HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

DƢƠNG THỊ HỒNG

NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ GÂY BỆNH
CỦA VIRUS GÂY DỊCH TIÊU CHẢY TRÊN LỢN ( PEDV
-PORCINE EPIDEMIC DIARRHEA VIRUS) PHÂN
LẬP ĐƯỢC TỪ CÁC ĐÀN LỢN YORKSHIRE NUÔI

TẠI VÙNG PHỤ CẬN HÀ NỘI

Chuyên ngành:

Thú y

Mã số:

60 64 01 01

Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS. Bùi Trần Anh Đào

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả
nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai cơng bố trong bất kì cơng trình
nào khác.
Tơi xin cam đoan các thơng tin trích dẫn trong luận văn đều đã đƣợc chỉ rõ

nguồn gốc.
Hà Nội, ngày 25

tháng 10 năm 2016

Tác giả luận văn

Dƣơng Thị Hồng

i


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hồn thành luận văn, tơi đã nhận đƣợc
sự hƣớng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cơ giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè,
đồng nghiệp và gia đình.
Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi đƣợc bày tỏ lịng kính trọng và biết
ơn sâu sắc tới PGS.TS Bùi Trần Anh Đào đã tận tình hƣớng dẫn, dành nhiều công sức,
thời gian và tạo điều kiện cho tơi trong suốt q trình học tập và thực hiện đề tài.
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ
môn Bệnh lý Thú y, Khoa Thú y - Học viện Nơng nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ
tơi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hồn thành luận văn.
Xin chân thành cảm ơn gia đình, ngƣời thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều
kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận
văn.
Hà Nội, ngày 25 tháng 10 năm 2016
Tác giả luận văn

Dƣơng Thị Hồng


ii


MỤC LỤC
Lời cam đoan......................................................................................................................i
Lời cảm ơn........................................................................................................................................... ii
Mục lục............................................................................................................................................... iii
Danh mục chữ viết tắt...................................................................................................................... vi
Danh mục bảng................................................................................................................................ vii
Danh mục hình................................................................................................................................ viii
Trích yếu luận văn............................................................................................................ix
Thesis Abstract................................................................................................................................. xii
Phần 1. Mở đầu...................................................................................................................1
1.1.

Tính cấp thiết của đề tài.......................................................................................1

1.2.

Mục tiêu đề tài..................................................................................................... 2

1.3.

Phạm vi nghiên cứu.............................................................................................2

1.4.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài.............................................................2

Phần 2. Tổng quan tài liệu.................................................................................................3

2.1.

Tình hình nghiên cứu về dịch tiêu chảy ở lợn Yorkshire (Porcine
Epidemic Diarrhea Virus - PEDV) trên thế giới và việt nam..............................3

2.1.1.

Một số nghiên cứu bệnh do Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV)
trên thế giới......................................................................................................... 3

2.1.2.

Tình hình nghiên cứu bệnh do Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV)
ở Việt Nam.......................................................................................................... 6

2.2.

Hiểu biết về căn bệnh.......................................................................................... 6

2.2.1.

Phân loại.............................................................................................................. 6

2.2.2.

Hình thái cấu trúc................................................................................................ 6

2.2.3.

Tính chất ni cấy............................................................................................... 7


2.2.4.

Sức đề kháng....................................................................................................... 7

2.3.

Hiểu biết về bệnh do Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV)........................8

2.3.1.

Loài mắc bệnh..................................................................................................... 8

2.3.2.

Lứa tuổi mắc bệnh...............................................................................................8

2.3.3.

Đƣờng xâm nhập.................................................................................................8

2.3.4.

Cơ chế sinh bệnh................................................................................................. 8

iii


2.3.5.


Triệu chứng lâm sàng.......................................................................................... 9

2.3.6.

Bệnh tích............................................................................................................10

2.3.7.

Chẩn đốn..........................................................................................................11

2.3.8.

Phịng và kiểm sốt bệnh...................................................................................12

2.3.9.

Phƣơng pháp nuôi cấy virus trên tế bào tổ chức...............................................15

2.3.10. Định lƣợng virus...............................................................................................15
Phần 3. Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu..............................................................17
3.1.

Đối tƣợng nghiên cứu....................................................................................... 17

3.2.

Nội dung nghiên cứu......................................................................................... 17

3.2.1.


Đặc tính sinh học............................................................................................... 17

3.2.2.

Đặc điểm gây bệnh............................................................................................ 17

3.3.

Địa điểm, thời gian nghiên cứu......................................................................... 17

3.4.

Nguyên liệu, hóa chất, máy móc....................................................................... 17

3.4.1.

Nguyên liệu........................................................................................................17

3.4.2.

Hóa chất.............................................................................................................17

3.4.3.

Máy móc dụng cụ.............................................................................................. 18

3.5.

Phƣơng pháp nghiên cứu.................................................................................. 18


3.5.1.

Phƣơng pháp chẩn đoán lâm sàng.....................................................................18

3.5.2.

Phƣơng pháp mổ khám..................................................................................... 18

3.5.3.

Phƣơng pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu làm tiêu bản.......................................18

3.5.4.

Phƣơng pháp tiến hành phản ứng RT- PCR...................................................... 19

3.5.5.

Phƣơng pháp xử lý mẫu cho phân lập virus......................................................21

3.5.6.

Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào............................................................................21

3.5.7.

Phƣơng pháp phân lập virus trên môi trƣờng tế bào........................................23

3.5.8.


Phƣơng pháp xác định hiệu giá virus TCID50...................................................23

3.5.9.

Phƣơng pháp làm và nhuộm tiêu bản vi thể......................................................24

3.5.10. Phƣơng pháp thống kê, xử lý số liệu.................................................................26
Phần 4. Kết quả và thảo luận..........................................................................................27
4.1.

Đặc tính sinh học............................................................................................... 27

4.1.1.

Xác định các mẫu lợn Yorkshire dƣơng tính với virus PEDV..........................27

4.1.2.

