•KT

4» HỄ?


LỊI CÁM ON

LỜI đầu tiên em xin bày tó lịng biCt ơn (Hì sâu sắc nhất tới ThS. Nguyên Th|
Phương Thủy - Giang viên Bộ mỏn Hoá sinh !ãm sảng - Khoa Kỳ thuật Y học

Trương Đại học Y Hà NỘI dà ln tận tinh dạy dó. hương dẫn. dộng viên em ttong

thơi gian học kip vã nghiên cửu đé hoan thanh khoa luân
Em xin gửi lởi cam irn chân thành tói cãc thầy cơ các anh chị nhãn viên tại

Trung tim xét nghiỹin da khoa Chcmcdic dà nhiệt tinh hương dẫn. giúp đờ. tạo điều
kiên tốt nhât đè em có thê hoan thảnh khoa luân
Em cùng xin gửi lời cam «m tới Ban giâm hiýu. Phơng Qn lý dào tạo F>ại
hục. các thày cô Bộ mon Hoa sinh Lám Sàng. Khoa Kỳ thuật Y học. trường Đại

Học Y Ha NỘI đà tao mọi điều kiện thuộn lợi cho em trong suồt quâng thời gian em
học táp ờ trường
Cuối cùng em xin cam ơn gia dính và bạn bè dà luôn dộng viên, giúp dờ. lả

chở dưa tinh thân vừng chác cho em học tập thật tốt
Dù dà rất cố gang đê thưc hiỳn khóa luận một cách tót nhất, nhung do đây lã

lan đẩu tiên thực hiộn nghiên cưu cùng nhu tám hiéu biết. kiến thức con han họp
nên khóa luận cua em vẫn cơn rất nhiều thiều sót Em ràt mong nhộn dược nhùng ỹ
kiến dóng gỏp quỹ báư cua thây cị vả các ban de khóa ln dược hoán thiện hơn
Em xin chan thành cam ơn!

Ha Nội, ngày 30 tháng 5 nửm 2021

Sinh viên

Trân Thị Thúy Lanh

•W.-

.?TíCa: <€

4» HỄ?


LÒ1 CAM DOAN

Em lã TRẢN IH| THỦY LÀNH, sinh vien tó 32 lóp Y4K. chuyên ngành Cư nhan

Xét nghiộm Y học khóa học 2017
1

2021. trường Dụi học Y Hà Nội xin cam đoan:

Dáy lã khóa luận do bân thản em trực tiếp thực hiện dưới sự hường dân
cũa ThS N guyễn Thi Phương Thúy

2. Nghiên cint nảy không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác dà dược
công bố tai Việt Nam

3. Cac số liệu vã thõng tin trong nghiên cứu là hoán toan chinh xác, trung
thực vá khách quan


Em xin hoan toàn chju trách nhiộrn truởc phap luật vè nhùng cam kết nay
Há .Vội, ngày 30 thủng 5 nảm 2021

Sinh viên

Trân Thị Thúy Lanh

•W.-

Ỉ&AVÍ <€


DANH MỤC TỪVIÉTTẨT

VDƯM

i NICCD

Vang da ử mat
Neonatal mtrahepatic cholestasis caused by citiin deficiency

NST

Nhiêm sic the

CTLN2

Adult onset type 1Ỉ citiullinmia


FTTDCD

Delayed development and dyslipemia caused by citrin deficiency

AGC
P

Citnn

aspartate glutamate carrier

Argininosuccinate
ASS

Argininosuccinate synthetase

PPAR-tt

Peroxisome Proliferator Activated Receptor

AFP

Alpha-fetoprotein

PSTI

Pancreatic secretory ưxpsin inhibitor

MCT


Medium chain triglycerid

SLC25AJ3

Solute carrier family 25 member 13

PCR

Polymerase Chain Reaction

Th

Teampreture melting

T.

Teampieture annealing - Nhiỏt dộ gắn mối

•W.- .-Tí ca:

<€

Nhiệt độ nong cháy

4» HỄ?

alpha


MỤC LỤC

DẬT VẢN Dí

.......................................... 3

CHi rơNG I TƠNG Q UaN TÀI LI CU
1.1. Bệnh K thiêu bụt citrin
1.11

1

....................................................................

................................................................................3

Khái ni ộ™ bộnh lý thiếu hụt citrin

...................................................... 3

1.12. Cơ chề bụnh sinh cùa bệnh lý thiếu hụt citrin ..............................................3

1.13 Dịch tề học......................................................................................................... 9
1.14 Triệu chứng lâm sàng vã cận lãm sàng

1.1.5. Chân đốn...............................

1.1.6. Diều tr|

.......... ...... 10

•••••••


13

..........

1.1.7. Cơ chê di truyền vã tư vân di truyền

Error! Bookmark not defined.

1.2. Die diem gen SLCĨ5.-U3 mỉ hóa tỏng họp protein citrin ...........

15

12.1. Vị tri. Cấu trúc gen SLC2SAJ3....................................................................... 15
1.1.2.

Tẩn xuẩt vã phản bốcũa một $ồ kiểu dụt bicn gen

thương gũp.... 17

19

1.3. Kị thuật PCR trong khuếch đại gen

1.3 1 Nguyên tie cua kỳ thuật PCR....................................................................... 19

1 3 2 Thành phần tham gia phan ứngPCR ....................................... ................... 20

13 3 Các yếu tô anh hương tới hiộusuât cua phan ứng PCR............................. 21
CHƯƠNG 2; DÕI TƯỢNG VÃ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu....................... 24


2.1. Dịa điếm, thời gian nghiên cũu

24

2.2. Trang thict bj, hóa chắt nghiên cứu

24

22.1. Trang thiết b|. vật tư ticu hao.............................
2 2 2 Hỏa chất sinh phẩm......

-......................................24
............................ 24

2.2.3 Chắt liợu nghiên cưu................................... Error! Bookmark not defined.

2.3. Dổi tuụng vã phương pháp nghiên cửu............. ERROR! BOOKMARK NOT

DEFINE D.

