•KT

4» HỄ?


LỜI CÁM ƠN

Trước hết. Tỏi xin bây lo lòng tri on sâu sắc tới ThS. Nguyên Thị

Phinrng Thúy

Giang xiên Bộ môn Hoa sinh lâm sáng. Khoa Kỳ thuật Y

học. Trưởng Đụi hục V Há Nội la người thày, người hướng dàn khoa hục. đà

tận tính giúp dờ. động viên tỏi trong st q trình hục tập. trục tiếp hướng
dẫn tời thực hiện nghiên cửu. gop ý vã sứa chừa luận ván.

Tôi xin gưi lời cảm ơn chân thánh tới cac thầy cô. các anh chi nhãn xiên

tại Trung tâm xét nghiệm da khoa Chcmedic dà nhiệt tính hướng đản. giúp
dờ. tao điều kiện dè tơi có được các sổ liệu trong luân vàn này.

Tôi cũng xin gưi lỏi câm ơn tỏi Ban giám hiộu. Phòng Quan lỷ dảo tạo
Dịù học. Bộ mỏn Hoả Sứih lãm sàng. Khoa Kỳ thuật Y học. Tnrừng Dại Học
Y Ha NỘI dà tạo mợi điều kiện thuận l<,ri cho lòi trong suốt quăiẹ thin gian

học ú»p ờ trường.
Cuối cùng, tòi xin cam

thương cua bố mẹ tôi. luôn ung hộ. dộng viên tôi phần đâu đê tói n tâm hực

tập và hồn thành ln vãn.

Dù dà rằt Cố gắng đê thực hiện khóa luận một cách tot nhài, nhưng do là
lần dầu tiên thực hiện nghiên cứu. cùng như tầm hiểu biết, kiến thức con hạn
hcp nên khóa luận cua tơi vàn cơn rất nhiều thiểu sót. Tỏi rất mong nhàn được

nhùng ỷ kiến dóng gỏp quỷ báu cua thầy cơ và các bạn de khóa luận dược
hỗn thiện hơn.

Tịi xin chán thánh cam ơn!

Hà NỘI ngày 31 tháng 5 /tâm 2021

Nguyền Thị Loan

•W.-

<€

4* HỄ?


LỜI CAM ĐOAN

Tỏi lá Nguyền Thị Loan, sinh viên nám cuối chuyên nganh Xét nghiệm
Y học. Tnrờng đại học Y Há Nội. xin cam đoan:

Đây là luận vân do ban thán tỏi trục tiêp thực hiện dưới sự hướng dàn
cua ThS. Nguyễn Thị Phirưng Thúy

Giang viên Bộ mịn Hóa sinh lam

sàng. Khoa Kỳ thuật Y học. Trường Đại học Y Há Nội.
Tôi cam đoan ring nhùng số lieu trong nghiên cứu la cõ thật, do tôi trực
tiếp thực hiện tai Trang tâm xét nghiệm đa khoa Chemcdic. Kổt qua thu thập

dược trong nghiên cứu khơng tràng lặp vởí bất kỳ một tap chi hay công trinh
khoa học nào trước đây.

Các tải Bệu trích đản dà được cỏng nhận.
Tịi xin hoan toài chịu trach Iihiộm trước phap luật về nhùng cam kết này.

Há Nội. ngày 3 ỉ thũ/ig .5 năm 2021
Người viết cam đoan

Nguyền Thị Loan

•W.- .-Tí ca:

<€

4» HỄ?


DANH MỤC TỪ MÉT TẤT

RLCHBS

Rối loạn chuyển hóa bâm sinh

PCR

Polymerase Chain Reaction (Kỹ thuật khuếch đụi gen)

DNA

Deoxynucleic add

FAOD

Fatty acid oxidation disorder

(Rỗi loạn quá trinh oxy hóa add béo)
CPTI

Carnitine palmitoyltransferase I

CPT n

Carnitine palmitoyltransferase n

CACT

Carnitine acylcamitine translocase

RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphisms

dNTP

Deoxynucleotide Triphosphate

ddNTP

Dideoxynucleotide Triphosphate

NST

Nhiễm sắc thê

T.

Teampreture melting (Nhiệt độ nóng chay)

T.

Teampreture annealing (Nhiýl độ gàn mồi)

•W.- .-Tí ca:

<€

4» HỄ?


MỤC LỤC

ĐẬT VÂN ĐẾ______________________________ ____ ________________ 1
CHƯƠNG 1: TÔNG QUAN TẢI LIỆU_____________________________ 3

1.1. Bệnh rịi loạn chun hóa acid beo bám sinh............................................ 3
1.2. Bênh thiếu hụt Carnitine palmitoyltransferase II (CPTII) vã Carnitine
acylcamitine translocase (C ACT)........................................................................ 5
1.2.1.

Nguycn nhãn vả cơ chê gảy bênh.........................................................6

1.22.

Tinh hinh mẳc bệnh.............................................................................. 8

1.23.

Triệu chửng lãm sảng..............................................................

1.2.4.

Các xét nghiệm chân đốn bệnh......................................................... 10

1 ■ .5 •

u 11 Ệ • • ... • ... ... ••

■ •»•■••(•(■««.■•■ • ... (••■■■■■ ■ •

...

1.3. Dột biền gen CPTII trong rối loạn chuyển hỏa acid bẽo bẩm sinh

9

V. 1 1

12

1.3.1.

Vi trí. câu trúc va chức nàng gen CPT II................ ~....................... 12

1.32.

Tần suất và hậu qua đột biến gen CPTII.............................. ............ 13

1.4. Dột biển gen SLC25A20 trong rót loạn chuyên hõa acid beo bẩm sinh.... 14
1.4.1.

Vị tri. cấu trúc vá chức năng gen SLC25A2O................................... 14

1.4.2.

Tần suất và hậu quã đột biển gen SLC25 A20................................... 16

1.5. Một sổ kỳ thuật xâc dinh dột biền gen...................................................... 17
1.5.1.

Kỳ thuật khuếch đại chuỗi gen (Polymerase Chain Reaction PCR).. 17

1.52.

Kỳ thuột RFLP-PCR............................................................................ 19

1.5.3.Kỳ thuột giãi tnnh tụ gen (Sequencing)................................................ 20

CHƯƠNG 2: DƠI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứì.....— 22

2.1. Thời gian và đ|4 diêm nghiên cứu....................................

22

2.2. Dung cu. trang thiết bi vả hóa chat........................................................... 22
2.2.1.Dung cụ va trang thiết bi
2.2 2.Hõa chất, sinh phàm

•W.- .-Tí ca:

<€

4* HỄ?


