes kirilowii, Salvia miltiorrhiza,
Magnolia officinalis và Glycyrrhizae radix. Kết quả cho thấy quá trình lên men làm
tăng cường giải phóng các thành phần có hoạt tính chống oxy hố và kháng khuẩn trên

vi khuần Gram âm và Gram dương [27]. Dược liệu (MA) lên men với Lactobacillus
acidophilus, MA128, cho thấy hiệu quả tăng lên so với ban đầu trong điều trị hen
suyễn và viêm da dị ứng [27]. Nghiên cứu của Young-ho (2017) chỉ ra tác dụng ức chế

9


S. aureus và Listeria monocytogenes của dịch chiết Zingiber officinale [33]. Sau q
trình lên men, các chất có hoạt tính trong dược liệu được tăng cường. Hơn nữa các sản
phẩm chuyển hố sau lên men cịn tạo ra các tác dụng điều trị mới, từ đó giúp cải thiện
hiệu quả điều trị của dược liệu và nâng cao giá trị của chúng trong điều trị lâm sàng.
1.3. Hệ vi sinh vật nội sinh trên thực vật
Thực vật từ lâu đã được xem như là nguồn cung cấp các hoạt chất để điều trị bệnh.
Tuy nhiên, có nhiều nghiên cứu cho thấy hệ vi sinh vật nội sinh trên thực vật
(endophytes) mới là tác nhân tạo ra các hoạt chất đó chứ không phải bản thân thực vật.
Các vi sinh vật nội sinh là một nguồn tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt
tính sinh học bao gồm kháng khuẩn, chống ung thư, điều trị tiểu đường và ức chế miễn
dịch có thể ứng dụng trong nơng nghiệp, y học và công nghiệp thực phẩm [34]. Các
hợp chất này được phân loại thành alkaloid, terpenoid, steroid, quinon, isocoumarin,
lignan, phenylpropanoid, phenol và lacton. Khi mà số lượng các vi khuẩn đa kháng,
toàn kháng xuất hiện ngày càng nhiều do việc lạm dụng kháng sinh trong cộng đồng,
việc tìm kiếm các loại kháng sinh mới và hiệu quả hơn để đối phó với những vấn đề
này đang đặt ra thách thức rất lớn cho các nhà khoa học. Trong đó, việc nghiên cứu và
phân lập các hợp chất mới từ vi sinh vật cư trú trên thực vật là một lĩnh vực nghiên
cứu tiến bộ và thu hút nhiều sự quan tâm.
1.3.1. Khái niệm vi sinh vật nội sinh
Nhiều cuộc khảo sát về tương tác gây bệnh giữa thực vật và vi sinh vật liên quan đã
được thực hiện. Tuy nhiên, sau một số nghiên cứu về vai trò của vi sinh vật cư trú trên
bề mặt hoặc bên trong thực vật đến các loài thực vật khác nhau, người ta cho rằng chỉ
một phần nhỏ vi sinh vật là tác nhân gây bệnh cho thực vật trong tự nhiên. Hầu hết vi

sinh vật cư trú trên bề mặt hoặc bên trong thực vật có ảnh hưởng đáng kể đến sự phát
triển, sự hấp thụ chất dinh dưỡng và khả năng chống chịu với mơi trường bên ngồi
của thực vật [16].
Ngồi các vi sinh vật gây bệnh, sự hiện diện của các sinh vật khác bên trong thực vật
lần đầu tiên được phát hiện bởi De Bary (1866), người đã phát hiện ra sự hiện diện của
các tế bào vi sinh vật trong các mơ thực vật bằng kính hiển vi. Ông đã đưa ra định
nghĩa đầu tiên về vi sinh vật nội sinh (endophytes) như sau: “Bất kỳ sinh vật nào phát
triển trong các mô thực vật đều được gọi là endophytes”. Tuy nhiên, định nghĩa này