2.3 1 Dổi tượng nghiên cửu...................................................................................... 25

2.32 Phương pháp nghiên cưu................................................................................ 25
2 3 3 Sơ dồ nghiên cứu

........................................................................................2 5

•W.-


.?TíCa: <€

4* HỄ?


2.4. Các chi tiêu nghiên cứu........................................................................................... 26
2 4 1 Toi tru hỏa nhiệt dộ gằn mồi (Ta) trong PCR khuếch dại gen SLC2ỈAỈ3 .26
2.4.2 TĨi ưu hóa số chu kỳ nhiêt trong PCR khuẽch đai gen SLC2ỈA13...........27

2.4 3 Tối ưu hoa thời gian kéo dãi chuỗi trong PCR khucch đai gen SLC25A1 328
2.4 4 Tối iru hóa nồng dộ mồi trong PCR khuếch dụi gen SLC23AĨ3.................28

2.4 5 Tối ưu hóa nồng dộ DNA khuôn trong PCR khuêch dại gen SLC25A13...29
2.5. ỈỈUU đúc nghiên cứu.............................

30

CHƯƠNG 3: KẾT QUA NGHIÊN cứt..... .....

31

3 1 Ket qua tối ưu hóa nhiệt độ gan mồi (TJ trong PCR khuếch đại gen$IC2W3...31
3.2 Kct qua tồi ưu hỏa íõ chu ký nhi à uong PCR khuếch đại gen SLC23A13.................32

3 3 Krt qua tơi ưu hóa thịi gian kéo dãi chuồi trong PCR khuéch dại gen SLC25AỈ3

33

3 4 K« qua tui ưu hóa nồng dộ mổi trong PCR khuếch dụi gen SLC25A13


35

3 5 Kổt qua tơi ưu hóa nùng dộ DNA khuỏn trong PCR khuếch dai gen SLC23A13

36

3.6. Kct qua khao sát trên 11 đoạn gen cua gen SLC23AỈ3.....................................38

CHƯƠNG 4: BAN LCẠN...............................

39

4.1 Tồi ưu hóa nhiệt dộ gán mồi (TJ trong per khuceh dại gen SLC23AJ3

39

4.2. Tồi ưu hóa *ồ chu ký nhiá ttong PCR khuếch đai gen SLC23AỈ3 ............................ 39

4 3 Tỏi mi hóa th<»i gian kẽo dá chuôi tiong PCR khuéch dội gen SLC23A13

...

40

4 4 Tối ưu hoa nồngdộmổi trong PCR khuếch dựi gen SLC23A13

41

4 5 Tồi ưu hóa nồng độ DNA khn trong PCR khch dj gen SLC23A13


43

KÉT LƯẶN_______________ ______________________ _______ _______ ___ 44
KI ÉN NGHỊ..................................

45

TÀI LIỆV THAM KHAO

PHỤ LỤC

•W.- .-Tí ca:

<€

4* HỄ?


DANH MỤC BÁNG
Bang 1.1: Các exon cua gen SLC25AỈỉ.................................................................

16

Bang 1.2: 31 đột biển thướng gập trẽn gen SLC25AỈ3......................................

18

Bảng2.1 Các ưang thiết bị - vật tư tiêu hao chính .......................................

24


Bang 2.2: Nhiột dộ nóng chay và nhiệt độ gân mồi Cua 4 càp mồi 1.3,6,9........... 26

•W.- .-Tí ca:

<€

4» HỄ?


DANH MỤC HIXH

Hình 1.1: cầu trúc cua protein citnn.............................................................................. 3
Hĩnh 1.2: Mỏ ta một motif EF cua protein Citrin ....................................................... 4

Hinh 1 3 Phăn img tạo glutamate từ alanine tại bảo tương

...5

Hình 14: Phán ùng tao aspartate từ glutamate t,ũ ty thê .......................................

5

Hình l.S: Vận chuyên malate - aspartate xây ra tại bảo tương và ty thè................... 6
Hinh 1 6: Chu ưinh urẽ trong cơ thê ............................................................................. 7

Hình 1.7: Qua trinh dường phân tạo nâng lượngtụi bảo tương....................................8
Hình 1.8: Cư chế gãy gan nhiễm mở ơ nhùng bệnh nhân thiểu hụt citrin .................9

Hình 19 Kiêu gen cúa bố mẹ vã tỷ lệ bị bệnh ơ the hệ con...................................... 14

Hình 1.10: Vị tri gen SLC25AJ3 trên nhiòn sac thê sõ 7............................................16
Hĩnh 1.11 Vị trí 31 đột biển thương gộp trên gen SLC25AJ3

.........................

18

Hĩnh 1.12: Các giai đoạn của một chu kỳ nhiệt trong PCR ......................................20

Hình 3.1. Khao sát nhiẽt độ gán mối trong PCR khucch đai 1 sổ đoạn trén gen
SLC2ỈAỈ3....................................................................................................................... 31

Hĩnh 3.2 Khao sát nhiệt độ gân mồi trong PCR khuếch i 1 s on trờn gen

SLC2Aè3 ããããããããããããããããããããããããããããããớ* *ããããããããããããããããããããããããôãããããã ãããããããããããããããããããããããããããããããã ãããããããããããããããã 32

Hình 3.3 Khao sát thỏi gian kẽo dãi chuỗi trong PCR khuềch dai 1 so đoạn trên gen

SLC25AỈ3........... ...................

34

Hình 3.4. Khao sát nóng độ mồi trong PCR khuếch dai 1 sơ doan tieu gen SLC23AJ3 .35
Hình 3 5 Kháo sát nống độ DNA khuôn trong PCR khuếch đại 1 số đoạn trẽn gen

............... 36

SLC2Ỉ3.......................

Hình 3.6 Hmh anh điên di san phàm PCR khuccb dai gen SLC23AJ3 vói quy trinh

đà được tơi ưu..............................

