ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC
NGUYỄN THUỲ DUNG

ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH CHỐNG NGƯNG TẬP TIỂU
CẦU VÀ CHỐNG ĐÔNG MÁU IN VITRO CỦA CÁC
PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT GỪNG ĐEN
( KAEMPFERIA PARVIFLORA WALL.)

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Hà Nội-2021


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC

Người thực hiện: NGUYỄN THUỲ DUNG

ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH CHỐNG NGƯNG TẬP
TIỂU CẦU VÀ CHỐNG ĐÔNG MÁU IN VITRO
CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT GỪNG
ĐEN ( KAEMPFERIA PARVIFLORA WALL.)

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Khoá : QH.2016.Y
Người hướng dẫn:

1. TS. Lê Hồng Luyến

2. ThS. Nguyễn Xuân Tùng

Hà Nội- 2021


LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, em xin cảm ơn đến Ban chủ nhiệm Trường Đại học Y
Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội, Bộ môn Bào chế và công nghệ dược phẩm,
các thầy cơ đã tạo điều kiện cho em hồn thành khóa luận tốt nghiệp này. Em
xin chân thành cảm ơn các thầy cô đã giảng dạy, giúp đỡ em hồn thành
chương trình học tập suốt 5 năm qua.
Em xin gửi lời cảm ơn đặc biệt đến TS. Lê Hồng Luyến, trường Đại
học Khoa học và Công nghệ Hà Nội – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ
Việt Nam và ThS. Nguyễn Xuân Tùng, trường Đại học Y dược – Đại học
Quốc Gia Hà Nội đã ln tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện giúp em hồn
thành khóa luận .
Em cũng xin cảm ơn đề tài “Nghiên cứu hoạt tính sinh học của Cây
Gừng đen Kaempferia parviflora” đã tài trợ kinh phí để em thực hiện nội
dung nghiên cứu này. Em cũng xin cảm ơn Khoa Khám bệnh và Điều trị
ngoại trú, Khoa Đông máu, Viện Huyết học- Truyền máu Trung ương đã giúp
đỡ em thực hiện thí nghiệm.
Cuối cùng em xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình, các bạn bè và
người thân đã ln quan tâm, khích lệ tinh thần giúp em có thêm quyết tâm
hồn thành khóa luận này.
Dù đã rất cố gắng, nhưng là lần đầu làm nghiên cứu khoa học nên khó
tránh khỏi những sai sót, em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của thầy cơ
giúp em hồn thiện khóa luận hơn nữa.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 06 năm 2021

Sinh viên

Nguyễn Thuỳ Dung


DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Kí hiệu

Giải nghĩa

ADP

Adenosin diphosphat

AMP

Adenosin monophosphat

APTT

Thời gian Thromboplastin từng phần hoạt hoá ( Activated partial
Thromboplastin Time)

ATP

Adenosin triphosphat

AUC

Diện tích dưới đường cong (Area Under the aggregation curve)


COX-2

Cyclooxygenase 2

cGMP

guanosine monophosphat

GP

Glycoprotein

HMWK

Kininogen trọng lượng phân tử cao

IC 50

Liều ức chế 50% đối tượng thử (Inhibitory concentration 50%)

NTTC

Ngưng tập tiểu cầu

PPP

Huyết tương nghèo tiểu cầu (Platelet Poor Plasma)

PRP


Huyết tương giàu tiểu cầu (Platelet Rich Plasma)

PT

Thời gian Prothrombin (Prothrombin Time)

TT

Thời gian Thrombin ( Thrombin Time)

vWF

Von- Willerbrand


DANH MỤC CÁC BẢNG

STT

Tên Bảng

Trang

Bảng 1.1 Các yếu tố tham gia đơng máu huyết tương

10

Bảng 3.1 Diện tích dưới đường cong (AUC) của các dịch chiết
Gừng đen ở nồng độ 0,2 mg/mL


28

Bảng 3.2 Phần trăm ức chế ngưng tập tiểu cầu của các dịch chiết
Gừng đen ở nồng độ 0,2 mg/mL

29

Bảng 3.3 Tốc độ ngưng tập tiểu cầu của các dịch chiết Gừng đen ở
nồng độ 0,2 mg/mL

30

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của các dịch chiết Gừng đen trên con đường
đông máu ngoại sinh

31

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của các dịch chiết Gừng đen trên con đường
đông máu nội sinh

31

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của các dịch chiết Gừng đen trên con đường
đông máu chung

32


DANH MỤC CÁC HÌNH


STT

Tên hình

Trang

Hình 1.1

Sơ đồ sinh tiểu cầu

2

Hình 1.2

Sơ đồ cấu tạo của tiểu cầu

4

Hình 1.3

Cơ chế ngưng tập tiểu cầu của ADP

7

Hình 1.4

Sơ đồ q trình đơng máu huyết tương

12


Hình 1.5

Vai trị của thrombin trong q trình đơng cầm máu

14

Hình 1.6

Gừng đen (Kaempferia parviflora Wall. ex Baker)

15

Hình 2.1

Sơ đồ chiết tách dược liệu Gừng đen

22

Hình 2.2

Máy ACL TOP500 của hãng IL

23

Hình 2.3

Máy CHRONO –LOG 530 VS

23


Hình 2.4

Mẫu máu sau khi ly tâm 500 vòng/ phút trong 10 phút

25


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ

1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

2

1.1.

Sinh lý học tiểu cầu

2

1.1.1 Giới thiệu chung về tiểu cầu

3

1.1.2. Chức năng của tiểu cầu

3


1.2.

