2/13/12
1
L/O/G/O
ĐIỆN DI
1. Khái niệm
•  Kỹ thuật tách những hợp chất của một
hỗn hợp nhờ điện trường
– VD: tách hỗn hợp các amino acid,
nucleic acid, protein
2. Nguyên tắc

•  Các protein có mang điện tích khi nó ở
môi trường có pH khác với pI
•  Các ion mang điện tích ngược dấu nhau sẽ
di chuyển theo 2 hướng ngược chiều nhau
•  Các ion mang điện tích cùng dấu di chuyển
với vận tốc khác nhau
! Các phân tử tách rời nhau
3. Căn bản vật lý của điện di
•  Vận tốc di chuyển của 1 phân tử có điện tích
được mô tả theo phương trình

Trong đó: v: vận tốc di chuyển của phân tử
trong điện trường
E: lực điện trường
q: điện tích toàn phần của phân tử
f: hệ số ma sát
v =
E ! q
f
2/13/12

2
•  Điện trường được thiết lập bằng cách áp một
điện thế V vào 2 điện cực, đặt cách nhau 1
khoảng cách d
•  Lực điện trường sẽ là
E = V/d
3. Căn bản vật lý của điện di (tt)
•  Điện tích toàn phần:
– Tổng số điện tích âm và điện tích dương
trong phân tử
•  Hệ số ma sát (f) phụ thuộc:
– Khối lượng phân tử
– Mức độ chặt chẽ trong cấu trúc phân tử
– Độ nhớt của dung dịch đệm
– Độ rỗng của hệ mạng môi trường điện di
3. Căn bản vật lý của điện di (tt)
•  Phân tử càng có nhiều điện tích và kích
thước càng nhỏ thì di chuyển càng nhanh
về điện cực ngược dấu.
•  Các phân tử có cùng điện tích nhưng hình
dạng khác nhau sẽ di chuyển với vận tốc
khác nhau
3. Căn bản vật lý của điện di (tt)
4. MÔI TRƯỜNG CHẤT MANG
SỬ DỤNG TRONG ĐIỆN DI
2/13/12
3
Môi trường chất mang
•  Nguyên liệu dùng làm chất mang trong điện di:
giấy lọc, acetate cellulose, agarose,

polyacrylamide, lớp mỏng silica, alumina,…
•  Phân loại dựa vào sự khác nhau của môi trường
điện di:
– Điện di trên giấy (paper electrophoresis)
– Điện di trên bản gel (gel electrophoresis)
– Điện di trên ống vi quản (capillary tube
electrophoresis)
Chất mang Ưu điểm Nhược điểm
Giấy Chứa ít nhóm có mang điện tích
Luôn có sẵn
Dễ cầm, thao tác (không cần xử
lý)
Độ nhạy thấp
Tính lặp lại thấp
Không kiểm soát được
kích thước các lỗ rỗng
Poly-
acrylamide
Thường được sử dụng
Áp dụng cho protein và acid
nucleic
Độc hại cho thần kinh
Gel có khoảng đời sống
ngắn
Không gấp xếp bản gel
được
Agarose Không cần thêm phụ gia
Không đắt tiền
Dùng cho DNA, RNA
Mao quản Có thể tái sử dụng. Khả năng

tách chất cao. Phân tích nhanh
Tốn lượng mẫu ít
Dễ áp dụng hệ thống tự động
Cần đầu dò nhạy cảm
Dụng cụ đắt tiền
Muốn tái sử dụng phải
mất thời gian
4.1. Điện di trên giấy
•  Phân tách các phân tử có MW nhỏ
– VD: amino acid, protein có kích thước nhỏ
•  Giấy lọc cắt thành những dãy băng có
chiều rộng 3 – 5 cm
4.1. Điện di trên giấy
2/13/12
4
4.1. Điện di trên giấy (tt)
•  Ưu điểm: rẻ, kinh tế, tiện dụng
•  Nhược điểm:
– Kết quả không chính xác
– Tốn thời gian
– Khó áp dụng cho một số loại phân tử như
protein hoặc những đại phân tử có tính thân
dầu (hydrophilic) vì giấy sẽ hấp thu " các
dãy band bị kéo thành vệt dài
4.2. Acetate cellulose
•  Có tính hấp thu ít hơn giấy
4.2. Acetate cellulose
•  Khi áp dụng cho các loại phân tử như
protein hoặc những đại phân tử có tính thân
dầu (hydrophilic) cho kết quả là các dãy