2.3. Phuong pháp nghiên cứu...........................................

• •••••••••••••••••••••••••••a.23

2.3.1. Thiết kẻ nghiên cửu..............................................

23

2.3.2. S ú nghiờn cu ãããằãããããããããããããằô ããããããããããããằã ãããã*ããã ããããããã<

23

2.4. Ccchi tiờu nghiên cứu.............................................

2.4.1.Thực nghiệm tổi ưu hóa nhiệt độ gẩn mỗi (Ta) trong PCR khuếch dại
genCPT II va SLC25A20 • ••••••• ••••••••••••«••••••••••••••••••••••••••••••••••••• ••••••••••••»••••• -1
2.42.Thực nghiệm tối ưu hóa nồng độ cua mồi ưong PCR khuếch đại gen

CPT II vả SLC25A20....................................................................................... 26

2.4.3. Thực nghiệm tồi tru hóa sả chu kỳ nhiệt ưong PCR khuếch đại gen
CPT n và SLC25A20.............................................. ............................. „.........27
CHƯƠNG 3: KÉT QUÁ NGHIÊN cửu_________________ ____ _____ 28

3.1. Kct qua tối ưu hóa nhiệt độ găn mồi (TJ trong PCR khuếch đại gen CPT

3.2. Kết qua tin ưu hóa nồng độ cua mồi trong PCR khuếch đại gen CPT II vá
SLC25A20 • •••••••••••.•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 29

3.3. Kẻt qua tói tru hóa sỗ chu kỳ nhiệt trong PCR khuếch đại gen CPTII vá
SLC25A2O.............................._............................................................................ 31

3.4. Ket qua PCR khuếch đại gen CPT II vã SLC25A20 tròn một số exon
khác cua hai gen sứ dụng cảc điếu kiện tối ưu dà xâc định............................. 32

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN----------------------------------- ------ -------------------34

4.1. Ket qua tối ưu hỏa nhiệt độ gán mỗi (Ta) và nồng độ mồi trong PCR
khuech dại gcn cPT 11 V a SLC25 A20. •••••■••....

..............

34

4.2. Kct qua tối ưu hoa số chu kỳ nhiệt trong PCR khuếch đại gen CPT II vã

SLC25A20............................. ..................................... „............

KÉT LUẬN.
__________
KII-^ >GH|

•••<

...............36
38
39

TÀI LIỆU THAM KHAO

•W.-

<€

4* HỄ?


DANH MỤC BÂNG

Bang 1.1: Vị tri cảc exon trẽn gen CPT n........................................................ 12
Bang 12: Vị tri các exon trẽngen SLC25A20.................................................. 15

•W.- .-Tí ca:

<€

4» HỄ?


DANH MỤC HÌNH

Hình l .1: Chu trinh Canitine trong quả trinh oxy hóa acid béo....................... 7
Hinh 12: Vị tri gen CPT n trên nhièm sắc the SO 1.......................................... 12

Hình 13: Hộ thống vụn chuyên este hóa add béo qua màng ty the................ 13
Hình 1.4: Vị tri gen SLC25A2O trên nhiễm sắc thê số 3.................................. 15
Hĩnh 1.5: Hình anh minh họa cua kỹ thuật PCR................................................ 18
Hình 1.6: Hĩnh anh minh họa ket qua cua kỹ thuụt RFLP-PCR.......................19
Hình 1.7: Nguyên lý giai trinh tự gen trên may tự dụng................................... 21
Hình 3.1: Diỏn di san phàm PCR khao sá nhiệt độ gủn mồi cho gen CPT u vã
SLC25A20

• •<

• •• •

28

llính 3.2: Điện di san phàm PCR khao sát nồng độ mồi cho gen CPT II vả

30

SLC25A20

Hình 3.3: Điện di sán phàm PCR khao sát chu kỳ nhãn lẽn cua gen CPT II và
SLC25A20

31

Hinh 3.4: Ket qua PCR khuếch đụi 5 exon cua gen SLC25A20 vá 4 exon cua
gen CPT II su dụng quy trinh PCR đà tồi ưu hóa............................ 33

•W.- .-Tí ca:

<€

4» HỄ?


1

l)ẠT VÂN DẺ

Rối loựn hấp thu Carnitine là nhỏm bệnh thiêu hụt các enzyme cua quả
trinh |J oxy hóa acid béo dản tói khơng san xuất được nâng lượng từ nguồn dự

trừ chát béo cua cơ thê [1]. Nguyên nhàn la do dột biến các gen mà hóa cho

cãc enzyme tham gia vào quá trinh chuyên hóa chất béo. trong dờ bệnh thiếu

hụt Carnitine palmitoyltransferase II (CPT n) và bênh thiếu hụt Carnitine
acylcamitine translocase (CACT) lã hai bệnh có dặc diêm làm sàng tương tự

nhau và có liên quan với nhau trong CƯ chề gảy bệnh rối loạn hẩp thu
Carnitine.

Bệnh thiêu hụt CPT n là bệnh lý di truyền lộn nhiêm sầc the thương do

đột biến gen CPT II năm trên nhảnh ngấn nhiêm sắc thê số 1 mà hoa enzyme
CPT II. CPT II lã enzyme gãn mang trong cua ti thê giúp chuyền dụng Acylcamitine thanh Acyl-CoA

tham gia vào quá trinh |ỉ oxy hóa acid béo đè tao

thành nàng lượng dõng thời giai phóng carnitine. Den nay. ba thê lãm sang
cua bênh đà được mo ta bao gôm: dạng sơ sinh gáy tư vong, dang cơ tim nàng

ơ ưc sơ sinh vả dạng cơ (thưởng nhe vả có the biêu hiện từ giai doạn sơ sinh

đến trương thành) [2].
Bệnh tlũều hụt CACT lá bệnh lý di truyền lụn nhiềm sầc the thường do

dột bicn gen SLC25A20 năm trẽn nhanh ngan nhiêm sắc thê SƯ 3. CACT lã
enzym gán màng ưong ty thê. có nhiệm vụ vận chuyên Acyl carnitine từ

ngồi vào trong ty thê đẽ tham gia qua trình |ỉ oxy hóa acid béo đổng thời vận
chuyên một camitinc đi ra khởi ty' the. Bệnh thiêu hụt CACT co hai thê lâm

sàng; thê nặng khơi pliát ư tre sơ sinh vã thê nhẹ hơn. Ca lrai dạng đưực dậc

trưng bởi tnih trang co giật. nơn. hịn mẽ. ha huyct áp, bệnh cơ tim. yếu CƯ. rối
loạn chức nâng gan và suy hơ hầp trong đó bênh nhãn ơ dang nhẹ đáp ứng tốt
với diều trị [3].[4].

