BÁO CÁO

TÌM HIỂU HỆ ENZYME PECTINASE
HỌC PHẦN: KỸ THUẬT THỰC PHẨM 3

i


MỤC LỤC
NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪNError! Bookmark not
defined.
LỜI CẢM ƠN ..................................................................... Error! Bookmark not defined.
MỤC LỤC ........................................................................................................................... ii
DANH SÁCH HÌNH ............................................................................................................ v
CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU TỔNG QUAN HỆ ENZYME PECTINASE............................ 1
1.1 Đôi nét chung về enzyme ............................................................................................... 1
1.1.1 Khái niệm .................................................................................................................... 1
1.1.2 Phân loại ...................................................................................................................... 2
1.1.3 Nguồn thu nhận ........................................................................................................... 2
1.1.4 Ứng dụng ..................................................................................................................... 4
1.2 Lịch sử phát triển của enzyme pectinase ........................................................................ 4
1.3 Khái niệm enzyme pectinase .......................................................................................... 5
1.4 Cấu tạo trung tâm hoạt động .......................................................................................... 5
1.5 Phân loại và cấu tạo từng loại enzyme trong hệ ............................................................. 5
1.5.1 Enzyme hydrolase........................................................................................................ 5
1.5.2 Transeliminase (TE) .................................................................................................... 7
1.6 Pectin – cơ chất của enzyme pectinase ........................................................................... 8
1.6.1 Cấu tạo và tính chất chung .......................................................................................... 8
1.6.2 Phân loại ...................................................................................................................... 8
CHƯƠNG II: NGUỒN THU NHẬN ENZYME PECTINASE ........................................ 10
2.1 Sơ lược chung ............................................................................................................... 10

2.2 Các nguồn thu nhận ...................................................................................................... 10
2.2.1 Enzyme pectinase từ nguồn thực vật ......................................................................... 10
2.2.2 Enzyme pectinase từ vi sinh vật ................................................................................ 12
2.3 Phương pháp thu nhận .................................................................................................. 14
2.3.1 Thu nhận chế phẩm enzyme pectinase theo phương pháp bề mặt ............................ 14
ii


2.3.2 Thu nhận chế phẩm enzyme pectinase theo phương pháp bề sâu ............................. 14
CHƯƠNG III: ỨNG DỤNG CỦA ENZYME PECTINASE ............................................ 17
3.1 Thị trường enzyme ....................................................................................................... 17
3.2. Trong sản xuất nước quả ............................................................................................. 18
3.2.1 Các loại pectinase được sử dụng ............................................................................... 18
3.2.2 Cơ chế tác dụng ......................................................................................................... 18
3.3 Trong sản xuất rượu vang ............................................................................................. 20
3.4 Trong trích ly các dược liệu đông y (thuốc bắc, thuốc nam) ....................................... 22
3.5 Trong chăn nuôi ............................................................................................................ 23
3.6 Trong công nghiệp sản xuất giấy.................................................................................. 24
3.7 Trong trích ly dầu thực vật ........................................................................................... 24
3.8 Trong lên men trà và cà phê ......................................................................................... 25
3.9 Dùng làm mềm mô thực vật (Maceration) và cô lập protoplast ................................... 25
3.10 Xử lí nước thải có chứa pectin.................................................................................... 25
CHƯƠNG IV: QUY TRÌNH SẢN XUẤT PECTINASE TỪ VI SINH VẬT .................. 26
4.1 Nguyên liệu sản xuất .................................................................................................... 26
4.1.1 Đặc điểm phân bố ...................................................................................................... 26
4.1.2 Điều kiện hình thành enzyme .................................................................................... 27
4.2 Môi trường lên men ...................................................................................................... 27
4.3 Các yếu tố ảnh hưởng trong q trình ni cấy ........................................................... 27
4.3.1 Ảnh hưởng bởi nguồn pectin và Carbon ................................................................... 27
4.3.2 Ảnh hưởng của nguồn nitro ....................................................................................... 29

4.3.3 Ảnh hưởng của pH..................................................................................................... 30
4.3.4 Ảnh hưởng của các yếu tố khác................................................................................. 31
4.4 Quy trình cơng nghệ sản xuất ....................................................................................... 32
4.4.1 Sơ đồ công nghệ ........................................................................................................ 32
4.4.2 Thuyết minh quy trình ............................................................................................... 33
KẾT LUẬN ........................................................................................................................ 37
iii


TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................. 38

iv


DANH SÁCH BẢNG
Bảng 2.1: Sự khác nhau giữa enzyme nội bào và enzyme ngoại bào ............................. 10
Bảng 3.1: Tỷ lượng các loại enzyme được buôn bán trên thế giới.................................. 17
Bảng 3.2: Hàm lượng pectin ở một số quả và dịch quả .................................................. 19
Bảng 3.3: Tốc độ ép của bã nghiền nho khi sử dụng pectinol ........................................ 21
Bảng 4.1: Ảnh hưởng của nguồn carbon ......................................................................... 29
Bảng 4.2: Ảnh hưởng của nguồn nitro ............................................................................ 30

v


DANH SÁCH HÌNH
Hình 1.1: Cấu trúc enzyme ................................................................................................ 1
Hình 1.2: Cơ chế tác dụng của pectinesterase ................................................................... 6
Hình 1.3: Cơ chế tác dụng của polymethyl galactunase kiểu I ......................................... 6
Hình 1.4: Cơ chế tác dụng của polymethyl galactunase kiểu III....................................... 7

Hình 1.5: Cơ chế tác dụng của polygalacturonase kiểu II ................................................. 7
Hình 1.6: Transeliminase ................................................................................................... 8
Hình 1.7: Cấu tạo pectin .................................................................................................... 8
Hình 2.1: Cấu trúc của pectinesterase từ cà rốt ............................................................... 11
Hình 3.1: Sơ đồ trích ly dược liệu sử dụng chế phẩm pectinase ..................................... 23
Hình 4.1: Sơ đồ thể hiện ảnh hưởng của nguồn pectin đối với Asp.niger ...................... 28
Hình 4.2 : Biểu đồ biểu diễn sự ảnh hưởng của pH đối với sự tổng hợp PE và PG ....... 31
Hình 4.3: Sơ đồ quy trình sản xuất enzyme từ vi sinh vật .............................................. 32