•w.-


1

ĐẠT VÁN ĐÈ
Cho tói ngày nay vàng da ử một (VDƯM) ớ trẻ em vàn lả mót trong nhímg

bệnh lý gan mật phức tạp và da dạng Nhờ sụ tiến bơ cua sinh hóa lãm sàng di

truyền vả sinh hoc phán tu, nhiều nguyên nhân vã co chế bệnh sinh dà dẩn đưuc
sáng tỏ. Mờt trong những nguyên nhãn gây VDUM ơ tre em mới đưưc xác d|nh

trong nhừng nám gần dây lã bỳnh VDƯM do thiếu citrin Đày lả bỳnh lý di truyền

lặn trẽn nhiciu $Ác thê (NST) thutag. do đột biến gen SLC23AỈ3 gày ra [ 1 Ị. Gen
này dược xác đinh vào năm 1999 vả lới nay dà có hon 50 kiịu đột biên gen trên

SLC25A13 được cõng bỗ [2] Chức náng cua gen SLC2ÍAỈ3 lã mà hỏa tồng hợp
protein citrin

một chẩt mang quan trụng thuộc hệ protein vận chuy ên qua máng.

Sụ thiều hụt citrin ánh hưung dến quá trinh tòng hợp protein dưimg phan sinh tống

hụp nucleotid vá nhiêu quã trinh chuyên hõa khác trong cơ thê [3]

Trẽn lãm sàng sự thiểu hụt citrin biêu hiýn báng ít nhãt hai kicu hĩnh dựa

vảo dộ ti khơi phát: VDƯM trong gan ơ trc so sinh và tre nho (Neonatal
intrahepatic cholestasis caused by citrin deficiency

type II ớ người lớn (Adult onset type n citruDinmia

NICCD) vã lảng citrullin máu

CTLN'2) Ngồi ra gan dây,

một kiêu hình trung gian mói dã dược dè xuất, dác trưng bui sư chụm phát triên vá
rối loạn lipid máu ở trố, got tắt la FTTDCD (Delayed development and dyslipemia

caused by citrin deficiency). Phẩn lởn cãc trường hợp NICCD sẽ xuất hiện các triệu
chung ngay trung vãi thang dâu đũi như: VDƯN1. gan lach to, rối loan dõng mâu....

vả các triệu chững náy sẻ đ.ìn biến mất khi trẽ tròn I tuổỉ Tuy nhiên một sồ tré sè
tiẽp tuc ticn triên thanh FTTDCD va hoặc CTLN2 vói các trièu chứng liên quan đẽn

thân kinh cõ thê nguy hiõin đến tinh mang nêu không được chân đoán va điêu trị
kịp thời
Sự thiếu hụt citrin lần dầu lien được báo cáo ở Nhật Ban nhưng sau dỏ dà

được cịng nhận lã một bệnh trèn tồn thế giới với tỳ lệ lưu hãnh bệnh cao ở cãc
nước Đông Á. Tần suất người mang gen bệnh trong cãc quần the khùng dung
đều: ơ Nhật Ban 1 65, Trung Quốc: 1 63 và Hãn Ọuổc l 108 [7] Tuy thuộc

•W.- .-Tí ca:

<€


4» HỄ?


2

Dõng Á với ty lệ mang gen bệnh cao nhung mãi đến năm 2008 Việt Nam mới
thực hiện dược các xét nghiệm di truyền xác định đột biển gen gây býnh Theo
mót nghiên cứu tim hiêu nguyên nhãn gây VDƯM tại Bệnh viện Nhi Trung ương

nám 2007. cô lới 51.1% không xác đinh dưvc nguyên nhan gãy bệnh vá trong số
đo ràt cơ thê CƠ các bộnh nhãn thuộc nhõm bệnh thiểu hụt citrin [7]. Tuy nhiên

việc xác dịnh bệnh khơng phái lã diều dề dảng bíri các dâu hiệu lâm sàng và các
xét nghiệm hoa sinh thông thướng thường không dặc hiệu [S]. Chinh vi vậy, cho
tới nay. các kỳ thuật sinh học phàn tư dặc biệt lả PCR vàn là còng cụ hửu hiệu vả

dang tin cậy nhẵt trong việc chân đốn xác đinh đối vói cac bộnh nhãn nghi ngờ
mac thiều hụt citrin (9] Việc xảy dựng được quy trinh PCR khuếch đại dãc hiệu
các đoạn gen má hóa tơng hợp protein citrin sê giúp phát hiện các đột bién gãy
bệnh thiếu hụt citrin dược chinh xảc hơn. Do dó. em tiến hành dề tài “rối tru

hóa quy trinh kỹ thuật PCR khuếch Jựi một sổ exon gen SLC2ỈA13 gãy bệnh

thiếu ciírin" với mục tiêu;
Tồi iru hỏa quy trinh kỳ thuật PCR khuếch đợi một ừ exongen SLC25AI3 gãy bfnh
thiếu citrin.

•KT



Chương I
TONG QI AN TÀI LIỆU
1.1. Bệnh lý thiếu hụt ciirin
1.1.1. Khải niịni bệnh lỷ thiều hụt citrùi

Citnn là protein vận chuyển aspartate

glutamate màng trong ty thê với chức

nàng vận chuyen aspartate tử ty thế ra bào tương đồng thời vận chuyền glutamate từ
bào lương vảo ty the. Ngoài ra. citnn cùng với protein vận chuyen oxoglutarate

malate tham gia vào kcnh vận chuyên malate

aspartate. Việc thiéu hụt citrin dàn

đến thiểu hụt aspartate và tâng glutamate trong bào tuông, mất cân bảng
NADHN AD’ dàn don anh hương tới các quá trinh chuyên hóa như chu trinh urc,
dường phân, tán tụo dường, tông hựp chất béo vả tống hụp DNA/RNA [3]

Bệnh lý thiêu hụt citrin la bênh di truyền lặn. NST thường, do dot bicn gcn
SLC23AỈ3 gãy thiều hụt citrin dẫn lởi rối loạn nhiêu quá trinh chuyên hóa trong

cơ thê [ 1J.
1.1.2. Cư chề bệnh sinh cùa bệnh lý thiểu hụt citrin

i.l.ĩ.l.cấu trúc cua protein atrm
Cẩu trúc cũa protein citrin được mõ ta trong Hình 1.1

Hình 1.1: ciu irúc của protein citrin [5]


•W.-

&AỊK <€

4* HỄ?