Kết quả phân lập và giám định virus PEDV trên môi trƣờng tế bào................29

4.1.3.

Xác định hiệu giá của chủng virus phân lập đƣợc............................................ 32

iv


4.1.4.

Khả năng gây bệnh tích tế bào của virus PEDV................................................33


4.2.

Đặc điểm gây bệnh chủ yếu của lợn mắc PEDV...............................................36

4.2.1.

Triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn mắc PEDV...........................................36

4.2.2.

Bệnh tích đại thể chủ yếu của lợn yorkshine mắc PEDV..................................39

4.2.3.

Bệnh tích vi thể chủ yếu của lợn Yorkshine mắc PEDV...................................42

Phần 5. Kết luận và kiến nghị.........................................................................................46
5.1.

Kết luận..............................................................................................................46

5.2.

Kiến nghị........................................................................................................... 47

Tài liệu tham khảo...........................................................................................................48

v



DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Tên viết tắt

Nghĩa tiếng Việt

µl

Micro lit

CPE

Cyto Pathogenic Effect

DMEM

Dulbecc’s Modified Eagle Medium

ELISA

Enzym Linked Immunosorbent Assay

FBS

Fetal bovine serum

IFA

Indirect Immunofluorescense Assay


IPMA

Indirect Immunoperoxidase Monolayer Assay

MOI

Multiplicity Of Infection

PEDV

Porcine Epidemic Diarrhea Virus

TCID50

50% Tissue Culture Infective Dose

TGEV

Transmissible Gastro Enteritis Virus

RNA

Ribonucleoic acid

vi


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1 Hệ thống máy chuyển đúc mẫu tự động gồm 12 bình.....................................24
Bảng 4.1. Kết quả của phản ứng RT-PCR ở các mẫu bệnh phẩm chẩn đoán bệnh

PEDV 28
Bảng 4.2. Nguồn gốc của các mẫu lợn Yorkshire

theo từng địa phƣơng đƣợc
chẩn đốn dƣơng tính với PEDV

30

Bảng 4.3. Kết quả phân lập virus PEDV trên môi trƣờng tế bào Vero...........................30
Bảng 4.4. Kết quả giám định virus PEDV trong các mẫu phân lập đời thứ 4.................32
Bảng 4.5. Kết quả xác định hiệu giá virus của các chủng virus PEDV phân lập
đƣợc 33
Bảng 4.6. Bệnh tích tế bào khi gây nhiễm các chủng virus PEDV phân lập..................34
Bảng 4.7. Triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn mắc PEDV........................................ 36
Bảng 4.8. Bảng kết quả biến đổi bệnh tích đại thể chủ yếu của lợn Yorkshire mắc
PEDV 39
Bảng 4.9. Biến đổi bệnh tích vi thể ở một số cơ quan

của lợn con theo mẹ mắc
PEDV 42

vii


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Cấu trúc của Coronavirus (Kathryn V.Holmes, 2003)...................................... 7
Hình 2.2. Cơ chế gây bệnh của PEDV..............................................................................9
Hình 2.3. Mơ hình ngun lý của phản ứng RT-PCR..................................................... 12
Hình 4.1. Gen đƣợc khuếch đại một phần gen S (651bp).............................................. 27
Hình 4.2. Tế bào Vero bình thƣờng................................................................................ 31

Hình 4.3. Tế bào Vero khi bắt đầu có bệnh tích.............................................................. 31
Hình 4.4. Bệnh tích tế bào đang phát triển......................................................................31
Hình 4.5. Tế bào bị phá hủy hồn tồn........................................................................... 31
Hình 4.6. Bệnh tích tế bào ở 24h - PEDV – 03...............................................................35
Hình 4.7. Bệnh tích tế bào ở 48h – PEDV – 03.............................................................. 35
Hình 4.8. Bệnh tích tế bào ở 72h – PEDV – 03.............................................................. 35
Hình 4.9. Bệnh tích tế bào ở 84h - PEDV - 03................................................................35
Hình 4.10. Lợn Yorkshire gây sút cân, gầy cịm............................................................. 38
Hình 4.11. Lợn Yorkshire nơn mửa.................................................................................38
Hình 4.12. Lợn Yorkshire nằm dồn đống........................................................................38
Hình 4.13. Phân dính hậu mơn, chân.............................................................................. 38
Hình 4.14. Phân lỏng màu vàng......................................................................................38
Hình 4.15. Phân màu xi măng.........................................................................................38
Hình 4.16. Ruột chứa dịch lỏng màu vàng......................................................................41
Hình 4.17. Thành ruột mỏng chứa đầy hơi..................................................................... 41
Hình 4.18. Hạch bẹn nơng sƣng to.................................................................................41
Hình 4.19. Thận xuất huyết điểm....................................................................................41
Hình 4.20. Phổi xuất huyết..............................................................................................41
Hình 4.21. Gan sƣng, túi mật căng.................................................................................41
Hình 4.22. Biểu mơ dạ dày đứt nát (HEx10).................................................................. 45
Hình 4.23. Ruột non sung huyết, xuất huyết (HEx10)....................................................45
Hình 4.24. Phổi sung huyết và thâm nhiễm tế bào viêm (HE x 10)................................45
Hình 4.25. Lơng nhung ruột đứt nát (HE x 10)...............................................................45
Hình 4.26. Thâm nhiễm tế bào viêm ở ruột (HE x 40)................................................... 45
Hình 4.27. Thận sƣng huyết, thâm nhiễm tế bào (HE x 10)...........................................45

viii


TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Tên tác giả: Dƣơng Thị Hồng
Tên Luận văn: “Nghiên cứu đặc tính sinh học và gây bệnh của virus gây dịch tiêu
chảy trên lợn (PEDV-Porcine Epidemic Diarrhea Virus) phân lập được từ các đàn
lợn Yorkshire nuôi tại vùng phụ cận Hà Nội”.
Ngành: Thú y

Mã số: 60 64 01 01

Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu đƣợc một số đặc tính sinh học và gây bệnh của các chủng virus
PEDV phân lập từ lợn Yorkshire mắc PEDV tại vùng phụ cận Hà Nội phục vụ cơng tác
chẩn đốn bệnh và điều chế vaccine phòng bệnh.
Phƣơng pháp nghiên cứu
 Nội dung :
- Đặc tính sinh học
+

Xác định các mẫu lợn Yorkshire dƣơng tính với virus PEDV.

