TRƯỜNG ĐHBK – ĐHQG TP.HCM
BỘ MƠN CNTP
BÁO CÁO THÍ NGHIỆM
HĨA HỌC HĨA SINH THỰC PHẨM

BÀI THÍ NGHIỆM SỐ 4: PROTEIN

NGÀY : 12/04/2021

BUỔI THÍ NGHIỆM: 4

NHĨM TN: 2 NHĨM L02

GVHD: TRẦN THỊ HỒNG HẠNH

Stt

Họ và tên

MSSV

Phân cơng

1

Trần Minh Thi

1915265

2

Trần Đình Việt Hùng

1913615

Chuẩn bị hóa chất
Cất đạm

3

Nguyễn Thị Ngọc Mai

1914109

4

Trần Lê Trọng Nghĩa

1914327

Chuẩn bị hóa chất
Chuẩn độ

5

Trần Gia Hịa

1913475

Ninhydrin


Ký tên


PROTEIN
1, Axit amin phản ứng với Ninhydrin
A, Nguyên tắc
-

-

Ninhydrin được dùng làm thuốc thử trong phản ứng định tính và định lượng axit
amin vì nó có thể phản ứng với nhóm -NH2 của amino acid ở 100oC cho sản phẩm
có khả năng hấp thụ bước sóng λ=570 nm.
Khi đung nóng acid amin với ninhydrin sẽ tạo thành CO2, NH3, aldehyde tương
ứng và diceton oxyhydrinden.
Phản ứng giữa đi diceton oxyhydrinden với NH3 và một phân tử ninhydrin mới sẽ
xảy ra. Phức mới tạo thành tiếp tục kết hợp với NH3 tạo thành hợp chất có màu
tím xanh đỏ.

B, Dụng cụ và hóa chất
-

Dụng cụ: ống nghiệm, kẹp, pipette, bếp điện.
Hóa chất:
+ Thuốc thử ninhydrin: dung dịch ninhydrin 1% trong acetone 95%.
+ Các dung dịch acid amin: glutamic, leucin, proline có nồng độ 0.05%.
+ Một dung dịch thủy phân (proteolysat) chứa hỗn hợp acid amin.


C, Tiến hành

1ml dd
glutamic,
0.2ml
ninhydrin

1ml dd
leucin,
0.2ml
ninhydrin

1ml dd
prolin,
0.2ml
ninhydrin

1ml hh acid
amin, 0.2ml
ninhydrin

0.5ml hh acid
amin, 0.5ml
nước cất, 0.2ml
ninhydrin

Đun nóng bằng bếp điện

T= 10 phút; t= 90oC

So sánh màu


Lấy dd vào ống nghiệm

Đun nóng dd bằng bếp điện


D, Kết luận
-

Ống 1 (prolin) sau khi đun nóng dung dịch có màu vàng, pha lỗng bằng 5ml cho
màu vàng.
Ống 2 (glutamic) sau khi đun nóng dung dịch có màu xanh tím, pha lỗng bằng
5ml nước cất cho màu tím nhạt.
Ống 3 (leucin) sau khi đun nóng dung dịch có màu xanh đen, pha loãng bằng 5ml
nước cất cho màu xanh tím.
Ống 4 (hỗn hợp acid amin) sau khi đun nóng dung dịch có màu đen, pha lỗng
bằng 5ml nước cất cho màu xanh đen.
Ống 5 (hỗn hợp acid amin + nước cất) sau khi đun nóng dung dịch có màu đen,
pha loãng bằng 5ml nước cất cho màu xanh tím đậm.
Prolin
Màu

Glutamic
+

Leucin
++

Pha lỗng

Hỗn hợp

acid amin
++++

Hỗn hợp acid amin
+ nước cất
+++


2, Định lượng Nitơ acid amin bằng phương pháp chuẩn độ Formol (Phương pháp Sorensen)
A, Nguyên tắc:
-

Các aldehyde dễ kết hợp với nhóm amin. Khi cho formaldehyde tác dụng với acid amin,
nhóm amin bị methylen hóa tạo thành dẫn xuất methylen imino acid.
Hợp chất tạo thành có tính acid mạnh hơn acid amin tự do, các nhóm cacboxyl của
chúng dễ dàng định phân bằng kiềm, qua đó gián tiếp tính được lượng nitơ amin của
các acid amin trong dung dịch.