Sinh lý q trình đơng máu huyết tương

9

1.2.1.

Các yếu tố tham gia đơng máu huyết tương

9

1.2.2.

Các nhóm yếu tố tham gia đông máu huyết tương

11

1.2.3.

Giai đoạn đông máu huyết tương

11

1.3.

Tổng quan về Gừng đen

14


1.3.1.

Đặc điểm thực vật

14

1.3.2.

Thực trạng và phân bố

16

1.3.3.

Thành phần hố học

16

1.3.4.

Cơng dụng và tác dụng dược lý

17

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

21

2.1. Nguyên liệu, đối tượng nghiên cứu


21

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

21

2.1.2. Nguyên liệu, dụng cụ nghiên cứu

22

2.2. Phương pháp nghiên cứu

24

2.2.1. Đánh giá hoạt tính chống đơng máu của các phân đoạn dịch 25
chiết Gừng đen.
2.2.2.Đánh giá hoạt tính chống ngưng tập tiểu cầu của các phân 26
đoạn dịch chiết Gừng đen.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

28


3.1. Kết quả

28

3.1.1. Tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của các phân đoạn dịch 28
chiết Gừng đen

3.1.2. Tác dụng chống đông máu của các phân đoạn dịch chiết 30
Gừng đen
3.2. Bàn luận

32

3.2.1. Mơ hình nghiên cứu

32

3.2.2. Kết quả nghiên cứu

34

3.2.3. Hạn chế của nghiên cứu

36

KẾT LUẬN

38

ĐỀ XUẤT

39

TÀI LIỆU THAM KHẢO


ĐẶT VẤN ĐỀ

Huyết khối động mạch và huyết khối tĩnh mạch là một trong những
nguyên nhân hàng đầu gây nên tử vong trên toàn thế giới [37]. Các thuốc đã
biết đến trong chống đông máu như: Heparin, wafarin,.. hay chống ngưng tập
tiểu cầu như : aspirin, clopidogrel, prasugrel… đều cho tác dụng điều trị tốt
nhưng bên cạnh đó chúng cũng gây nên những tác dụng phụ như: dị ứng,
giảm tiểu cầu, loét dạ dày… [37,24]. Vì vậy, việc tìm kiếm liên tục các loại
thuốc mới đặc biệt là thuốc chống kết tập tiểu cầu, chống đông máu là vô
cùng cần thiết. Xác định được các con đường sinh hoá liên quan đến hoạt hố
đơng máu và ngưng tập tiểu cầu đã đưa đến việc tìm kiếm các thuốc mới cho
các thuốc chống huyết khối mới có ít tác dụng phụ hơn luôn được các nhà
khoa học quan tâm. Bên cạnh các thuốc tổng hợp, các thuốc có nguồn gốc từ
thiên nhiên là một ứng viên tiềm năng để sử dụng nghiên cứu [37].
Gừng đen (Kaempferia parviflora Wall. ex Baker) thuộc họ Gừng
Zingiberaceae [51,28] đã được sử dụng rất lâu đời trong y học Thái Lan và y
học cổ truyền để tăng cường sức khoẻ [47]. Chúng được nghiên cứu khá
nhiều về tác dụng dược lý, hoá học. Tuy nhiên ở Việt Nam và trên thế giới, số
lượng các nghiên cứu về tác dụng chống đông máu và ức chế ngưng tập tiểu
cầu cịn rất hạn chế. Vì vậy, để làm rõ cơ sở khoa học và giá trị sử dụng Gừng
đen, góp phần sử dụng hiệu quả tài nguyên cây thuốc vào điều trị bệnh huyết
khối, tôi đã thực hiện đề tài “ Đánh giá hoạt tính chống ngưng tập tiểu cầu
và chống đông máu in vitro của các phân đoạn dịch chiết cây gừng đen
(Kaempferia parviflora)” . Mục tiêu của đề tài là:
1. Đánh giá được hoạt tính chống đông máu của các dịch chiết cây
Gừng đen.
2. Đánh giá tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của các dịch chiết
cây Gừng đen.

1



CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Sinh lý học tiểu cầu
1.1.1. Giới thiệu chung về tiểu cầu
Khái niệm:
Tiểu cầu là những đĩa nhỏ hình trịn hoặc bầu dục, có đường kính 3 – 4
µm, độ dày trung bình 0,5 µm và thể tích khoảng 7 µm3. Đây là thành phần
hữu hình nhỏ nhất của máu. Số lượng tiểu cầu lưu hành ở máu ngoại vi
khoảng từ 150.000 - 400.000/µL (150 – 400 x 109/L). Tiểu cầu là những tế
bào khơng có nhân và khơng có khả năng phân chia. Chúng là một trong
những thành phần đóng vai trị quan trọng bậc nhất của q trình cầm máu và
đơng máu, nhất là giai đoạn cầm máu ban đầu [3,1,35].
Nguồn gốc phát triển:
Tiểu cầu được sinh sản từ mẫu tiểu cầu, nguyên mẫu tiểu cầu bắt nguồn
từ tế bào nguồn dòng tuỷ (CFU - GEMM), do tế bào gốc sinh máu tạo nên
(Hình 1.1). Mẫu tiểu cầu trưởng thành ở tuổi sinh tiểu cầu là tế bào máu lớn
nhất trong các tế bào máu ở tủy xương, với nhân rất to, nhiều múi, nguyên
sinh chất rộng chứa rất nhiều hạt, có đường kính 50 – 100 µm. Mỗi mẫu tiểu
cầu có thể tạo được từ 1000 đến 3000 tiểu cầu [3,9,14].

