ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
KHOA NÔNG HỌC
Bộ mơn Cơng nghệ Sinh học

Bài giảng Nhập mơn

CƠNG NGHỆ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN 2008


CHƯƠNG 4

CƠNG NGHỆ SINH HỌC ĐỘNG VẬT

NỘI DUNG
1. Ni cấy tế bào động vật
2. Động vật chuyển gen
3. Công nghệ tế bào gốc
4. Nhân bản vơ tính động vật
5. Liệu pháp gen


1. Nuôi cấy tế bào động vật
1.1. Sơ lược lịch sử phát triển
Từ năm 1907, nuôi cấy tế bào động vật in vitro lần đầu
tiên được chứng minh có khả năng thực hiện
1949, J F Enders nuôi mô động vật thành công để nuôi
các chủng virus gây bệnh bại liệt (Poliovirus)
1950, tế bào động vật có vú được ni với số lượng

lớn để nuôi nhiều virus gây bệnh bại liệt dùng để chế tạo
vacxin phịng bệnh bại liệt.
Ni tế bào động vật được ứng dụng vào các lĩnh vực
sau: sản xuất protein, hormon trị liệu, kháng thể đơn dòng, y
học tái sinh


1.2. Những ưu điểm và hạn chế của nuôi cấy tế bào động vật
Ưu điểm:
- Hệ thống tế bào động vật là các nhà máy tế bào thích
hợp cho việc sản xuất các dược chất và các kháng thể dùng
trong phịng bệnh, điều trị và chẩn đốn
- Tế bào động vật là tế bào eukaryote, có q trình biến
đổi sau dịch mã.
- Sản xuất các viral vector dùng trong liệu pháp gen
- Ứng dụng trong y học tái sinh/phục hồi (regenerative
medicine) ví dụ da nhân tạo để chữa bỏng, mơ gan để chữa
viêm gan, ....



Hạn chê:
- Tế bào động vật có kích thước lớn, chuyên hóa cao
và cấu trúc phức tạp hơn tế bào vi sinh vật. Trong q trình
ni tế bào động vật có thể tạo ra các mức độ bội thể khác
nhau và tế bào nuôi không thể kéo dài mãi được, chúng sẽ
chết theo chương trình đã được định sẵn
- Sinh sản chậm. Tế bào động vật có vú cần 15 –
20h để tăng gấp đôi số lượng
- Rất nhạy cảm với các yếu tố của môi trường nuôi

cấy như nhiệt độ, pH, dinh dưỡng
- Hầu hết các tế bào động vật chỉ sinh trưởng khi
được gắn trên bề mặt


1.3. Tế bào động vật
Là tế bào eukaryote, chúng liên kết với nhau để tạo
thành các mô. Mô động vật được chia làm 4 nhóm:
- Biểu mơ (epethelium). Tạo thành lớp bao bọc bên
ngồi và bên trong cơ thể
- Mơ liên kết (connective tissue)
- Mô cơ (muscle)
- Mô thần kinh (nerve)



1.4. Mơi trường ni cấy
1.4.1. Mơi trường tự nhiên
Ví dụ: Cục máu đông, dịch huyết tương, nước ối
bào thai, dịch ối bào thai,...
1.4.2. Môi trường nuôi tổng hợp
Môi trường gồm các thành phần chủ yếu sau: axit
amin, vitamin, hormon, nhân tố sinh trưởng, muối khoáng,
glucose, huyết tương


1.5. Chuẩn bị tế bào để nuôi cấy
Mảnh mô tế bào được tách ra trong điều kiện vơ
trùng, sau đó được xử lý với trypsin để tạo huyền phù tế
bào.

- Loại bỏ trypsin, dịch huyền phù được cho vào bình
ni cấy chun dụng. Gọi là q trình ni sơ cấp (primary
cultures)
- Các tế bào của q trình ni sơ cấp sẽ được tách
ra và dùng làm nguyên liệu khởi đầu cho q trình ni thứ
cấp (secondary cultures)
- Các tế bào được nhân lên qua nhiều lần cấy chuyển
liên tiếp. Các tế bào khơng tăng vơ hạn mà chúng chỉ có khả
năng phân chia nhất định rồi chết (ví dụ tế bào người chỉ
phân chia tối đa 100 lần rồi chết)