10


tiếp tục thay đổi theo nhiều nhà nghiên cứu khác nhau [36]. Petrini (1991) đã đưa ra
định nghĩa phù hợp nhất cho endophytes, đó là “Bất kỳ vi sinh vật nào mà trong một
phần hoặc tồn bộ vịng đời của nó, cư trú bên trong tế bào thực vật khoẻ mạnh mà
không gây ra tác hại tới cây chủ”. Vi sinh vật nội sinh phân bố và khu trú ở tất cả các
loài thực vật và hầu hết đã được phân lập từ các loài thực vật được khảo sát cho đến
nay.
Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện trong những năm gần đây để khám phá nguồn
gốc của các sinh vật nội sinh ở các loài khác nhau. Các nhà nghiên cứu đã xem xét
tương quan kích thước bộ gen với lối sống của vi sinh vật và cho rằng định nghĩa
endophytes có thể phù hợp với giả thuyết rằng chúng sống bên trong các lồi thực vật,
nơi mơi trường ổn định hơn so với đất. Tuy nhiên, cũng có một số endophytes chỉ xuất
hiện trong thực vật trong một phần vịng đời của chúng. Do đó, cộng đồng vi sinh vật
nội sinh được tạo thành từ các vi sinh vật có nguồn gốc khác nhau, với những vi sinh
vật có bộ gen lớn hơn có thể sống trong các môi trường thay đổi, chẳng hạn như đất,
trong khi những vi sinh vật có bộ gen nhỏ tồn tại trong môi trường ổn định hơn [25].
1.3.2. Các loại vi sinh vật nội sinh
Các loại vi sinh vật nội sinh trên thực vật bao gồm vi khuẩn, xạ khuẩn, mycoplasma và
nấm.

Hơn 200 chi từ 16 ngành vi khuẩn đã được tìm thấy là vi sinh vật nội sinh và trong số
đó, hầu hết thuộc ngành Actinobacteria, Proteobacteria và Firmicutes. Các vi khuẩn
nội sinh được biết đến với vai trò sản xuất các chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học
như các hợp kháng khuẩn và chống ung thư [19]. Năm 2000, Strobel và cộng sự đã
nghiên cứu về vai trò của vi khuẩn nội sinh Streptomyces sp. chủng NRRL 30562 được
phân lập từ cây Kennedia nigriscans, sản xuất kháng sinh phổ rộng munumbicin, có
hoạt tính kháng vi khuẩn Gram (+) như Bacillus anthracis, M. tuberculosis đa kháng
và một số vi khuẩn kháng thuốc khác [19].
Nấm nội sinh sản xuất một số chất có hoạt tính kháng khuẩn và thuốc chống ung thư
được sử dụng rộng rãi. Năm 2014, Lena và cộng sự tiến hành phân lập và xác định cấu
trúc các hợp chất polyketide từ các dịch chiết của nấm nội ký sinh Acremonium
strictum, phân lập từ cây Đước đôi (Rhizophora apiculata B.) thu hái tại Việt Nam.
Trong đó có 1 hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn đối với S. aureus với giá trị MIC
14,3 µM [18]. Ngồi ra, các nghiên cứu của Chithra và cộng sự (2014), Arora và
11


Ramawat (2017) đã tìm ra lồi nấm nội sinh Colletotrichum gloeosporioides sống trên
cây Piper nigrum sản xuất hợp chất piperin có tác dụng kháng khuẩn [31].
Xạ khuẩn được coi là dạng chuyển tiếp giữa nấm và vi khuẩn. Xạ khuẩn nội sinh tham
gia tổng hợp các hoạt chất có tầm quan trọng trong y học. Nhiều hợp chất kháng khuẩn
đã được báo cáo từ xạ khuẩn nội sinh, đặc biệt là chi Streptomyces sp., bao gồm
naphthomycin, clethramycin, coronamycin, cedarmycin, saadamycin và kakadumycin.
Các hợp chất khác như paclitaxel sản xuất từ xạ khuẩn Kitasatospora sp. trên
cây Taxus baccata và tyrosol trên cây Emblica officinalis, được dùng để điều trị nhiễm
khuẩn lây truyền qua thực phẩm [14].
Các loài Mycoplasma cũng được báo cáo là vi sinh vật nội sinh thực vật. Tuy nhiên,
cịn rất ít các nghiên cứu về vai trị của chúng.
1.3.3. Vai trò và ứng dụng của vi sinh vật nội sinh
1.3.3.1. Tổng hợp hoạt chất sinh học và hợp chất mới

