ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
KHOA NÔNG HỌC
Bộ mơn Cơng nghệ Sinh học

Bài giảng Nhập mơn

CƠNG NGHỆ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN 2008


Chương 2
KỸ THUẬT DI TRUYỀN
NỘI DUNG
- Mở đầu
- Khái niệm về ADN tái tổ hợp
- Các enzym chính sử dụng trong công nghệ ADN tái tổ hợp
- Các vector sử dụng trong công nghệ ADN tái tổ hợp
- Các hệ thống tế bào chủ
- Nhân dòng gen
- Kỹ thuật PCR
- Xác định trình tự gen


1. MỞ ĐẦU
CNSH hiện đại khác với CNSH truyền thống ở chỗ
lấy kỹ thuật di truyền (genetic engineering) làm trung tâm
Kỹ thuật di truyền hay công nghệ gen (gene
technology) bao gồm các kỹ thuật thực hiện trên axit
nucleic, nhằm điều chỉnh và biến đổi gen, hoặc tạo ra gen

mới, từ đó tạo ra sản phẩm mới hoặc các cơ thể mới
Để có thể tiến hành được kỹ thuật di truyền hay các
thao tác gen, mọi thực nghiệm đều phải sử dụng ADN tái
tổ hợp. Do đó, cơng nghệ ADN tái tổ hợp (recombinant
DNA technology) là chìa khóa của kỹ thuật di truyền


Năm 1972: CÔNG
NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP ra
đời. Nhà sinh hóa tại Stanford,
Paul Berg, đã nối hai đoạn DNA
đầu bằng cắt từ virus SV 40 và
vi khuẩn E. coli lại với nhau, tạo
ra phân tử DNA tái tổ hợp. Berg
đã được nhận giải Nobel Hóa
học vào năm 1980 cùng với
Walter Gilbert và Fred Sanger.


Năm 1972, tại một hội nghị khoa
học ở Hawaii, Cohen nghe Boyer trình
bày thí nghiệm với EcoE1 của ơng và
kết luận của Boyer rằng các đầu dính
của DNA có thể được nối lại với nhau
hoặc có thể “bị cắt” bằng DNA ligase.
Sau đó, hai ơng đã gặp nhau và thảo
luận về phương pháp kết hợp phân lập
plasmid với cắt nối DNA. Họ đã đưa ra
ý tưởng về việc chèn đoạn DNA mong
muốn vào các plasmid của vi khuẩn để

sau đó có thể sản xuất lượng lớn các
protein đặc biệt – chất cơ bản của công
nghiệp công nghệ sinh học


Năm 1976, NHỮNG BƯỚC ĐỘT PHÁ
CỦA CÔNG NGHỆ SINH HỌC. Nhờ các kỹ thuật
sinh học phân tử, các tế bào được sử dụng như
các nhà máy nhằm sản xuất các hormone và
protein với quy mô công nghiệp. Các sản phẩm
này chính là các “dược phẩm sinh học” có tiềm
năng thương mại rất lớn. Robert Swanson – một
nhà đầu tư táo bạo ở thung lũng Silicon, và Herb
Boyer đã cùng nhau thành lập hãng Genetech,
Inc với mục tiêu tách dòng insulin của người.
Genetech được đưa lên sàn giao dịch vào ngày
14/10/1980, bán ra tới 1 triệu cổ phiếu với mệnh
giá 35 $/cổ phiếu- và thu tới 35 triệu $ chỉ trong
một buổi chiều. Tới cuối phiên giao dịch, cổ
phiếu của Genetech đã lập kỷ lục khi lên giá tới
89$, một kỷ lục cho 1 lần đầu tiên chào bán.


1978 Insulin của người được
các nhà khoa học của Genetech
nhân tách dịng vào E. coli.
Genetech sau đó đã chuyển giao
cơng nghệ sản xuất insulin cho Eli
Lilly. Năm 1982, insulin người, hay
Humulin, trở thành loại thuốc DNA

tái tổ hợp đầu tiên được Cơ quan
Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm
của Hoa Kỳ (FDA) cấp phép


2. Khái niệm về ADN tái tổ hợp
ADN tái tổ hợp (recombinant DNA) là phân tử ADN
được tạo ra từ hai hay nhiều nguồn vật liệu di truyền khác
nhau. Phân tử ADN tái tổ hợp được tạo ra nhờ kỹ thuật ghép
nối các đoạn ADN của các cá thể khác nhau trong cùng một
loài hoặc khác loài


Kỹ thuật ADN tái tổ hợp gồm các bước sau
- Nuôi tế bào chủ để tạo vector chuyển gen và nuôi tế
bào cho để cung cấp ADN
- Phân lập gen: Tách chiết ADN plasmid và ADN tế bào
cho
- Cắt cả hai loại ADN (plasmid và tế bào cho) với cùng
một loại enzym giới hạn
- Trộn hai loại ADN vừa cắt với nhau để chúng bắt cặp
- Bổ sung ligase để tạo ADN tái tổ hợp
- Biến nạp ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ và nhân dòng
- Chọn lọc dòng tế bào chủ mang ADN tái tổ hợp