Hình 1.1. Sơ đồ sinh tiểu cầu [3]
(HSC: tế bào gốc sinh máu, MTC: mẫu tiểu cầu, TC: tiểu cầu)
Đời sống của tiểu cầu:
Tiểu cầu có đời sống ngắn, khoảng từ 8 - 14 ngày. Hiện nay có thể giữ
tiểu cầu trong 7 ngày ngoài cơ thể ở nhiệt độ 20 – 22°C, lắc liên tục [3].
2


Cấu trúc tiểu cầu:
Cũng như các tế bào khác, tiểu cầu gồm có lớp màng, các hạt, hệ thống
vi ống, hệ thống nội NSC (nội sinh nguyên chất).

- Màng tiểu cầu: Gồm hai lớp lipid (lớp lipid kép); trong đó có thành
phần quan trọng là glycoprotein (GP). Chúng có trọng lượng phân tử khoảng
140kD, có các thành phần sau đây:
+ GPIb: Là protein xuyên màng có nhiệm vụ liên kết với yếu tố Von
Willebrand (vWF). Đây là bước đầu tiên trong hoạt động động cầm máu của
tiểu cầu.
+ GPIIb/IIIa: Là protein màng, hoạt động phụ thuộc vào Ca++, có nhiệm
vụ liên kết với fibrinogen, giúp cho tiểu cầu ngưng tập thành “đinh cầm máu”
[3].
- Hệ thống các hạt đặc hiệu: Có ba loại hạt:
+ Hạt δ (hạt đặc): Có kích thước nhỏ hơn hạt α, trong chứa nhiều các
chất như ATP, ADP, calci, serotonin, histamin và epinephrin. Các chất này
được giải phóng khi tiểu cầu bị kích thích. Mỗi tiểu cầu chứa khoảng 3 – 8 hạt
đặc [3,26, 41].
+ Hạt α: Là loại hạt chiếm tỷ lệ cao nhất trong tiểu cầu, mỗi tiểu cầu có
khoảng 50 – 80 hạt α, chiếm khoảng 10% thể tích tiểu cầu. Hạt này chứa
nhiều protein khác nhau: thromboglobulin, yếu tố phát triển (GF), fibrinogen,
yếu tố V, vWF và nhiều protein quan trọng khác như thrombospondin,
fibronectin, giúp cho hiện tượng dính của tiểu cầu [3,9,15].
+ Hạt lysosome: Là các hạt có số lượng thưa thớt, chứa các enzym như
acid hydrolase và protease. Các hạt này có chức năng tiêu hóa các thành phần
ma trận tế bào chất. Sự bài tiết thành phần lysosome có các chức năng ngoại
bào quan trọng gồm phân cắt thụ thể, tiêu sợi huyết và phân hủy chất nền
ngoại bào [27].
- Hệ thống vi ống và vi sợi:

3


+ Các vi ống: Nằm ngay cạnh màng tiểu cầu, hệ thống này tạo nên

khung đỡ của tiểu cầu và tham gia vào hiện tượng co rút khi tiểu cầu bị kích
thích.
+ Các ống dày đặc: Đó là khối vật chất khơng định hình, dày đặc điện
tử, đóng vai trị là kho dự trữ Ca++, đồng thời là nơi tổng hợp cyclooxygenase
và prostaglandin của tiểu cầu.
+ Các vi sợi: Gồm các sợi actin tham gia tạo giả túc của tiểu cầu. [3]
- Hệ thống các kênh mở: Gồm các kênh mở vào trong tiểu cầu như các
không bào (vacuole) làm tăng diện tích bề mặt của tiểu cầu. Hệ thống này
đóng vai trị như một đường dẫn cho các chất từ bên ngồi mơi trường đi vào
trong tế bào chất của tiểu cầu và là nơi đưa các chất được giải phóng từ các
hạt ra khỏi tiểu cầu khi chúng bị hoạt hóa [3,9].

Hình 1.2. Sơ đồ cấu tạo của tiểu cầu [9]
1.1.2. Chức năng của tiểu cầu
Tiểu cầu có ba chức năng chính là làm vững bền mạch máu (bảo vệ nội
mơ), tham gia vào q trình cầm máu bằng cách tạo nút cầm máu ban đầu và
tham gia vào q trình đơng máu huyết tương [8].
1.1.2.1. Vai trị của tiểu cầu trong quá trình cầm máu
Trong trạng thái sinh lý bình thường, tiểu cầu khơng dính vào nội mơ
mạch máu cịn ngun vẹn, có lẽ do một chất có tác dụng ức chế dính của tiểu
cầu – chất đó có thể là prostagladin [3]. Tuy nhiên, khi tế bào nội mô thành

4


mạch bị tổn thương, tiểu cầu nhanh chóng trải qua các q trình bám dính,
thay đổi hình dạng, bài tiết và kết tập thông qua một loạt các phản ứng phối
hợp tinh xảo, mà đỉnh điểm là hình thành một nút tiểu cầu tại nơi mơ tổn
thương. Q trình này đạt được thơng qua ba bước riêng biệt: kết dính tiểu
cầu, chế tiết tiểu cầu và kết tập tiểu cầu [9,21].

