Kỹ thuật PCR và điện di
1. Phản ứng chuỗi polymerase (PCR)
1.1. Giới thiệu về PCR
Phản ứng chuỗi của polymerase thường được viết tắc là PCR (polymerase chain
reaction). Đây là một kỹ thuật tạo dòng DNA rất đơn giản và hiệu quả. Thơng qua PCR,
hàng triệu đoạn DNA đồng nhất có thể được thu thập một cách dễ dàng từ một hỗn hợp
các phân tủ bao gồm RNA, protein, plysaccharride, ADN khơng có chức năng di truyền.
Người ta gọi đó là kỹ thuật tạo dòng ADN invitro. Ngày nay, PCR được dùng phổ biến
trong nhiều lĩnh vực thuộc sinh học.
PCR là kỹ thuật xử lý invitro các chuỗi mã hoá di truyền DNA bằng cách phát triển
primer một cách đồng loạt trên các dây đơn DNA. Tồn bộ tiến trình được hoàn thiện do
sự biến chất của DNA cần thiết, sự tác động của primer tại đầu của các dây đơn DNA này,
kế đến là sự phát triển của các primer do phản ứng DNA polymerase.

Hình Phản ứng PCR


Kỹ thuật PCR và điện di
Sự khuếch đại này được tính như sau:
Tổng số DNA được khuếch đại = m x 2n
Trong đó n là số chu kỳ và m là số bản sao của chuỗi trình tự DNA cần nhân ra.
Giả sử chúng ta được hiệu quả khuếch đại là 100 %, chúng ta sẽ có:
Số chu kỳ

Tổng số khuếch đại

1

2

5

32

10

1024

20

1048576

30

1,07 x 109

1.2 Nguyên tắc chung
PCR được thực hiện trên cơ sở phản ứng sinh tổng hợp DNA theo 3 trình tự:
- Biến thành dây đơn (denature).
- Phản ứng của primer gắn vào đầu dây chuỗi mã đối xứng với chuỗi mã trên dây
nền (template), được gọi là tiến trình “annealing” để có phân tử DNA mới.
- Kéo dài dây mới nhờ Taq polymerase (extension).
- Lặp lại qui trình


Kỹ thuật PCR và điện di

Hình Quá trình phản ứng PCR
Ba giai đoạn này lập lại nhiều lần, để tạo mức độ cao trong sự khuếch đại. Ba giai
đoạn xảy ra trong điều kiện nhiệt độ khác nhau (thí dụ 94 0C, 550C, 720C), nên máy nhân
gen (thermalcycler) phải có tính chất tự động hố một cách chính xác, với sự trợ giúp của

Taq. Enzyme này được chiết xuất từ vi khuẩn chịu nhiệt độ cao sống ở suối nước nóng
(750C) là Thermophilus aquaticus, có hoạt tính tối ưu ở 72 0C, song nó có thể bền vững tới
940C.
Một polymerase của DNA và bốn deoxy (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) được dùng để
khuếch đại (amplified) một đoạn chun tính nào đó của DNA. Thể tăng hoạt có tính
“chọn lọc” này được hồn thiện thơng qua sự hợp lại của hai oligonucleotide (F và R)
trong phản ứng. Nhiệm vụ của những oligonucleotide này là tác động làm cho DNA bị


Kỹ thuật PCR và điện di
biến chất (mở dây đôi thành dây đơn) và những phần cuối của đoạn nhằm tăng hoạt lên và
cho nó hoạt động như những primer trong sinh tổng hợp DNA. Để có tác động một cách
đặc biệt tại vị trí mình mong muốn, những primer này phải được tổng hợp để cung cấp
khoảng 20-24 bp chuỗi xoắn (duplex) tại mỗi đoạn cuối của segment.
Primer ở bên trái tác động trên dây DNA 3’-5’ còn được gọi là forward primer, ký
hiệu là F. Primer bên phải tác động dây 5’-3’ còn được gọi là reverse primer, ký hiệu là R.
Sự sắp xếp như vậy đảm bảo vùng bị can thiệp được tăng cường hoạt động, theo 3 trình tự
đã nói trên. Có thể tóm tắt các bước của chu kì phản ứng chuỗi PCR theo sơ đồ sau:
Tóm lại, khi các primer kết hợp với sợi DNA đối lập của nó trong điều kiện một
khoảng cách đã được kích hoạt, các đoạn DNA này có thể sẽ được khuếch đại lên theo
phản ứng dây chuyền với polymerase. Độ dài của DNA được tăng hoạt tuỳ thuộc vào số
đoạn và chiều dài của primer trong phản ứng, điều kiện chất đệm, nhiệt độ annealing...