•W.- .-Tí ca:

<€

4» HỄ?


2

Đột Wen gen CPT ILSLC25A2O lảm giâm hoặc mất hoụt độ cua enzyme

CPT n/CACT dàn đền khơng chun hóa dược acid bẽo dê tạo nàng lượng.
Hiện nay. hơn 90 đột biến gày thiếu hụt CPT II và khoảng 41 dột biẩi gảy

thiếu hụt CACT đà được xác dinh. Bệnh gày hậu qua nghiêm trọng nếu khơng
được chân đốn, điều tri kịp thói đậc biẽt ờ đói tượng trc sơ sinh.

Chấn đoán bệnh thiếu hụt CPT II' CACT dựa hen triệu chứng iânt sang

kct họp với các xét nghiệm hóa sinh nun ch» là chương trinh sảng lọc ban dầu
chira chân đoán xảc định dược bệnh. Trong nhùng năm gằn dây. xu hướng

nghiên cứu chuyên sảu về cơ chế bệnh sinh ờ mức độ phân tử hứa hẹn làm
tiền dề triên khai chân đoản trước sinh cùng như liệu pháp điều trị gen. đổng

thời giúp xác định và quan lý tổt h«m nhùng người mang gen gảy bộnh Bệnh

nhân được chân đoán xác định bệnh báng cách xãc định đột biên trên các gen

CPT IVSLC25A20 thõng qua các kỹ thuật sinh học phân tư như: Kỹ thuật
khuếch đại chuỗi gen (PCR) hay giai trinh tự gen (Sequencing). Kỳ thuật PCR

giúp xảc đinh clunh xác. đặc hiệu cac đột biến gen gãy thiếu hụt CPT
11'CACT trẽn cac bệnh nhân nghi ngờ mắc bênh. Tuy nhiên nẻu muốn ảp

dung kỳ thuật PCR xâc đinh dột biến gen CPT1I/CACT vào chân đoản bênh
cần phai dam bao sự ổn định cùa kỳ thuật này xi PCR bị anh hương bơi nhiều

yếu tố có the làm giâm hiệu qua cua phán ứng. Chinh vi vậy. chúng tỏi thực
hiện dề tai: “Tối ưu hỏa quy trình ki’ thuật PCR khuếch dạỉ một sá exon
trên gen CPT II và SLC25A20" nhẩm hai mục tiêu:

Ị. Tồi lơ/ hâu nhiột độ gần mồi (Tj vít nồng độ moi trong PCR khuếch iỉại
genCPT II và SLC25A20.

2. Tối ưu hóa sồ chu kỳ nhiệt trong PCR khuếch đụi gen CPT II va
SLC25A20.

•KT


3

CHƯƠNG 1

TỊNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Bỳnh rỗi loạn chun hóa acid bro bà III sink

Rối loạn chuyển hóa bấm sinh (RLCHBS) lã một thuật ngừ do Aclũbal
Garrod dưa ra đê mõ tá bệnh lý di truyền phân tư do những rỗi loạn về cấu

trúc gen dàn tới sự khiếm khuyềt khác nhau Trong quá trinh chuyên hóa như:
thiều cãc enzym. receptor, prctein vận chuyền và các dồng yểu tố (Cofactor).
Cho đen nay. khoáng 1000 loại RLCHBS đà được phảt hiện. cỏ nhiều cách

phân loại các bộnh Rl.CHBS khác nhau nhưng cách phân loại theo hỏa sinh
bệnh học và sinh lý bênh học có ý nghía thực tiền lâm sảng và được sư dung

nhiều hiộn nay [ 1 ].

Theo các COI1 đường chun hóa cư bím. có thê chia RLCHBS thành 4

nhóm: RLCHBS Caibohydrate: La dạng rỗi loạn trong tịng hựp hoặc phân
giãi các Glycoside hay Alcohol trong cơ the. Dạng RLCH này xuẩt hiện khi

trc án mót sỗ loại Carbohydrate; RLCHBS add béo; La bênh thiếu hụt các
enzym tham gia vảo quã trinh 0 oxy hóa acid béo dản đến không sứ dụng
được nguồn năng lượng dư trử từ acid bẽo cua cơ the: RLCHBS protein

gồm: RLCHBS acid hửu cư. acid atnin và chu trinh urc; RLCHBS acid ainin

lã những bệnh lý thiếu hụt các enzym tham gia vào chuyên hóa cãc acid
amin. Bệnh được độc trưng bưi sự tâng các acid amin độc hiệu trong máu vả

nước tiêu.

Acid béo là một nguồn nãng lượng chinh cua cư the. Quá tnirh oxy hóa
acid beo là một con đường quan trụng đê duy tri cán bang nội môi nâng lượng

klu cư thê nhịn ăn. lãng hoai dộng cư bãp. cảng thầng hốc ơm sót. trong dó
80% nàng lượng cho tim. cư xương và gan có thê dược lấy từ chung. Ở trê sơ

sinh acid béo dõng một vai trò quan trọng do đây là dộ tuồi có dự trừ

•W.- .-Tí ca:

<€

4» HỄ?


4

glycogen còn hạn chế và ty lộ trao đổi chất cao, Qúa trinh oxy hóa acid béo

tạo ra acetyl- CoA. cung câp nảng lượng cho các mõ khac khi nguôn dự trử
glycogen cạn kiệt. Các acid béo trung binh vá ngẩn dược vận chuyên trực tiếp

vao tế bao va ti thè. Cac acid béo chuồi dãi sè liên hợp VÓI Carnitine đê vận
chuyên qua mảng ty thê vả được giãi phóng dưới dạng Acyl- CoA được sứ

dụng trong con đường p-oxy hóa acid bẽo [5].