Các bệnh truyền nhiễm và ký sinh trùng chiếm khoảng một nửa số ca tử vong trên toàn
thế giới. Mặc dù ngày nay là thời đại của công nghiệp hoá dược, các hợp chất tự nhiên
đã được chứng minh là nguồn tốt nhất để tìm kiếm thuốc mới. Đặc biệt dược liệu và hệ
vi sinh vật nội sinh trên nó là nguồn quan trọng của các hoạt chất và các chất chuyển
hóa thứ cấp, đóng góp hơn 80% các loại thuốc tự nhiên hiện có trên thị trường. Các vi
sinh vật nội sinh có khả năng tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp mới dùng để điều
trị tiêu chảy, kháng khuẩn, chống ung thư, tiểu đường và ức chế miễn dịch. Cho đến
nay, chỉ có một số lồi thực vật được nghiên cứu về hệ vi sinh vật nội sinh và các chất
chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học. Việc phát hiện ra các chất chuyển hóa thứ
cấp có tác dụng kháng khuẩn mới từ các loại vi sinh vật nội sinh khác nhau là một giải
pháp thay thế quan trọng để khắc phục tình trạng kháng thuốc ngày càng tăng đối với
các vi sinh vật gây bệnh. Các chất chuyển hóa thứ cấp này được phân loại thành các
nhóm chức năng khác nhau: alkaloid, benzopyranones, chinon, flavonoid, axit
phenolic, quinon, steroid, saponin, tannin, terpenoit, tetralones, xanthones, và các chất
khác [14].
Một số nghiên cứu về hệ vi sinh vật nội sinh và chất chuyển hoá thứ cấp có tác dụng
ức chế vi sinh vật gây bệnh được tổng hợp trong nghiên cứu của Gouda (2016) [15]:
Năm 2004, Kim phân lập nấm Periconia sp. trên cây Taxus cuspidate tổng hợp

12


terpenoid có tác dụng ức chế Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Klebsiella
pneumoniae và Salmonella typhimurium. Năm 2008, Hoffman phát hiện ra chủng nấm
nội sinh Penicillium sp. trên cây Cerbera manghas và Phoma spp. trên cây Saurauia
scaberrinae sản xuất hợp chất phenol có tác dụng ức chế Staphylococcus aureus. Cùng
năm 2008, Aliye đã tìm ra lồi nấm Ampelomyces sp. trên cây Urospermum picroides
có khả năng tổng hợp quinone có tác dụng ức chế Staphylococcus aureus,
Staphylococcus epidermidis và Enterococcus faecalis. Năm 2014, Hussain và cộng sự
đã phân lập nấm Penicillium sp. trên cây Acrostichum aureurm có khả năng sản xuất

hợp chất peptide có tác dụng ức chế Staphylococcus aureus và Candida albicans. Hợp
chất munumbicin do vi khuẩn Streptomyces coelicolor trên cây Boesenbergia rotunda
sản xuất có khả năng ức chế vi khuẩn Escherichia coli trong nghiên cứu của Golinska
(2015).
Năm 2009, Trần Thị Như Hằng và cộng sự nghiên cứu về nấm nội sinh trên cây khổ
sâm (Croton tonkinensis) và bùm bụp (Mallotus paella), kết quả thu được chủng nấm
Trichoderma konilangbra KS14 sản sinh chất sorbicillin có hoạt tính kháng S. aureus
với MIC=25mg/ml [3].
1.3.3.2. Sản xuất enzym
Nhiều enzym quan trọng được tạo ra bởi một số vi sinh vật nội sinh. Nấm nội sinh như
Acremonium terricola, Aspergillus japonicas, Cladosporium cladosporioides,
Cladosporium sphaerospermum, Fusarium lateritium, Monodictys castaneae,
Nigrospora