+

Phân lập các chủng PEDV trên môi trƣờng tế bào.

+

Xác định hiệu giá virus của các chủng PEDV phân lập.

+
Đánh giá khả năng gây bệnh tích tế bào (CPE) của chủng PEDV phân lập trên

môi trƣờng nuôi cấy tế bào Vero.
- Đặc điểm gây bệnh
+Xác định triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn Yorkshire mắc PEDV (Porcine
Epidemic Diarrhea Virus).
+Xác định bệnh tích đại thể chủ yếu của lợn Yorkshire mắc PEDV (Porcine
Epidemic Diarrhea Virus).
+Xác định bệnh tích vi thể chủ yếu của lợn Yorkshire mắc PEDV (Porcine
Epidemic Diarrhea Virus ).
 Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu :
-Vật liệu
+ Nguyên liệu
Các lợn Yorkshire mắc bệnh PEDV nuôi ở một số trang trại tại vùng phụ cận Hà
Nội.
Tế bào Vero đƣợc nuôi cấy trên khay nuôi tế bào hoặc đĩa lồng

ix


+ Hóa chất
Hóa chất sử dụng trong làm tiêu bản vi thể: dung dịch focmon 10%, xylem, thuốc
nhuộm HE, Baume Canada, NaHCO3 1%, focmon10%, cồn, Xylen, Ethanol (96-100°),
paraffin, PBS, DAB…
Hóa chất sử dụng trong nuôi cấy tế bào: môi trƣờng nuôi cấy DMEM (Dulbecc’s
Modified Eagle Medium), FBS (Fetal bovine serum), kháng sinh ( penicillin (100
UI/ml), streptomycin (100 pg/ml)), …
+ Máy móc dụng cụ
Máy móc: Kính hiển vi, máy ly tâm, máy votex, máy chạy điện di, máy PCR,
máy đục khuôn mẫu, máy cắt tiêu bản (Microtom), máy chụp gel, cân điện, lị vi sóng,
°


°

°

máy PCR , box vơ trùng, tủ ấm 37 C/5% CO2, tủ sấy, tủ lạnh -20 C, tủ lạnh -80 C, bình
nitơ lỏng, máy ly tâm lạnh, kính hiển vi soi nổi, máy chụp ảnh,…
Dụng cụ sử dụng : Dao, kéo, panh kẹp, khay, eppendorf, bông cồn, lamen, lam
kính, bộ dụng cụ nhuộm, panh, dao, kéo, cƣa, cốc đong hóa chất, đèn cồn, ống nghiệm,
lọ đựng formol 10%, bình ni cấy tế bào, khay 96 giếng, khay 24 giếng, đĩa lồng,
pipet,…
-

Phƣơng pháp nghiên cứu

+

Phƣơng pháp chẩn đoán lâm sàng

+

Phƣơng pháp mổ khám

+

Phƣơng pháp lấy mẫu và bảo quản tiêu bản

+

Phƣơng pháp tiến hành phản ứng RT-PCR


+

Phƣơng pháp xử lý mẫu và phân lập virus

+

Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào

+

Phƣơng pháp xác định hiệu giá virus TCID50

+

Phƣơng pháp làm và nhuộm tiêu bản vi thể

+

Phƣơng pháp thống kê và xử lý số liệu

Kết quả chính và kết luận
1.

Đặc tính sinh học

Phân lập thành cơng 4 chủng virus PEDV từ 15 mẫu lợn đƣợc chẩn đốn
dƣơng tính bằng với bệnh. Bệnh tích tế bào đặc trƣng đƣợc với các đám tế bào bị dung
giải màng tế bào, nhân tế bào co cụm lại với nhau hình thành các thể hợp bào, quan sát
rõ bằng kính hiển vi soi ngƣợc.
-


Các chủng virus PEDV phân lập đƣợc có hiệu giá từ 10
5.50

10

/25µl.

x

4.25

/25µl đến


Nghiên cứu khả năng gây bệnh tích tế bào bắt đầu xuất hiện sau 24 giờ gây
nhiễm là sớm nhất. Tế bào sau gây nhiễm sẽ bị phá hủy hoàn toàn sau 84 giờ gây nhiễm.
2.
Đặc điểm gây bệnh
-

Các lợn mắc PEDV có các triệu chứng lâm sàng: lợn ủ rũ, mệt mỏi, bỏ ăn, bỏ

bú, lợn bị tiêu chảy nặng, phân lỏng màu vàng ở lợn con (100%), gầy sút giảm cân
(80,00%), nằm chồng đống, thích nằm trên bụng mẹ (46,67%).
-

Các bệnh tích đại thể thƣờng gặp ở các cơ quan khi lợn mắc PEDV chủ yếu

gặp ở đƣờng tiêu hóa: ruột căng phồng chứa đầy dịch vàng bên trong, có khi chứa hơi

căng mọng, thành ruột mỏng (100%), có khi sung huyết ruột, gan sƣng, túi mật căng,
dịch mật đặc (86,67%). Dạ dày chứa thức ăn không tiêu, sữa vón đơng 100%. Một số cơ
quan khác cũng có bệnh tích nhƣng khơng phải đặc trƣng của bệnh.
-