1.3 Các yếu tố của phản ứng PCR
- DNA mục tiêu: là những đoạn ADN mang mật mã đã được biết trước. Trong kỹ
thuật PCR, người ta sẽ nhận được kết quả tốt, nếu ADN thật sự tinh khiết.
- Primer và dNTP: chiều dài của primer và thành phần của dNTP ảnh hưởng quan
trọng đối với nhiệt độ trong quá trình tác động dây đơn.
- Chất đệm: thành phần chất đệm gồm có Tris, KCl, MgCl 2 . Nồng độ Mg 2+ tối hảo
là 1,5 – 2,5 mM. Vì dNTP có thể gắn với Mg 2+ , cho nên nồng độ chính xác của Mg2+ phụ

thuộc và nồng độ dNTP.
- DNA polymerase được dùng phổ biến là Taq polymerase trích ly từ Thermus
aquaticus, có tính ổn định nhiệt rất cao.
- Các thành phần khác như chất tẩy khơng có tính ion, gelatin, NP 40 và Tween 20
được thêm và với số lượng nhỏ nhằm thúc đẩy hoạt động của Taq polymerase.[8]


Kỹ thuật PCR và điện di
1.4 Quy trình khuếch đại
Chu kỳ 25-35 trong điều kiện:
+ Denature 94-960C

15 giây (hoặc lâu hơn tùy theo vật liệu)

+ Annealing 550C

1 phút

+ Extension 720C

2 phút

Hình Qui trình khuyếch đại trong phản ứng PCR
Bảng Thiết lập chương trình chạy PCR trực tiếp trên máy cho SSR
Giai đoạn

Tên giai đoạn

1


Làm nóng

2

Làm nóng

3
4

Chu kỳ

Nhiệt độ (0C)

Thời gian
(phút)

94

5

34

94

1

Lai

34


55

1

Chuyển

34

72

2


Kỹ thuật PCR và điện di
5

Chuyển

72

7

6

Lưu trữ

4

Vô định


2. Điện di
Phương pháp điện di trong gel (keo) thường được sử dụng để phân li (phân đoạn)
DNA, RNA, oligonucleotide, protein... sau đó có thể dùng để giám biệt (đồng định) và
tinh chế các chất đó. Việc phân li các chất dựa trên độ lớn cũng như hình thái của các
chất. Thơng thường sử dụng gel agarose và gel polyacrylamide nhưng gel agarose cho
phép phân li nucleic acid lớn hơn 1 kb, còn gel polyacrylamide thường dùng để phân li
các đoạn nucleic acid nhỏ hơn 1 kb. Nguyên lý của việc điện di DNA là khi ở trong điện
trường, do tích điện âm nên các phân tử DNA dịch chuyển về phía anode và với tốc độ
dịch chuyển của chúng khác nhau phụ thuộc vào khối lượng phân tử. Các đoạn DNA càng
lớn thì dịch chuyển càng chậm. Kết quả là từ một điểm chung (lỗ hay "giếng" tải mẫu)
các đoạn DNA khác nhau dịch chuyển về một hướng tạo thành một làn (lane), và trên làn
đó có các đoạn DNA khác nhau phân bố ở các vị trí (các băng - band) khác nhau tương
ứng với độ lớn của chúng. Trong khi đó, các phân tử protein do tích điện bề mặt khác
nhau nếu điện di trong gel khơng gây biến tính thì dịch chuyển theo các hướng khác nhau
với tốc độ khác nhau phụ thuộc cả khối lượng phân tử lẫn điện tích bề mặt, nhưng nếu
điện di trong gel sau khi xửlý bằng SDS thì do bề mặt protein trở nên tích điện âm đồng
nhất nên chúng dịch chuyển về anode với tốc độ khác nhau hầu như chỉ phụ thuộc khối
lượng phân tử.