4

Citiin là protein dược mỉ hoa bưi gen SLC23AJ3 gốm 675 gốc axidamin vói
trọng lượng phân từ 74 kDa [6] cầu tạo boi hai phân chính

-

Dau N nắm ờ bào tng với 4 F.F motif có thê gắn Ca2*:
Một motif EF có cẩu trúc lien kct: vỏng xoắn I

chuồi xoắn lặp lai

vỏng

xoàn F. Cầu trúc nãy dược mõ phong như vi trí ngon tay cai vá ngon tro cua bân
tay; trong dó các ion Ca2* được gân kết bởi các liên kết ion trong vịng xoắn lặp

(H'tnh 1.2) gáy kích hoạt citrin. Citrin chi cỏ chức nàng khi ủ nhất mội nhánh EF

dược gắn vói Ca2*. Ví vậy. dạng đột biển gảy dung tông hụp protein citrin dẫn lới
mất một phẩn hoặc toàn bộ dầu N VỚI các nhánh EF sỉ khiến citrin khơng dưực kích


hoat và mắt lioụt tính [lỡ].

Hình 1.2: Mõ tã một motif EF cua protein Citrin (10J
- Đầu c nằm ờ màng trong ly thè. có 6 kènh vận chuyền xuyên mảng. Đầu c
quyết định khá nàng vận chuycn cua citrin. Việc vận chuyên aspartate tử ty thê ra

ngoai bão tương đe thum giu các chu bính chun hóa tụi gan chú yếu do cilrin dam

nhiệm. Trong khi aralar (một protein vận chuyên cỏ cầu tạo rãi giồng VÓI citrin)
gánh vác phần vận chuyên này tại các tơ chức o co vả não [1].[5],[11 ],[12].

•W.- .-Tí ca:

<€

4* HỄ?


5

ỉ .1.2.2. Chửi nâng cua protein curin
•ĩ’ Cirrin

aspa-tate

glutamate carrier fAGC) ỉà protein vận chuyền

aspartate từ n thê ra bào tương trưa đô', vởi glutamate.
* Tại bão lương; Amin lu alanine được chuyên sang u-ketoglutarate tạo ra
pyruvate vả glutamate (Hình 13)


COO
ĩ

COO
1
ch2

r*
ch3

+ c = o 4—1
COO

HC—NH 1
1
COO
alanine

ch3

CH2

CH2
1
C=O + HỘ — NH3
1
COO
COO


pyruvate

a-kctoglutaratc

glutamate

Hình 13: Phun ứng rạo glutamate từ alanint' tại bào nrưng

- Tại tv the Glutamate sinh ra ơ báo tương sê được vận chuyên băng AGC vảo
trong ty thê. Tụi dày. glutamate kểt họp Vơi oxaloacetale tụo thánh u-ketoglutarate

vã aspartate (Hình 1.4)

(ikunule

■ t Ktt^lvurnc

(hâkmtưtc

Hình 1.4: Phan ứng tạo aspartate tù glutamate tại ty thê
Aspartate sinh ra vận chuyên từ ty thề ra nội báo b.ing AGC Tại dày.

aspartate dược chuyên hỏa thành

argininosuccinate (A$A) nhờ enzyme

argininosuccinate synthetase (ASS). ASA tham gia vào chu trinh tòng hụp urẽ, tân

tạo đường vã tỏng h^> nhiều chất khác [3]


•W.-

.ZtiW <€

4* Hi:


6

•ĩ’ Tham giứ vào kênh vận chuyên malate aipanate

- Tại bào tương: aspartate sau khi được AGC vận chuyến từ ty thê ra bào tương.
mô< phân $ẽ phan ứng với
Glutamate được chuyên hi vào ty thê nhở AGO oxaloacetate chuyên thanh malate

dong thời NADH chuyên thánh NAD- Malate sinh ra dtrục chuyên vào ty thé nhờ

malate-a-keto glutarate transporter (Hmh 1.5)
• Tai ty thè: malate đuoc chuyên thanh ưxaloacetate dóng thời chuyên NAD*

thánh NADH Oxaloacetate k<ít hụp với glutamate chuyến hóa thánh aspartate vã a-

kêtoglutarate làm nguyên liệu cho phan ứng ơ nội bảo (Hình 1.5)
NADH • H*

a

HAD*
Malxo

f \

Ketog»ul.vatc

Glutamate

CytcrxH

Nĩalite-ti-keto^uluate
nans port đ

Mơtrix

NADH . H’

NAO-

Hknh 1.5: Vận chuyển malate - aspartate tày ra lại háo tương vả ty thê [13]
Có thê tháy. AGC dóng vai trị rất quan trọng trong duy trì ty lệ

NADH N AD’ tại bảo tương và ty thê giúp quá trinh đường phán tan tạo dường hoạt
dong hiýu qua (3J.

J. J.2.3. Anil hướng cùa 'iự thiêu hụt cìtrin
■ĩ* Anh hưởng rớt chu trình urẽ
Chu trinhurẻ đưục mõ ta dâu tiên váo nám 1932 bời Krebs va Henseleit Vai
trỏ chinh cửa chu trinh urè lá chuyên hóa nitơ

một sán phàm thái tir sự trao đổi

protein vã tư khiu phàn ản thanh urẽ. 0 người bính thư»mg uré được bãi tia qua

nước lieu. Khiếm khuyết trong chu trxnh chun hoa ure khiên mtơ khơng dưực

•W.- .-Tí ca:

<€

4» HỄ?