Một số bệnh tích vi thể của bệnh: dạ dày xuất huyết (73,33%,), sung huyết tập

trung nhiều ở các cơ quan nhƣ hạch ruột (100%), ruột, phổi, dạ dày đồng chiếm
(80,00%). Thâm nhiễm tế bào là tổn thƣơng chiếm tỷ lệ lớn trên các cơ quan: Hạch ruột
(66,67%), ruột (73,33%), phổi (80,00%). Thối hóa tế bào trên các cơ quan nhìn chung
có tỷ lệ thấp hơn, đặc biệt tập trung trên thận (80%), hạch ruột (66,67%). Hoại tử tế bào
xảy ra ít hơn trên các cơ quan (20 – 60%)

xi


THESIS ABSTRACT
Master candidate: Duong Thi Hong
Thesis title: “Studied biological characteristics and pathogenicity of the Porcine
Epidemic Diarrhea Virus (PEDV) isolated from Yorkshire pigs raised in the vicinity of
Hanoi”
Major: Veterinary

Code: 60.64.01.01

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)
Research Objectives.
Study some biological characteristics and pathogenicity of the PEDV strains
isolated from Yorkshire pigs in the vicinity of Hanoi to serve the diagnosis and vaccine
preparation.

Materials and Methods.
• Content :
-

The biological characteristics

+

Identify positive Yorkshire pig samples for the PEDV

+

Isolate the PEDV strains on the cell culture.

+

Determine the titer of the virus strains isolated PEDV.

+
Determine cytopathogenicity effect of PEDV isolated strains on the Vero cell
culture.
- Pathogenicity characteristics
+
Determine mainly clinical symptoms in the pig Yorkshire suffering
PEDV.
+
Determine mainly macroscopic lesions in the pig Yorkshire suffering
PEDV.
+
Determine mainly microscopic lesions in the pig Yorkshire suffering

PEDV.


Materials and research methods:

-Materials
The Yorkshire pig suffering PED of the some farms in the vicinity of Hanoi.
Vero cells in culture.
-Chemicals
Chemicals were used in making microscopic specimens: 10% solution formol,
xylen, HE stain, Canada Baume, NaHCO3 1%, formol 10%, alcohol, Xylene, Ethanol
(96-100 °), paraffin, PBS, DAB ...


xii


Chemicals were used in cell culture: DMEM (Dulbecc's Modified Eagle Medium),
FBS (Fetal bovine serum) and antibiotics (penicillin (100 IU / ml), streptomycin (100
pg / ml)), ...
+

Machinery and instruments

Machinery: Microscopes, centrifuges, machines VOTEX, electrophoresis, PCR

machines, perforated mold machine, Microtom, gel cameras, scales, microwaves, PCR
machines, aseptic box, incubator 37°C / 5% CO2, oven, refrigerator -20 ° C, -80°C
refrigerators, liquid nitrogen bottle, cold centrifuges, stereoscopic microscope, cameras, ...


+Instruments used:Knives, scissors, pince, tongs, trays, Eppendorf, alcohol,
cover slip, microscope slides, staining kits, forceps, knives, scissors, saws,
chemical beaker, Bunsen burner, test tubes, vials formalin 10%, average cell
culture, tray 96 wells, 24 wells tray, drive cage, pipettes, ...
-

Research Methods

+

Clinical examination

+

Autopsy, take sample

+

RT-PCR

+

Sample processing and virus isolation

+

Cell cultures

+


Determining virus titre TCID50

+

Histopathology

+

Statistics and data processing
Main results and conclusions

1. Biological characteristics
-Isolated successfully four virus strains from 15 samples of pigs infected with
PEDV. CPE characteristic were clusters, membrane lysis, syncytium, clearly observed
by reverse microscope.
-

The PEDV strains were isolated having the titre varies from 10

4.25

/25µl đến

5.50

10

/25µl.
- Possibility of causing cell lesions begin to appear after 24 hours at the earliest
infectivity. After infecting cells will be destroyed completely after 84 hours.


2.
-

Pathogenicity characteristics
Clinical symptoms: moodiness pigs, fatigue, anorexia, not feeding, the pigs

have severe diarrhea, loose stools, yellow in piglets (100%), weight loss (80.00%), lying
husband heap, like lying on the womb (46.67%).

xiii


-

The macroscopic lesions primarily seen in the gastrointestinal tract: intestinal

distension fluid-filled inner gold, sometimes containing a little plump, thin intestinal
wall (100%), with when congestion bowel, liver swelling, tension gallbladder, bile
characteristics (86.67%). The stomach contained undigested food, which accounts for
100% milk. Some other agencies also have lesions, but not characteristic of the disease.
-

Some microscopic lesions: gastric hemorrhage (73.33%), congestive

concentrated in bodies such as intestinal lymph nodes (100%), colon, lung, stomach
contracts accounted for (80, 00%). Cell infiltration was hurt on a large proportion of the
organs: intestinal lymph node (66.67%), colon (73.33%), lung (80.00%). Cell
degeneration in the organs generally has lower rates, particularly focusing on the kidney
(80%), intestinal lymph nodes (66.67%). Cell necrosis occurs less in the bodies (2060%).


xiv


PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Chăn nuôi trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam đang phát triển nhanh
chóng, khơng chỉ dừng lại ở sự gia tăng về số lƣợng mà đang trở thành một phần
của nền kinh tế sản xuất hàng hóa. Ngành chăn ni lợn có ý nghĩa rất lớn, góp
phần vào sự phát triển đó, thịt và các sản phẩm sản xuất từ lợn chiếm tỷ trọng cao
trong tổng sản lƣợng thực phẩm sản xuất ra phục vụ trong nƣớc và nƣớc ngoài.
Tuy nhiên, ngành chăn nuôi lại ngày càng bị ảnh hƣởng bởi tình hình dịch bệnh,
sự rủi ro và chi phí cho thiệt hại tiềm ẩn thông qua các sản phẩm động vật ngày
càng tăng cao trong nền chăn nuôi tập trung (FAO, 2009).
Hiện nay, tình hình dịch bệnh đang diễn ra rất phức tạp, có nhiều bệnh mới
xuất hiện rất khó kiểm sốt gây thiệt hại lớn cho ngành chăn ni. Trong đó phải kể
đến dịch tiêu chảy trên lợn do virus PEDV, đây là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm
ở lợn đã gây ra những thiệt hại đáng kể cho ngành chăn nuôi lợn trong nƣớc cũng
nhƣ trên thế giới. Bệnh xuất hiện đầu tiên ở Châu Âu vào thập niên 1970 và lan sang
Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản vào những năm 1980. Từ năm 2000 về sau bệnh
PEDV đƣợc phát hiện ở Thái Lan, Philippins, Việt Nam. Ở Việt Nam, PEDV đã
đƣợc phát hiện trong một số đàn lợn bị tiêu chảy vào năm 2008.