Tuy nhiên, có một số dịng tế bào được biến đổi do
đó chúng có khả năng phân chia lâu dài, gọi là các dòng tế
bào liên tục (cell lines)
Do các dịng tế bào này có xu hướng biến đổi liên
tục qua nhiều lần nuôi cấy nên chúng được giữ ở trạng thái
đông lạnh
1.6. Các cách nuôi cấy
Nuôi quy mô nhỏ: Bình ni cấy dung tích 25 – 175
cm3
Ni quy mơ lớn: Dùng các bioreactor



1.7. Ứng dụng của nuôi cấy tế bào động vật
1.7.1. Sản xuất vacxin virus
- Virus là vi sinh vật kí sinh nội bào, đặc hiệu từng loại
tế bào chủ. Do đó muốn nhân với số lượng nhiều để làm
vacxin cần phải ni virus trong các tế bào động vật có vú

- Một số vacxin được sản xuất như vacxin bại liệt, viêm
gan B, quai bị, sởi, dại, lở mồm long móng.
1.7.2. Sản xuất các protein, protein tái tổ hợp
Interferon, kháng thể, hormon trị liệu, chế phẩm miễn
dịch
1.7.3. Trong y học phục hồi
- Cấy ghép tế bào, sản xuất các cơ quan nhân tạo


1.8. Tế bào lai và kháng thể đơn dòng
Kháng thể đơn dòng (Monoclonal antibodies – Mab) là
sản phẩm của là sản phẩm của một dòng tế bào bạch cầu,
bắt nguồn từ một dịng tế bào được kích thích
G. Milistein và C. Koehler đã sử dụng tế bào lai giữa
một dòng tế bào lympho B tạo kháng thể đặc hiệu với tế bào
mylolema (tế bào bạch cầu ung thư) có khả năng sinh sản vô
hạn và tiết ra kháng thể đặc hiệu
Sản xuất Mab gồm hai cơng đoạn chính:
- Gây miễn dịch
- Dung hợp tế bào
Ứng dụng
Chẩn đoán bệnh nhiễm khuẩn, virus, ký sinh trùng
hoặc chẩn đoán sự xâm nhập của kháng nguyên lạ vào cơ
thể


Túm tt quy trỡnh sn xut Mab
Tiêm
kháng nguyên


áp ứng miễn dịch sơ cấp và thứ cấp
Tách và thu tế bào lympho B từ lách

Hợp màng với tế bào myeloma
Tế bào myeloma sống
. ợc trong môi trờng
đ
nhng chết khi có HAT

Tế bào lympho B
sản xuất KT nhng
chết khi nuôi trong Tế bào lai (hybridoma) sinh trởng, phát triển
môi trờng
trong môi trờng HAT và sản xuất kháng thể



2. Động vật chuyển gen
Động vật chuyển gen (transgenic animal) là động vật
có gen chuyển (ngoại lai) trong hệ gen của chúng. Gen ngoại
lai phải được truyền lại cho tất cả các tế bào kể cả tế bào
mầm (gốc)
Các bước chính:
- Phân lập gen mong muốn
- Tạo vật liệu để biến nạp gen, thu nhận phôi
- Biến nạp gen vào phôi động vật
- Nuôi cấy phôi hoặc cấy truyền hợp tử (động vật bậc
cao)
- Đánh giá tính ổn định và sự biểu hiện của gen lạ
- Tạo ra dòng động vật chuyển gen



2.1. Các phương pháp chuyển gen
2.1.1. Phương pháp chuyển nhiễm (transfection)
Dùng hóa chất như calcium phosphate,
Diethyaminoehtyl – dextran (DEAE – dextran) mở các lỗ
trên màng để ADN xâm nhập
DEAE – dextran là polycation kết hợp với DNA (tích
điện âm) dẫn đến q trình nhập bào với màng tế bào (tích
điện âm)


2.1.2. Chuyển gen nhờ liposome
Liposome là các màng lipid bao gói DNA ở bên
trong, sau đó màng liposome sẽ hợp nhất với màng tế bào
chất và đưa ADN vào tế bào chất



2.1.3. Phương pháp dùng xung điện (electroporation)
Dùng dòng điện để mở các lỗ trên màng cho ADN
xâm nhập


2.1.4. Chuyển gen bằng vi tiêm (microinjection)
Dùng thiết bị vi thao tác có gắn kim thủy tinh cực nhỏ
để tiêm ADN ngoại lai vào tế bào phôi ở giai đoạn 2 – 4 tế
bào