7

chuyên hóa. bt tich tụ lai dưúi dụng ammoniac (NHj)

một chat độc dối với co the

đặc biệt là đói với hộ thần kinh [14]

Trong phan ủng đâu tiên cúa chu trinh urè xày ra trong tế bào chất
aspartate liên kết với citrullin nhở ASS đe hình thành ASA Cãc quá trinh tiếp

tục diễn ra va hmh thanh san phâm cuối cùng lã urê (Hình 1.6). Neu co sự thiếu
hụt ettrin

protein vụn chuyên aspartate từ ty thê ra té bào chàt. lưựng arpartate

không đu đê kẻt hụp với citrullin khiển lượng lớn citrullin bị tích tụ, sự tỏng hợp

ASA cùng sẽ giam. Điều nãy anh hương tói chu trinh ure ớ gan lam gia tảng
nóng dộ NHj trong mâu

Hmh 1.6: Chu trinh urẽ trong cơ thẻ [13]

•> .-Inh hướng tới iịuã trinh đườngphàn
Khi nồng độ aspartate giam 4T bào tương dàn đến giám nồng độ

oxaloacetate. dóng thời khơng chun hóa dưực NADH sang NAD’ gây giam
NAD' và tảng NADll. Chính điều này đà ức chẻ phan ửng chuyên tử
glỵceraldehyde-3-phosphate

thành 1,3-bisphosphoglycerate

ngân quá trinh

đường phân tạo nâng lượng (Htnlỉ 1.7). Dây cùng la nguyên nhân gãy táng

glucose mâu ơcãc bênh nhãn thiêu hut citrm

•W.- .-Tí ca:

<€

4» HỄ?


8

Glucose

ADP*} I
Hexose Kinase
Glucose-6-Phosphate
ị
PhosphoGlucose Isomerase

F ructose-6-Phosphate
AOP*^ ị
PhosphoFructoseKinase
Fructose-1,6-BisPhosphate
ị
AldoLase
I
GLAP «?NAO- . ?p. -V.
2NADH e

I
ị

DHAP
GLAP Hydroqcnase

1,3 B i s Pho sphoGly ce rate
2ADP-X
JAIPe7

PhosphoGlycerate Kinase

Ỉ-P hosphoGlycerate

PhosphoGlycerate Mutase
2-PhosphoGlycerate
ị
Enolase
PhosphoEnolPyruvate
/a'ip p I
Pyruvate Kinase

Pyruvate

Hĩnh 1.7: Quá trình đường phân tạo nàng lượng tại bao tuông
❖

Gáy rỉnh trụng gan nhiễm mở

Gan dóng một vai trơ trung tâm trong việc tich trù vả chuyên hoâ Cua các

chắt. Nguồn náng lượng chinh cho cac hoạt động nay cua gan đến từ qua trinh
đường phân vá 0-oxy hõacãc axit béo [15]

Khi cư thê nh|n dơi lâu ngảy; lipid trong cãc mị mỡ sè dược phản giãi
phóng thích một lưụng lớn axit bẽo tự do váo tuân hoán vả dưa chung dền gan
chúng được chuyên hóa dê tựo ra các thê ceton

nơi

nhiên liệu cho cac mô lõng hợp

nâng lượng cho các hoạt động sồng Vì các enzym chun hóa các axit béo trong
gan đưục kich hoạt bưi thụ thê PPAR-C1 (Peroxisome Proliferator Activated

Receptor

alpha) nen việc ức chế các thụ thê nay ư nhùng bênh nil an thiêu hụt

citrin sê d’in den tinh trụng lích tụ các acid béo trong câc tế báo gan vả hậu quã khớ
tránh khoi la việc gan bi nhièm :nỏ [16Ị.

•W.-

.?TíCa: <€

4» HỄ?


9

Hình 1.8: Cư chẻ gây gan nhivni inữ ớ những bỹnli nhân thiếu hụt cilrin [15]

1.1.3. nịch tỉ hục
1.1.3.ỉ. Tinh hình mác NĨCCD trên thỉ giới

NICCD làn đẩu tiên đuex: mõ ta bưi Ohura và cộng sự vào năm 2001 (17],

Sổ lượng bệnh nhãn NICCD ngây câng gia tàng, dặc biệt ơ các quốc gia Đỏng Á

như Nhật Ban Dải Loan Han Quốc vá Trung Quốc [5] Một số ít bệnh nhan

NICCD dà dược xác định lá con cháu người A RẠp. Pakistan. Caucasian, cho thấy
dãy lá một căn bệnh cơ liên quan tói sắc tộc [6] [ 18]

Tý lệ lưu hanh NICCD quan sát được ứ Nhặt Ban tuông lự như tý lô mang

gen dõng hụp tử lá I 17000 cao lum nhiều so với ty lệ mác cn N2 (I 1 (M).(MN) den
1 230 000). Các nghiên cứu cùng dà chi ra rÁng. cỏ tới h
dược ưởc lính lả dong http tư dối với các biến thê gây bệnh [5]
Vi hau het tre mắc NICCD sẽ khoi bệnh gan sau một tuũi nên nhùng tic nãy

thường b| chân đoán nhầm VỚI viêm gan sơ sinh võ càn dân đen khó xác định chinh
xác tý lõ mắc NTCCD [ 19] Theo một nghiên cứu dưực tiền hành ư Thái Lan trẽn 39
trc dược chán doán màc vicm gan sơ sinh vô cản. người ta dà xãc định dược 5 trc

rnàc NICCD. chiêm ty lè 12 8% [20] tỷ lẽ nay được báo cao tai Hãn Quốc vá

Trung Quốc lần luựt lá 6% (3 47) vã 9.5% (38 400) [21].

•W.-

<€

4* HỄ?