B, Dụng cụ
-

Bình định mức 100ml
Pipette 1ml, 20ml
Ống đong 10ml

- Erlen 100ml
- Burette 25ml
- Becher 100ml

C, Hóa chất

-

Dung dịch đệm pH=7, pH=9.2
NaOH 0.05N
H2SO4 0.05N

- Formol trung tính
- Phenolphtalein
- Bromthymol blue

D, Cách tiến hành

20ml dd pH 7 và
5 giọt
bromthymol
blue 0.04%

Lắc đều

Dd màu
lục nhạt

20ml dd pH 9.2
và 5 giọt
bromthymol
blue 0.04%

Lắc đều

Dd màu

tím xanh



Nước mắm

Định mức 1ml nước mắm thành
100ml dd

Lấy 20ml dd nước mắm vào bình
nón
5 giọt
bromthymol blue
Dd màu vàng

Từng giọt NaOH


Chuẩn độ bằng dd NaOH 0.05N

Dd có màu
tương tự pH 9.2

Lấy 1ml nước mắm


Lấy vào bình nón 20ml dd nước mắm pha lỗng

Đưa pH của nước về 7


Thêm NaOH 0.05N để được màu dd pH 7

Màu các dd sau chuẩn độ tại pH 9.2


E, Tính kết quả
Số gam Nitơ acid amin có trong 1 lít nước mắm:
x=

( a−b ) ×T × 0.0007 ×100 ×1000 ( 7.9−2.5 ) × 0.96× 0.0007 ×100 ×1000
=
20V
20 ×1

¿ 18.9 gam

a: số mL NaOH 0.05N dùng để chuẩn dung dịch thí nghiệm.
-

a = V1 NaOH 0.05N đưa về pH 7 + V2 NaOH 0.05N khi đưa tiếp về pH 9.2
= 6.5 + 1.4 = 7.9 mL

b: số mL NaOH 0.05N dùng để chuẩn dung dịch kiểm chứng.
-

b= V NaOH 0.05N đưa nước về pH 9.2 = 2.5 mL

T: hệ số hiệu chỉnh nồng độ của dung dịch NaOH đem dùng so với nồng độ chuẩn.
-


Chuẩn độ 10mL dd H2SO4 0.05N chuẩn bằng dd NaOH 0.05N. Ta thấy V NaOH
0.05N đã dùng bằng 5.2 mL => T =

5
≈ 0.96
5.2

V: số mL nước mắm cho vào bình định mức.
0.0007: số gam nitơ ứng với 1 mL NaOH 0.05N.

Dd NaOH 0.05N, phenolphtalein trước và sau khi chuẩn độ


3. Phản ứng Biure
A, Nguyên tắc
Đây là phản ứng dùng để phát hiện liên kết peptit -CO-NH-. Phản ứng xảy ra đối với các
chất chứa từ hai liên kết peptit trở lên. Trong môi trường kiềm mạnh, CuSO 4 phản ứng
với các liên kết peptit có trong dung dịch chứa protein tạo phức có màu tím, tím đỏ. Các
phức màu hấp thụ ở bước sóng 540nm.
B, Dụng cụ: ống nghiệm, pipette 1-5ml
C, Hóa chất: Dung dịch CuSO4 1%, dung dịch NaOH 10%, ure, dung dịch lòng trắng trứng
1%

D, Tiến hành

Tinh thể Ure

Đun chảy bằng bếp
điện
1ml dd lịng trắng

trứng, 1ml NaOH
10%

Nóng chảy

2-3 giọt
CuSO4 1%

Lắc đều

Khơ cứng, NH3 bay hơi

Dd màu
xanh tím


Biure

2ml NaOH
10%
Lắc đều

2-3 giọt
CuSO4 10%

Dd màu
tím nhạt

Ure trước và sau khi đun nóng



Dd lịng trắng trứng

Màu dd sau phản ứng Biure:
+ Tím nhạt: ure
+ Xanh tím: lịng trắng trứng

E, Kết quả
- Biure chỉ có 2 liên kết peptit nên cho màu tím nhạt.
- Lịng trắng trứng có hàm lượng lớn các protein khoảng 10% protein (bao
gồm albumin, mucoprotein và globulin), số lượng liên kết peptit nhiều nên cho màu
xanh tím.
- Sự tạo thành biure
To

H2N-CO-NH2
(ure)

+H2N-CO-NH2

H2N-CO-NH-CO-NH2

H2N-CO-NH-CO-NH2 + NH3
(biure)
HO-C-NH-CO-NH2
NH
CO=NH

2( HO-C-NH-CO-NH2)