Nguyên nhân gây dịch tiêu chảy trên lợn là một virus thuộc giống
Coronavirus, họ Coronaviridae, cùng với TGEV. Toàn bộ gen CV77 của PEDV
có chứa 28.033 nucleotide (Kocher hans and et all, 2001), dựa trên trình tự
nucleotide của gen sao chép PEDV đƣợc xem là có mối quan hệ gần gũi nhất với
Coronavirus ngƣời 229E và TGEV. Việc nghiên cứu virus PEDV trong phịng thí
nghiệm rất khó khăn. Đã có rất nhiêu loại tế bào đƣợc thử nghiệm để nuôi cấy
PEDV nhƣng vẫn không thành công. Hofmann and Wyler (1988, 1989), Lee and

Yeo (2003) đã chỉ ra việc sử dụng dòng tế bào Vero là thích hợp cho việc phân
lập virus PEDV.
Ở
Việt Nam, trong những năm gần đây, lợn mắc PEDV vẫn thƣờng xuyên
xảy ra và có mặt trên nhiều tỉnh thành, nhiều bệnh ghép xảy ra với tốc độ lây lan
nhanh gây thiệt hại đáng kể cho ngành chăn nuôi. Đứng trƣớc thực tế trên thì yêu
cầu tìm hiểu về bệnh, tiến hành nghiên cứu các đặc tính sinh học của virus tại
thực địa sẽ có ý nghĩa lớn trong việc xác định chủng lƣu hành cũng nhƣ chẩn

1


đốn nhanh, chính xác để ngăn chặn và hạn chế dịch bệnh xảy ra là vô cùng cấp
thiết phục vụ cho việc chế tạo chế phẩm sinh học, vacine phòng bệnh và các kit
chẩn đoán bệnh nhanh. Xuất phát từ thực tế, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề
tài: “Nghiên cứu đặc tính sinh học và gây bệnh của virus gây dịch tiêu chảy
trên lợn (PEDV-Porcine Epidemic Diarrhea Virus) phân lập được từ các đàn
lợn Yorkshire nuôi tại vùng phụ cận Hà Nội ”.
1.2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI
Nghiên cứu đƣợc một số đặc tính sinh học của các chủng virus PEDV
phân lập từ lợn Yorkshire mắc bệnh do PEDV tại vùng phụ cận Hà Nội phục vụ
cơng tác chẩn đốn bệnh và điều chế vaccine phòng bệnh.
Phân lập đƣợc các chủng virus PEDV từ lợn mắc bệnh do PEDV tại
các vùng phụ cận Hà Nội.
Xác định đƣợc một số đặc tính sinh học của các chủng virus PEDV
phân lập từ lợn mắc bệnh do PEDV tại vùng phụ cận Hà Nội khi nuôi cấy trên
môi trƣờng tế bào.
Xác định đƣợc các triệu chứng lâm sàng, đặc điểm gây bệnh chủ yếu
do Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV), từ đó làm nguồn tƣ liệu tham khảo
cho các bác sỹ thú y cơ sở, ngƣời làm cơng tác chẩn đốn trong lĩnh vực thú y về

bệnh PEDV.
1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu trên lợn Yorkshire nuôi tại vùng phụ cận Hà Nội dƣơng tính
với virus PEDV.
1.4. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
Nghiên cứu đƣợc một số đặc tính sinh học và gây bệnh của các chủng
virus PEDV phân lập từ các đàn lợn Yorkshire mắc PEDV tại vùng phụ cận Hà
Nội phục vụ cơng tác chẩn đốn bệnh và điều chế vaccine phòng bệnh.

2


PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ DỊCH TIÊU CHẢY Ở LỢN
YORKSHIRE (PORCINE EPIDEMIC DIARRHEA VIRUS – PEDV)
TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM
2.1.1. Một số nghiên cứu bệnh do Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV)
trên thế giới
Pensaert and et all (1982) đã đặt tên cho virus tiêu chảy cấp là Porcine
Epidemic Diarrhea Virus – PEDV. Trên cơ sở di truyền và kháng nguyên, PEDV
đƣợc phân loại trong nhóm 1 của giống Coronavirus, họ Coronaviridae, cùng
với TGEV, Coronavirus gây bệnh cho chó mèo.
Theo Kocher hans and et all (2001) đã đƣợc giải trình tự và xác định gen
virus có chứa 28.033 nucleotide tồn bộ gen CV777 của PEDV. Dựa trên trình tự
nucleotide của gen sao chép PEDV đƣợc xem nhƣ là có mối quan hệ gần gũi
E

nhất với Coronavirus của ngƣời 229 và TGEV.
Bridgen and et all (1993) xác định trình tự gen protein N quyết định
E