Giai đoạn bám dính
Tiểu cầu có khả năng dàn ra và dính vào một số bề mặt. Trong in vitro,
tiểu cầu có thể dính vào tất cả các bề mặt lạ như ống nghiệm, bi thủy tinh,
thạch anh, bentonit, barbiturat. Cịn trong in vivo, tiểu cầu khơng dính vào lớp
tế bào nội mạc, nhưng lại có thể dính rất mạnh với tổ chức dưới nội mạc, đặc
biệt là với collagen [8]. Khi thành mạch bị tổn thương, lớp tế bào nội mô bị
mất đi và bộc lộ lớp dưới nội mơ. Lớp này có bản chất là các protein dính
như: collagen, yếu tố vWF, fibronectin, lamilin… [9,16,50]. Yếu tố vWF tạo
điều kiện cho sự bám dính ban đầu, thơng qua liên kết với phức hợp
GPIb/IX/V đóng vai trị thụ thể trên màng tiểu cầu. vWF đóng vai trị quan
trọng trong bám dính của tiểu cầu khi tốc độ dịng máu cao. Trong điều kiện
tốc độ dòng máu thấp hoặc tĩnh, bám dính ban đầu của tiểu cầu chủ yếu thơng
qua liên kết collagen với GPIa/IIa. Những tương tác này cho phép tiểu cầu lưu
thơng chậm lại đủ để có sự tương tác, ràng buộc hơn nữa của các cặp thụ thể phối tử dẫn đến sự bám dính tĩnh [9,36]. Đặc biệt sự tương tác ban đầu giữa
collagen và GPVI gây ra sự kích hoạt GPIIb/IIIa và GPIa/IIa. vWF và
collagen hình thành liên kết mạnh mẽ tương ứng với GPIIb/IIIa và GPIa/IIa,
fibrinogen liên kết với GP IIb/IIIa giữ tiểu cầu tại chỗ [9].
Giai đoạn chế tiết
Tiểu cầu hoạt hóa, thay đổi hình dạng từ hình đĩa thành dạng quả cầu
nhỏ gọn, với phần mở rộng đuôi gai dài tạo điều kiện thuận lợi cho độ bám
dính [8,9]. Một khi sự kết dính tiểu cầu đã xảy ra tại vị trí thành mạch bị tổn
thương, cần duy trì hoạt hóa tiểu cầu để quá trình cầm máu tiếp tục diễn ra.
Điều cần thiết cho việc khuếch đại hoạt hóa tiểu cầu là sản xuất và giải phóng
các chất chủ vận hịa tan tại vị trí tổn thương [69], hoạt động theo cách tự tiết
(tác động lên chính các tế bào đã tạo ra chúng) và cận tiết (tác động lên các tế

5


bào lân cận) để khuếch đại hoạt hóa tiểu cầu và thu nạp thêm các tiểu cầu lưu

thông. Các chất chủ vận này bao gồm thromboxan A2, ADP, epinephrine và
thrombin. ADP được tiết ra từ các hạt đặc của tiểu cầu và liên kết với các thụ
thể liên quan của nó, gồm P2Y12 và P2Y1 trên bề mặt tiểu cầu [31]. Thụ thể
P2Y1 huy động Ca++ và thay đổi hình dạng tạm thời. Thụ thể P2Y12 tăng
cường sự tiết của tiểu cầu và tham gia vào duy trì kết tập tiểu cầu bền vững
[9]. P2Y12 cũng là mục tiêu của nhóm thuốc chống kết tập tiểu cầu gọi là
thienopyridines (ticlopidine, clopidogrel, prasugrel), được sử dụng rộng rãi
trong việc phòng ngừa các biến cố mạch máu ở bệnh nhân mắc các bệnh tim
mạch [12].
Ở giai đoạn này, các hiện tượng sinh hóa xảy ra như: kích thích chuyển
hóa tiêu đường, thối hóa và tái tổng hợp từng phần ATP, ADP thành AMP,
hoạt hóa thrombosterin. Hiện tượng này xảy ra có sự tham gia của thrombin,
collagen và có tiêu tốn năng lượng của tiểu cầu. Đây là hiện tượng vô cùng ý
nghĩa trong việc bảo vệ mạch máu khi mạch máu bị tổn thương [8].
Trong thực tế, các khả năng kết dính, ngưng tập, phóng thích của tiểu
cầu có sự gắn bó rất chặt chẽ với nhau. Khả năng này thúc đẩy, tạo điều kiện
và mở rộng cho khả năng khác xảy ra để đạt mục đích cuối cùng là thực hiện
tốt các chức năng của tiểu cầu [8].
Giai đoạn ngưng tập
Tiểu cầu có khả năng kết dính lẫn nhau tạo nên các kết chụm tiểu cầu
gọi là hiện tượng ngưng tập tiểu cầu. Đây là một khả năng rất đặc biệt của tiểu
cầu, thông qua hiện tượng này mà tiểu cầu thực hiện chức năng của mình [8].
Ngưng tập tiểu cầu được đặc trưng bởi sự tích tụ tiểu cầu vào một nút cầm
máu. Các thụ thể tiểu cầu trung tâm trong quá trình này là GPIIb/IIIa, liên kết
các tiểu cầu kích hoạt thơng qua cầu fibrinogen. Một tiểu cầu khơng hoạt hóa
có khoảng phức hợp GPIIb/IIIa trên bề mặt của nó. Trong trạng thái khơng
hoạt động, thụ thể này khơng thể gắn với fibrinogen, vWF, fibronectin,
vitronectin. Chỉ khi tiểu cầu được hoạt hóa, phức hợp GPIIb/IIIa mới được
hoạt hóa, hoạt động như một thụ thể dành cho fibrinogen, chất này lại gắn với
thụ thể trên các tiểu cầu khác tạo nên một cầu nối làm cho các tiểu cầu ngưng