band sắc nét, không có hiện tượng bị kéo
dài thành vệt
•  Đắt tiền nhưng vẫn được sử dụng rộng rãi
trong các PTN y khoa trong việc phân tích
những mẫu protein (định lượng protein
huyết thanh)
2/13/12
5
4.3. Mao quản (capillary)
•  Vi quản: silica nóng chảy, có tính mềm dẻo
nhờ được bọc polyimide.
4.3. Mao quản (capillary) (tt)
•  Diện tích mặt cắt ngang nhỏ ! tiêu thụ
năng lượng tối thiểu, khả năng tách chất
nhanh (chỉ trong vài phút)
•  Hệ thống tự động hóa, ghi nhận kết quả
bằng máy ghi (sắc ký đồ) → không phải
nhuộm màu bản gel
4.3. Mao quản (capillary) (tt)
•  Đắt tiền → không loại bỏ cột, phải rửa kỹ,
loại bỏ hoàn toàn các mẫu lần trước, để tái
sử dụng
•  5 – 50nl (≈ 1% điện di cổ điển)
•  Cần đầu dò cực nhạy để phát hiện tín hiệu
4.3. Mao quản (capillary) (tt)
•  Phân tích hệ gen, sàng lọc các bệnh
•  Phát hiện tác nhân gây bệnh, định chủng
•  Phát hiện cây trồng chuyển gen (GMO),
các sản phẩm trong nông nghiệp
• 

2/13/12
6
4.4. Gel agarose
•  Polymer (polysaccharide) trích từ loại rong đỏ
•  Không mang điện tích
•  Có kích thước lỗ lớn hơn so với gel
acrylamide
•  Ưu điểm: không cần thêm chất phụ gia và chất
tạo mạng ngang để polymer hóa, không độc
hại, rẻ tiền
•  Dùng tách các phân tử lớn (DNA)
4.5. Gel polyacrylamide
– S
2
O
8
2-
→ 2SO
4
2-
– Bền cơ học, trơ
hóa học
– Có thể thay đổi
độ rỗng → tách
những phân tử có
cùng điện tích
nhưng kích thước
và hình dạng
khác nhau
c

4.5. Gel polyacrylamide (tt)
•  Có thể điều chế gel ở một nồng độ nhất định
hoặc có nồng độ tăng dần tuyến tính (xác định
trọng lượng phân tử, điểm đẳng điện)
•  Nồng độ của acrylamide sẽ tạo gel có lỗ rỗng
kích cỡ khác nhau
– <2.5%: tách protein có trọng lượng phân tử ~
1.000 KDa
– >30%: tách protein có trọng lượng phân tử ~
2 KDa
2/13/12
7
•  Điện di trong điều kiện biến tính (SDS-PAGE)
•  Điện di trong điều kiện tự nhiên
5. MỘT SỐ KỸ THUẬT ĐIỆN DI
TRÊN GEL POLYACRYLAMIDE
Phân tích các protein kém hòa tan
Điện di với gel polyacrylamide có chứa SDS
(sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel
electrophoresis, SDS – PAGE)
5.1. Điện Di Trong Điều Kiện Bị Biến
Tính
2/13/12
8
5.1. (tt)
•  SDS
– hợp chất có dây alkyl dài 12C, có tính kỵ
nước và 1 đầu mang nhóm sulfat phân cực
– chất hoạt động bề mặt có khả năng hòa tan
rất hiệu quả hầu hết các loại protein