PEDV giữ một vị trí trung gian giữa 229 và TGEV.
Các tác giả Callebaut, DeBouck, Lee and Yeo đã tìm ra các đặc tính sinh
hóa của virus nhạy cảm với ether và chloroform, mật độ của nó trong đƣờng
succarose là 1,18 d/ml. Tế bào thích nghi ni cấy PEDV phải ổn định trong
50°C, bị mất tác dụng gây nhiễm khi ở nhiệt độ 60°C trong 30 phút. Virus sống
đƣợc trong khoảng pH từ 4,0 đến 9,0 ở 4°C và khoảng pH từ 6,5 đến 7,5 ở 37°C
(Callebaut, Debouck and et all, 1981), (Lee, Yeo and et all, 2003).
Theo Kweon and et all (1993) chỉ ra rằng khơng có thêm bằng chứng nào
chứng tỏ có hơn một serotype của PEDV. Các đoạn polypeptide phân lập đƣợc ở
Hàn Quốc cho thấy khối lƣợng phân tử cũng tƣơng tự với dòng nguyên mẫu
CV7777.
Việc nghiên cứu PEDV trong phịng thí nghiệm rất khó khăn. Đã có nhiều
loại tế bào đƣợc thử nghiệm để nuôi cấy PEDV nhƣng vẫn không thành công.
Các tác giả Hofmann and Wyler (1988, 1989), Lee and Yeo (2003) đã tìm ra tế
bào Vero (thận khỉ xanh Châu Phi) để hỗ trợ cho công tác nối tiếp các đời của
PEDV. Virus phát triển phụ thuộc vào sự có mặt của trypsin trong mơi trƣờng

3


nuôi cấy tế bào. Bệnh lý tế bào do virus gây ra là các thể không bào và hợp bào
lên tới 100 nhân. Sau 15 giờ gây nhiễm virus nhân lên nhanh với hiệu quả cao
nhất 105,5 đơn vị tế bào.
Từ năm 1982 tới năm 1990, những kháng thể kháng lại PEDV đƣợc xác
định trong quần thể lợn tại Bỉ, Hà Lan, Thụy Sỹ, Bungari, và Đài Loan (Hofmann
and Wyler, 1987). Ở vùng Đông Bắc Ấn Độ 21,2 % trong số 528 mẫu huyết
thanh của lợn từ 2 đến 6 tháng tuổi dƣơng tính với kháng thể PEDV. Virus đã
đƣợc phân lập ở hầu hết các nƣớc chăn nuôi lợn tại Châu Âu cũng nhƣ ở Trung
Quốc. Hiện chƣa có báo cáo nào công bố về sự bùng phát PEDV ở vùng Bắc và

Nam Mỹ.
Ở
Châu Âu, sự bùng phát PEDV ít xảy ra và gần đây những báo cáo
nghiên cứu về sự lƣu hành cũng nhƣ chẩn đốn PEDV ít đƣợc thực hiện.
Tại Hà Lan, một nghiên cứu về virus học lâm sàng ở các ca PEDV cấp
tính trong một trại nuôi cả lợn thịt và lợn giống đã đƣợc thực hiện. Kết quả cho
thấy tiêu chảy trầm trọng xảy ra trên lợn vỗ béo và lợn nái sinh sản với lợn con
theo mẹ và lợn con cai sữa, bệnh biểu hiện nhẹ hơn hoặc khơng biểu hiện. Bệnh
sau đó trở thành dịch địa phƣơng tồn tại ở độ tuổi từ 6 đến 10 tuần tuổi và ở lợn
hậu bị mới nhập về trong thời gian ít nhất 1,5 năm kể từ khi bệnh bùng phát lần
đầu tiên.
Ở

Tây Ban Nha, PEDV đã đƣợc xác nhận là nguyên nhân gây dịch tiêu

chảy địa phƣơng tại 7 trong số 15 trại, với triệu chứng tiêu chảy kéo dài trên một
số lợn nái tại một trại. Xét nghiệm huyết thanh học đã đƣợc thực hiện từ năm
1992 đến 1993 cho thấy 1513 trong số 5052 lợn nái có kháng thể đặc hiệu kháng
PEDV, chiếm 55% trong số 803 trại giống theo dõi (Carvajal and et all, 1995).
Ở

Bỉ, một nghiên cứu về huyết thanh học trên các trại lợn nuôi vỗ béo cho

thấy 50% trại kiểm tra dƣơng tính với PEDV, năm 1993. Tuy nhiên khơng có trại
nào dƣơng tính khi kiểm tra lại vào năm 1997, điều này chỉ ra rằng trong những
năm gần đây mức độ lƣu hành của virus đã giảm đáng kể (Pensaert and et all,
1998).
Ở

Anh, PEDV bùng phát lần đầu năm 1998 kéo dài trên 2 tháng bệnh xảy


ra ở 3 lứa lợn liên tiếp trong giai đoạn từ 8 đến 15 tuần tuổi tại một trại nuôi
hƣớng thịt.

4


Ở

Hungari, năm 1995 có 5,5% trong số 92 mẫu lợn cai sữa thu từ 19 trại

kiểm tra dƣơng tính vơi PEDV và virus này đƣợc xác định là căn nguyên quan
trọng nhất gây ra tiêu chảy ở lợn sau cai sữa.
Ở

Cộng Hòa Séc, 27 trong 219 mẫu phân thu đƣợc từ lợn tiêu chảy ít hơn

21 ngày tuổi dƣơng tính với PEDV, lợn thƣờng bị ghép với các virus gây ra tiêu
chảy khác (Rodak and et all, 2004).
Khác với tình trạng hiện nay ở Châu Âu, dịch tiêu chảy xảy ra gần đây rất
trầm trọng với tỷ lệ cao đã đƣợc báo cáo ở các khu vực Châu Á. Các đợt bùng
phát xảy ra ở dạng cấp tính rất nghiêm trọng, rất khó phân biệt về mặt lâm sàng
với bệnh TGE ở thể cấp tính.
Ở

Nhật Bản, những đợt dịch bùng phát vào tháng 9 năm 1993 và tháng 6

năm 1994 đã làm 1400 lợn chết với tỷ lệ từ 30 đến 100% ở lợn con theo mẹ.
Trong suốt thời gian xảy ra dịch lợn trƣởng thành chỉ có biểu hiện chán ăn một
thời gian ngắn và lợn nái giảm sản lƣợng sữa (Speyosbi and et all,1995). Mùa