vi


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Stt

Chữ viết tắt

Nguyên chữ

1

VSV

Vi sinh vật

2

PE

Pectinesterase


3

PE1

Pectinesterase 1

4

PE2

Pectinesterase 2

5

PG

Polygalacturonase

6

PMG

Polymethyl galacturonase

7

Endo–PMG–I

Endo glucosidase polymethyl galactunase kiểu I


8

Exo–PMG–III

Exo–glucosidase polymethyl galacturonase kiểu III

9

Endo–PG–II

Endo glucosidase polygalacturonase kiểu II

10

Exo–PG–IV

Enxo–glucosidase polygalacturonase kiểu IV

vii


LỜI MỞ ĐẦU
Từ xa xưa, khi con người hoàn toàn chưa biết gì về enzyme, người ta đã biết sử dụng
rộng rãi các quy trình enzyme trong hoạt động thực tế như làm bánh mì, bia, rượu, muối
chua rau quả...Ngày nay với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, việc sử dụng
enzym ngày càng rộng rãi hơn trong rất nhiều lĩnh vực khác nhau, như: trong nhiều ngành
công nghiệp, nông nghiệp, y học và nghiện cứu khoa học. Việc nghiên cứu và sử dụng các
chế phẩm enzym có ý nghĩa rất lớn vì nó thúc đẩy các quy trình sản xuất, rút ngắn thời gian
sản xuất, tối ưu hóa chất lượng sản phẩm, làm tăng hiệu xuất chế biến,…Vì vậy hiệu quả

kinh tế cũng được nâng cao. Trong số các enzym thì pectinase có ứng dụng khá rộng rãi
chỉ sau amylase và protease. Pectinase thường được ứng dụng nhiều trong công nghệ thực
phẩm và dược phẩm, đặc biệt là được sử dụng trong sản xuất nước quả, rượu vang, trích ly
đơng dược,….
Để tìm hiểu nhiều hơn về enzyme này, nên em đã thực hiện bài báo cáo với chủ đề
Tìm hiểu hệ enzyme pectinase và ứng dụng, Bài báo cáo gồm có 4 phần:
Chương I: Giới thiệu tổng quan hệ enzyme pectinase
Chương II: Nguồn thu nhận enzyme pectinase
Chương III: Ứng dụng của enzyme pectinase
Chương IV: Quy trình sản xuất enzyme pectinase từ vi sinh vật
Bài báo cáo này được thực hiện trong thời gian tương đối ngắn, kiến thức có hạn, do
vậy khó tránh khỏi những hạn chế nhất định. Rất mong nhận được những nhận xét, đánh
giá và đóng góp quý báu quý báu từ quý Thầy.

Vĩnh Long, ngày 15 tháng 6, năm 2020

viii


CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU TỔNG QUAN HỆ ENZYME PECTINASE
1.1 Đôi nét chung về enzyme
1.1.1 Khái niệm
Trong các tế bào của cơ thể sống ln ln xảy ra q trình trao đổi chất. Sự trao đổi
chất ngừng thì sự sống khơng cịn tồn tại. Q trình trao đổi của một chất là tập hợp các
quy luật của rất nhiều phản ứng hoá học khác nhau. Các phản ứng hoá học phức tạp này có
liên quan chặt chẽ với nhau và điều chỉnh lẫn nhau. Enzyme là chất xúc tác sinh học xúc
tác cho các phản ứng hố học đó, có bản chất protein, hoà tan trong nước và trong dung
dịch muối lỗng.
Enzyme có phân tử lượng lớn từ 20 – 1.000 kDa nên khơng qua được màng bán thấm.
Chúng có khả năng xúc tác đặc hiệu các phản ứng hóa học nhất định và đảm bảo cho các

phản ứng xảy ra theo một chiều hướng nhất định với tốc độ nhịp nhàng trong cơ thể sống.
Chúng có trong tất cả các loại tế bào của cơ thể sống. Enzyme còn được gọi là chất xúc tác
sinh học (biocatalysator) nhằm để phân biệt với các chất xúc tác hố học.

Hình 1.1: Cấu trúc enzyme
(Nguồn: Wikipedia.com)

Tất cả các yếu tố làm biến tính protein như acid đặc, kiềm đặc, muối kim loại nặng,...
đều có thể làm enzyme bị biến tính và mất hoạt tính xúc tác.
Enzyme có nhiều tính chất ưu việt hơn hẳn các chất xúc tác hố học. Enzyme có cường
lực xúc tác rất lớn, ở điểu kiện thích hợp hầu hết các phản ứng có xúc tác enzyme xảy ra
với tốc độ nhanh gấp 1 – 10 lần so với phản ứng khơng có chất xúc tác.
Ví dụ:
- Một gam pepsin phân giải đuợc 5 kg protein trứng trong 2 giờ.
- Một gam renin làm đông tụ được 72 tấn sữa trong sản xuất pho mát.
1


- Một mol catalase phân huỷ được 5.l06 mol H2O2/phút trong khi đó 1 mol Fe+3 chỉ
phân huỷ l06 mol H2O2/phút
Mỗi enzyme chỉ xúc tác làm chuyển hoá được một hoặc một số cơ chất nhất định theo
một kiểu liên kết hoá học nhất định, và một kiểu phản ứng nhất định. Sự tác dụng có tính
chất lựa chọn này gọi là tính đặc hiệu của enzyme,hay cịn gọi là tính chun mơn hóa cao.
Enzyme có tính đặc hiệu cao nên không tạo ra những sản phẩm phụ. Enzyme tác dụng trong
điều kiện “êm dịu”, enzyme thường tác dụng thích hợp ở nhiệt độ 30 – 50℃, pH trung tính
và ở ấp suất thường, không cần nồng độ acid hay nồng độ kiềm mạnh, áp suất cao, do đó
khơng địi hỏi các thiết bị chịu acid, kiềm và chịu áp suất cao đắt tiền.
1.1.2 Phân loại
Tiểu ban về enzyme (The enzyme Commission. EC) được tổ chức bởi Hội hóa sinh
quốc tế (The internationl Union of Biochemistry, IUB) đã đưa ra cách phân loại thống nhất

dựa trên các loại phản ứng và cơ chế phản ứng. Theo cách phân loại này thì enzyme được
chia ra làm sáu lớp lớn đánh số từ 1 đến 6. Các số thứ tự này là cố định cho mỗi lớp.
Sáu lớp enzyme theo phân loại quốc tế gồm có:
1. Oxydoreductase: các enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa – khử.
2. Transferase: các enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển vị.
2. Hydrolase: các enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân.
4. Lyase: các enzyme xúc tác cho phản ứng phân cắt không cần nước, loại nước tạo
thành nối đôi hoặc kết hợp phân tử nước vào nối đôi.
5. Isomerase: các enzyme xúc tác cho phản ứng đồng phân hóa.
6. Ligase: các enzyme xúc tác cho phản ứng tổng hợp có sử dụng liên kết giàu năng
lượng ATP,..
1.1.3 Nguồn thu nhận
Enzyme là những chất không thể điều chế được bằng phương pháp tổng hợp hoá học,
mà người ta thường thu nhận chúng từ nguồn tế bào động vật, thực vật hoặc vi sinh vật.
Trong hàng trăm enzyme được sử dụng trong công nghiệp hơn một nửa được sản xuất
từ nấm mốc và nấm men, trên một phần ba từ vi khuẩn, còn lại từ 8% nguồn động vật và
4% nguồn thực vật.
a. Từ động vật
Một số mô động vật chứa nhiều enzyme: dạ dày, tụy tạng, tim, gan, lá lách...