•  Protein được SDS bao bọc đều ở bên ngoài,
thành 1 lớp che phủ đồng nhất, tích điện âm
•  SDS loại bỏ sự khác biệt về điện tích giữa các
đại phân tử trong dung dịch
•  Các phức “protein-SDS” có điện tích toàn phần
giống nhau
→ tách các đại phân tử dựa vào kích
thước phân tử
2/13/12
9
Mối liên quan giữa T% của gel
và trọng lượng phân tử của hợp
chất điện di
T% Trọng lượng phân tử của hợp chất điện di
<2.5 1.000.000
5 25.000 – 300.000
7 100.000
10 15.000 – 70.000
15 12.000 – 50.000
30 2.000
2/13/12
10
5.1. (tt)
•  Ưu điểm
– Kỹ thuật đơn giản
– Kết quả có tính lặp lại cao
– Khả năng tách chất rất tốt: tách các protein
có độ dịch chuyển chênh lệch nhau 1% =
phân biệt được sự khác nhau 1KDa giữa
những protein có trọng lượng phân tử

khoảng 100KDa
2/13/12
11
5.1. (tt)
•  Nhược điểm
– Khó tách các polypeptide <10KDa
– Khó phân biệt các protein có cùng kích
thước hoặc kích thước gần giống nhau
– Protein không giữ được hoạt tính sinh học
– …
5.2. Điện di trong điều kiện tự
nhiên
•  Điện di với hệ thống bất liên tục
– Áp dụng với các mẫu protein hòa tan và
không bị kết tủa trong quá trình điện di
– Môi trường điện di có pH bất liên tục, gồm
2 lớp gel khác nhau có pH ban đầu hoàn
toàn khác nhau, được đặt liền kề nhau
5.1. (tt)
•  Điện di với hệ thống bất liên tục (tt)
•  Stacking gel (gel chồng đống mẫu, gel chuẩn bị)
– lớp gel phía trên, có chiều cao ~ 1/5 tổng
chiều cao bản gel
– Nồng độ polyacrylamide loãng (3 – 5%), pH
trung tính (6.9)
– Gel có lỗ rỗng to, lực ion yếu
•  Resolving gel (gel phân tách mẫu)
– Lớp gel phía dưới, chiều cao 4/5 bản gel
– Nồng độ polyacrylamide đặc (8 – 20%), pH
base ( 8 – 9)

– Gel có lỗ rỗng nhỏ, lực ion mạnh
6. Điện di hội tụ
(Isoelectric focusing, IEF)
•  Điểm đẳng điện (isoelectric point, pI): giá
trị pH mà protein không còn điện tích
2/13/12
12
Giá trị điểm đẳng điện của một số
protein
Protein pI
Pepsin 1.0
Pepsinogen 2.8
ovalbumin 4.6
Bovine serum albumin 4.9
urease 5.0
6. (tt)
6. (tt)
•  Muốn xác định pI, cần phải thiết lập 1 gel
với gradient pH ổn định
–  Sử dụng chất điện ly lưỡng tính: hợp chất
tổng hợp, sản phẩm của sự polymer hóa các
loại acid oligoamino (-NH
2
) oligocarboxylic (-
COOH) có MW nhỏ
–  Trộn các hợp chất điện ly khác nhau (không
có sự hiện diện của điện trường): hỗn hợp chỉ
có 1 pH duy nhất
–  Khi có dòng điện, từng chất riêng lẻ di chuyển
đến vị trí pI của nó " chúng hoạt động như

