Sắc ký cột
Nguyên lí tách của sắc kí cột cũng như của các loại sắc kí
khác:
-một mẫu thử được nạp lên một cột chứa chất hấp phụ
(thường là silica gel, nhôm oxyt).

Biên soạn: PGS TS Võ thị Bạch Huệ
01/2015
1


Sắc ký cột
-

Cột chứa chất hấp phụ này đóng vai trị
là một pha tĩnh. Một dung mơi khai triển
(pha động) di chuyển dọc theo cột sẽ
làm di chuyển các cấu tử của mẫu thử,
do các cấu tử này có độ phân cực khác
nhau nên ái lực của chúng với pha tĩnh
cũng khác nhau, vì vậy chúng bị dung
mơi giải hấp và bị đẩy đi với vận tốc
khác nhau tạo các dải riêng biệt có vị trí
khác nhau ra khỏi cột tại các thời điểm
khác nhau, làm cơ sở cho việc phân tích
định tính và định lượng.
2


1/- Mở đầu
Pha tĩnh được nhồi sẵn vào trong cột phía

trên một lớp bơng (sẽ ngăn những vật rắn
chảy vào dịch thu được) và thêm một lớp
mỏng cát
Nếu không cẩn thận khi nạp mẫu thử vào có
thể dẫn đến làm xáo trộn pha tĩnh và hiệu
suất chiết xuất sẽ thấp vì vậy cần thêm 1 lớp
cát vào phía trên pha tĩnh nữa để ổn định
cột.
Điều quan trọng nhất là không được để pha tĩnh ở trạng thái khô
và không được có bọt khí. Vì vậy phải ln giữ cho pha tĩnh được
bao phủ bới pha động.
Bởi vì silica gel và nhơm oxyt có thể tạo một lớp khá dày, q trình
chiết tách có xu hướng mất nhiều thời gian nếu trọng lực chỉ là 1
lực duy nhất kéo pha động đi. Q trình này có thể được tăng tốc
bởi việc tăng áp suất ở đầu cột hay chân không ở phía dưới cột.


2.1/- Pha tĩnh
Loại chất sử dụng làm pha tĩnh là những chất hấp phụ, thay
đổi theo độ phân cực của chất cần phân lập.
Hiện nay phổ biến là silicagel và nhôm oxyt, là những chất
hấp phụ phân cực (chất hấp phụ pha thuận), chúng được
dùng để phân lập những chất có độ phân cực yếu đến độ
phân cực trung bình.
Cỡ hạt hấp phụ: Cỡ hạt nhỏ (15- 40μm), cỡ hạt trung bình
(40- 63μm), cỡ hạt thơ (63- 200μm).

4



2.2/- Cách thức chuẩn bị cột sắc ký
Cột sắc ký thường là một ống thủy tinh có đường kính từ
50mm trở lên, chiều cao từ 50cm đến 1m với 1 cái vịi ở phía
dưới.
Chiều cao cột vừa phải, càng cao thì khả năng tách càng
hiệu quả nhưng nguy cơ mất mẫu càng lớn. Cột được rửa
sạch, sấy khô, gắn trên trên một giá vững chắc.

5


1/- Mở đầu

3/- PHƯƠNG PHÁP NHỒI CỘT:
3.1/- Phương pháp khô:
Cột đầu tiên được điền đầy với bột

pha tĩnh khô, sau đó bổ sung pha
động từ từ cho đến khi pha tĩnh

hồn tồn ướt, và kể từ thời điểm
này khơng được phép để cột khô.

6


1/- Mở đầu

3/- PHƯƠNG PHÁP NHỒI CỘT:
3.2/- Phương pháp ướt:

Một hỗn dịch tương đối loãng, tạo từ chất hấp phụ hịa trong
dung mơi nền, được đổ cẩn thận vào trong cột đã chứa một
lớp dung môi nằm trên lớp bông ở đáy cột. Mở khóa cột tối
đa. Chú ý phải loại trừ bong bóng khí bằng cách cho từ từ
và thường xuyên vỗ nhẹ cột. Cố gắng đưa toàn bộ khối hỗn

dịch bằng 1 lần rót duy nhất. Từ thời điểm này không được
để khối bột khô.