Rối loạn qụả ưinh oxy hóa acid béo (FAOD) có thê xay ra ờ bất ký bước
não cưa con đường 0-oxy hóa acid béo ty thê. ánh hường đen các chức nàng
cua màng nguyên sinh chầt. sự vện chuyền acid béo vào trong ty thê hoậc con

dường p-oxy hóa acid béo chuỗi ngăn, trung binh hoặc dài. Dựa trên nguyên

nhàn gày bệnh có thê phân loọi bệnli như sau:

- Rối loụn tại mãng nguyên sinh chát: Do thiếu hụt Carnitine hoặc do
khiếm khuyết liên kểt/ vận chuyên với acid béo chuồi dải.

- Rối loạn vận chuyến acid béo qua mảng ty the do:
+ Thiếu hụt CPT (Carnitine palmitoyltransferase)

+ Thiết hụt CACT (Camitine-acylcamirine translocase)
+ Thiều hụt CPTII (Carnitine palmitoyltransferase n)

- Roi loạn quá trinh 0-oxy hóa acid béo:

+ Thiếu VLCAD (Acyl-CoA dehydrogenase chuỗi dài)
+ Thiếu protein ba chức nâng ty thể (MTP)Thjcu hụt 3-Hydroxyacyl-

CoA dehydrogenase chuôi dái (LCHAD)'Thicu hụt 3-Ketoacyl-CcA Thiolase
chuỗi dài (LCKAT).
- Rối loạn quá trình oxy hóa add béo chi trung binh:
- Thiếu hụt MCAD (Acyl-CoA dehydrogenase chuôi trung binh)
’Thiêu htit 3-Hydroxyacyl-CoA dehydrogenase chuôi ttung binh \-a ngân
+ Thiều hụt 3-Ketoacyl-CoA Thiolase chuồi trung binh

•W.- .-Tí ca:

<€

4» HỄ?


5

- Rối loạn quá tnhh 0-cocy hóa acid béo chuồi ngấn: Thiểu hụt SCAD
(Acyl-CoA dehydrogenase chuỗi ngán) [5].

Do bệnh được phàn chia làm nhiều loại, khả phức tạp nên đề tài này tập

trung vào loại rối loạn vận chuyên acid béo qua màng ty thê do thiếu hụt các
enzym Carnitine palmitoyl transferase II (CPT II) vã Carnitine acylcamitine

translocase (CACT).

1.2. Bệnh thiếu hụt Carnitine palmitoyltransferase II (CPTII) và

Carnitine acylcarnitine translocase (CACT)

Bcnh thicu hụt CPT II là bệnh lý di truyền làn nhi cm sic thê thưởng do
đột biến gen CPT II nảm trẽn nhánh ngăn nhiêm sắc thê sổ 1 (lp32.3) mầ hóa

enzyme CPT II. CPT II là enzyme gắn màng trong cùa ti thê giúp chuyển

dạng Acyl-camitine thảnh Acyl-CoA

tham gia vào quá trinh 3 oxy hỏa acid

béo đê tạo thành năng lượng đồng thịi giai phóng carnitine. Đến nay. ba thê
lảm sảng cua bệnh đà đưực mô ta bao gồm: dạng sư sinh gãy từ vong, dụng cư

tim nặng ờ trc sư sinh và dụng cư (thường nhẹ và có thê biểu hiện từ giai đoạn

sơ sinh đền trương thành) [2].
Bệnh thiều hụt CACT la bệnh lý di truyền lặn nhiễm sãc thê thường do

dột bién gen SLC25A20 nằm trẽn nhanh ngăn nhiêm sắc thê sổ 3. CACT là
enzym gan mang trong ty thé. co nhiệm vu vận chuyên Acyl carnitine từ

ngoải vào nong ty' the đê tham gia quá trinh 0 oxy hóa acid bẽo dồng thời vận
chuyển một camitinc đi ra khói ty’ the. Bênh thiếu hụt CACT cõ hai thê làm

sảng: thê nặng khói phát ở trê sư sinh vả thê nhe lum. Ca hai dạng dưực dặc

trưng bởi tinh trạng co giật. nón. hơn mẽ. hạ huyết áp. bênh cư lim, ycu cơ. rồi
loạn chức nâng gan vả suy hơ hấp trưng dó bènh nhản ơ dang nhẹ dáp ứng lốt
VỚI điểu ữị [3],[4].

•W.- .-Tí ca:

<€

4» HỄ?


6

1.2.1. Sguyên nhàn vả cư che gây bệnh

Bệnh rối loạn chuyên hóa acid béo bân sinh do thiêu hụt các enzym

CPT II va CACT đản đến không tạo ra được năng lượng cho cơ thê từ nguồn

acid béo. Nguyên nhàn là do dột bicn gen CPT II nám trẽn nhánh ngắn cua
nhiễm sầc the sổ 1 (lp32.3) va dột bicn gen SLC25A20 nằm trẽn nhanh ngân

nhi cm sẩc thê số 3 (3p21.31) với dặc diêm di I tuyền lặn trẽn nhi cm sic the
thưởng [21,(3].
Khi các te bào cần nâng lượng, các acid héo dược huy dộng tử cãc mõ

mờ dự trừ và vận chuyền trong mần hoán nhờ chú yều giin với Albumin. Sau

khi xám nhập vảo tế bảo bơi protein vận chuyên acid béo (FATP) cỏ mẠt ớ
mảng tế bao. lúc này các acid beo được liên hợp với Coenzyme A dưới sự xúc
tác cua AcylCoA synthetase. Các acid bẽo mụch dãi dưới dụng AcylCoA
được hình thành ở mãng ngồi ty the khơng qua được mãng nong ty' thê đê

vao chầt khuôn (matrix)

nơi chung b| oxy hoa. Chúng phai được hen hợp

với Carnitine de di váo ly thè. Carnitine lá phân tư amin bậc 4 mang chửc

alcol bậc hai được tích lùy bên trong tẻ bào nhớ chát vận chuycn Carnitine lã
OCTN2 có mặt ỡ mãng tề bảo một sổ cơ quan như: tim. cơ và thận. Carnitine

tạo thánh liên kết cstc nàng lượng cao với các acid béo mạch dài nhờ lác dộng
cua enzym Carnitine palmitoyltransferase I (CPT I) nầm ờ mát trong cùa

màng ngoài ty’ thê. Sau dô. Acyl-Camitine được chuyên qua màng trong ty’ thê
váo trong ty thè nhờ Carnitine acylcamitine translocase (CAC1). Trong ty’

thê. gốc Acyl dược chuyên tứ Carnitine den Coenzyme A có ơ trong ty thê
dưới tac dụng cua Carnitine palmitoyltransferase II (CPT II) khu tru ớ mặt
trong cua mang trong ty thè. Carnitine dược giai phỏng sẽ trơ lụi tế bào chất

dè sư dưng trong một chu kỳ khác nhừ enzym vân chuy en CACT. Cảc acid

bẽo được hen hụp trờ lại với Coenzyme A trong chất nền ty thê có thè di vào

•W.-

<€

4» HỄ?