2


Tụy tạng là cơ quan chứa nhiều enzyme nhất như amylase, mantase, lipase,
cholesterrol esterase, excitinase, nuclease, trypsin, kimotrypsin, cacbocylpeptidase A, B,
elastase. Tất cả các enzyme này đều là enzyme ngoại bào.
Màng nhầy của dạ dày lợn, chó, gà, thỏ, chứa pepsin A,B,C,D, riêng dạ dày lợn con
có gastrinsin (enzyme thuỷ phân protein). Ngăn thứ tư của dạ dày bò chứa loại vi khuẩn
tổng hợp cellulase. Dạ dày của loài động vật có sừng non (bé, nghé) chứa.
Gan là cơ quan chứa nhiều enzyme có trong ở mọi cơ quan khác, cịn thấy có những

hệ enzyme chỉ riêng gan mới có, như enzyme tham gia tổng hợp ure, chính nhờ sự phong
phú về enzyme này mà gan tham gia nhiều quá trình trao đổi chất. Người ta ví gan như một
phịng thí nghiệm trung tâm của cơ thể.
Trong nước bọt ngồi các enzyme tiêu hố, như amylase, mantase, cịn chứa enzyme
có tên kalicrein, enzyme này tác dụng lên globin α–2 Kali–dinogen để giải phóng ra kalidin
là một decapeptít có tác dụng làm tăng sự tiết nước bọt.
b. Từ thực vật
Trong tất cả các nòi đậu rựa đều rất giàu enzyme urease, hàm lượng có thể đến 20%
chất khơ.
Trong các bộ phận khác nhau của cây dứa kể cả dứa dại (vỏ, lõi, chồi, thân, lá,...) đều
có chứa enzyme bromelin. Trong đó nhiều nhất là ở phần đầu quả dứa. Hoạt tính của
enzyme bromelin phụ thuộc nhiều vào trạng thái và điều kiện bảo quản nguyên liệu.
Nhựa đu đủ, đây là loại cây ăn quả phổ biến ở các nước nhiệt đới. Từ quả tươi hoặc
thân thu được nhựa (latex) chính là chế phẩm papain thơ để từ đó tinh chế thành papain
thương phẩm.
Một số loại nguyên liệu khác, khi tiến hành nghiên cứu khoa học, y sinh học, nhiều
khi cần xem xét (định tính, định lượng, cầu trúc phân tử, độ hoạt động enzyme,..) của một
số loại enzyme có trong bản thân nguyên liệu đó để định lượng sử dụng. Đáng chú ý hơn
cả là chế phẩm enzyme polyphenoloxydase điển hình nhất là polyphenoloxydase của lá chè,
của nội nhủ hạt ca cao tươi, nước ép quả nho.
c. Từ vi sinh vật
Đây là nguồn thu enzyme rất phong phú. Từ vô số lồi vi sinh vật, người ta có thể thu
được rất nhiều loại enzyme khác nhau, trong đó có những enzyme mà cơ thể động vật và
thực vật không thể tổng hợp được.
Vi sinh vật có khả năng sinh sản, phát triển và sinh tổng hợp enzyme với tốc độ cực
kỳ lớn, do đó cho phép thu được một lượng lớn enzyme trong thời gian ngắn một cách đễ
dàng. Enzyme vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, vượt xa enzyme từ các nguồn khác. Người
3



ta đã tính rằng, trong vịng 24 giờ vi sinh vật có thể chuyển hố lượng lớn thức ăn gấp 30 –
40 lần so với trọng lượng cơ thể chúng. Trong khi đó hệ enzyme của con lợn trên 50 kg chỉ
có thể chuyển hố vài kg thức ăn trong một ngày.
1.1.4 Ứng dụng
Enzyme có nhiều ứng dụng trong các ngành cơng nghiệp khác nhau, như cơng nghiệp
hóa học, thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm, và các lĩnh vực khác. Một số enzyme rất hữu
ích trong cuộc sống hàng ngày là protease, amylase và lipase.
Trong ngành dược việc ứng dụng công nghệ enzyme cũng rất rộng rãi, như sử dụng
enzyme bromelin trong dứa giúp các bệnh nhân giảm đau sau phẫu thuật. Các enzyme
trypsin và chymotrypsin được sử dụng làm thuốc tiêu viêm, làm lành vết thương, vết bỏng,
làm giãn và tiêu biến niêm mạc bị hoại trong một số bệnh viêm phổi, viêm khí quản.
Trong ngành cơng nghiệp thực phẩm, enzyme được sử dụng để tăng hương vị, giúp
tiêu hóa, tăng giá trị dinh dưỡng, giảm chi phí sản xuất của thực phẩm hoặc giảm các tác
dụng gây dị ứng, như trường hợp enzyme lactase. Enzyme này được sử dụng trong q
trình tạo ra các sản phẩm khơng chứa lactose, phá vỡ nó thành đường glucose và galactose.
Enzyme cũng được ứng dụng nhiều trong ngành mỹ phẩm và các sản phẩm chăm sóc
cá nhân giúp cải thiện chất lượng và đặc tính của sản phẩm. Ví dụ như Coenzyme Q10 là
một enzyme hai cấu tử với cofactor là vitamin có khả năng kháng oxy hóa đẩy mạnh q
trình tạo năng lượng ATP trong cơ thể và da, giúp duy trì sức khoẻ làn da. Bên cạnh đó,
các sản phẩm được ứng dụng enzyme đều rất an toàn khi được sự dụng trực tiếp trên da.
Đặc biệt, trong sản xuất Bioethanol 2G – một năng lượng thay thế dầu hóa thạch hiện
nay, enzyme là một yếu tố rất quan trọng. Enzyme đóng một vai trị nền tảng trong q
trình suy biến sinh khối lignocellulosic đóng góp vào sự sống cịn của công nghệ này.
1.2 Lịch sử phát triển của enzyme pectinase
Lịch sử nghiên cứu pectinase bắt đầu từ khi người ta hiểu biết về cấu trúc pectin và
cơ chế phân cắt pectin của những enzyme này.
Trong nhiều thập niên gần đây việc sản xuất pectinase từ vi sinh vật đã trở nên phổ
biến. Nhiều vi sinh vật như vi khuẩn, nấm men, nấm mốc đều có khả năng sản xuất enzyme
pectinase. Người ta cũng đã chứng minh rằng pectinase là một enzyme cảm ứng có thể
được sản xuất từ nhiều nguồn carbon khác nhau.