10

ỉ.ỉ.3.2. Tinh hình mắc NỈCCD lụi Vici Num

Tại Việt Nam. VDƯM rầt phô biến trong nhỏm bộnh gan mật tré em Theo
nghiên cứu trên các bệnh nhi được chân đoán mác VDƯM tại Bênh viện Nhi Trung

ương nảm 2007. co lởi 51.1% không xác đinh duực nguyên nhân gày bệnh Ở nước

ngoái, ty lệ nay dược báo cão trong khoang từ 25

45% [7]

Năm 2008. 4 bệnh nhi VDƯM dầu tiên ơViệt Nam dược chan đoán xác dinh
NTCCD nhờ chương trinh họp tãc giữa bệnh viện Nhi đồng 1

Thảnh phố Hồ Chí

Minh VĨI tnrờng dại học Kagoshima Nhật Bàn [22]
Năm 2009. Hồng Lê Phúc và cộng sự dã mó ta 5 trường họp VDƯM do

thiếu citrin (báo cáo tại hội nghi Nhi khoa tồn quốc lãn thứ 30, khơng cịng bồ y

vãn). Nhùng xét nghiệm xác dịnh dột biền cùa 5 trường hợp này dược làm tai khoa
di truyền dai học Kagoshima Nhà’ Ban

Cùng nám 2009 Nguyên Th| Mai Hương vả cộng sự dà tiển hành nghiên cứu
"Sảng lợc 4 đột biên thướng gập trên gen SLC25AĨ3 báng kỳ thuật sinh học phân

tư" tui bộnh viện Nhi Trung ương. Bồn dột biền dưục ticn hành sang lọc tren 60
bỳnh nhân la dột biền Ị m X XIX Ty lệ phát hiện dột biến lá 20.48%. Ty lệ dột
biên I và dot biên III X. XIX trẽn tỏng số alen bi đột biên lần lượt lả 71 67% vá

1,67%. Như vây, đột biến 1 la dột biền phô biên nhầt ư người Việt Nam mắc bênh
thiếu hụt citrin [7].

Nâm 2012. củng tai Viện Nhi Trung ương tác gia Nguyen Phạm Anh Hoa đà

tiến hành nghiên círu day dll VC dặc diêm lâm sàng, cặn lãm sáng vả theo dồi sau
điều tr I bênh thiêu hut citrin ớ tre em [22]
ỉ.1.4. Trifii chứng lâm sing và lận lủm sàng

’** Thiêu hụt cttnn được chia thành hai thê lâm sàng chinh dưa vào dộ tuồi khui
phát:

• Viêm gan ứ mũt trong gan ớ tre sơ sinh vá tre nhơ (NICCD).

•

Tảng citrullin máu type II khơi phát ơ tuồi trương thành (CTLN2)

Ngoài ra gân dãy. một the trung gian mơi đả dược dề cũp tới. đặc trưng bởi
sự chụm phát triẽn và rối loụn lipid mõu ôtre gi tt l FTTDCD

ãW.- .-Tớ ca:

<

4ằ H?


11

Ngoại trú một sỗ trường hop b| rói loạn chút lúng gan nghiêm trong cần
phai ghép gan NICCD sê thuyên giam dàn vá các triệu chimg sê Wen mắt khi tre
đây l tuõi Tuy nhiên, một số trc sỉ tiên triẽn thành FTTDCD va hoặc CTLN2 vói
cãc triệu chửng liên quan den thần kinh có thê nguy hiẽm đến tinh m^mg nêu khơng
đưực chân đồn vú điêu tri kip thoi [4].[5Ị.[6]

•ĩ* I 'iêm gan ừ mật trong gan ứ trê str sinh và tré nhị (NICCD)
*Lám sàng

• Xuắt hiện ớ tre sơ sinh. VDƯM khi tre 1,5

2 thang tuổi

• Khn mặt trịn, ma phình (dầu hiộu chubbing face).
•

Trc tiêu chay kẽo dài phàn cị thê bạc mâu vả có nhiêu hạt mỡ

•

Tú 0

6 tháng tuổi: acid amin tâng cao bao gồm citrullin. threoniạ

methionin. tyrosin phenylalanine, arginin
•

Gan nhiêm mờ thường thấy ơ tre trẽn trẽn 9 thăng ti có thê có xơ gan

•

Cãc bộnh nhi lớn cõ Sơ thích ãn uống dác biệt: thích ản các loại hụt lạc. đậu

do. khơng thich ản dồ ngọt
*Cận ỉánt sàng

•

Tảng bilirubin chu yếu la táng bilirubin trực tiếp, tàng transaminase vã

phosphatase kiềm TýlệAST/ALT thường trẽn 2,5.
•

Bỹnh nhãn thè NỈCCD nâng co hội chímg suy tề báo gan với biêu hi^n rỗi

loạn tòng hợp cãc yếu tổ dỏng máu vả giam tồng hụp albumin
•

Giam dường máu di kém các con họ dương huyẽt khi đói.

•

Ting NHị lactate và AFP (alpha-fetoprotein) màu

•

Một số cỏ tàng acid mật tồn phần, tâng Inglycerid.

•

Đinh lượng acid amin mâu; lâng citrullm. arginin, methíonin tyrosin

•ĩ* Tàng citruUin máu type ỉ! khái phải ở tuổi trưởng thành (CTLNĩị
• Làm sàng
•

Khin phát một cách đột ngột ỡ tuổi I rường thành từ 20

•

Khoang 10% bênh nhãn CTLN'2 tiền triên tới ung thư gan khùng kẽm theo

xơ gan hoặc viêm gan mạn tinh

•W.-

.ZtiW <€

4* HỄ?

50 tuổi


12

• Xuất hiện các triệu chúng thẩn kinh như rối loạn tâm thân, hoang tường, ao
giác, mẽ sang; tập tinhbẩt thường: gảy gỗ, cáu bân, tàng động, hòn mẻ. và có
thớ tu vong do hơn mẽ nâo.

•

Ihich An thực phàm giàu protein và lipid như dậu lạc. trứng, sừa. cà và thịt
khong thích ân (hực phàm giàu caibohvdrat nhu com. nước trái cây và đồ
ngọt.

• C(bì ỉám sàng
•

Tảng citrullin. amoniac mâu. PSTI (Pancreatic secretory trypsin inhibitor).

• Giam ASS. giam ty lê Fischer (ty lẽ Vai - Leu • Ile Tyr - Phe).
1.1.5. Chun iln

1.1.5.1. Cliân đồn xác định
•> Dựa vảo các triệu chững lãm sảng vã cận lãm sảng, đặc biệt la cãc xét
nghiêm về gen:
✓

Hội chửng ứ mật kẻo dài vã suy tế bão gan

✓

Bộ mật trịn, má phình (chubby face).

z Tiêu chay kẽo dãi phân mừ. gan nhiễm mờ.

J Hụ đườnghuyết, tảng NHỉ vã AFP
✓

Táng một só acid amin trong giai doạn sớm (trc 3 tháng tuổi).