Kỹ thuật PCR và điện di

Hình 1.14 Quá trình điện di
Agarose là một trong các dạng của polysaccharide. Theo tinh chất của nó các nhà
khoa học đã khai thác đặc tính gel trong điện di để phân loại các DNA. Agarose sẽ tạo
thành các hạt agarose sau khi tan (melting) ở nhiệt độ cao, hoạc đun nhiệt độ cac trong vài
phút. Khi nguội lại những hạt agarose sẽ kết tụ lại với nhau [gọi là gelling]. Giữa những
hạt như vậy có những lỗ rất nhỏ, kích thước của những lỗ này có thể xê dịch chút ít tùy
theo nồng độ của agarose gel. Trong điện trường DNA duy chuyễn từ cực âm sang cựa
dương, vì ADN mang điện tích âm (do tính chất của gốc phosphate).


Hình 1.15 Agarose


Kỹ thuật PCR và điện di
Khi DNA duy chuyễn qua các lổ của agarose, sự cọ xát giữa hạt agarose và phân tử
DNA tạo ra lực kháng làm ngăn cản sự dịch chuyễn của DNA. DNA có phân tử càng lớn,
thì lực cản càng mạnh. Do đó, DNA có phân tử càng nhỏ di chuyễn càng nhanh. Nhờ vậy,
người ta phân loại được các đoạn DNA trên agarose gel. Khi nồng độ agarose thay đổi,
kích thước lổ giữa các hạt agarose cũng thay đổi. Nó sẽ trở nên lớn hơn khi nồng độ
agarose càng thấp. Kích thước của lổ to và phân tử DNA bé, thì sự khuếch đại sẽ gặp trở
ngại. Người ta thấy rằng cần có sự tương xứng giữa hai yếu tố, để có kết quả mong muốn
khi nghiên cứu các đoạn DNA. [6]
Bảng Quan hệ giữa nồng độ agarose và độ lớn DNA

Vị trí của DNA trong gel được được xác định trực tiếp: các băng DNA trong gel
đươc nhuộm ở nồng độ thấp của thuốc nhuộm huỳnh quang ethidium brommide (EtBr) và
có thể phát hiện dưới ánh sáng tử ngoại (ultraviolet – UV)
Điện di agarose gel được sử dụng trong các trường hợp sau:
- Ước lượng kích thước của các phân tử DNA sau khi thực hiện phản ứng cát hạn
chế ( ví dụ: lập bản đồ hạn chế của DNA được tạo dòng…)
- Phân tách các sản phẩm PCR ( ví dụ: trong chẩn đoán di truyền phân tử hoặc in
dấu di truyền…).
- Phân tách DNA của hệ gen đã được cắt hạn chế trước khi thẩm tích Southern,
hoặc RNA trước khi thẩm tích Northern
Ưu điểm của phương pháp này là gel đươch rót dễ dàng, khơng gây biến tính mẫu,
và bền vững vật lý hơn polyacrylamide. Mẫu cũng dễ thu hồi. Nhược điễm là agarose gel