7

quá trinh p-oxy hóa arid bêo vời diều kiện hiểu khi và sự có một cứa ATP ờ
nóng độ thắp Ị6Ị.

ĩĩinh 1.1 ĩ Chu trình Carnitine trong quá trinh oxy hóa acid béo
FATP: Protein vụn chuyên acid bẽo FA: Acid bẽo, CPT-1: Ccrnừme

Palmitoyltransferase-!. CPT-2: Carnitine Pahmtoy!ưansferase-2, CACT:
Carnitine Acyícarnitine Translocase [6],
Gen CPT ỉỉ mà hoa cho enzym CPT II. gen SLC25A20 mà hoa cho
enzym CACT. Ca hai enzym nảy đều iá enzvm gùn mang ưong ty thể và tham

gia vào chu trinh Carnitine trong quá trinh oxy hóa acid béo (FAO) tạo năng

lượng. Neu gen CPT n/SLC25A2O bị độ! biển làm giâm hoác mất chức nâng
enzym CPTIVCACT gãy rối loạn quá trinh oxy hóa acid béo. Khi quá trinh

oxy hóa add béo bi rối loan. chất béo vãn được giai phóng khói mõ mị khi
đỏi và sê tich tụ ớ gan. co xương và tim làm suy giâm chức năng cua các mõ.

cơ quan nãy. Gan khơng thê chun hóa chùng sê dàn đến tình trạng nhiêm

mở và giâm san xuầl thê Cclon. Binh thường, thề Ceton có thè được su dụng
như một nguồn nâng lượng thay thế cho tun. cơ xương và não. giúp tie! kiêm

glucose cho cơ thè. RÓi loan quá trinh oxy lioa and beo lam chất béo khơng

•W.- .-Tí ca:

<€

4» HỄ?


s

the được sư dụng. Glucose được tiêu thụ mà không được tải tạo thõng qua con
đường tân tạo Glucose dàn đen giam nồng độ Glucose trong mâu (hụ đường

huyết). Việc thiếu nguồn cung cấp năng lượng có thè sư dụng được sè làm
suy giam chức nâng nào và mẩt ý thirc. Các acid beo tự do va Acyl-Canutine

chuồi dai co thê lảm thay đôi xung diện cua tề bao cơ tim dẩn đến lời loạn

nhịp tim Trong một sổ bênh nhắt dinh, các sợi co cùng có thê bi phá vờ khi

tâp luyện liên tục dan den myoglobin niêu [6].

Hiện nay, hơn 90 dột biến gảy thiểu hụt CPTII vã khoang 41 đột biển
gáy thiếu hụt CACT đà được xảc định Bệnh gảy hậu quá nghiêm ưọng nếu

không dược chân doán. diều trị kip thin đặc biột ớ đổi lượng tre sơ sinh.

1.22. Tình hình mắc bệnh
Thiếu hụt enzym CPT II lá bệnh hiềm gộp nên đa số các nghiên cứu trẽn

thề giới đều lã báo cáo ca bệnh, loụt bệnh. Theo số liệu cua các bái nghiên
cứu trước đó. dã có khoang 20 gia dính có trường họp mãc bệnh dụng sư sinh

gãy tư vong. Khoang 28 gia dinh co truòng hợp mắc bỳnh dạng cơ tun nặng ỡ
trc sơ sinh. Kê từ mo ta dẩu tiên VC dang cơ cua bộnh nám 1973. đã cỡ hơn

300 trường hợp bệnh được cõng bổ. Tuy nhiên, cùng cô những trường hợp

cảc triệu chứng cua bệnh cỏ the nhọ vã bênh nhản khơng có suy giãm về thê
chất dần dển cỏ thề bo sót các trướng hợp nãy [7].
Thiều hụt enzvm CACT lồ một bệnh rỗi loan bầm sinh hiếm gập vã gảy
tư vong cao. Tý lộ mắc bệnh có biêu hiện làm sáng dà dược bảo cảo lả từ 1:
750.000 dền 2.000.000 ỡ Caucasia và khoang 1: 60.000 ỡ quần thê tre sơ sinh

Hống Kõng. chiêm 33% số bộnh nhãn bị rói loạn quã tnnli o.xi hỏa add bẽo.

Trong suốt 2 thập ky qua. klióng cõ nhiều hon 60 bệnh nhân được mó ta trẽn
tồn thê giới.Tư nãm 2013 den năm 2016. dà co nghiên cứu tiến hanh sáng

luc 153.789 trc sơ sinh ờ tinh Hồ Nam. Trung Quốc và chi xác dinh dược 2
trường hợp nức bệnh nảy [3J.

•W.-

<€

4* HỄ?


9

1.2J. Triện dtirnglánt sàng
Bộĩih nhàn nglú ngờ thiêu hụt CPT II khi có nhùng dặc diêm làm sáng
(theo ti) sau đày:

•

Dạng sơ sinh gáy chết người: Xuất hiện trong vong vai ngày sau khi

sinh, dậc trưng bưi:
+ Các đựt suy gan với hạ đường huyết vã hạ Kall mâu
+ Bệnh cơ tim
+ Rổi loạn nhịp tim
+ Co giật vả hỏn mê sau khi nhịn ân hoặc nhiễm trùng

+ Bất thường trên khuôn mật hoik dị dạng cấu tnic (vi dụ: loạn san thận dạng

nang, anh hương sự dán truyền xung thân kinh hoẠc tơi lo;in chức nâng nâo).

•

Dạng cơ tim nặng ỡ trê sơ sinh: Xuàt hiện trong năm đàu tiên cũa cuộc

đời. đặc trưng bởi:
+ Suy gan

+ Bệnh cơ tỉm
+ Co giật
+ Hạ dường huyết, hạ Kali mau

+ Bệnh cơ ngoại biên
4- Đau bụng vũ đau đầu.