Cùng với sự phát triển của sinh học phân tử người ta đã đẩy mạnh nghiên cứu việc tạo
dòng và biểu hiện gen của enzyme pectinase trong các tế bào chủ khác nhau. Tuy nhiên, tế
bào chủ được sử dụng nhiều nhất vẫn là Saccharomyces.

4


1.3 Khái niệm enzyme pectinase
Enzyme pectinase là một nhóm enzyme thủy phân pectin , sản phẩm của quá trình này
là acid galacturonic, galactose, arabinose, methanol… đây là một nhóm ezyme được ứng
dụng rộng rãi trong công nghiệp chỉ đứng sau amylase và protease. Enzyme này ban đầu
được phát hiện trong các dịch chiết trái cây như cà rốt, cà chua hay đại mạch. Đầu tiên phải
kể đến là phát hiện của E.fremi (1840) trên đối tượng cà rốt.
1.4 Cấu tạo trung tâm hoạt động
Enzyme pectinase chứa vùng có 8 – 10 vịng xoắn kép về phía phải với 2 vịng tạo
thành khe liên kết với cơ chất.
Trung tâm hoạt động của enzyme này chứa acid amin aspartate và lysine. Có 1
histidine nằm gần trung tâm hoạt động sẽ ảnh hưởng đến khả năng xúc tác của enzyme.
Nhiệt độ tối ưu của enzyme pectinase khoảng từ 45 – 55℃.
1.5 Phân loại và cấu tạo từng loại enzyme trong hệ
Hiện nay hệ thống enzyme pectinase được chia làm 2 nhóm chính: hydrolase và
transeliminase với đặc điểm chung nhất là làm giảm độ nhớt của dung dịch pectin và làm
giảm phân tử lượng của các sản phẩm tạo thành.
1.5.1 Enzyme hydrolase
Thuộc nhóm này có 2 enzyme chủ yếu là: pectinesterase và polygalacturonase.
a. Pectinesterase – gọi tắt là PE
Enzyme xúc tác thủy phân liên kết ester trong phân từ pectin hóa acid pectinic để giải
phóng sản phẩm là methanol và acid polygalacturonic, PE chỉ phân cắt các nhóm metocyl
đứng cạnh nhóm –COOH tự do.
Pectinesterase thu được từ các nguồn khác nhau có giá trị pH tối ưu khác nhau. Nếu

thu từ nguồn vi sinh vật pH tối ưu từ 4,5 – 5,5, còn nếu từ nguồn thực vật thi có pH tối ưu
từ 5,0 – 8,5. Pectinesterase từ nấm mốc có nhiệt độ tối ưu là 30 – 45℃ và bị vô hoạt ở 55
– 62℃. Pectinesterase thường được hoạt hóa bởi các ion Ca và Mg.
Enzyme này tác dụng lên nhóm metoxy ở vị trí 3, 5, 7 (vị trí thứ 5 dễ dàng hơn) cơ
chế tác dụng như Hình 1.2.

5


COOCH3 COOCH3 COOCH3 COOCH3 COOCH3 COOCH3 COOCH3 COOCH3
1

2

5
6
7
3
4
Hình 1.2: Cơ chế tác dụng của pectinesterase

8

(Nguồn: Nguyễn Trọng Cẩn và cộng sự, 1998)

b. Polygalacturonase – gọi tất là PG (poly 𝛼– galacturonide glucanhydronase)
Polygalacturonase xúc tác sự phân cắt các mối liên kết 𝛼–1,4–glycoside. Các exo–
PG (exo–poly(1,4–𝛼D–galacturonide)galacturonohydrolase, EC 2.2.1.67), phân cắt từ các
đầu không khử, và endo–PG (endo–poly(1,4– 𝛼D–galacturonide)glycanohydrolase, EC
2.21.15) tấn công ngẫu nhiên vào giữa mạch cơ chất. Enzyme này ít gặp trong thực vật, chủ

yếu gặp trong vi khuẩn và nấm mốc.
Đây là một phức hệ enzyme và thường có tính đặc hiệu cao đối với cơ chất. Dựa vào
đó người ta chia ra 4 kiểu sau:
- Polymethyl galacturonase (PMG–Poly–𝛼1,4–galacturoside–methyl ester
glucanhydrolase), PMG được phân thành 2 nhóm nhỏ phụ thuộc vào vị trí phân cắt liên
kết 𝛼–1,4 ở trong hay ở cuối và đầu mạch.
+ Endo glucosidase polymethyl galactunase kiểu I (endo–PMG–I). Đây là enzyme có
tính chất dịch hóa, pectin có mức độ methyl hóa càng cao (nhiều gốc metoxy –OCH3) thì
bị thủy phân càng nhanh và triệt để trong mơi trường khi có mặt pectinesterase. Endo–
PMG–I rất phố biển trong các nấm mốc: Asp.niger, Asp.awamori, Botrytis cinezea,
Neurispora crassa. Cơ chế tác dụng như Hình 1.3. Trong mơt trường khi có PE thì enzyme
này càng bị giảm hoạt lực.

COOCH3 COOCH3 COOCH3 COOCH3 COOCH3 COOCH3 COOCH3 COOCH3
1

2

3

4

5

6

7

8


Hình 1.3: Cơ chế tác dụng của polymethyl galactunase kiểu I
(Nguồn: Nguyễn Trọng Cẩn và cộng sự, 1998)

+ Exo–glucosidase polymethyl galacturonase kiểu III (exo–PMG–III) Đây là enzyme
có tính chất đường hóa, có khả năng cắt từng gốc monome acid galacturonic ra khỏi mạch
bắt đầu từ đầu khơng khử có nhóm metoxy (–OCH.) Cơ chế tác dụng như Hình 1.4.
6


COOCH3 COOCH3 COOCH3 COOCH3 COOCH3 COOCH3 COOCH3 COOCH3
1

2

3

4

5

6

7

8

Hình 1.4: Cơ chế tác dụng của polymethyl galactunase kiểu III
(Nguồn: Nguyễn Trọng Cẩn và cộng sự, 1998)

- Enzyme tác dụng lên acid pectinic hay acid pectit – gọi là polygalacturonase (PG)

cũng được phân thành 2 nhóm nhỏ:
+ Endo glucosidase polygalacturonase kiểu II (endo–PG–II). Đây là enzyme có tính
chất dịch hóa, chỉ thủy phân cơ chất khi có mặt nhóm -COOH tự do. Hoạt độ của endo–
PG–II tăng lên nhiều khi cơ chất được xử lý trước bằng pectinesterase (dễ tạo ra nhiều gốc
–COOH tự do). Nấm mốc và vi khuẩn tổng hợp được enzyme này, Cơ chế tác dụng như
Hình 1.5.