dung dịch đệm và có pH gradient
Điện di hội tụ có pH tuyến tính
nhờ các chất bất động
•  Sử dụng những hợp chất là dẫn xuất của
acrylamide (CH
2
=CH-CONH
2,
chất bất
động), trong cấu trúc có chứa các nhóm
acid yếu (CH
2
=CH-CONH-COOH, acid
carboxylic), hoặc base yếu (CH
2
=CH-
CONH-NH
2
, amin tam cấp)
6. (tt)
•  Ưu điểm:
– Loại gel này tương thích được với urea và
các chất tạo nhũ
– Không bị ảnh hưởng bởi các muối chứa
trong mẫu protein
6. (tt)
2/13/12
13
Ứng dụng của IEF để đo pI
•  Khi một protein được đặt vào bản gel

gradient pH, protein này di chuyển về vị trí
pI của nó
•  Nếu protein ở trong môi trường có pH cao
hơn giá trị pI của nó, protein có điện tích
toàn phần là điện tích âm, và di chuyển về
phía anod và ngược lại
•  Chỉ ở môi trường pH = pI, protein có điện
tích toàn phần = 0 (zero net charge) và
không di chuyển trong điện trường
7. Điện di SDS-PAGE 2 D
7.1. Nguyên tắc
– Protein được tách theo chiều thứ nhất bằng
điện di đo điểm đẳng điện (dựa vào sự khác
biệt về giá trị điểm đẳng điện) và chiều thứ 2
bằng SDS-PAGE (dựa vào sự khác biệt về
MW)
•  Điện di đo điểm đẳng điện (IMF): gel có dạng
hình cái que
–  Mẫu phân tích được đặt lên 1 đầu que, mỗi que chứa 1
mẫu, điện di nhiều que 1 lúc
•  Điện di SDS-PAGE:
–  Các que gel được thụt tuột ra khỏi ống chứa, rồi đặt
lên trên 1 tấm agarose ấm
–  Khi agarose nguội, que gel đã gắn dính vào tấm
agarose
–  Tấm agarose được đặt nằm ngang, phía trên đầu gel
SDS-PAGE
–  Điện di SDS-PAGE theo chiều có góc 90
o
so với

chiều thực hiện IEF
2/13/12
14
7.2. CÁC THIẾT BỊ SỬ DỤNG
TRONG SDS – PAGE 2 CHIỀU
•  Thực hiện IEF trên tấm gel đặt trong hình
ống trụ làm bằng thủy tinh, đường kính ống
5mm, chiều dài 14cm
•  Sau khi thực hiện IEF xong, que gel được
thụt tuột ra khỏi ống chứa, rồi được đặt trên
một agarose ấm và khi nguội lại, que gel đã
gắn dính vào tấm agarose. Tấm agarose
này được đặt nằm ngang, ở phần lớp gel
chuẩn bị của một tấm gel SDS-PAGE
8. Hiện hình bản gel
•  sau khi điện di, bản gel cần được làm cố định,
nghĩa là làm cho các protein kết tủa, cố định trên
bản gel và đồng thời loại bỏ những thành phần
không phải là protein vì các thành phần này có thể
gây trở ngại cho quá trình hiện hình bản gel
•  Phương pháp cố định tốt nhất: ngâm bản gel trong
dung dịch 10 – 20% w/v acid trichloroacetic hoặc
hỗn hợp acid trichloroacetic và acid
sulphosalicylic (10% w/v cho mỗi chất), ngâm ở
nhiệt độ phòng trong khoảng 2 giờ
8. Hiện hình bản gel (tt)
Thuốc nhuộm
Loại chất
phát hiện
Giới hạn

phát hiện
Amino black Protein 400 ng
Coomassie blue Protein 200 ng
Ponceau red (thuốc nhuộm thuận
nghịch)
Protein 200 ng
Bis-1-anilino-8-napthalen
sulfonate (ANS)
Protein 150 ng
Nile red Protein 20 ng
SYPRO orange Protein 10 ng
Flourescamin Protein 1 ng
AgNO
3
Protein/DNA 1 ng
SYPRO red Protein 0.5 ng
2/13/12
15
8.1. Nhuộm màu bản gel bằng
Coomassie Brilliant Blue
•  Protein hiện hình màu xanh dương
•  Ưu điểm:
–  Phẩm màu không xuyên qua hệ thống mạng
gel nên quá trình tẩy bản gel xảy ra nhanh
chóng
–  Thao tác đơn giản
•  Nhược điểm
–  Phẩm màu kém nhạy, chỉ phát hiện khoảng
0.5µg protein/cm
2