•

Dạng cơ: Bộnh khơi phát khác nhau ữ tré sư sinh vả người trư
đậc trtmg bởi:
-*• Các cơn đau cư tai phát kèm theo myoglobin niệu sau khi tập thê dục

kéo đái (đặc biệt lã sau khi rtlỉỊn ãn). tiếp xúc với lạnh hoặc căng thảng.
+ Yểu cơ có thê xay ra khi bệnh tân cõng

+ Thường khơng có dâu hiộu cua bệnh cư như. suy nhược. đau cư. táng
nồng độ Creatine kinase [CK] huyct thanh giừa các đợt tấn cong.

•W.- .-Tí ca:

<€

4» HỄ?


10

Bệnh nhân nghi ngừ thiếu CACT có các dặc diem lâm sàng như sau: hạ
đường huyêt. hụ Kali mâu cỏ thê dần den co giạt vã hôn mê. suy hô hấp. loạn

nhíp tim. bệnh cơ tim. bệnh gan. Một sổ trường hợp khơi pliáĩ muộn có kiêu

hình nhẹ hơn nhưng ít phơ biến hơn. Kiêu hình náy biêu hiện dưới dạng các

đẹn hạ dường huyết va hạ Kali máu khi dúi [8|.
1.2.4. Các xét nghiệm chùn đoán bịnh
xét nghiệm sinh hóa:
- Nhiễm toan chun hóa
Nơng độ Creatine kinase trong huyết thanh có thê giâm, bính thường

hoặc tảng cao.
Nước tiêu có thè có màu tiàu vi myoglobin niệu.

- Nồng dợ myoglobin huyết thanh lâng cao trong một số tnròng hợp.
- Ưre máu cõ the lảng
- Ha Calci máu
ơ dạng tre sơ sinh, hạ dường huyết và hạ Kali niệu rỏ rệt.

- Xét nghiệm AST. ALT. LDH. Lactat. Bilirubin toàn phần. Bilirubin
trục tiếp tâng.

- Do hoạt độ enzym CPTn vả CACT: Bính thường hoạt độ cua enzym
CPTII chi chiếm 20% - 40% lơng hoạt dộ CPT [2].

••• Xét nghiệm khác:

Định lượng Acyl -Carnitine từ màu máu thẩm khỏ bâng phương pháp

khơi phô dôi (MS/MS). Phương pháp nãy la tiên bộ cõng nghệ vượt bậc trong

sàng lục rỗi loạn chuyến hóa bẩm sinh (RLCHBS). có kha náng nhận ra khối
lượng (trọng lượng) cua các phân dộc lập và các phan manh cua chung nen có
kha nâng sáng lọc nhicu lới loạn chuyên hóa chi trong một lằn phân tích với

máu bênh phám lá giọt mau thẩm khó. Xet nghiệm cõ sụ táng Dodecanoyl-L-

camitine (C12) và Octadecanoyl-L-carnitine (CIS) acyl-camitìne. dặc biột lả

•W.- .-Tí ca:

<€

4» HỄ?


11

sự tàng Hexadecanoyl-L-camitine (Cl6) vả Octadecenoyl-L-canùTine (C18:1)
gộp trong bệnh thiều hụt CPT II ớ cơ. Nồng độ cao cua Acyl-Camitine gợi ý

chằn đoán bệnh thiếu hụt CACT hoặc CPT II. Do vậy. dè xác đrnh chác chăn

la thiếu hụt loại enzym nao cần phai do hoạt độ cua en/.yni dó hoặc phân tích

đột biển trên các gen bang các kỳ thuật sinh học phàn tư (3J.
Xét nghiệm trao dôi dồng vị phong xạ: Được sư dụng rộng rài dê do hoạt
độ cũa enzvni

•••Xét nghiệm sinh học phân tứ:
Sinh học phân tử là tập họp các kỳ thuật dược sư dụng dé phản tích các
dằu hiệu sinh học trong bộ gen và mà di truyền cua từng cả thè. Do dỏ. sinh

hdặc biệt la bệnh lý di truyền . Một sô kỳ thuật sinh học phân tư hay dược sư

dụng de chân đoản bệnh thiếu hụt cn/ym CPT II và CACT như: kỹ thuật

PCR. kỹ thuật RFLP-PCR vã kỹ thuật giai trinh gen....
1.2.5. Diều trị
Cho den nay chưa có phương pháp diêu tri đặc hiẻu. chi dừng lại ơ điều

tri hò trợ nhẩm giam di chững cho bênh nhản như:
Trụyen Glucose trong các dựt nhiễm trúng dê chóng di hóa.

-

Che độ ãn nhiều Caibohydrat (?0%) và ít chât bẽo (<20%):Giãm

lượng acid beo chuồi dái trong che dộ ãn uổng dồng thời dáp ứng nhu cầu VC

cảc acid bẽo thiết yểu. Cung cấp một lưựng lớn Calo dưới dụng Caibohydrat
dè cung cãp nhiên liêu cho qua trình dường phàn, giam sư dung chai bẽo

trong cơ thê và ngan ngứa ha dưỡng huyết.

-

An thưởng xuyên vả tránh nhịn án kéo dai.
Trárih tạp thê dục kéo dài và các tác nhàn khác như: cám lạnh, gảy mẽ

tồn th«ân. thiêu ngu...

•W.- .-Tí ca:

<€

4» HỄ?


12

-

Cung cap Carnitine de chuyền Acyl-CoA chuồi dãi độc hại tiềm ẩn

thành Acyl-carnitine.
-

Cung cầp một phần ba lượng Calo dưới dạng Triglycerid chi tning

binh có sồ Catbon chần.
-

Cung cấp đu nước trong dịrt tiêu cơ vân và myoglobin niệu de ngân

ngừa suy thân.

-

Tranh dùng cac tlnóc ấd valproic. ibuprofen và diazepam ở liêu cao [7].

1.3. Dột biến gen CPT II trong rói loạn chun hóa arid bẽo bẩm sinh

1.3.1. 1'ịlrí, cấu trúc MÒ Chức nãnggen CPT 11

Gen CPT II nằm trẽn nhánh ngần cua nhiêm sắc thê số ltại vị tri lp32.3,
bắt dầu từ Nucleotide 53.196.824 den Nucleotide 53.214.197 với chiều dài
17.374 bp [9],

ỉk & tk

■W1

U ỉũ z i r

iW ỉu ; H

■Iifiwi

viiiimm mi I

P
cr

Hình 1.2: I "Ị trí gen CPTII trẽn n/tiểnt sue the su 1 Ị9Ị
Gen gồm 5 exon vởi chiêu đai tií 81 đen 1305 bp. mà hỏa cho 658 acid

amin [9], Vj trí các exon được thè hiện frong Bang 1.