sphaerica, Penicillium

aurantiogriseum,

Penicillium

glandicola,

Pestalotiopsis guepinii, Phoma tropica, Phomopsis archeri, Tetraploa arista ta,… đã
thể hiện tiềm năng hứa hẹn trong phát triển công nghệ sinh học sản xuất enzym
pectinase, protease, cenllulase, xylanase,… [31]
1.3.3.3. Tác dụng kháng khuẩn
Hầu hết các vi sinh vật nội sinh phân lập từ thực vật được biết đến có hoạt tính kháng
khuẩn. Chúng giúp kiểm sốt mầm bệnh trên thực vật. Vi sinh vật nội sinh phân lập từ
cây thuốc cho thấy hoạt tính sinh học đối với vi sinh vật gây bệnh. Tổng cộng có 37 vi
sinh vật nội sinh được phân lập từ Tectona grandis và Samanea saman, trong đó 18

lồi có tác dụng ức chế hiệu quả đối với B. subtilis, S. aureus, E. coli và 3 loài ức chế
sự phát triển của Candida albicans [31].

13


1.4. Một số phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn
Có rất nhiều phương pháp để thử hoạt tính kháng khuẩn đã được áp dụng trên thế giới,
tuy nhiên không phải phương pháp nào cũng phù hợp để thử hoạt tính của dịch chiết
thực vật. Một số phương pháp phù hợp để thử hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết
thực vật được đề cập sau đây [5]:
1.4.1. Phương pháp khuếch tán
1.4.1.1. Phương pháp khuếch tán giếng thạch (Agar well diffusion method)
- Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của
thực vật hoặc chất chiết xuất từ vi sinh vật.
- Nguyên tắc: Đầu tiên, các đĩa thạch petri được cấy chủng vi sinh vật trên bề mặt, sau
đó đục lỗ, nhỏ dịch thử vào giếng và ủ ở điều kiện thích hợp.
1.4.1.2. Phương pháp khuếch tán đĩa thạch (Agar disk-diffusion method)
Phương pháp khuếch tán đĩa thạch được phát triển vào năm 1940, là phương pháp
quan trọng được sử dụng thường quy trong nhiều phòng thí nghiệm vi sinh để kiểm tra
tính nhạy cảm kháng sinh.
Quy trình:
- Cấy vi sinh vật cần thử vào đĩa petri chứa môi trường thạch Luria bertani vô khuẩn.
Dùng que cấy vô trùng dàn đều vi sinh vật trong đĩa.
- Đặt khoanh giấy (đường kính khoảng 6mm) chứa chất thử lên bề mặt thạch và ủ đĩa
petri ở điều kiện thích hợp.
Các chất thử có hoạt tính từ khoanh giấy sẽ khuếch tán vào thạch và ức chế sự phát
triển của vi sinh vật thử nghiệm. Đọc kết quả bằng cách đo đường kính vịng vơ khuẩn.
1.4.2. Phương pháp pha lỗng
Phương pháp pha lỗng là phương pháp thích hợp nhất để xác định giá trị MIC (nồng