COOCH3 COOCH3 COOCH3 COOCH3 COOCH3 COOCH3 COOCH3 COOCH3
4
3
8
2
1
5
6
7

Hình 1.5: Cơ chế tác dụng của polygalacturonase kiểu II
(Nguồn: Nguyễn Trọng Cẩn và cộng sự, 1998)

+ Enxo–glucosidase polygalacturonase kiểu IV (exo–PG–IV) thủy phân các liên kết
gắn với nhóm –COOH tự do ở đầu hay mơi mạch.
1.5.2 Transeliminase (TE)
Đây là nhóm enzyme được tìm ra cách đây chưa lâu (khoảng năm 1960 – 1961), bao
gồm protopectinase xúc tác sự phân cắt araban galactan khỏi protopectin để tạo thành pectin
hòa tan và enzyme transeliminase phân cắt phi thủy phân (khơng có sự tham gia của phân
tử nước) pectin dễ tạo ra các gốc galacturonic có nối kép giữa C4 và C5 Phản ứng xảy ra dễ
dàng ở môi trường trung tinh hay kiềm yếu.

7



Hình 1.6: Transeliminase
(Nguồn: Nguyễn Trọng Cẩn và cộng sự, 1998)

1.6 Pectin – cơ chất của enzyme pectinase
1.6.1 Cấu tạo và tính chất chung
Pectin là cơ chất của enzyme pectinase. Pectin rất phổ biến trong tự nhiên, đặc biệt
trong giới thực vật.
Về phương diện hoá học, pectin polymer của 𝛼–D galacturonic acid, mạch thẳng.
Mạch chính là galacturonic acid, các mạch bên của phân tử pectin gồm có rhamnose,
arabinose, galactose và xylose.

Hình 1.7: Cấu tạo pectin
(Nguồn: Ifoodvietnam.com, 2016)

Tùy thuộc vào nguồn thu pectin, khối lượng của nó từ 80.000 – 200.000 đvC. Pectin
khơng hịa tan trong rượu và các dung mơi hữu cơ khác. Pectin hoà tan trong nước, amoniac,
dung dịch kiềm, carbonate natri và trong glycerine nóng. Độ hịa tan của pectin trong nước
tăng lên khi mức độ ester hóa trong phân tử tăng và khi khối lượng phân tử pectin giảm.
1.6.2 Phân loại
Pectin là tên gọi chung bao gồm: protopectin, acid pectic, acid pectinic, pectin hịa
tan. Có nhiều cách phân loại, tuy nhiên 2 cách sau đây là phổ biến nhất:
Cách 1
Dạng protopectin khơng tan trong nước, thường có mặt ở thành tế bào
8


Dạng pectin hịa tan được trong nước, có mặt trong dịch tế bào.
Cách 2

High methyl ester pectin (gọi tắt là HM pectin): tỷ lệ các gốc ester methylic cao (trên
50%).
Low methyl ester petin (gọi tắt là LM pectin): tỷ lệ các gốc ester methylic thấp hơn
50%.
Amidared pectin (pectin amin): trong q trình sản xuất, khi xử lí pectin cùng amoniac
sẽ tạo thành pectin amin, loại này thuận lợi đặc biệt trong nhiều quy trình ứng dụng.
- Phần trung tính – phức chất galactanoraban.
- Phần acid – acid pectic.
Trong bào tương, pectin nằm ở dạng hòa tan. Trong màng tế bào và gian bào, chúng
nằm ở dạng khơng hịa tan gọi là protopectin. Protopectin ở màng gian bào có chứa lượng
kim loại khá lớn và một lượng nhóm metocyl đủ để làm protopectin bền vững. Còn
protopectin ở màng tế bào chứa một lượng kim loại khơng nhiều, có độ metocyl hóa cao.
Vì thế, tế bào thực vật có khả năng trương nở tốt.
Nếu enzyme tham gia phân giải pectin ở gian bào sẽ làm các tế bào khó liên kết với
nhau và thịt quả dễ dàng bị mềm ra. Pectin thường có mối liên kết hydro và liên kết nguyên
tử yếu hơn so với cellulose. Tham gia phân hủy pectin gồm nhiều loại enzyme, như
cellulose, pectinase,…

9


CHƯƠNG II: NGUỒN THU NHẬN ENZYME PECTINASE
2.1 Sơ lược chung
Có hai loại enzyme là: nội bào và ngoại bào, mỗi enzyme địi hỏi phải có phương pháp
tách và thu nhận riêng:
- Enzyme ngoại bào: do vi sinh vật tiết ra trong mơi trường ni cấy ngồi tế bào,
thường hịa tan trong nước do đó dễ trích ly và tinh sạch.
- Enzyme nội bào: là enzyme được sản xuất ra bên trong tế bảo vi sinh vật và không
được tiết ra mơi trường bên ngồi. Những tế bào vi sinh vật sau khi được nuôi cấy sẽ được
tách ra và phá vỡ tế bào. Mục đích của việc này là giải phóng tồn bộ các chất có trong tế

bào gồm cả enzyme nội bào. Hỗn hợp thu được sẽ đem ly tâm tách tạp chất và những chất
có phân từ lượng lớn; còn enzyme sẽ được kết tủa bằng cồn hay muối. Enzyme sau đó sẽ
được đem tinh sạch.
Bảng 2.1: Sự khác nhau giữa enzyme nội bào và enzyme ngoại bào
Enzyme nội bào

Enzyme ngoại bào

– Khó tách

– Dễ tách

– Phải phá vỡ thành tế bảo

– Không cần phá vỡ thành tế bào

– Thường lẫn chung với các chất khác của tế
– Không lẫn chung với các thành phần
bào sau khi bị phá vỡ (acid nội bảo, nếu có chỉ nội bào, nếu có chỉ là enzyme ngoại bào
là một vài nucleic, chất nguyên sinh, lipid..)
khác.
– Chỉ bền vững ở trong môi trường nội bào

– Bền vững hơn enzyme nội bào

– Phương pháp tinh sạch khó thực hiện quy
trình cơng nghệ phức tạp, giá thành đắt.