6


tập lại với nhau và tiếp tục hoạt hóa. Hai giai đoạn ngưng tập và hoạt hóa tác
động qua lại, tương hỗ lẫn nhau diễn ra liên tục cho đến khi tạo thành nút tiểu
cầu [8,9,28].
Có nhiều chất có khả năng gây ngưng tập tiểu cầu như: ADP, thrombin,
adrenalin, serotonin, acid arachidonic, thromboxan A2, collagen, ristocetin,…
Các chất này được gọi là “chất kích hoạt tiểu cầu”. Trong đó, ADP đóng vai
trị quan trọng nhất vì chất này gây ngưng tập tiểu cầu một cách độc lập
không phụ thuộc các tác nhân khác và giúp cho phản ứng ngưng tập do các
tác nhân khác xảy ra đầy đủ hơn. Ngoài ra, ADP cịn có nguồn gốc từ hồng
cầu. Những hồng cầu tại vị trí thành mạch bị tổn thương sẽ bài tiết ADP và
nhờ vậy làm tăng nhanh nồng độ ADP khu trú tại chỗ tổn thương, góp phần
làm tăng quá trình ngưng tập tiểu cầu, nhanh chóng tạo nút cầm máu ban đầu,
làm ngừng chảy máu [8,12,51].
ADP gây ra ngưng tập tiểu cầu theo cơ chế sau: Bình thường các tiểu
cầu khơng ngưng tập là phải có năng lượng, năng lượng được tạo ra là do sự
thoái hoá ATP thành ADP. Trong trường hợp có nhiều ADP (do đưa từ ngồi
vào) thì phản ứng này bị ức chế, nên gây ra thiếu năng lượng dẫn đến tiểu cầu
bị ngưng tập (Hình 1.3) [8]

Hình 1.3. Cơ chế ngưng tập tiểu cầu của ADP [8]
(- -: ức chế, ngăn cản)

7


Sự ngưng tập tiểu cầu là một hiện tượng có thể phục hồi được tự nhiên.

Quá trình phục hồi này là do sự có mặt của một hệ thống men ở trong huyết
tương và trong tiểu cầu; trong đó adenylat kinase đóng vai trị quan trọng nhất
[8].
1.1.2.2. Vai trị của tiểu cầu trong q trình đơng máu huyết tương
Ngay từ khi bắt đầu hiện tượng bám dính, tiểu cầu thay đổi hình dạng
và chế tiết những hoạt chất tham gia q trình khởi động đơng máu.
Kininogen trọng lượng phân tử cao (HMWK) cùng với kallikrein hoạt hóa
yếu tố XII bước đầu của q trình đơng máu. Tiểu cầu có thể làm tăng nhanh
sự tổng hợp thrombin. Một lượng nhỏ thrombin được hình thành trên bề mặt
của một số tế bào mang yếu tố tổ chức (TF – tissue factor) như: nguyên bào
sợi, bạch cầu đơn nhân hoạt hóa hoặc tế bào nội mơ. Lượng thrombin này
khơng có khả năng để tạo ra một cục máu đông fibrin ổn định, nhưng đủ để
hoạt hóa tiểu cầu. Tiểu cầu hoạt hóa sau đó có thể liên kết các yếu tố đơng
máu bởi các thụ thể chuyên biệt. Tiểu cầu liên kết với các yếu tố V và VIII
chống lại sự phân cắt bởi hoạt tính protein C. Trên bề mặt tiểu cầu, XIa liên
kết với thụ thể GPIb và hoạt hóa yếu tố IX. Ngược lại yếu tố Xa dễ dàng bị ức
chế bởi TF. Các hoạt động phối hợp của các yếu tố đông máu trên bề mặt tiểu
cầu mang đến một sự bùng nổ hình thành thrombin, vì vậy một cục máu đơng
ổn định fibrin được hình thành. Ngồi ra tiểu cầu còn cung cấp khoảng 20%
yếu tố V và các yếu tố đông máu khác như fibrinogen, yếu tố IX, XIII [9].
1.2. Sinh lý q trình đơng máu huyết tương
Đơng máu là q trình chuyển máu ở thể lỏng sang thể đặc, mà thực
chất là chuyển fibrinogen ở dạng hịa tan trong huyết tương thành fibrin ở
dạng khơng hịa tan dưới xúc tác của thrombin [7].
Trong cơ thể luôn có sự cân bằng sinh lý giữa hai hệ thống: làm đơng
máu và chống lại q trình đơng máu. Một hệ thống mang tính bảo vệ cơ thể
tránh chảy máu, một hệ thống đóng vai trị gìn giữ lưu thơng lịng mạch để
ln bảo đảm tuần hồn duy trì sự sống. Mất cân bằng hai hệ thống này sẽ
dẫn đến hậu quả tắc mạch hoặc chảy máu [8]. Thông thường, q trình đơng
máu nằm dưới sự kiểm sốt của một số chất ức chế nhằm hạn chế sự hình


