Nghiên cứu cố định kháng thể kháng kháng nguyên PSA lên hạt nano sắt từ nhằm chẩn đoán ung thư tuyến tiền liệt
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.73 MB, 28 trang )
TRƯỜNG ĐẠI BÁCH KHOA ĐÀ NẴNG
KHOA HĨA
NGÀNH CƠNG NGHỆ SINH HỌC
−−−−−−
ĐỒ ÁN ĐỀ
TỐT
TÀI NGHIỆP
Nghiên cứu cố định kháng thể
kháng kháng nguyên PSA lên
hạt nano sắt từ nhằm chẩn đoán
ung thư tuyến tiền liệt
SVTH: Nguyễn Nữ Zen Na
GVHD: TS. Lê Lý Thùy Trâm
Ngành: Công nghệ Sinh học
ĐẶT VẤN ĐỀ
• Ung thư tuyến tiền liệt là ung thư có tỷ lệ tử vong cao thứ 2 ở nam giới.
• Tuy nhiên, nếu được phát hiện kịp thời thì cơ hội điều trị thành cơng cao.
• PSA là chất chỉ thị quan trọng trong chẩn đoán ung thư tuyến tiền liệt.
• ELISA là kỹ thuật phổ biến được dùng để định lượng PSA.
MƠ HÌNH THIẾT BỊ
(a) Cố định kháng thể thứ nhất đặc hiệu PSA lên đế sinh học.
(b) Phủ mẫu máu chứa PSA, kháng nguyên sẽ bị kháng thể bắt giữ.
(c) Thêm kháng thể thứ hai đã được gắn trên MNPs.
(d) Kháng thể đặc hiệu kháng nguyên sẽ được giữ lại sau những lần rửa.
(e) Dựa vào thiết bị đo lượng sắt từ, xác định lượng sắt từ từ đó suy ra nồng
độ kháng nguyên trong mẫu cần đo.
MỤC TIÊU ĐỀ TÀI
Y
Kháng thể
Hoạt hóa bề mặt bằng APTES – GA
?
• Liệu có kháng thể gắn lên hạt sắt từ khơng?
• Liệu kháng thể có cịn hoạt tính khơng?
HOẠT HÓA BỀ MẶT MNPs
THỬ NGHIỆM GẮN STREPTAVIDIN, ĐO BẰNG
PHƯƠNG PHÁP UV-VIS
Kiểm tra độ tin cậy của phương pháp
1.600
1.400
Delta OD 280nm
f(x) = 3.44x - 0.01
1.200 R² = 1
1.000
0.800
0.600
0.400
0.200
0.000
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45
Nồng độ Streptavidin (mg/ml)
THỬ NGHIỆM GẮN STREPTAVIDIN, ĐO BẰNG
PHƯƠNG PHÁP UV-VIS
400 µl MNPs được hoạt hóa bề mặt
400 µl Streptavidin nồng độ 0.1
mg/ml
Thu dịch
400 µl PBS chứa Tris 0,2M +
1% NaCNBH3
400 µl PBS + 0, 05% Tween 20
Lắc nhẹ 3h, lắc nhẹ, nhiệt
độ phịng
Rửa 3 lần với PBS
Thu dịch hút
400 µl PBS/1 lần
Li tâm 6000v/p, 5p
Lắc , 1h, t0p
Rửa 3 lần
Thu dịch
Thu dịch
Li tâm 6000v/p, 5p, 40C
Bảo quản trong 400 µl
PBS
Giá trị OD của dịch rửa cao hơn so với dịch ban đầu, delta OD âm => ở dịch rửa
có các tạp chất protein khác ngoài streptavidin
THỬ NGHIỆM GẮN STREPTAVIDIN- HRP, ĐO BẰNG PHƯƠNG PHÁP
DỰA TRÊN SỰ THAY ĐỔI MÀU CỦA CƠ CHÁT TMB
TMB
Stop solution
OD
450 nm
THỬ NGHIỆM GẮN STREPTAVIDIN, ĐO BẰNG PHƯƠNG
PHÁP DỰA TRÊN SỰ THAY ĐỔI MÀU CỦA CƠ CHÁT TMB
Mẫu
Mẫu đối chứng (MNPs- StreptavidinHRP, to = 1000C, 5 phút)
Mẫu thử nghiệm (MNPsStreptavidin-HRP)
OD450nm
0.147±0.04
0.421 ±0.066
Delta OD mẫu thử nghiệm lớn hơn mẫu đối chứng do đó có
thể khẳng định rằng có streptavidin gắn lên hạt nano sắt từ
KHÁNG THỂ CĨ GẮN LÊN MNPs?
TMB
Y
Kháng thể (µl) 0
Stop solution
Y
25
Y
50
75
OD
450 nm
100
KHÁNG THỂ CÓ GẮN LÊN MNPs?