Hang 1.1 ĩ ỉ Ị tri các exon trên gm CPTII
Tên exon

Vi tri

Chiếu dải

Exon 1

1-272

273

Exon 2

3896-3976

81

Exon 3

5500-5606

107

Exon4

13192-14496

Exon 5

16441-17374

•KT

4» HỄ?

1305

1294


13

Enzym Carnitine palmitoyltransferase (CPT) tạo điều tóộn thuận lợi cho

việc chuyên các acid béo chuỗi dái tư tề bào chât vảo ty thê trong quá trinh

oxy hóa acid beo. CPT gồm hai dụng: CPTI và CPTII khu tiu ờ trong ty thê.
Enzym CPT I lã một protein xuyên mang nằm ơ màng ngoài cua ty thê vả

enzym CPT II nầm ơ mang trong ty thê được tòng hợp bơi gen CPT II. AcylCamitinc sau khi được vận chuyên từ tế bão chất vào mang trong ty thê sè được
enzym Carnitine palmitoyltransferase II (CPT II) xúc tàc phan ứng ngượ: tựo

thánh Camitine '-à Acyl-CoA. Sau dó, Acyl-CoA được tạo ra sê di vảo con
đường p-oxy hóa acid béo để tạo nâng lượng chơ cư thê (Hinh 3) [10],
Mang ngoải ty thê

Mãng trong ty thi-

carnitine

camitine

acyl-CoA

acyl-CoA

p-Oxiơation

CPTII

CPTI

CoASH
acyt-carmiine

Hình 1.3: Hị thơng vộn chun este hóa acid bẽo qua màng ộ thê
OMM: Màng ngoài ty thế: 1MM: Màng trong ty thể: CPĨ ỉ & 11: Carnitine
palniitoylưansferase ĩ và lĩ: CACT: Carnitine-Acylcarnitine translocase:

CoASH: Coenzyni A tự do [10].

1.32. rần suẳt và hậu qua dột biến gen CPT11

Hơn 75% bệnh nhân dtrợc báo cáo cho đến nay đêu là nam giới. Điều

nay cho thấy bộnh thiều hụt enzym CPT II ở nam giới chiếm ưu the hơn so

với ớ nữ giới. Tuy nhiên, vàn chưa rò liệu ty lự nam chiếm tru the có phai là

•W.- .-Tí ca:

<€

4* HỄ?


14

do sự khác biệt liên quan dền giói tinh trong cảc hoạt động tập thê dục. gen
điều chinh nhicm sắc thê (NST) X hay lá do các yếu tố nội tiết tỗ như

estrogen đường như lá chất điểu hòa gen CPTII [10].
Cho đến nay. hon 90 dột biên gãy bệnh thiểu enzyin CPT II đà được xàc

dinh, phẩn lớn lá dột biến tạo ra sụ thay the acid anãn hoặc mat đoạn nho làm
giâm hoặc mẩt chức năng cnzym CPT II gây nên bệnh thiếu hụt enzym CPT

II. Thiếu enzym CPT II là bệnh di truyền lăn trên NST thường và dược báo
cáo vói ba kiêu hĩnh chinh gom [7]:

• Dạng sơ sinh gây tư vong: Các đột biến gây bệnh nghiêm trọng ờ dạng
đổng hợp tư như p.Pro227Leu. p.Lys414ThrfiTer7 vàp.Lys642Thrf$Teró. Đột

biến ỡ trạng thái dị họp từ gảy bệnh thường ờ thê nhẹ như: c. [ỉ 73 7deicj:

[520G>A].
• Dạng cơ tim nẶng ơ tre sơ sinh: Đột biến dị hợp tư gãy bệnh liên quan

dển các the nhe và nâng d«à dược báo cão như: p.ĩyr!20Cys. p.ArglSỈGỈn,
P-Asp328Gly. p. Arg382Lys. p.Argi03Cys. p. Tyrố28Ser và p.4rgổ31Cys.

• Dạng cơ: Dột biểnp.Serl!3Leu chiếm 60% số alen gáy bênh ờ dạng cơ
cua bênh thiếu hụt enzym CPT II. Trong số 32 trường h
báo cáo cỏ 14 trường hợp bị đột biến đong hợp tư. 17 trường hợp đột biến dị
hợp tư đổi vói loụi dột biển nảy. Ổ Bắc Âu, các đột biến gày bênh
p.Sữl13Leu. p.ProỉOHiỉ vàpLys4ỉ4ThrfsTer7 (hường gặp nhất. Trong khi ớ

Nhụt Ban. dụt biểnp.Phe383Tyr có tỳ lệ mốc cao nhẩt [10Ị.
1.4. Đột bicn gen SLC25A20 trong rối loạn chuyên hỏa add béo bầm sinh

1.4.1. ỉ'ịtri, cáu trúc rò chức nànggen SLC25A20

Gen SLC25A20 nám trài nhánh ngắn cua nhiễm sắc thê số 3 tội vị tri

3021.31, bất đàu từ Nucleotide 48.856.926 den Nucleotide 4S.S98.882 với
chiều dái 41.957 bp [ 11].

•W.- .-Tí ca:

<€

4* HỄ?

15

7 ? *- r n n
**
Ỉ z z zz z 2 ziiSzrijjsiiS

7 * ? 5, n
zi i £ a

ru Ini » ■ ■ fill n I —— m 11 w

♦

Huth 1.4: Vị tri gen SLC2SA20 trèn nhiễm sẳc thểsồ J Ị11Ị
Gen gồm 9 exon vái chiều dãi từ 73 dền 847 bp. mà hóa cho 301 acid

amin. Vị trí các exon dược thê hiện ưong Bang 2.
Bang ỉ.2ĩ 17 rrí các exon trên gen SLC2SA20
Tênexon

Vị tri

Chiều dải

Exon 1

1-193

193

Exon2

6811-6903

93

Exon3

14759-14886

128

Exon4

19435-19525

91

Exon 5

36224-36341

118

Exon6

39256-39328

73

Exon 7

39682-39791

110

Exon 8

40252-40376

125

Exon9

41111-41957

847

Gen SLC25A2O mà hóa tồng hợp enzym Camitine-Acylcamitine
translocase (CACT). CACT lả một trong những enzym vãn chuyên quan

trọng trong quá trinh 0-oxy hóa acid béo ty thê. Nó chú yểu xúc tac sự trao
dôi Acylcamiúne và Carnitine tự do ờ ca hai phía cúa mãng rrong ty thê và
dóng một vai trò quan trọng trong việc vụn chuyên Acylcamitine chuỗi dải
vào trong ty thê (Hình 3) [4Ị.