8


thành cục máu đơng, do đó tránh được sự lan truyền huyết khối. Sự cân bằng
mong manh này bị gián đoạn bất cứ khi nào hoạt động đông máu của các yếu
tố đông máu được tăng lên, hoặc hoạt động của các chất ức chế tự nhiên bị
giảm [48].
1.2.1. Các yếu tố tham gia đông máu huyết tương
Phần lớn các yếu tố đông máu là tiền chất của các enzym phân giải
protein được gọi là các zymogen ở dạng không hoạt động. Sự kích hoạt của
mỗi zymogen được mơ tả bằng cách thêm chữ cái “a” vào chữ số La Mã xác
định zymogen cụ thể đó. Hầu hết các yếu tố đông máu và chống đông máu
đều do gan sản xuất, ngoại trừ yếu tố III, IV và VIII. Các protein này trải qua
một quá trình sửa đổi sau dịch mã để cho phép chúng liên kết với canxi và các
cation hóa trị hai khác và tham gia vào quá trình đơng máu. Thiếu vitamin K
hoặc sử dụng thuốc đối kháng vitamin K (warfarin) dẫn đến chống đông máu
[42,52].
Danh pháp của các protein tham gia vào q trình đơng máu khá phức
tạp và được Ủy ban danh pháp quốc tế (1954) đặt tên cho các yếu tố đó bằng
các chữ số La mã. Tuy nhiên về sau đã có sự thay đổi: một số yếu tố đã bị bỏ
đi (như các yếu tố III, IV, VI) vì khơng tương ứng với một protein riêng biệt
nào. Bên cạnh đó, một số yếu tố đơng máu được phát hiện gần đây (ví dụ như
prekallikrein, HMWK) không được chỉ định bằng số La mã (Bảng 1.1). Yếu
tố V và VIII còn được gọi là yếu tố khơng bền vì hoạt tính đơng máu của
chúng không bền trong máu lưu trữ [8,52].
Bảng 1.1. Các yếu tố tham gia đông máu huyết tương [8,13,52]

Yếu tố đông máu


I (fibrinogen)

Nồng độ
trong
huyết
tương
(mg/dL)
150 – 400

Chức
năng

Cơ chất

9

Nửa đời
sống

90 giờ

Nơi sản
xuất

Tế bào gan
Mẫu tiểu cầu


10,0 – 15,0


Zymogen 60 giờ

Tế bào gan

0,5 – 1,0

Tế bào gan

V (proaccelerin)

Đồng
yếu tố

VII (proconvertin)

1,0

Zymogen 4 – 6 giờ

Tế bào gan

VIII (yếu tố chống
< 0,01
hemophilia A)

Đồng
yếu tố

12 giờ


Tế bào gan

IX (yếu tố chống
0,01
hemophilia B)

Zymogen 24 giờ

Tế bào gan

X (yếu tố Stuart)

Zymogen 24 giờ

Tế bào gan

XI (yếu tố Rosenthal) 1,2

Zymogen 40 giờ

Tế bào gan

XII (hageman)

Zymogen 48 – 52 giờ Tế bào gan

II (prothrombin)

0,75


0,4

12 – 36 giờ

Mẫu tiểu cầu

XIII (yếu tố ổn định
2,5
sợi huyết)

Zymogen 3 – 5 ngày

Prekallikrein (yếu tố
0,3
fletcher)

Zymogen 48 – 52 giờ Tế bào gan

HMWK (yếu
fitzgerald)

Đồng
yếu tố

tố

2,5

6,5 ngày


Tế bào gan

Tế bào gan

1.2.2. Các nhóm yếu tố tham gia đơng máu huyết tương
Các yếu tố tham gia đơng máu huyết tương có thể được phân thành ba
nhóm như sau [52]:
- Nhóm yếu tố tham gia vào giai đoạn đầu (giai đoạn tiếp xúc) được gọi
chung là các yếu tố tiếp xúc. Đó là yếu tố XI, XII, prekallikrein và HMWK.
Các yếu tố thuộc nhóm này có đặc tính khơng phụ thuộc vitamin K khi tổng
hợp, khơng phụ thuộc Ca++ trong q trình hoạt hóa, ổn định tốt trong huyết
tương lưu trữ và là những yếu tố bền vững. Các yếu tố này hầu như khơng có
vai trị gì trong q trình cầm máu in vitro; tuy nhiên chúng lại có vai trị rất
quan trọng trong việc khởi đầu cho q trình đơng máu theo con đường nội

10


sinh. Ngồi ra, chúng cũng có vai trị quan trọng trong việc hoạt hóa hệ thống
tiêu fibrin [8,52,13].
- Nhóm prothrombin gồm các yếu tố II, VII, IX, và X. Đây là các yếu
tố phụ thuộc vitamin K khi tổng hợp, cần có Ca++ trong q trình hoạt hóa.
Ngoại trừ yếu tố II, các yếu tố kia không bị tiêu thụ trong q trình đơng máu
(có mặt trong huyết thanh) và ổn định trong huyết tương lưu trữ [3,31]. Cả
bốn yếu tố này đều là zymogen (tiền men) của các serin protease (men hoạt
động). Chúng khơng có hoạt tính enzym ở trạng thái cơ bản, nhưng có thể bị
biến đổi thành serin protease bằng sự phân cắt có lựa chọn một hoặc hai dây
nối peptid [8].
- Nhóm fibrinogen gồm các yếu tố I, V, VIII và XIII. Thrombin có tác
dụng qua lại với tất cả các yếu tố này. Các yếu tố trong nhóm fibrinogen bị

tiêu thụ trong q trình đơng máu. Riêng yếu tố V và yếu tố VIII còn bị mất
hoạt tính trong huyết tương lưu trữ [3,13].
1.2.3. Giai đoạn đơng máu huyết tương
Q trình đơng máu huyết tương có thể chia thành ba thời kỳ [3]:
- Hình thành thromboplastin hoạt hóa (phức hợp prothrombinase) bằng
hai con đường nội sinh và ngoại sinh.
- Hình thành thrombin.
- Hình thành fibrin.