Kỹ thuật PCR và điện di

có thể bị nóng chảy trong q trình điện di, đệm có thể bị tiêu hao, và các dạng khác nhau
của nucleic acid có thể chạy không ổn định.
Các yếu tố ảnh hưỡng đến tốc độ dịch chuyễn điện di trong agarose gel:
- Các phân tử DNA có kích thước càng lớn ( khối lượng phân tử lớn ) thì tốc độ
dịch chuyễn càng chậm
- Nồng độ agarose: đoạn DNA mang kích thước nhất định sẽ dịch chuyễn ở các tốc
độ khác nhau qua các bản gel chứa các nồng độ agarose khác nhau.
- Cấu hình của DNA: các DNA dạng vịng (form-I), vịng đứt (form-II) và mạch
thẳng (form-III) có cũng khối lượng phân tử sẽ dịch chuyển trên agarose gel ở các tốc độ
khác nhau. Nhìn chung, DNA của cá plasmid mạch vịng dịch chuyễn nhanh hơn DNA
của plasmid cùng loại nhưng có dạng mạch thẳng. Hầu hất plasmid mạch vịng chứa ít
nhất hai dạng DNA có cấu trúc khơng gian khác nhau là dạng vịng đóng ( siêu xoắn) và
vịng đứt.
- Thành phần base và nhiệt độ: tập tính điện di của DNA trong agarose gel không
bị ảnh hưởng rõ rệt bởi thành phần base của DNA hoặc nhiệt độ mà ở đó gel được chạy.
Trong agarose gel, tính linh động điện di tương đối của các đoạn DNA có kích thước khác
nhâu khơng thay đổi trong khoảng từ 40C – 300C. Nói chung, agarose gel thường được
chạy ở nhiệt độ phòng
Một số đệm điện di thích hợp cho DNA sợi đơi thường dùng là Tris-acetate-EDTA
(TAE), Tris-borate-EDTA (TBE) và Tris-photphate-EDTA (TPE) nồng độ khoảng 50mM
và pH 7,5- 7,8. Thường do thói quen, TAE được sử dụng nhiều nhất, nhưng khả năng
đệm của nó lại thấp. Đệm TBE và TPE đều có khả năng hịa tan tốt các đoạn DNA và có
khả năng đệm cao hơn một cách rõ rệt. Các đoạn DNA sẽ dịch chuyễn với các tốc độ khác
nhau một chút trong ba loại đệm trên do sự khác nhau về cường lưc ion của đệm. Đệm
không những thiết lập một giá trị pH, mà còn cung cấp các ion để hổ trợ cho độ dẫn
(conductivity). Nếu chúng ta dùng nước thay vì là đệm trong q trình điện di, thì sẽ
khơng có sự dịch chuyễn cần thiết của DNA trong gel. Ngược lại, nếu dùng đệm nồng độ
đậm đặc ( ví dụ: dung dịch stock X10), thì nhiệt độ trong gel sẽ tăng cao và làm nóng
chảy nó.



Kỹ thuật PCR và điện di
Phương pháp quan sát DNA trong agarose gel thuận lợi nhất là dùng thuốc nhuộm
huỳnh quang EtBr. EtBr đượcdùng để phát hiện DNA sợi đôi và RNA sợi đơn. Tuy nhiên,
ái lực( affinity) của thuốc nhuộm đối với nucleic acid sợi đơn là tương đối thấp và có hiệu
suất huỳnh quang khơng cao. Sau khi nhuộm, EtBr sẽ xen vào giữ các base của nucleic
acid và cho phép phát hiện dễ dàng chúng trong gel.

Hình Ethidium Bromide và sự tác động của EtBr lên ADN
Thường EtBr (0,5mg/mL) được đưa vào trong agarose gel để phản ứng nhuộm xảy
ra trong suốt quá trình điện di. Măc dù tính linh động điện di của DNA sợi đơi mạch thẳng
giảm khi có mặt thuốc nhuộm ( khoảng 15%), nhưng khả năng xác định gel trực tiếp dưới
ánh sánh UV trong suốt quá trình điện di hoặc ở giai đoạn cuối có ưu thế rõ rết. tuy nhiên,
nếu cần có thể chạy điện di gel khơng có EtBr và chỉ nhuộm DNA hoặc RNA sau khi điện
di xong. Gel được ngâm trong đệm điện di hoặc H2O chứa EtBr (0,5 mg/mL) trong 45
phút ở nhiệt độ phòng.( chú ý EtBr là tác nhân gây đột biến mạnh. Vì thế, phải đeo găng
tay khi cầm gel hoặc dung dịch chứa thuốc nhuộm).