– Phương pháp tinh sạch dễ và rẻ hơn


2.2 Các nguồn thu nhận
Enzyme pectinase được tìm thấy ở thực vật bậc cao và vi sinh vật. Ở thực vật bậc cao,
pectinase có nhiều trong lá, củ khoai tây, trong chanh, cà chua, cỏ ba lá… Trong các loại
cỏ khác thường chỉ có enzyme pectinesterase.
2.2.1 Enzyme pectinase từ nguồn thực vật
a. Pectinesterase
Trong thực vật, hầu hết các loại cây cho trái đều chứa enyme PE. Enzyme này thường
tồn tại dưới nhiều hình thức khác nhau, nằm trong phần vỏ tế bào. Pectinesterase ở thực vật
nói chung có hoạt độ tối ưu trong khoảng pH hơi kiềm. Các cation kim loại ở nồng độ thấp,
như Ca2+ chẳng hạn, có khuynh hướng làm tăng nồng độ hoạt động của enzyme.
Cà chua chứa ít nhất hai loại pectinesterase. Cả pectinesterase 1 (PE1) và
pectinesterase 2 (PE2) đều tăng trong giai đoạn đầu của q trình chín. Khi bước vào giai
10


đoạn chín, nồng độ enzyme PE1 giảm xuống, nhưng PE2 tích luỹ dần cho đến khi trái cây
có màu đặc trưng của trái chín. Pectinesterase 2 có khối lượng phân tử 23 kDa, pH tối ưu
7,6. Enzyme này bị bất hoạt 50% sau 5 phút đun ở 67℃. Các ion Ca2+ và Na+ làm tăng hoạt
độ của enzyme lên tối đa ở các nồng độ lần lượt là 0,005M và 0,05M.
Pectinesterase của đậu nành là protein có khối lượng phân tử 33 kDa, hoạt động tối
ưu tại pH gần 8. Polygalacturonic acid, là sản phẩm được hình thành do quá trình để methyl
hố các phân tử galacturonic acid.
Trong thịt quả chuối có hai isoenzyme pectinesterase. Cả hai có cùng khối lượng phân
tử là 30 kDa, nhưng có điểm đẳng điện khác nhau là 8,8 và 9,2. Các enzyme này hoạt động
ở pH tối đa là 7,5. Hoạt độ enzyme tăng lên khi thêm vào dung dịch NaCl ở nồng độ 0,2M,
và đưa pH của dung dịch về 6,0. Các enzyme này bị ức chế bởi nhiều loại polyol có khối
lượng phân tử thấp, như glycerol, sucrose, glucose, maltose và galactose.
Pectinesterase trong quả cam có hai loại là isoenzyme PE1 và PE2 có khối lượng phân
tử 36 kDa, nhưng có điểm đẳng điện khác nhau là 10,05 và 11,0, pH tối ưu của PE1 là 7,6,
còn của PE2 là 8,0.

Trong thành phần của nhiều thịt quả khác cũng chứa hai isoenzyem, một trong hai
enzyme này có tính bền nhiệt hơn, cịn enzyme kia thì ít mẫn cảm hơn khi bị tác động của
protease. Độ ổn định của enzyme có thể liên quan đến mức độ glycosyl hoá của các phân
tử enzyme. Enzyme bền nhiệt hơn và enzyme cịn lại có khối lượng là 51 kDa và 36 kDa,
theo thứ tự.

Hình 2.1: Cấu trúc của pectinesterase từ cà rốt
(Nguồn: Wikipedia.org)

Cả táo và kiwi cũng chứa hai loại isoenzyme. Các isoenzyme của kiwi có cùng khối
lượng phân tử là 57 kDa và cùng điểm đẳng điện là 7,2. Tuy nhiên, chúng khác nhau về
mức độ bền nhiệt.
b. Polygalacturonase
11


Hầu hết các nghiên cứu về PG đều trên cơ sở các nguồn VSV. Polygalacturonase
thường được tìm thấy trong các phần tiết ngoại bào của các loài nấm và vi khuẩn gây bệnh,
chẳng hạn như: Sacchromyces gragilis, Aspergillus niger, Lactobacillus plantarum,
Cochiliobolus carbonum, Neurospora crassa, các loài Ascomycete, Rhizopus arrchizus, và
Fusarium osyporum. Tuy nhiên trong thực tế, PG của thực vật bậc cao được nghiên cứu rất
nhiều ở cà chua chín.
Các enzyme PG trong cà chua chín tồn tại dưới hai dạng, và cả hai đều là
endo–
enzyme. Polygalacturonase 1 có khối lượng phân tử 84 kDa và có khoảng 50% bị bất hoạt
ở nhiệt độ 78oC. Polygalacturonase 2 có khối lượng phân tử 44 kDa và có khoảng 50% bị
bất hoạt ở 57℃. Polygalacturonase1 có độ ổn định tối đa ở pH 4,3, trái lại PG2 ổn định tối
đa ở pH 5,6.
Exo–polygalacturonase thủy phân các đầu không khử của chuỗi polygalacturonic, tạo
ra galacturonic acid là sản phẩm thủy phân chiếm ưu thế. Sự thủy phân polymer này bị gián

đoạn của sự tồn tại của các mạch nhánh trong cơ chất. Mức độ thuỷ phân tăng tỉ lệ với kích
thước cơ chất, đạt tối đa với mức polymer hoá 20 đối với các exo–PG ở cà rốt và đào. Hoạt
động của các exo–enzyme làm tăng nhanh sự tạo thành các nhóm khử và làm tăng chậm độ
nhớt của dung dịch cơ chất. Sự phân hủy polyuronide trong q trình chín khơng gây ra sự
tích lũy galacturonic acid, và chỉ có endo–enzyme PG là có liên quan.
2.2.2 Enzyme pectinase từ vi sinh vật
Nguồn giàu enzyme pectinase chủ yếu là nấm mốc, nấm men và vi khuẩn.
- Nấm mốc: Penicillium glaucum, Pen.ehrlichii, Pen.chrysogenum, Pen.expanam,
Pen.cilrimim, Aspergillus awamori, Asp.foetidus, Asp.niger, Asp.terrus, Asp.saitoi,
Asp.aureus, Asp.oryzae, Asp.wentii, Fusarium moniliforme,…
- Nấm men: Saccharomyces fragilis
- Vi khuẩn: Bacillus polymyxa, Flavobacterium pectinovorum,…
Các lồi vi sinh vật này thường có trong bề mặt tất cả các loại quả, các bộ phận khác
của thực vật. Khi quả bị hư hỏng, hoặc thực vật chết, chúng sẽ cùng các loài vi sinh vật
khác phá huỷ nhanh quả và các bộ phận của thực vật. Người ta thường thu pectinase từ
canh trường bề mặt hoặc từ canh trường bề sâu của nấm mốc.
Các vi khuẩn và nấm men cũng tổng hợp được enzyme này Asp.niger chủ yếu tổng
hợp ra pectinesterase. Con.diplodiella, Pen.citrimin tạo ra chủ yếu là polygalacturonase.
- Nấm men Sac.fragilis dường như chỉ tạo ra endo-pectintraseliminase.
- Vi khuẩn Bac.polymyxa, Bac.species lại chủ yếu tạo ra transeliminase.
12


a. Pectinesterase
Pectinesterase thu được từ các nguồn khác nhau có giá trị pH tối ưu khác nhau, pH tối
ưu của pectinesterase từ nguồn nấm mốc là 4,5 đến 5,5 còn của chế phẩm đã loại bỏ enzyme
polygalacturonase sẽ có pH tối ưu từ 2,0 đến 6,5. Trái lại pH tối ưu của pectinesterase từ
nguồn thực vật bậc cao là từ 6 đến 7,5 – 8.7.
Nhiệt độ tối ưu của PE từ nấm mốc là 40℃ đến 45℃, từ 55℃ đến 62℃ thì enzyme bị
vơ hoạt, trong khi đó nhiệt độ tối ưu của enzyme pectinesterase từ thực vật bậc cao cao hơn