độ ức chế tối thiểu). Có thể sử dụng phương pháp pha lỗng thạch hoặc mơi trường để
định lượng hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm in vitro.
1.4.2.1. Pha loãng thạch (Agar dilution method)
Kỹ thuật này thích hợp cho cả thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm.
Nguyên tắc: Trộn chất kháng khuẩn với các nồng độ khác nhau vào môi trường thạch
đang chảy lỏng (thường sử dụng các mẫu thử pha loãng hai lần liên tiếp). Sau khi
14


thạch đông lại, cấy vi sinh vật lên bề mặt đĩa thạch và ủ ở điều kiện thích hợp. Điểm
cuối MIC được ghi nhận là nồng độ chất kháng khuẩn thấp nhất ức chế hoàn toàn sự
phát triển vi sinh vật trong điều kiện ủ thích hợp.
1.4.2.2. Pha lỗng mơi trường (Broth dilution method)
Nếu phương pháp pha loãng thạch được thực hiện trên các đĩa thạch thì phương pháp
pha lỗng môi trường thường sử dụng đĩa 96 giếng hoặc ống ni cấy tế bào. Các mẫu
thử được pha lỗng dần (thường là 2 lần) trên đĩa 96 giếng hoặc ống ni cấy tế bào,
sau đó mỗi giếng hoặc ơng được thêm cùng một lượng vi sinh vật đã hoạt hoá và có độ
đục tương 0,5 McFarland.

15


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu, thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu
- Dược liệu: Cây bạc hà (Mentha arvensis L.) trồng ở làng dược liệu Nghĩa Trai (Hưng
Yên) được kiểm định bởi Bộ môn Thực vật – Đại học Dược Hà Nội.
- Cơ chất để phân lập nấm men: Đề tài sử dụng chủng nấm men phân lập từ hoa cúc
(thu hái từ làng dược liệu Nghĩa Trai, Hưng Yên), vỏ cam (Nghệ An), trà xanh (Thái
Nguyên).

2.1.2. Chủng vi khuẩn kiểm định
Các chủng vi khuẩn được sử dụng để thử hoạt tính kháng khuẩn trong nghiên cứu của
chúng tôi được cung cấp bởi Viện kiểm nghiệm Trung ương và được trình bày trong
Bảng 2.1.
Bảng 2.1. Chủng vi khuẩn kiểm định
Vi sinh vật

Ký hiệu chủng

Bacillus subtilis

ATCC 6633

Pseudomonas aeruginosa

ATCC 9027

Staphylococcus aureus

ATCC 6538

Escherichia coli

ATCC 8739

2.1.3. Thiết bị
- Tủ an toàn sinh học cấp II Streamline
- Tủ ấm vi sinh WiseCube
- Tủ lạnh Samsung SR-269
- Tủ sấy Shellab

- Nồi hấp tiệt trùng Hirayama HVE 25
- Đĩa petri
- Thước kẹp Panme
- Cân kỹ thuật
- Micropipet 100 µL,1000 µL
16


- Đĩa 96 giếng
- Cốc có mỏ, ống nghiệm, bình nón
- Đèn cồn
- Que cấy
- Bơng, gạc
2.1.4. Dung mơi, hố chất
- Môi trường Luria Bertani được sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn.
Thành phần môi trường như sau:
+ Cao nấm men: 5g/L
+ Pepton:

10g/L

+ NaCl:

10g/L

+ Agar:

16-18 g/L

- Môi trường Sabouraud được sử dụng để nuôi cấy nấm men.

Thành phần của môi trường Sabouraud như sau:
+ Glucose: 40g/L
+ Pepton: 10g/L
+ Agar:

16-18g/L

Sau khi pha các môi trường, hấp tiệt trùng ở 121 oC trong 20 phút.
- Đường saccarose (Sucrose C12H22O11 - Xilong Trung Quốc)
- McFarland 0,5 và 1,0: BaCl2, H2SO4
- Gentamycin
- Ethanol 70 o, NaCl 0,9%, nước cất.
2.2. Nội dung nghiên cứu
Đề tài được thực hiện theo những nội dung sau:
- Nội dung 1: Sàng lọc các vi sinh vật có khả năng sinh trưởng trong môi trường chứa
dịch chiết bạc hà.
- Nội dung 2: Xác định hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết bạc hà lên men bằng vi sinh
vật tự nhiên.
- Nội dung 3: Phân lập các chủng nấm men có khả năng tăng cường hoạt tính kháng
khuẩn của dịch chiết bạc hà.

17