7


4/- ỔN ĐỊNH CỘT:
Cột ở vị trí thẳng đứng, nén cột bằng 2 nút cao su gõ nhẹ
đều quanh cột đến khi khơng cịn bọt trong cột, mặt thống
phẳng và không tụt xuống được nữa. Sau khi nén cột cho
dung mơi chảy qua cột trong một thời gian thích hợp tùy theo
kích thước để ổn định cột. Cột càng ổn định thì các băng
tách sẽ càng phẳng và gọn.

8


Các kỹ thuật
5/- CHUẩN Bị MẪU SắC KÝ, ĐƯA MẫU LÊN CộT
5.1/- Mẫu sắc ký
Cần xác định rõ hợp chất cần chiết xuất. Quy trình chiết xuất
phải phù hợp với nhóm hợp chất này. Mẩu thử trước khi

phân tích phải được loại tạp bằng phương pháp thích hợp.


9


Các kỹ thuật
5/- CHUẩN Bị MẪU SắC KÝ, ĐƯA MẫU LÊN
CộT
5.1/- Mẫu sắc ký
Mẩu thử có thể ở dạng bột khô nhưng

thường ở dạng dung dịch khá đậm đặc
(không được quá đậm đặc) trong 1 dung

môi không quá phân cực so với hệ dung
môi sắp dùng để khai triển cột. Lý tưởng
nhất là dung môi nền của hệ dung môi
pha động.
10


Các kỹ thuật
5/- CHUẩN Bị MẪU SắC KÝ, ĐƯA MẫU LÊN CộT
5.1/- Mẫu sắc ký
Nều mẫu khó hịa tan trong dung mơi nền, có thể dùng một
dung mơi khác phân cực hơn dung mơi nền để hịa tan mẫu.
VD: Pha động là Benzen - EtOAc thì tốt nhất hịa tan mẫu
trong Benzen, nếu mẫu khơng tan trong Benzen thì có thể

dùng dung môi phân cực hơn Benzen một chút (CH2Cl2,
CH3Cl, hỗn hợp Benzen - EtOAc) để hòa tan mẫu.

Mẫu dạng bột khô: trộn dung dịch mẫu với giá tơi xốp vừa
đủ, bốc hơi hết dung môi thu được một bột màu có thể chất
mịn tơi xốp.

11


5.2/- Đưa mẫu lên cột
Nạp mẫu dạng bột khơ (ít được sử dụng)
Rắc đều mẫu lên lớp dung môi vừa đủ trên đỉnh cột.
Chú ý: Lớp dung môi chừa lại trên đỉnh cột phải hơi dư so
với khả năng hút dung môi của lượng bột mẫu.
Nạp mẫu dạng dung dịch
Dùng pipet khắc độ hoặc pipet Pasteur đủ dài có gắn quả
bóp hoặc bình lắng gạn có đầu dài đưa nhẹ nhàng dung dịch
mẫu vào lớp dung môi chừa trên đỉnh cột.
Nạp mẫu xong, mở khóa cột chậm cho tồn bộ dung dịch
mẫu thấm đều vào chất hấp phụ.
Dùng dung môi hòa tan mẫu rửa lòng cột vài lần đến khi dịch
rửa trở nên trong suốt không màu. Trong khi rửa vẫn mở
khóa cho chảy với tốc độ thích hợp. Từ giờ trở đi tuyệt đối
không để nứt cột.
12


6/- DUNG MƠI SẮC KÝ:
Cách lựa chọn dung mơi
Tìm dung môi sắc ký dựa vào tài liệu tham khảo nhưng
thường nhất vẫn là phải dị tìm hệ dung mơi này bằng
phương pháp SKLM trên cùng chủng loại pha tĩnh.