HN

NH-CO
Cu

NH + Na + + 4H2O


CO-NH

NH=CO

4, Cất đạm
A, Nguyên tắc :
Khi đun nóng vật mẫu đem phân tích với H2SO4 đậm đặc, các hợp chất hữu cơ bị oxy
hóa. Carbon và Hidro chuyển thành CO2 và H2O. Cịn Nitơ sau khi được giải phóng dưới
dạng NH3 kết hợp H2SO4 tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch. Đuổi NH3 ra khỏi NaOH
đồng thời cất và thu NH3 bằng một lượng dư H2SO4 0.1N còn lại bằng dung dịch NaOH
0.1N chuẩn, qua đó tính được lượng Nitơ có trong mẫu ngun liệu thí nghiệm.
B, Dụng cụ và thiết bị :
-

Máy cất đạm tự động GERHARDT, tủ Hotte
Bình KJELDAHL 500 mL
Ống đong 25mL
Pipette 2mL, 10mL

- Bình định mức 100 mL
- Erlen 500 mL
- Burette 25mL

- Becher 100mL, 250mL

C, Hóa chất:
-

H2SO4 đặc, NaOH 40%
Dung dịch NaOH 0.1N, dung dịch chuẩn H2SO4 0.1N
Phenolphtalein


D, Tiến hành

Mẫu đã được vơ cơ hóa

Định mức trong bình 100ml

Lấy 10ml đi cất đạm
Bật bếp, mở van xả thải, tráng bình bằng nước cất.
Đóng van xả.
Lấy 10ml H2SO4 0.1N vào becher.
Cho mẫu vào ống sinh hàn + 10ml NaOH
40%

Khóa van, đợi 10 phút


Becher chứa mẫu và
H2SO4

Bộ cất đạm



(3)
(1)

(2)

(4)

(5)

(1) Bình cầu dung tích 1 lít
(2) Bình Kjedahl 500ml
(3) Ống sinh hàn thẳng
(4) Becher chứa 10ml H2SO4 0.1N
(5) Bình thu mẫu
 Chú ý
- Lúc thêm mẫu hoặc NaOH vào bình sinh hàn thì nên cho từ từ, sát thành để tránh
bị dịng khí bên trong đẩy ngược ra ngồi.
- Trong quá trình rửa bộ cất đạm ban đầu ta có thể dùng khăn ướt để làm nguội
bình kjendahl, từ đó chênh lệch nhiệt độ làm đẩy dung dịch trong ống sinh hàn về
phía van xả thải, tránh lẫn với các mẫu trước đó.
E, Kết quả
-

x=

Độ đạm của nước mắm là số g nitơ trong một lít nước mắm được tính theo cơng
thức sau:


( a−bK ) × 0.0014 ×100 × 1000 ( 10−9 ×0.96 ) × 0.0014 ×100 ×1000
=
10 V
10× 1

¿ 19.04 g/L

a – số mL H2SO4 0.1N đem hấp thụ NH3

a = 10 mL

b – số mL NaOH 0.1N tiêu tốn cho chuẩn độ

b = 9 mL


V – thể tích dịch nước mắm đem vơ cơ hóa, mL
0.0014 – lượng gam nitơ ứng với 1mL H2SO4 0.1N
K – hệ số điều chỉnh nồng độ NaOH 0.1N
-

Lấy 10mL H2SO4 0.1N vào erlen, định phân bằng NaOH 0.1N.

-

V NaOH 0.1N = 5.2 mL => K ¿

5
≈ 0.96
5.2


5. Bàn luận
- Thêm NaOH 40% vào ống sinh hàn khi cất đạm là để trung hòa hết axit dư ở giai đoạn
phá mẫu và đẩy NH3 ra khỏi muối (NH4)2SO4
2NaOH + H2SO4 -> Na2SO4 + 2H2O
2NaOH + (NH4)2SO4 -> 2NH3 + 2H2O + Na2SO4
- Ta thấy độ đạm ( gam nitơ có trong 1 lít nước mắm) cao hơn số gam nitơ acid amin có
trong 1 lít nước mắm (19.04 > 18.9) là do trong nước mắm ngoài các nguyên tử N tồn tại
trong acid amin và protein cịn có các nguyên tử N trong các hợp chất muối vô cơ.
- Độ đạm x = 19.04 g/L (>15) => Đây là nước mắm loại 1.
- Kết quả thí nghiệm có thể không chuẩn xác do những nguyên nhân gây sai số sau:
+ Q trình lấy mẫu, cân mẫu khơng chính xác (làm trịn).
+ Hóa chất, thuốc thử bị lẫn tạp chất.
+ Sai số lúc chuẩn độ (dừng chuẩn độ không đúng, làm tròn lúc đọc kết quả).
+ Sai số lúc lắp ống nghiệm chứa mẫu vào bộ cất đạm, lắp bị lệch làm mất một phần
mẫu.