•* Xét nghiệm di truyền xác đinh đột bicn gen SLC2ỈAÌ3 la tiéu chn vàng dẽ
chíin đốn xác định bẻnh

1.1.5.2. Chấn ctốnphàn hift

Chần đoản phân biệt NTCCD với cac bệnh lý khác gãy VDƯM la rãt quan
trọng Các xét nghiêm di truyền đổ chân doán xảc định bộnh khá đất tiền và chi có

thê làm được ơ một só bệnh viện lớn. chi nén thục hiện sau khi đà cổ các kềt qua
sinh hoa nghi ngó mÁc NIC CD

•w.- .tf'iCe: <€


B

1.1.6. Điều trị
Thicu hụt citrin ớ tre lã bệnh lý di truyền Vi vậy các phương pháp diều trị

bệnh chu VCU lả diêu tri triệu chưng vã him chế các đựt búng phatcàp tinh CTLN2
❖

Điều trt các triệu chủng bỷnh ư bệnh nhi mắc NICCD

Các triẻu chững ờ hâu hết trê bị NIC CD sê dược dấy lủi sau 12 thảng tuồi khi
tre dược bõ sung các vitamin tan trong dâu (A. D E. K) và các chề phảm sữa cỏ
chuối triglycerid. chuối trung binh (Medium chain triglycerid - MCT). Dồng thời,
trong chế độ ân hãng ngây cùa nên tre hạn che các thức ãn Chita nhiều carbohvdrat

đường lactose. Tuy nhiên, sau khi tre được một tuồi, việc tiếp tục điều tri bang các

công thúc tri bệu náy chua cử các bang chững khoa hục chứng minh có the lãm
giam khâ nâng mác FTTDCD và hốc CTLN2 [23] [24].[25]
Neu có rối loạn dông máu, tre cần dược bô sung các yếu tố đông máu

vitamin K, plasma tươi vá càc yêu tồ dỏng mâu thiêu hụt
ơ nhùng trê có biêu hiện phu nầo. chi su dụng cãc san phàm chứa mannitoL

Việc sir dụng cãc dung dịch cỏ chứa glycerol, fructose hay glucose nông độ cao rat

nguy bicm cho tre do cảc chất nay sè gây lAng NADH trong báo tương, lảm tang ty
so NADH NAD' và làm trâm trọng thêm tình trạng hỏn mẽ gan [26] (27]

•í* Diều trị 0 các bịnh nhàn mắc CTLN2
Đối với các bệnh nhàn đà tiến triển dền CTLN2. phương phãp diều trị có

hiệu qua nhất den nay ván là ghép gan Gần như tất ca những người mac CTLN2

đèu duực chi dinh ghép gan trong quà khữ. Ghép gan có thê giúp cai thiên các triệu
chứng do rối loạn chuyến hõa ke ca các triệu chưng thần kinh dã cớ trước đó

[28].[29].[30] Beu cạnh dờ, việc phông ngừa các đợi lãng huyết ap vã điều tri các
rồi loạn chuyến hóa loại bỏ sớ thích in câc thực phẩm giàu protein sê giúp tinh

trụng bệnh được cái thiện rồ rẻt [31].
Trong tương lai. liêu pháp gen cò thê sê la mõt trong những phương pháp

diều trị hiệu qua cho cãc trưởng hụp CTLN2 hốc N1CCD nẠng

•W.-

<€

4* HỄ?

14

1.1.7. ỉ. Cư ché ill truy ền
Thiểu hut citrin lã bệnh di truyền lộn trẽn NST thưởng Để biểu hiện bệnh

một cả the phái được thừa hướng hai gen SLC2ỈA13 bãt thường, một gen từ bó vã
mút gen tu my Neu chi mang duy nhãt một gen bắt thường la ngưởi mang gen

bệnh Tuy không mấc bnhiêm các chức nâng cua cilnn trong cơ the nhưng nhùng người mang gen bẻnh có

thê truyẽn lụi gen bầt thường này cho con cháu. Khi hai người cung mang một gen

bầt thường, các tnrõng hợp má con hụ sinh ra cỏ the gặp la:
•

25% Ue bi bộnh thiếu hụt citrin vi nhân cả hai gen bãi thường t ừ bó vá mọ.

•

50% tre khơng mác bệnh nhưng lã người mang gen bợih vi nhận một gen bắt
thườngtù bố hoẶc me va một gen binh thường tu người cịn lại

•

25% trê khơng bị bẻnh vả sè không mang gen bệnh vi nhận ca hai gen binh

thường tú bổ và mc-

25% SO CON
BINH THƯƠNG

50% SƠ CON
MANG GEN BENH

25% sọ CON
BI B£NH

Hình 1.9: Kiều gcn của bổ mẹ vã tị lệ hị bệnh ứ thế hệ con
ịhttp://dứntym.CCHf)

•KT


15

ỉ. J.7.2. Tư VUII di truyền

Với tần suất mang gen cao ở các nước Dỏng Á trong đơ có Việt Nam thi
cõng tác tư vằn di truyền có ý nghía vò cùng quan trong vá cân được nhãn rộng

trong cộng đổng như không két hôn cận huyết trưức khi kct hòn nêu một trong hai

người ma biết cỏ mang dột biến ttẽn gen SLC253 thi khơng nèn kểt hỏn vin nhau

Trong trường hựp tinh con dẩu có biêu hiộn hoậc b| bẹnh NICCD thi nẻu sinh con
thú hai cần phai lam xét nghiẻm chân đoán trưức sinh, sàng lọc sau sinh. Ngoai ra,

dê phong ngừa mảc NICCD 0 tre nhùng ba mọ mang thai nên làm xét nghiộm chân

đoan trước trước sinh về đột biến gen SLC2ỈAỈỈ.