từ 55 – 60℃
Pectinesterase có thể nhận được từ canh trường nấm mốc Asp.niger có nhiệt độ tối ưu
là 30 – 45℃, pHopt = 4,5 – 5,5 và bị vô hoạt ở 55 – 62℃ và từ thực vật (pHopt=7,5 – 8, toopt=
55 – 60oC). Khả năng hoạt động của chúng phụ thuộc vào nguồn thu nhận, mức độ ester
hoá của pectin. Ion natri và đặc biệt là ion Ca, cũng như chlorua của Na, K và Ca sẽ hoạt
hóa pectinesterase từ nấm mốc Conithyrium diplodiella và từ Asp.niger. Trái lại các cation
hóa trị 3 và 4 (thủy ngân nitrate, chì nitrate, nhơm sulfate và sắt clorua) sẽ kìm hãm tác
dụng của pectinesterase.
Ngoài ra, người ta đã thu được enzyme pectinesterase ở trạng thái đông thể và cũng
đã xác lập được rằng n–acid cuối trong phân tử enzyme là phenylalanin.
Pectinesterase của nấm mốc sẽ thủy phân trước nhất là nhóm methylester nằm ở giữa
hai nhóm carboxyl tự do và enzyme sẽ thủy phân lần lượt cắt liên kết ester dọc theo phân
tử pectin. Hoạt động của pectinesterase phụ thuộc nhiều vào mức độ ester hóa của pectin
và tỷ lệ thuận vào mức độ ester hóa. Chẳng hạn, đối với tác động của pectinesterase từ nấm
mốc Asp.niger, cần thiết phải có pectin ester hóa ở mức độ cao khơng ít hơn 70%.
b. Polygalacturonase
Hầu hết các nghiên cứu về polygalacturonase đều trên cơ sở các nguồn vi sinh vật.
Polygalacturonase thường được tìm thấy trong các phần tiết ngoại bào của các loài nấm và
vi khuẩn gây bệnh, chẳng hạn như: Saccharomyces fragilis, Asperigillus niger,
Lactobacillus plantarum, Cochlibolus carbonum, Neurosrora crassa, các loài Ascomycete,
Rhizopus arrchizus và Fusarium oxysrorum.
PH tối ưu của các polygalacturonase cũng khác nhau, phụ thuộc vào nguồn thu và cơ
chất. Chẳng hạn polygalacturonase dịch hóa (endo–polygalacturonase) khi tác dụng trên
acid pectinic thì pH tối ưu nằm trong khoảng từ 4,0 – 5,5. Cũng enzyme đó nhưng khi tác
dụng trên pectin thì lại có pH tối ưu trong khoảng 5,5 – 6, cịn polygalacturonase đường
hóa khi tác dụng trên pectin thì pH tối ưu từ 3 – 4, nhưng khi tác dụng trên acid pectinic thì
pH tối ưu cao hơn một ít ở vùng 4,4 – 6.
13



Các polygalacturonase chủ yếu bền vững ở vùng pH từ 4 – 6.
Polygalacturonase đường hóa chủ yếu từ Asp.niger nếu được hoạt hóa bằng thủy ngân
thì có thể bền vững khi pH= 2,5.
Nhiệt độ tối ưu của đa số polygalacturonase nằm trong khoảng từ 40 – 45℃, trong
khoảng nhịệt độ đó, chúng thường bền vững, nhưng sẽ bị vơ hoạt khi ở nhiệt độ 50℃ và 55
– 65℃.
2.3 Phương pháp thu nhận
Hiện nay người ta thu nhận pectinase chủ yếu từ VSV chủ yếu bằng 2 phương pháp:
- Thu nhận chế phẩm enzyme pectinase theo phương pháp bề mặt.
- Thu nhận chế phẩm enzyme pectinase theo phương pháp bề sâu.
2.3.1 Thu nhận chế phẩm enzyme pectinase theo phương pháp bề mặt
Môi trường sử dụng để nuôi cấy VSV để thu nhận pectinase thường là cám gạo hay
cám mì, bã củ cải hay thóc mầm. Nguồn dinh dưỡng bổ sung thường là amonium,
phosphoric.
Độ ẩm môi trường phải nằm trong khoảng 60%. Nấm mốc Awamori thường được
nuôi cấy ở 30℃ trong thời gian 40 giờ, sau đó giảm xuống 24℃ và ni cấy trong thời gian
48 – 52 giờ. Sản phẩm lên men được sấy khô thành chế phẩm enzyme thô và đem tinh chế.
Để thu được chế phẩm pectinase tinh khiết thì chế phẩm enzyme thơ phải được trích
ly bằng phương pháp kết tủa nhờ dung môi hữu cơ hay muối amoni sulfate. Dung môi hữu
cơ dùng để kết tủa enzyme pectinase có thể là rượu ethanol (71,5 – 75% ) hoặc isopropanol
(55 – 57%). Muối amonium sulfate sử dụng có độ bảo hòa 0,79. Khi kết tủa bằng nượu
ethanol chế phẩm enzyme thu được có độ tinh khiết 90%, cịn nếu bằng muối thì có độ tinh
khiết 75%. Nhiệt độ kết tủa tối ưu với rượu là 2 – 5℃, thời gian tiếp xúc với rượu càng
ngắn càng tốt. Sau đó ly tâm để tách kết tùa khỏi dung dịch, sấy kết tủa trong thiết bị sấy
chân không hay sấy thăng hoa rồi nghiền nhỏ và đem bảo quản.
2.3.2 Thu nhận chế phẩm enzyme pectinase theo phương pháp bề sâu
a. Phương pháp hiếu khí
Sự tích tụ enzyme trong mơi trường được bất đầu khi sự phát triển của VSV gần đạt
đến pha ổn định, khi mơi trường bị acid hóa mạnh và khi lượng phospho vơ cơ được sử
dụng hồn tồn pH của mơi truờng ni cấy thường đạt từ 6 – 7,2 là thích hợp. Đối với nấm

mốc pH kiềm kìm hàm sự tổng hợp sinh khối và sự tích lũy enzyme pectinase pH 4 ức chế
hồn tồn sự tích lấy enzyme pectinase. Khi pH dịch chuyển về phía acid, ngay cả khi pH
nằm trong khoảng 4,5 – 5,0, tuy sự tạo thành sinh khối không bị ảnh hưởng nhưng sự tạo
14