11


Hình 1.4. Sơ đồ q trình đơng máu huyết tương [8]
Hình thành thromboplastin hoạt hố
Theo đường nội sinh:
Đây là con đường có sự tham gia của đa số các yếu tố đông máu và
theo quy luật diễn tiến mở rộng, do vậy mà rất cơ bản và bền vững. Năm
protein (yếu tố XII, prekallikrein, yếu tố XI, HMWK, kallikrein trọng lượng
phân tử cao và chất ức chế CI) là những yếu tố quyết định chính q trình
hoạt hố và ức chế giai đoạn tiếp xúc đông máu.
Khi thành mạch bị tổn thương, các sợi collagen được bộc lộ. Bề mặt
các sợi cơ này mang điện tích âm sẽ gắn và cố định các yếu tố XII,
prekallikrein, HMWK, yếu tố XI vào. Ngay sau khi gắn, các yếu tố này được
hoạt hố để tạo yếu tố XIIa, tiếp đó là sự tác động của XIIa để chuyển XI 
XIa, nhờ có XIa mà yếu tố IX  IXa. Yếu tố X được hoạt hóa với sự tham
gia của một phức hợp bao gồm yếu tố XIa, đồng yếu tố VIIIa, ion Ca++ và
phospholipid của tiểu cầu. Giai đoạn này cịn có sự hiệp lực của con đường
đông máu ngoại sinh. Yếu tố IXa không chỉ giới hạn tác dụng enzym lên yếu
12



tố X mà cịn có khả năng hoạt hóa yếu tố VII tạo nên mối liên hệ giữa đường
đông máu nội và ngoại sinh [1,3,8,].
Theo đường ngoại sinh:
Yếu tố tổ chức (các lipoprotein từ tổ chức bị tổn thương) hoạt hoá yếu
tố VII. Yếu tố này cùng với ion Ca++ trực tiếp hoạt hoá yếu tố X.
Tổ chức tổn thương, các chất hoạt hố của tổ chức hoạt hố đơng máu
đi đến hình thành fibrin sẽ thúc đẩy nhanh con đường nội sinh bằng sự hoạt
hoá đồng yếu tố VIII và V [3].
Hình thành thrombin
Thromboplastin hoạt hố (phức hợp prothrombinase) nội sinh và ngoại
sinh tác động chuyển prothrombin thành thrombin.
Thrombin đóng vai trị quan trọng trong các phản ứng của q trình
đơng máu. Tác động men của nó ảnh hưởng đến nhiều cơ chất và can thiệp
vào nhiều khâu của q trình đơng máu với mục đích chủ yếu là tạo thành
fibrin. Nó chuyển fibrinogen thành fibrin, hoạt hố yếu tố XIII để ổn định sợi
huyết. Nó cũng tự làm tăng tốc độ hình thành của bản thân, hoạt hố yếu tố
VIII và yếu tố V nhằm làm gia tăng sự hình thành yếu tố Xa bằng cả hai con
đường nội sinh và ngoại sinh. Hơn nữa, thrombin tác động lên tế bào bằng
cách cố định lên tế bào và hoạt hóa chúng như hoạt hóa tiểu cầu. Thrombin
kích thích tế bào nội mạc sản xuất ra prostacyclin ức chế chất hoạt hóa
plasminogen do nội mạch sản xuất và tăng sự phát triển tế bào do nội tiết tố
sinh trưởng đặc hiệu. Nó cũng cố định lên tế bào sợi non (fibroblast) và kích
thích chúng tăng sinh [3,8].

13


Hình 1.5. Vai trị của thrombin trong q trình đơng - cầm máu [8]
Hình thành fibrin

Thrombin tác động thủy phân fibrinogen thành fibrinopeptid A và B.
Như vậy, fibrinogen được chuyển thành fibrin monomer. Với sự thay đổi về
điện tích, xuất hiện các lực hút tĩnh điện fibrin monomer thành fibrin
polymer.
Yếu tố XIII được hoạt hóa bởi thrombin và có ion Ca++ đã làm ổn định
fibrin polymer nhờ các liên kết đồng hóa trị giữa các sợi fibrin. Fibrin được
ổn định có đặc tính cầm máu nghĩa là có khả năng bịt vết thương ở thành
mạch làm ngưng chảy máu. Cục sợi huyết là những khối gel hóa được tạo
thành bởi lưới fibrin có đường kính khoảng 1 micromet. Mạng lưới này bao
bọc hồng cầu, bạch cầu và nhất là tiểu cầu. Một protein tiểu cầu là actomyosin
sẽ tác động làm cục máu co lại [3,8].
1.3. Tổng quan về Gừng đen
1.3.1. Đặc điểm thực vật
Gừng đen, còn gọi là Ngải đen, Sâm Thái, Địa liền đen. Tên khoa học:
Kaempferia parviflora Wall. ex Baker, thuộc họ Gừng – Zingiberaceae
[10,59].

14


Gừng đen là một loại cây thân thảo lâu năm, có thể cao tới 20 cm. Thân
rễ nhỏ và có màu tím đậm. Lá dài 8 – 16 cm, rộng 9 – 13 cm, mỏng, đỉnh
nhọn, tròn ở gốc và có màu xanh trơn. Cuống lá ngắn và có rãnh. Hoa dạng
cụm, dài 5,1 – 5,4 cm. Mỗi cây ra khoảng 8 bông hoa và mỗi ngày chỉ ra một
bông hoa; thời gian ra hoa từ tháng 4 đến tháng 9. Các lá bắc dài 2,5 cm, hình
mác, màu xanh lục. Đài hoa màu trắng, dài hơn lá bắc. Ống tràng hoa 3 cm;
các đoạn có màu xanh lục, dài 1 cm, phía trên tăng dần và khá lõm. Nhị hai
bên, thẳng, màu trắng. Môi dưới màu trắng với màu tím ở phần cuối, hình
trứng, dài 0,75 – 1,0 cm. Bao phấn khơng cuống, có mào. Vịi nhụy dài 4,2
cm. Bầu nỗn trịn, tam bội, hình elip [29,46].