•W.- .-Tí ca:

<€

4» HỄ?


16

1.4.2. Tần sitảt và hận qua dột biển gen SLCỈSA2Ơ
Tử năm 2016 đen 2017 đà xác dịnli dược 5 trường blip mâc bệnh thiếu
hụt enzym CACT trong khoáng 500.000 tre sơ sinh ỡ Quang Châu. Trung

Quốc vói ty lệ mắc bệnh ước tỉnh ít nhất là 1:100.000. Trường hop mắc bệnh

đâu tiên được mỏ tả váo nám 1992 vả chi cõ 55 trường họp được báo cao trẽn
toàn thế giới trong hai thập ky kê từ dó. Ba trường hợp thiểu hụt CACT đầu
tiên ở người Trung Quốc dược báo cáo ở Hồng Kỏng. Hai trường hợp khác
dược xác định ở 153.789 trê sơ sinh được sàiEt lọc trong thời gian 3 nàm từ

nám 2015 đốn 2017 tại tinh Hổ Nam. Trung Quốc (4 J.

Cho den nay. it nhát 42 dột biến gãy bệnh dă dược xác dinh. Phồ biến
nhất là đột biền ở VỊ ữí nổi C.199-I0TXỈ dổi với các bỹnh nhàn Đông Á (Nhật
Ban. Trưng Quốc vã Việt Nam) và đột biên sai nghía C.713AXĨ đà được phát

hiện ờ bệnh nhân nguồn gốc Trung Dõng. Dột biên C.199-I0TXỈ lá dột biền
điểm phò biển ơ dán sổ Chau à với tân suất 0.4%o. Đến nay. dà có 20 trường

hựp thiếu CACT dược xảc dinh ư Trung Quổc vả tât Ca đều có đột biên c. 19910T>0[4].

Khi gen SLC25A20 bị dột bicn sê lãm giam hoộc mat chức năng cnzym

CACT gảy nén bệnh thiều hụt enzym CaCT. Thiếu hụt CACT lả một bệnh di
truyền lặn hiếm gập trên NST thưởng vả hầu hết các cả thê bị bộnh ơ giai
đoạn sư sinh có kiêu hình nglùẽm trọng dược dặc trưng b*TĨ qưã trinh tiến triền

nhanh chõng và tý lệ tư vong cao. Thicu CACT gảy hụ dường huyết. hạ Kali
máu có thê dần den co giật, hỏn mẽ. suy hõ hấp, loạn nhịp tint bệnh cơ tim.

bệnh gan và gãy tư vong [8].
Bệnh thiếu hụt cnzym CACT dược phản thành 2 kiêu hình: dạng nặng vá
dang nhc. Dạng nặng la kièu h 11111 phơ biên hơn. có hoat tinh enzyni CACT

côn lai <1% mức binh thường. Dang nảy thường xuất lúên ờ thời kì sơ sinh và
dược dậc trưng bơi tinh trang mất bũ chuyền hõa cấp tinh, thường cỏ bicu

•W.- .-Tí ca:

<€

4» HỄ?


17

hiện suy hơ hấp cấp tinh Kiêu hình nhự lum có hoạt tinh enzym CACT cơn
lại khoang 5% mức bính thưởng va bệnh nhãn chu yếu biêu hiện với các dụt
hạ đường liuyèl vã lãng Nalri máu [3 ị.

1.5. Một số kỹ thuật xác dịnli đột biền gen

l.ĩ.l. Kỹ thuật khuếch ílụì chuỗigett (Polymerase Chain Reaction - PCRị

PCR (Polymerase drain Reaction) la một kỳ thuật sinh học phân tứ cho
phép nhân bán một hay một vài đoạn DNA lèn háng tý lần.

Nguyên tẳc cua kỹ thuật PCR: Kỳ thuàt PCR lã một phương pháp tông

hợp DNA dựa trên mạch khuôn lả một trinh tợ DN/\ đích ban dầu, sau dó
dược khuếch dai số lượng thành háng triệu ban sao nhô hoạt động cua enzym

DNA polymerase và một cộp mồi (pnmcr) dộc hiệu cho đoạn DNA này.

Primer lã nhùng đoạn oligonucleotide ngán, có khá nâng bắt cộp bơ sung vói

một mạch cua đoạn DNA khn va nhó hoạt dộng cua DNA polymerase nên
đoạn primer này dược kẻo dài dế iùiúi thanh mạch mới. Kỳ tbuật PCR dưực

hĩnh thành dựa trên đặc tinh nay cua enzynt DNA polymerase, đoạn DNA

nam giũa hai primer sè dược khuếch dại tlìãnh số lượng lớn ban sao đen mửc
cõ thề thầy dược sau khi nhuộm bang Ethidium bromide vã cô the thu nhận
đoạn DNA này cho cảc mục dích khác nhau bảng câc thao lác trẽn gcl. Như

vậy, dè khuếch dại một trinh tự DNA xác dinh cần phái cỏ nhủng tltòng tin tổi

thiêu vè trinh tự cùa DNA, dặc bi ợ là trinh tự base ờ hai dằu đoạn DNA du dè

tụo cảc primer gán dặc hiệu theo nguyên tắc bò sung.
PCR gồm nhiều chu kỳ lộp lyi nỗi tiếp nhau. Mỏi chu kỹ gồm 3 giai
đoụn khác biột nhau vá được điều l»a bơi nhiệt dộ:

Giai do ạ II I (Giai doạn biền tính): Chuỗi xoắnkep DNA khuôn bi biẻn tinh,

tach klioi nil au thành hai chuồi don.
Giai doạn 2 (Giai đoạn gắn mỗi): Nhiột độ dưực ha xuống vê nhiét dộ gần

mồi cho phép các đoạn oligonucleotid gán với sợi DNA khuôn. Trong q

•W.-

Ỉ&AVÍ <€