Hệ dung môi này nên gồm tối đa 2 thành phần và sau khi
chạy xong trên sắc ký đồ SKLM cho kết quả:
Các vết có di chuyển, có tách nhau, khơng bị kéo thành
vệt dài.
Các vết cần tách có Rf khoảng 0.25 – 0.35
Các vết đúng là đối tượng cần nghiên cứu.
Ghi nhận hệ dung môi vừa chọn, xác định dung môi nền (là
dung môi kém phân cực nhất trong hệ trên). Dung mơi nền
ưu tiên hịa tan chất hấp phụ nhồi cột, hịa tan mẫu nạp cột
và làm dung mơi đầu khai triển cột.


6/- DUNG MƠI SẮC KÝ:
Chú ý: Khơng nên khai triển cột sắc kí ngay với hệ dung
mơi vừa chọn bằng SKLM mà phải dùng hệ dung môi cùng
dãy nhưng kém phân cực hơn để chạy cột.
Thay đổi dung môi trong quá trình sắc ký (sự tăng dần độ
phân cực của dung môi):
Dung môi được thay đổi sao cho độ phân cực thay đổi
không đột ngột.
Tỷ lệ của dung môi phân cực hơn (B) trong hệ dung môi (A
- B) sẽ được tăng từ từ.
Dung môi mới sẽ được thay đổi vào thời điểm khi lượng
dung môi cũ trên cột gần hết.
Thận trọng trong thay đổi dung môi nhất là dung môi phân
cực mạnh.


7/- PHÁT HIỆN VÀ THU NHẬN KẾT QUẢ SẮC KÝ
Theo dõi khả năng tách: quan sát màu, chấm trên SKLM

bản silica gel F254 soi UV
Thu phân đoạn: Hứng càng sớm càng tốt nhất là khi phân
lập các chất không màu.
Để gộp các phân đoạn: Theo dõi băng SKLM, gộp các ống
hứng có sắc ký đồ giống nhau, ghi lai thể tích của phân
đoạn mới gộp.
Báo cáo kết quả: phải ghi rõ các thông số và các chi tiết.
Khi kiểm tra các thành phần trong phân đoạn, ln chấm
kèm mẫu tồn phần để tiện theo dõi.
Các thành phần thu được sau khi sắc ký có thể sử dụng các
phương pháp đo UV, huỳnh quang, HPLC, GC,… để tiến
hành kiểm tra, đánh giá, nhận biết chính xác hơn các thành
phần có trong mẫu.
15


8/- ƯU VÀ NHƯỢC ĐIỂM
8.1/- Ưu điểm:
Có thể được sử dụng trong cả hai lĩnh vực phân tích và điều
chế.
Sắc ký cột không những dùng để xác định số lượng các
thành phần của một hỗn hợp mà nó cịn có thể được dùng
để tách và tinh chế những thành phần phân tích.
Pha tĩnh và các dụng cụ thí nghiệm rẻ tiền, dễ kiếm; có thể
triển khai với một lượng lớn mẫu chất.
8.2/- Nhược điểm
Khi chạy cột sắc ký cần đòi hỏi sự chú ý theo dõi liên tục đễ
duy trì mức dung mơi vì nếu khơng sẽ dễ gây xuất hiện các
bọt khí làm tắc cột, nứt cột, và biến dạng đường đi của dung
môi.

Chạy cột tốn thời gian và và công việc lặp đi lặp lại, đặc biệt
là khi chạy các mẫu lớn.
Quá trình tách chậm và hiệu quả thấp so với sắc ký lỏng cao
16
áp.
/>

9/- ỨNG DỤNG
Phân lập các hormon tăng trưởng steroid, hormon
sinh dục và các hợp chất liên quan.
Rửa giải các thuốc trừ sâu.
Tách các thuốc trừ sâu gốc clo.
Phân lập kháng sinh.
Tách các chất lipid.
Phân lập alkaloid.
Tách các hợp chất chứa nito từ các hydrocarbon.
Làm tinh khiết dược liệu.
Tách hợp chất vịng thơm từ hỗn hợp mạch thẳngvịng thơm.
Phân tích các vitamin
Khử màu dầu, chất béo và sáp bằng phương pháp
17
thấm lọc.