Hình 1.6. Gừng đen (Kaempferia parviflora Wall. ex Baker) [17]
15


1.3.2. Thực trạng và phân bố
Gừng đen phân bố chủ yếu ở các nước Đông Nam Á, gồm Thái Lan,
Việt Nam, Malaysia, Lào, Myanmar và một số nước khác như Ấn Độ, Trung
Quốc. Ở Việt Nam, lồi này được tìm thấy nhiều ở các tỉnh An Giang,
Đăklăk, Gia Lai, Thanh Hóa, Nghệ An, Hưng Yên và Lai Châu. Hiện nay, trữ
lượng Gừng đen trong tự nhiên ở Việt Nam là khơng nhiều. Trong khi đó,
nguồn dược liệu này ngày càng trở nên cạn kiệt do khai thác quá mức. Vì vậy,
ngày càng có nhiều nghiên cứu trong nước cũng như quốc tế với mục tiêu xây
dựng quy trình nhân giống Gừng đen nhằm chủ động cung cấp nguồn dược
liệu thay thế nguồn dược liệu sẵn có. [10,11,46].
1.3.3. Thành phần hóa học
Thành phần hóa học chủ yếu trong Gừng đen bao gồm các nhóm chất
chính như flavonoid, glycosid, steroid. Trong đó, chủ yếu là nhóm flavonoid
với thành phần chính là dẫn xuất 7-methoxy [4,60].
Flavonoid
Bằng phương pháp sắc ký khí, 11 flavonoid đã được phân lập; trong đó,
5,7,4′-trimethoxyflavone và 5,7-dimethoxyflavone là những thành phần chủ
yếu [46]. Tuy nhiên, vào năm 2014, khi sử dụng phương pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao (HPLC) để phân tích các methoxyflavone trong dịch chiết
ethanol của Gừng đen, Tuntiyasawasdikul S. và cộng sự đã chỉ ra ba thành
phần chính là 5,7,4′-trimethoxyflavone, 5,7-dimethoxyflavone và 3,5,7,3′,4′pentamethoxyflavone [61].
Glycosid
Glycosid là một trong những thành phần chính trong Gừng đen. Năm
2008, Toshiaki Azuma và cộng sự đã phân lập được ba glycosid đầu tiên từ
phân đoạn dịch chiết nước của thân rễ cây Gừng đen, bao gồm: rel(5aS,10bS)5a,10b-dihydro-1,3,5a,9-tetrahydroxy-8-methoxy-6Hbenz[b]indeno[1,2-d]furan-6-one 5a-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-β-Dglucopyranoside],

rel-5aS,10bR
isomer,
và
(2R,3S,4S)-3-O-[α-Lrhamnopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl]-3’-O-methyl-ent-epicatechin-

16


(2α→O→3,4α→4)-(5aS,10bS)-5a,10b-dihydro-1,3,5a,9-tetrahydroxy-8methoxy-6H benz[b]indeno [1,2-d]furan-6-one 5a-O-[α-L-rhamnopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranoside [36]. Gần đây, hai hợp chất glycoside mới được
phân lập từ thân rễ của Gừng đen là Kaempferiaoside A và Kaempferiaoside
B [53].
Steroid
Steroid và các dẫn chất của chúng cũng được tìm thấy trong phần thân
rễ Gừng đen. Hai hợp chất steroid chính đã được phân lập từ dịch chiết
methanol có khả năng chống oxy hóa và chống loãng xương yếu, gồm: βsitosterol và daucosterol [2,47].
Các thành phần khác
Ngồi các thành phần chính trên, Gừng đen cũng bao gồm một số thành
phần khác như: 2-methoxyanthraquinon, 2-hydroxy-9,10-anthraquinon,
tilianine, (2R,3R)-(–)-Aromadendrin trimethyl ether, syringetin 3-Orutinoside, tamarixetin 3-O-rutinoside [47,32].
1.3.4. Công dụng và tác dụng dược lý
Công dụng
Từ xa xưa, Gừng đen đã được sử dụng cho mục đích y học ở Thái Lan.
Trong y học cổ truyền, nó thường được sử dụng để tăng cường sức khỏe, chữa
rối loạn tiêu hóa và chống viêm [47]. Gừng đen cũng được sử dụng như một
chất kích thích tình dục để kích thích hoạt động tình dục ở nam giới. Trong
dân gian, nó đã được sử dụng để cải thiện sức khỏe và điều trị các bệnh
chuyển hóa. Gừng đen có thể được sử dụng bằng cách ăn trực tiếp cả thân rễ
tươi hoặc khô trước khi thực hiện các hoạt động thể chất để nâng cao năng lực
làm việc [43,66].
Tác dụng dược lý

- Tác dụng kháng khuẩn:
Hai flavonoid (gồm: 5,7,4'-trimethoxyflavone và 5,7,3',4'tetramethoxyflavone) phân lập từ thân rễ Gừng đen thể hiện hoạt tính kháng
khuẩn đối với Plasmodium falciparum; giá trị IC50 tương ứng là 3,70 µg/mL
17