Delta OD 450 nm
Biến thiên OD theo kháng thể
1.77
1.83
75
100
1.2
0
0
0.31
25
50
Kháng thể (µl)
Giá trị OD tăng dần khi lượng kháng thể tăng dần
=> Có kháng thể gắn lên MNPs.
KHÁNG THỂ CĨ HOẠT TÍNH?
D elta O D 4 5 0 n m
KHÁNG THỂ CĨ HOẠT TÍNH?
Kết quả đo OD 450
0.06
0.06
2
4
0.06
6
Nồng độ kháng ngun (ng/ml)
Giá trị OD biến thiên nhưng khơng tuyến tính với nồng độ kháng ngun. Vì:
• Lượng kháng thể đưa vào khơng đủ để bắt giữ kháng ngun
• Mất kháng thể trong q trình rửa
• Kháng thể khơng cịn hoạt tính
KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ TỐI ƯU CỦA KHÁNG THỂ
Nồng độ
kháng thể
0
160X
80X
40X
KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ TỐI ƯU CỦA KHÁNG THỂ
Delta OD450nmn
So sánh hoạt tính của kháng thể tự do và kháng thể cố định
1.98
2.01
0.14
80X
0.11
40X
0.93
0
0
0.06
160X
Nồng độ kháng thể 4ng/ml
Kháng thể cố định
Kháng thể tự do
- Nồng độ 80X là nồng độ thích hợp để gắn kháng thể lên hạt nano.
- Có 2 trường hợp có thể xảy ra:
• Kháng thể gắn lên hạt nano sắt từ một phần đã bị mất hoạt tính.
• Kháng thể gắn lên hạt nano khơng nhiều.
KHẢO SÁT LƯỢNG KHÁNG THỂ CỐ ĐỊNH LÊN
MNPs
TMB
Y
Nồng độ
kháng thể
Stop solution
Y
0
160X
Y
80X
OD
450 nm
40X
KHẢO SÁT LƯỢNG KHÁNG THỂ CỐ ĐỊNH LÊN
MNPs
2.5
Delta OD450nmn
Lượng kháng thể cịn hoạt tính
2
1.5
Lượng đã kháng thể gắn lên MNPs
Kháng thể tự do
1
0.5
0
0
160X
80X
Nồng độ kháng thể 4ng/ml
40X
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN:
• Chứng minh được phương pháp sử dụng APTES- GA có thể gắn được
kháng thể lên hạt nano sắt từ, tuy nhiên hiệu suất không cao.
• Xây dựng được phương pháp kiểm tra sự tồn tại của kháng thể sau khi
gắn lên hạt nano sắt từ.
• Xây dựng phương pháp xác định hoạt tính của kháng thể.
KIẾN NGHỊ:
• Tối ưu hóa quy trình sử dụng APTES- GA
• Thử nghiệm phương pháp hoạt hóa bề mặt mới.
L/O/G/O
EM XIN CHÂN THÀNH CẢM ƠN
SỰ CHÚ Ý LẮNG NGHE CỦA
THẦY CÔ VÀ CÁC BẠN
www.themegallery.com
THỬ NGHIỆM GẮN STREPTAVIDIN, ĐO BẰNG
PHƯƠNG PHÁP UV-VIS
Mẫu
Streptavidin ban Streptavidin
đầu
dịch rửa
Nồng độ (mg/ml)
0.1
0.13
Kết quả: Các giá trị thu được đều âm (delta OD của dịch rửa và dịch hút cao
hơn dịch ban đầu đưa vào) chứng tỏ trong dịch rửa có các protein khác ngồi
streptavidin làm cho kết quả khơng chính xác.
KHẢO SÁT KHẢ NĂNG “BẮT CHƯỚC” ENZYME
PEROXYDASE CỦA MNPs
TMB + H2O2
Stop solution
OD 450 nm
KHẢO SÁT KHẢ NĂNG “BẮT CHƯỚC” ENZYME
PEROXYDASE CỦA MNPs
Đường chuẩn:
Lượng
MNPs (µg)
OD trung
bình
0
10
20
30
40
0,000
0,679
1,447
2,147
2,459
Đường chuẩn
OD trung bình
3.000
2.500
f(x) = 0.06x + 0.07
R² = 0.98
2.000
1.500
1.000
0.500
0.000
0
5
10
15
20
25
30
Lượng MNPs (µg)
35
40
45
XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG THỂ DỰA VÀO KHẢ NĂNG
“BẮT CHƯỚC” ENZYME PEROXYDASE CỦA MNPs
TMB + H2O2
Stop solution
PSA
MNPs – Ab
CÔNG THỨC CÁC CHẤT SỬ DỤNG TRONG BÀI
APTES: (3-Aminopropyl) triethoxysilane
GLUTARALDEHYDE :
CÔNG THỨC CÁC CHẤT SỬ DỤNG TRONG BÀI
SMCC:
4-(N-Maleimidomethyl)cyclohexanecarboxylic acid Nhydroxysuccinimide ester