Xét nghiệm chùn đoán truửc sinh

Các kỷ thuột di truyền hiện nay có the chân đoán trước sinh cho nhừng
trường hợp nghi ngở mang đõt biên gen SLC25AJ3. cần chân đoán trước sinh cho
nhùng dổi tượng nguy cư cao như thai cua cãc bã mọ mang đột biến SLC25AỈ3
nhừng lằn mang thai sau cứa các bà mẹ có con bị NICCD dẻ hụn chế sụ truyền gen

bênh sang cãc thê hê sau [32]
❖

xẻt nghiệm sàng lọc sau sinh

Đê phát hiên sũm những trường hựp cõ cac rôi loan chuyên hõa băm sinh,

nhiều nước trẽn thế giới ãp dụng chương trinh xẻt nghiệm sang lọc các b^nh rối

loạn chuyên hỏa bõm sinh cho tre em ngay sau sinh. Các tre NICCD cùng có thê
được phat hiên bỹnh Slim nhờ phương pháp nãy. Các tre sư sinh co nồng độ citrullin

máu tảng cao sè được làm các xét nghiên di truyền đê xãc định dột brôn gen
SLC2ỈAI3 nhầm phat hiện sỡm va diều tri kip thoi cho trê [33 ],[34].

1.2. Dặc diẻm gcn SLC2S.il 3 mã hỏa tơng hụp protein cìtrin

12. J. Tị tri, cấu trủcỊỊtn SLC2ỈA13
Gen SLC23AJ3 (Solute carrier family 25 member 13) thuộc họ gen mâ hõa
cho cac protein hoa tan vận chuyên qua mang với hưn 400 protein, phân thánh 66

loại [35].

•W.- .-Tí ca:

<€

4* HỄ?


16

SLC2ỈÀỈ3 nằm trén NST sỗ 7, nhanh dãi. V| trí 21.3 (Hình 1.10) Gen này
có chức phận má hỏa cho sự tống hụp protein citrin, gồm 201 879 base, tử bp 5050
đẽn bp 206 928 vái cấu trúc gồm lSe.xon vá 17 intron 'Bang 1.1) (]]

Exon

Rang 1.1: Cíc cxon cua gcn SLC2ĨAỈỈ
—
Chieu
Vjtri
Exon
Vjtri
dai (bp)

Exon 1

1 - 157

Exon 2

25148

Exon 3

44761

Chieu
dãi(bp)

158

Exon 10

137088

137172

85

25201

54

Exon 11

137664

137822

159

44903

143

Exon 12

150575

150627

53

Exon 4

87182—87297

116

Exon 13

151974- 152052

79

Exon 5

113122-113261

140

Exon 14

175403- 175543

141

Exon 6

128916

129062

147

Exon 15

190218

190356

139

Exon 7
130852 130990
r------------Exon 8
132425 132518
L 1 ■ ■ -.....
Exon 9

132721-132805

139

Exon 16

200102

200260

159

94

Exon 17

200354

200444

91

85

Exon 18

200722 - 201879

•KT

4» HỄ?

1158


17

ỉ. 1.2. Tần xuẩt và phân bồ của một sti kiểu lĩột biến ỊỊCtt SLC25A13 thường ỊỊặp
Kế lù khi trinh tự dầy đu của gen SLC2ỈAỈĨ dược cõng bổ vào nảm 1999.

hơn 50 đột biên đã dược xác đinh, trơng dớ dột biên sờ sỡ 1 (c.851_854del4) lá loại

dột biền phó biền nhát [2]
Một nghiên cứu trẽn dãn sờ Trung Quôc dà chi ra ring dột bicn I chiếm 70%

tông sổ dột biến gen SLC25A13 dược phát hiện < ỉ Nhật Ban vả Hãn Quốc ngoải

đột biến 1 xuất hiện vói tần xuất cao với 20% và 50%, tỷ lệ nung đột bicn II
(C.I0I9I I77dcl) cùng dâ được bão cáo lén tới 45% vá 36%. Dãy lá hai đột biến đà

được phát hiện 0 tất cá các quốc gia châu A [5]
Tại Việt Nam. dột biến I cũng là dõt biến phố biến nhất ớ những bệnh nhãn

mắc thiểu hụt citrin Nguyen Thi Mai Hương vá cộng sự dà báơ cảo tỷ 1ệ mang dột
bicn I lên tới 71 67% trong nghiên cứu cua minh vảo nâm 2009 (7]
Theo một nghiên cứu tiấỉ hanh trẽn 274 bênh nhi niâc thiêu hụt citrin ơ

Trung Quốc, bâng cãc kỳ thuật sinh hục phân tư nguôi ta dâ xác d|nh dưục 42 dột
biền trên gen SLC25A1Ỉ. trong dó 4 dột bicn: c85l_854del4 c1658_1660dup

IVS6 - 5G>A và IVS16ins3kbcõ lãn xu.it mác cao nhất, lẽn tới 84.47% [36]
Tân sô người mang gen dồng hợp lừ được bão cáo lả 1 50 000 ớ Hàn Quóc

và 1 17.000 ơ Trung Quốc. gàn giống tai Nhật Ban la 1 19.000. Điều này cho thầy ở

Đóng à hiỳn dang cỏ rằt nhiêu bỷnh nhàn mầc CTLN2 vả NIC CD Xét tơng dãn sổ
cua Dịng à (khoang 1.5 X lo’ ) thi si cỏ tới hơn 80.000 người cỏ thê mang dồng
hụp tử với đột biển gen SLC2ỈA13 [5].

Cac nghiên cữu sau này còn chi ra rang co Sự khac biệt rất lỏn về kiểu dột
biền và tàn suất mắc giữa các khu vực dịa lý Cụ thé, tần suắi mang gen dột biển d|

hợp tư ớ người Nhật Ban là I 69. cao hơn so với ngươi Hãn Ọuòc 1 112. Ty lộ này
ơ người Trung Quốc lã 1/65. nhung cứ sự khác nhau rất rỏ giũa hai vùng Bấc sõng

Hồng Há (1 940) và Nam sóng Hoảng Hà (1 48) [5] [6]
Cho tới hiỳn nay. cỏ 31 kicu đột biên gen SLC2ỈA13 gãy thiểu hụt citrin

đuục cõng nhận la cõbicu biện bỳnh trẽn lãm sang
•W.- .-Tí ca:

<€

4* HỄ?