đông năm 1996, một đợt dịch PEDV đã xảy ra ở 108 trại lợn tiêu chảy chủ yếu
gặp ở lợn con và 39500 trong số 56256 lợn con mắc PEDV đã chết.
Cũng ở Nhật Bản năm 2000, Shibata and et all đã nghiên cứu thành công
sự nhân lên của virus PEDV trong tế bào bàng quang và thận lợn. Tiếp theo đó,
Kadoi and et all (2002) đã phân lập đƣợc dòng P-5V sử dụng một chủng vaccine
ni cấy trong tế bào lợn dịng KSEK6 và IB-RS2.
Ở

Hàn Quốc, PEDV đã gây tiêu chảy trên lợn ở mọi lứa tuổi. Trong 71 ca

bệnh đƣờng tiêu hóa do virus đƣợc chẩn đoán tại Viện nghiên cứu Thú y, từ
tháng 1 năm 1992 đến tháng 12 năm 1993 có 56,33% ca đƣợc xác định là PEDV,
trong đó lợn con dƣới 10 ngày tuổi chiếm tới 90% số ca mắc bệnh. Từ tháng 8
năm 1997 tới tháng 7 năm 1999 có 1258 ca bệnh đƣờng ruột ở lợn xảy ra tại 5
tỉnh thành trong đó có 50,4% đƣợc xác định là PEDV (Chae Kim and et all,
2000). Xét nghiệm huyết thanh học tại các cơ sở giết mổ ở Hàn Quốc cho thấy
trong số 469 mẫu huyết thanh thu từ 7 tỉnh có từ 17,6 đến 79% (trung bình 45%)
là dƣơng tính với PEDV, điều này cho thấy virus đã trở thành dịch địa phƣơng
tại một số vùng. Từ kết quả nghiên cứu đƣợc, có một số ý kiến cho rằng tình
trạng PEDV ở Châu Á tiến triển trong thời gian gần đây phản ánh bệnh mang tính
địa phƣơng rõ hơn khi lƣu hành trong quần thể nái nào đã có miễn dịch.

5


2.1.2. Tình hình nghiên cứu bệnh do Porcine Epidemic Diarrhea Virus
(PEDV) ở Việt Nam
Ở

Việt Nam có nghiên cứu của các tác giả Đỗ Tiến Duy, Nguyễn Tất Toàn


và cs (2001), PEDV xảy ra lần đầu tiên ở Việt Nam vào đầu năm 2008. PEDV ở
Việt Nam có sự khác biệt cao về một phần trình tự nucleotide của gen S so với
các tài liệu đã đƣợc công bố nhƣ PEDV phân lập ở Châu Âu (Brl/87.CV777) và
ở Hàn Quốc (Spk1, Chinju 99, DR13 và KNU-0801). Mối quan hệ của hai gen
protein S và N đã chỉ ra rằng PEDV ở Việt Nam giống với dòng virus phân lập ở
Trung Quốc (JX-2004-2 và DX), ở Thái Lan (07NP01, 08NP02 và 08CB01), gần
đây ở Hàn Quốc (KNU-0802 và CPF299). Từ các kết quả nghiên cứu trên chỉ ra
rằng PEDV ở Việt Nam có nguồn gốc ở Trung Quốc trải qua di truyền và biến
thể nhiều đời hình thành nên một PEDV mới ở Việt Nam.
Các tác giả Nguyễn Tất Tồn, Nguyễn Đình Quát và cs (2012) đã phân
biệt đƣợc PEDV và TGEV bằng phƣơng pháp nested RT-PCR trong các ổ dịch
từ năm 2008 đến 2010. Trong 284 mẫu phân tích có 41,09% tỷ lệ dƣơng tính với
PEDV mà khơng phát hiện dƣơng tính với TGEV và tỷ lệ mẫu dƣơng tính với
PEDV ở ruột là 58,14% cao hơn hẳn mẫu phân 16,96%.
Ngoài nghiên cứu của nhóm tác giả trên thì Việt Nam chƣa có thêm nghiên
cứu nào đƣợc cơng bố để cho thấy sự lƣu hành các chủng của bệnh PEDV

ở

các tỉnh thành khác nhau.

2.2. HIỂU BIẾT VỀ CĂN BỆNH
2.2.1. Phân loại
PEDV đƣợc xếp vào nhóm 1, giống Coronavirus, họ Coronaviridae, cùng
với TGEV, Coronavirus gây ra bệnh cho mèo (Feline Coronavirus), Coronavirus
gây ra bệnh cho chó (Canine Coronavirus), và Coronavirus gây ra bệnh cho
E

ngƣời chủng 229 (Human Coronavirrus). Dựa vào kết quả giải trình tự gen cho

E

thấy PEDV có quan hệ với Coronavirrus gây ra bệnh cho ngƣời chủng 229 và
TGEV
2.2.2. Hình thái cấu trúc
PEDV có cấu trúc giống với các virus khác trong họ, có đƣờng kính
khoảng 95-190 nm, có một lớp bề mặt hình dùi cui nhơ ra ngồi khoảng 18-23

6


nm. Là virus có vỏ bọc. Nhân có cấu trúc là RNA sợi đơn, kích thƣớc phân tử
27-32 kb.
PEDV mang glycoprotein S (spike) có khối lƣợng phân tử 180000200000 dalton và protein N (nucleocapsid) có khối lƣợng phân tử 57000-58000
dalton. Virus khơng có khả năng gây ngƣng kết hồng cầu.

Hình 2.1. Cấu trúc của Coronavirus (Kathryn V.Holmes, 2003)
2.2.3. Tính chất ni cấy
PEDV có thể nhân lên khi gây bệnh thực nghiệm bằng cách cho lợn con uống
virus PEDV có khả năng thích ứng kém trong điều kiện ni cấy phịng thí nghiệm.
Ngƣời ta đã thử nghiệm ni cấy virus trên nhiều loại tế bào khác nhau nhƣng rất ít
thành cơng. Đến nay tế bào Vero có thể cấy chuyển đƣợc PEDV, gây bệnh tích tế
bào, tuy nhiên sự phát triển của virus phụ thuộc vào sự có mặt của trypsin trong môi
trƣờng nuôi cấy. Hiệu giá virus đạt tối đa sau khi nuôi cấy 15 giờ.