3. Các enzyme của cơng nghệ ADN tái tổ hợp
Có 5 nhóm enzym chính được sử dụng trong cơng nghệ
ADN tái tổ hợp:

- Nuclease: cắt, phá hủy axit nucleic, bao gồm hai
loại là exonuclease (cắt ngoại bào) và endonuclease (cắt
nội bào)
- Ligase: Nối các phân tử axit nucleic
- Enzym sửa đổi: thêm hoặc bớt các thành phần hóa
học của phân tử axit nucleic
- Topoisomerase: làm biến đổi cấu hình khơng gian
- Reversre – transcriptase: có khả năng xúc tác sao
chép ngược từ ARN thành ADN


3.1. Enzyme cắt hạn chế (RE – Restriction endonuclease)
1962, V. Arber phát hiện “enzym hạn chế” sinh sản của
phage trong tế bào vi khuẩn và gọi là Restriction
endonuclease – RE
1970, H. Smith đã tách được RE từ vi khuẩn
Heamophilus influenza và đặt tên là HinII. Ngay sau đó các
nhà khoa học đã xác nhận rằng đa số các loài vi khuẩn đều
mang loại enzym này để bảo vệ tế bào chống lại sự xâm nhập
của các ADN ngoại lai
RE là enzym có khả năng nhận biết những đoạn
ADNnhất định và cắt ADN ở tại đó hoặc tại điểm kế cận.
RE là một loại nuclease đặc biệt
RE có thể cắt tạo ra đầu bằng hay đầu so le


RE cắt ADN tạo ra các đầu bằng hay đầu so le


Phân loại RE

Loại I. Vị trí cắt cách xa vị trí nhận biết khoảng 1000
– 5000 base
Loại II. Vị trí nhận biết là vị trí cắt
Loại III. Vị trí cắt cách vị trí nhận biết từ 10 – 20 base



3.2. Enzyme nối
Qúa trình nối 2 phân tử ADN với nhau để tạo nên
phân tử ADN tái tổ hợp cần xúc tác bởi enzym nối (ligase)
Ligase xúc tác hình thành liên kết phosphodieste
giữa hai chuỗi ADN

DNA ligase

DNA ligase


Quá trình nối các đoạn ADN lại với nhau nhờ ligase



3. 3. Các enzym khác
- Enzym phiên mã ngược (Reverse transcriptase)
tổng hợp ADN từ ARN
- Các enzyme polymerase xúc tác quá trình sao chép
của axit nucleic (ADN hoặc ARN): ADN polymerase và ARN
polymerase



4. Các vector sử dụng trong công nghệ ADN tái tổ hợp
Vector chuyển gen là phân tử ADN có khả năng tự tái
sinh, tồn tại độc lập trong tế bào và mang được các gen cần
thiết
Vector chuyển gen cần phải có các đặc điểm sau:
- Có điểm khởi đầu sao chép (origin of replication – ori)
để tự sao chép và tồn tại độc lập trong tế bào
- Có trình tự nhận biết của RE
- Có các trình tự promoter xúc tiến q trình phiên mã
- Có các dấu chuẩn chọn lọc để cho phép phát hiện
chúng trong tế bào chủ nhận. Ví dụ các gen kháng kháng
sinh, gen tổng hợp chất màu
- Các đặc điểm khác như: có khả năng tạo nhiều bản
sao, có các trình tự cần thiết cho sự biểu hiện gen


4.1. Các vector plasmid
Plasmid là những phân tử ADN có kích thước nhỏ (2 – 5
kb), dạng vịng, nằm độc lập trong tế bào chất, có khả năng sao
chép độc lập không phụ thuộc vào sự sao chép của ADN nhiễm
sắc thể. Các plasmid dùng làm vector tạo dịng có các đặc điểm
sau: kích thước tương đối nhỏ, mang một hay nhiều gen chỉ thị
chọn lọc
Các plasmid đã được cải tiến qua 3 thế hê
- Thế hệ đầu tiên. Là các plasmid tự nhiên đến nay hầu
như khơng cịn sử dụng nữa.
- Thế hệ thứ hai Là các plasmid đa năng (polycloning
plasmid) có chứa vị trí đa tách dịng (vị trí có các vị trí nhận biết
cho RE)



Plasmids are extrachromosomal self-replicating
DNA molecules


Plasmid thế hệ thứ hai

Plasmid vector pBR 322


Ba loại plasmid được sử dụng rộng rãi:
- Nhóm các plasmid pUC, kích thước khoảng 2600
bp, mang gen Ampr và gen lac Z’, vị trí đa tách dịng xen
giữa gen lac Z’
- Nhóm các plasmid pGEM, kích thước khoảng 3000
bp, mang gen Ampr và gen lac Z, vùng đa nối, promoter cho
các ARN polymerase
- Nhóm các plasmid pBluecript, kích thước khoảng
3000 bp


pUC19