thành enzyme pectinase bị kìm hãm. Tuy nhiên pH mơi trường ni cấy của các Asp.niger
và Asp.awamori có thể dịch chuyển về 2,5 – 2,8 và 2,9 – 2,2 theo thứ tự.
Vật liệu gieo cấy có thể là sợi nấm 24, 32, 48 giờ tuổi và với hàm lượng từ 2 – 10%.
Đối với Asp.niger và Asp.awamori, vật liệu gieo là sợi nấm được ủ sơ bộ trong môi trường
dinh dưỡng cho đến khi bắt đầu sinh bào tử.
Thời gian ủ sơ bộ thường là 38 – 42 giờ. Lượng sợi nấm đem gieo cấy thường là 2%.
Trong quá trình ni cấy, hàm lượng chất hịa tan trong mơi trường thường giảm từ 6%
xuống còn 1,5 – 1,8%. Để thu canh trường lỏng đến khi hàm lượng chất khô đạt từ 5 – 8%
rồi sấy khô trên thiết bị sấy phun, điều kiện sấy phun là nhiệt độ chất tải nhiệt đi vào phải
đạt từ 165 – 180℃ và đi ra đạt 60 – 70℃. Thời gian lưu của chế phẩm enzyme trong thiết
bị sấy phun không quá 7 giây và nhiệt độ chế phẩm sau khi sấy không quá 40℃.
Chế phẩm thu được cần phải được đóng gói kín để tránh hút ấm. Có thể thu được chế
phẩm enzyme pectinase tinh khiết bằng cách kết tủa enzyme trong dịch lọc canh trường với
ethanol theo tỉ lệ 4:1, với acetone theo tỉ lệ 2:1, với isopropan theo tỉ lệ 1,3:1, hoặc với muối
amoni sulfate (50 – 80%) trong muối kết.
- Nếu kết tủa bằng ethanol, hoạt độ pectin trong kết tủa sẽ vào khoảng 88 – 90% so
với hoạt độ của dịch canh trường ban đầu.
- Nếu kết tủa bằng muối amoni sulfate, cần tách muối ra khỏi enzyme bằng phương
pháp thẩm tích (với nước hoặc dung dịch đệm), sau đó sấy khơ.
- Nếu kết tủa bằng (NH4)2SO4 có độ bảo hịa 1,0 thì sẽ kết tủa chỉ chiếm 0,11% nhưng
lại có hoạt độ pectinase cao.
b. Phương pháp yếm khí
Mơi trường thường nuôi cấy là bã củ cải 2%, (NH4)2HPO4 0,75%, KH2PO4 0,1% +
CaCO3 0,3% , nước chiết ngô 0,5% đối với Clostridium pectinopermentants 15, có khả

năng tổng hợp pectinnase một cách mạnh mẽ ở pha tăng trưởng của quá trình sinh trưởng
và tăng đồng thời với sự tích lũy enzyme sẽ tối đa tương ứng với pha ổn định của sự sinh
trưởng qua 55 – 60 giờ, pH ban đầu của môi trường dung dịch là 6,5 – 7,0. Vật liệu gieo
cấy ban đầu được chuẩn bị ở dạng canh trường chứa bảo từ và được cấy với lượng 4% theo
thể tích. Q trình ni cấy được tiến hành ở nhiệt độ 35℃.
Clostridium felsineum cũng có thể được ni cấy yếm khí để thu pectinase. Thành
phần mơi trường gồm có: (NH4)2HPO4 0,4%, KH2PO4 0,3%, K2HPO4 0,7% NaCl 0,1%,
MgSO4 0,25%, FeSO4 dạng vết, CaCO3 0,5%, dịch nấm men tự phân 0,05%, ascorbic acid
0,5%.

15


Có thể tiến hành thu chế phẩm từ dịch lọc canh trường bằng cách kết tủa enzyme với
dung môi hữu cơ hoặc với muối amoni sulfate.
- Nếu kết tủa bằng dung mỗi hữu cơ, pH của dung dịch đã xử lý là 6,5 – 6,8.
- Nếu kết tủa bằng 2 – 1,5 thể tích acetone thì hoạt độ của enzyme trong kết tủa đạt
93 – 95% so với hoạt độ ban ban đầu.
- Khi kết tủa bằng amoni sulfate có độ bảo hịa bằng 0,2 thì sẽ thu được chế phẩm chỉ
chứa pectinesterase và pectintranseliminase và exo–polygalacturonase.
Phương pháp hiện đại trong chuẩn bị chế phẩm enzyme pectinase thường theo các
bước cơ hản sau đây:
- Khử muối bằng phương pháp lọc gel (Biogel PI00)
- Tách protein bằng phương pháp trao đổi ion (DEAE Biogel A) hay trao đổi cation
(CM Biogel A).
- Tách enzyme pectinase bằng alginate liên kết ngang.

16



CHƯƠNG III: ỨNG DỤNG CỦA ENZYME PECTINASE
3.1 Thị trường enzyme
Trước năm 1965 toàn thế giới chỉ thu được vài triệu USD về buôn bán các chế phẩm
enzyme công nghiệp. Trong đó các chế phẩm enzyme cơng nghiệp dùng trong cơng nghệ
chất tẩy rửa chiếm tỷ lượng rất lớn trong những năm 60 của thế kỷ XX. Enzyme sử dụng
trong công nghệ sản xuất chất tẩy rửa có một giai đoạn giảm rất mạnh. Sau đó, các loại
enzyme sử dụng trong lĩnh vực này lại tăng rất nhanh.
Những năm 1972 – 1974, các enzyme sử dụng để sản xuất siro có lượng fructose cao
được giới thiệu rất mạnh, được sản xuất và tiêu thụ rất nhiều. Từ năm 1974 – 1986, lượng
enzyme sản xuất theo quy mô công nghiệp tăng dần lên. Giá trị enzyme công nghiệp tăng
hàng năm 10 – 15%. Đến năm 1989, tổng giá trị buôn bán enzyme cơng nghiệp trên tồn
thế giới là 500 triệu USD. Cho đến nay, công nghiệp enzyme đã phát triển rất mạnh.
Nếu phân tích từng loại enzyme được bn bán trên thế giới, người ta cho thấy rằng
enzyme protease từ vi khuẩn Bacillus được sản xuất với số lượng lớn nhất. Sau đó, là
enzyme amylase cũng từ Bacillus. Ta có thể tham khảo số liệu Bảng 3.1.
Bảng 3.1: Tỷ lượng các loại enzyme được buôn bán trên thế giới
STT

Tỷ lượng buôn bán (%)

Loại enzyme

1

Protease Bacillus

30 – 35

2


Glucose amylase

8 – 10

3

Amylase Bacillus

10 – 12

4

Glucose isomerase

5

Rennet động vật

6

Rennet vi sinh vật

2–4

7

Pectinase

4–5


8

Pancreatin, trypsin

2–4

9

Papain, bromalin

4–6

10

Lipase

2–3

11

Các loại enzyme khác

5–7
10 – 12

5 – 10

(Nguồn: Nguyễn Đức lượng và Cộng Sự, 2004)

17