2.2.4. Sức đề kháng
PEDV mẫn cảm với ether và chloroform. Với nhiệt độ 60°C, virus mất
hoạt tính sau 30 phút, nhƣng lại tƣơng đối bền ở nhiệt độ 50°C.
Ở nhiệt độ 4°C, pH dao động từ 4 đến 9 hoặc 6,5 đến 7,5 virus tƣơng đối bền.


7


2.3. HIỂU BIẾT VỀ BỆNH DO PORCINE EPIDEMIC DIARRHEA VIRUS
(PEDV)
2.3.1. Lồi mắc bệnh
Bệnh xảy ra ở lồi lợn, có thể mắc ở mọi lứa tuổi. Trong nhiều ổ dịch, tỷ
lệ ốm lên đến 100%, tỷ lệ chết trung bình ở lợn con là 50% nhƣng cũng có thể
rất cao đến 100%.
Nếu lợn con mắc bệnh ở độ tuổi 6-7 ngày tuổi tỷ lệ chết khoảng 50%.
Nếu lợn con mắc bệnh ở độ tuổi lớn hơn 7 ngày tuổi tỷ lệ chết khoảng 30%.

2.3.2. Lứa tuổi mắc bệnh
Bệnh do PEDV thƣờng gây bệnh ở lợn 1 đến 3 tuần tuổi, khi lợn con
chƣa hoàn chỉnh hệ thống miễn dịch, lợn con khơng cịn đƣợc bú sữa mẹ, khơng
đƣợc nhận kháng thể từ mẹ nữa.
2.3.3. Đƣờng xâm nhập
Các chất chứa mầm bệnh nhƣ dịch miệng, phân, hạch amidan, trong dụng
cụ chăn nuôi,… của lợn bệnh có thể lây sang cho lợn khỏe bằng phƣơng thức
tiếp xúc trực tiếp hay gián tiếp.
Bệnh lây lan chủ yếu qua đƣờng tiêu hóa, lợn khỏe tiếp xúc trực tiếp với
phân, dịch miệng của lợn bệnh.
Tiếp xúc gián tiếp qua dụng cụ chăn nuôi nhƣ mắng ăn, mắng uống, nền
chuồng,… của lợn mang virus bài thải ra.
PEDV có nhiều điểm tƣơng đồng với TGEV về đƣờng truyền lây, nhƣng
virus này tồn tại lâu hơn trong các trại sau khi PEDV cấp tính đã đi qua.
2.3.4. Cơ chế sinh bệnh
Để nghiên cứu cơ chế sinh bệnh của PEDV, ngƣời ta sử dụng lợn con sinh
ra không đƣợc bú sữa đầu. Cho lợn 3 ngày tuổi uống virus chủng CV777, sau 22,
36 giờ bắt đầu có biểu hiện bệnh. Bằng kính hiển vi điện tử, quan sát thấy virus

nhân lên đầu tiên trong tế bào chất của các tế bào biểu mô lông nhung từ ruột non
đến hết kết tràng. Tại ruột non tế bào nhiễm virus bị phá hủy khiến cho lông
nhung ngắn lại (tỷ lệ chiều cao và độ dày của lông nhung thay đổi từ 7,1 xuống
3,1) tuy nhiên không quan sát đƣợc tế bào biểu mô kết tràng bị phá hủy.
Cơ chế sinh bệnh ở ruột non của PEDV cũng giống nhƣ TGEV, tuy nhiên
do thời gian nhân lên của PEDV trong ruột non chậm hơn nên thời gian nung

8


bệnh thƣờng dài hơn so với TGEV. Khơng có bằng chứng nào cho thấy sự có sự
nhân lên của virus ở các tế bào bên ngồi đƣờng tiêu hóa.
Cơ chế sinh bệnh của PEDV ở lợn lớn không đƣợc nghiên cứu chi tiết,
nhƣng ngƣời ta vẫn ghi nhận có sự nhân lên của virus trong tế bào biểu mô ở cả
ruột non và kết tràng. Tuy nhiên, hiện tƣợng một số lợn thịt bị chết đột ngột, cơ
lƣng bị hoại tử cấp tính vẫn chƣa đƣợc làm sáng tỏ.
Biểu hiện và tiến trển lâm sàng ở lợn sạch bệnh (không nhiễm PEDV) bị
gây nhiễm chủng PEDV đã thích nghi trên môi trƣờng nuôi cấy tế bào (chủng ca
– PEDV) nhẹ hơn nhiều so với lợn nhiễm chủng PEDV thể hoang dại (chủng wt
– PEDV). So với chủng wt – PEDV, độc lực của chủng ca – PEDV yếu hơn
nhiều tốc độ sinh sản virus chậm hơn và sự biến đổi về mặt vi thể ở các cơ quan
của lợn nhiễm virus cũng kém rõ ràng hơn.
Virus
Nhiễm qua đƣờng miệng
Nhân lên ở biểu mô ruột non, dạ dày

Giảm hoạt động của
enzyme bề mặt biểu mô

Hội chứng giảm hấp thu

( mất nƣớc nặng, chết)

ình 2.2. Cơ chế gây bệnh của
PEDV 2.3.5. Triệu chứng lâm sàng
Triệu chứng đặc trƣng khi lợn mắc PEDV là hiện tƣợng lợn bỏ ăn mệt
mỏi, tiêu chảy, phân nhiều nƣớc. Lợn con theo mẹ lƣời bú, ỉa chảy, phân lỏng
tanh, màu vàng có sữa khơng tiêu, nơn mửa, lợn con sụt cân nhanh do mất nƣớc.

9