gel
8.2. Nhuộm màu bằng dung dịch
bạc nitrat
•  Ngâm bản gel trong dung dịch AgNO
3
cho kết tủa
kim loại bạc tại các vùng có sự hiện diện của
protein hoặc DNA tạo thành vùng màu đen
•  Ưu điểm:
–  Độ nhạy cao gấp 20 – 200 lần so với CBB
(0.05 – 0.1ng protein/mm
2
gel, có thể phát hiện
các protein ở lượng vết
•  Nhược điểm
–  Các protein như Ig dây ngắn cho hiện màu rất
kém
–  Đắt tiền, tốn nhiều thời gian
9. Western blotting
•  Kỹ thuật điện thấm (electroblotting): áp
dụng điện trường vuông góc với bản gel
•  Protein >15kDa: màng nitrocellulose với
đường kính lỗ rỗng 0.45 µm
•  Protein <15kDa: màng nitrocellulose với
đường kính lỗ rỗng 0.2 µm
2/13/12
16
9. Western blotting (tt)
•  Lai protein (antigen) với kháng thể (antibody
- Ab) đặc hiệu

•  Nghiên cứu protein và enzyme
9.1. Kháng nguyên và kháng thể
•  Kháng nguyên: các chất miễn dịch
– Hợp chất có trọng lượng phân tử nhỏ (các
phân tử đường)
– Hợp chất polymer sinh học có cấu trúc phức
tạp (protein)
•  Kháng thể: protein nhận biết kháng nguyên
9.1 (tt)
•  1 protein và 1 kháng thể gặp nhau
– Tương tác đặc trưng xảy ra giữa vùng biến đổi
(variable region) của kháng thể và epitope
(vùng đặc biệt ở trên kháng nguyên) của
kháng nguyên
•  Các epitope khác nhau trong những cấu trúc
protein có thể nhận diện bởi các Ab đặc trưng
– PAb: nhận diện nhiều epitope trong cùng 1 Ag
– MAb: nhận ra 1 epitope
9.1 (tt)
•  Với kháng thể đa dòng (polyclonal
antibody): một số epitope hiện diện trên bề
mặt của 1 antigen
•  Kháng thể đơn dòng (monoclonal
antibody, Mab): 1 epitope hiện diện trên 1
antigen
2/13/12
17
9.1 (tt)
•  Sử dụng lượng thừa Ag hoặc Ab, sau khi
nhuộm màu phức tạo thành giữa Ag-Ab "

đo nồng độ của Ag hoặc Ab
9.2. Nguyên tắc
•  Tách chiết protein
•  điện di
•  Chuyển lên màng lai
•  Rửa màng lai với “dung dịch khóa” (dung dịch
protein, blocking solution): khóa vị trí không đặc
trưng trên kháng thể
•  Lai protein trên màng với các protein kháng thể
đặc hiệu (VD: IgG thỏ: gắn vào epitope của
protein)

9.2. (tt)
•  Kháng thể này sẽ được phát hiện nhờ kháng thể
thứ 2, có ái lực đặc trưng với kháng thể thứ nhất
(VD: IgG kháng thỏ)
•  Làm hiện màu protein:
– Hiện hình phát huỳnh quang: cho tác dụng với
fluorescein isothicyanat
– Ghi dấu phóng xạ
– Phản ứng enzyme: sử dụng perixidase, β-
galactosidase,…
• 
Bài giảng SHPT & KT Gene _
Hutech
2/13/12
18
!
Bài giảng SHPT & KT Gene _
Hutech

Bài giảng SHPT & KT Gene _
Hutech