Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 2 * 2020

Nghiên cứu

XÂY DỰNG
T NH ĐỊNH ƯỢNG ĐỒNG THỜI IRBESARTAN VÀ
HYDROCLOROTHIAZID TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI
BẰNG KỸ THUẬT LC-MS/MS
hương g c Nãi*, Lê Thị Đào**, Lê Nguyễn Trung Nguyên*, Nguyễn Văn r ng*,
Trần Việt Hùng*, Nguyễn Đức Tuấn**

TÓM TẮT
ở đầ : Phối hợp của irbesartan (IRB) và hydroclorothiazid (HCTZ) được chỉ định trong điều trị phù nề và
tăng huyết áp. Các nghiên cứu lâm sàng về IRB và HCTZ cho thấy sự kết hợp này có hiệu quả lâm sàng. Cho đến
nay, chỉ có một chế phẩm phối hợp IR và HCTZ được sản xuất trong nước với giá thành rẻ hơn so với các sản
phẩm ngoại nhập. Để chứng minh hiệu quả điều trị tương đương giữa thuốc generic và thuốc phát minh, cần
phải đánh giá tương đương sinh học in vivo. K thuật LC-MS/MS có nhiều ưu điểm như độ nhạy và tính đặc
hiệu cao, thời gian phân tích ngắn và giới hạn định lượng các chất thấp trên các nền mẫu dịch sinh học. Vì vậy, k
thuật này đang được áp dụng phổ biến để định lượng hoạt chất trong dịch sinh học. Hiện tại, chỉ có một vài cơng
trình định lượng đồng thời IRB và HCTZ trong huyết tương người bằng k thuật LC- /
được công bố
trên thế giới. Tuy nhiên, cho đến nay chưa có tác giả nào trong nước cơng bố quy trình định lượng đồng
thời IRB và HCTZ trong huyết tương người. Do đó, đề tài này được thực hiện với mục tiêu xây dựng và
thẩm định quy trình định lượng đồng thời irbesartan và hydroclorothiazid trong huyết tương người bằng
k thuật LC-MS/MS theo hướng dẫn của
-FD và E
, là cơ sở để phục vụ cho việc đánh giá tương đương
sinh học của các chế phẩm chứa IRB và HCTZ.
Đối tượng nghiên cứ : IRB và HCTZ trong các mẫu huyết tương người giả lập.
hương pháp nghiên cứ : Mẫu huyết tương giả lập chứa các chất phân tích và chuẩn nội telmisartan được
xử lý bằng các phương pháp như kết tủa protein với methanol, acetonitril; chiết lỏng-lỏng với tert-butyl methyl

ether, ethyl acetat và hỗn hợp tert-butyl methyl ether -ethyl acetat. Mẫu sau khi xử lý sẽ được định lượng bằng k
thuật LC-MS/MS, sử dụng cột sắc ký pha đảo, pha động methanol và đệm amoni format 5 mM pH 5. Sau cùng,
quy trình định lượng được thẩm định theo hướng dẫn của US-FDA và EMA.
ết ả: IRB, HCTZ và chuẩn nội đã được ion hóa bằng k thuật E I và được ghi phổ bằng k thuật
R để thu được các ion phân tử và ion phân mảnh d ng cho định lượng. Quy trình định lượng đồng
thời IRB và HCTZ trong huyết tương người bằng k thuật LC/
đã được xây dựng, sử dụng cột sắc
ký Gemini C18 (250 x 2 mm; 5 μm), pha động methanol và đệm amoni format 5 mM, pH 5 (80:20, tt/tt),
tốc độ dòng 0,4 ml/phút. Mẫu huyết tương giả lập được xử lý bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng với hỗn
hợp tert-butyl methyl ether - ethyl acetat (50:50, tt/tt) cho hiệu suất chiết trên 95 . Quy trình định lượng đã
được thẩm định đạt yêu cầu của một quy trình phân tích thuốc trong dịch sinh học.
ết l ận: Quy trình định lượng đồng thời IRB và HCTZ trong huyết tương người bằng k thuật LC/
đã được xây dựng và thẩm định với độ nhạy, độ đặc hiệu và độ chính xác cao. Quy trình có thể được ứng
dụng để đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học của các chế phẩm chứa IRB và HCTZ.
ừ hóa: LC-MS/MS, irbesartan, hydroclorothiazid, huyết tương người

*

Viện Kiểm nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh
Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: PGS.TS. Nguyễn Đức Tuấn
ĐT: 0913799068
**

B – Khoa học Dược

Email:

131



Nghiên cứu

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 2 * 2020

ABSTRACT
DEVELOPMENT OF LC-MS/MS METHOD FOR SIMULTANEOUS DETERMINATION OF
IRBESARTAN AND HYDROCHLOROTHIAZIDE IN HUMAN PLASMA
Chuong Ngoc Nai, Le Thi Dao, Le Nguyen Trung Nguyen, Nguyen Van Trung,
Tran Viet Hung, Nguyen Duc Tuan
* Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol. 24 - No. 2 - 2020: 131 - 141
Background - Objectives: Combination of irbesartan (IBR) and hydrochlorothiazide (HCTZ) is indicated
in the treatment of edema and hypertension. Clinical studies on IRB and HCTZ suggest that this combination is
effective. So far, there has been only one formulation of IRB and HCTZ combination produced locally with a
competitive price than one of imported products. In order to prove clinically equivalent efficacy between generic
and patent drugs, the in vivo bioequivalence study is mandatory. The LC-MS/MS technique has several
advantages such as high sensitivity and specificity, short analysis time and low limit of quantitation. This
technique is being applied commonly to quantify active ingredients in biological fluids. There have been several
simultaneous quantitative studies of IRB and HCTZ in human plasma by LC-MS/MS until now. However, no
local authors have published the simultaneous quantitative studies of IRB and HCTZ in human plasma, so far.
Therefore, this study has been performed with the aim of development and validation of the simultaneous
quantitative procedure of irbesartan and hydrochlorothiazide in human plasma by LC-MS/MS in accordance with
the guidelines of US-FDA and EMA, contributing to the in vivo bioequivalence study of pharmaceuticals
containing IRB and HCTZ.
Method: The object of this study is IRB and HCTZ spiked into blank human plasma samples. Method: Blank
human plasma samples containing the analytes and telmisartan as internal standard, were treated by protein
precipitation with methanol, acetonitrile; liquid-liquid extraction with tert-butyl methyl ether, ethyl acetate and
mixture of tert-butyl methyl ether and ethyl acetate. The treated samples were quantified by LC-MS/MS, using
reverse phase column, mobile phase containing methanol and ammonium formate buffer 5 mM with pH 5.
Finally, the quantitative procedure was validated on the basis of FDA and EMA guidelines on bioanalytical

method validation.
Results: IRB, HCTZ and internal standard were ionized using ESI source and detected by multiple reaction
monitoring (MRM) mode to obtain molecular ions and fragment ions for quantification. The procedure for
simultaneous assay of IRB and HCTZ in human plasma by LC-MS/MS was developed, using Gemini C18
column (250 x 2 mm; 5 µm), mobile phase containing methanol and ammonium formate buffer 5 mM with pH 5
(80:20, v/v), and flow rate of 0.4 ml/min. The human plasma samples were treated by liquid-liquid extraction with
a mixture of tert-butyl methyl ether and ethyl acetate (50:50, v/v), which gave the recovery above 95%. The
procedure was successfully validated with general requirements for a bioanalytical procedure.
Conclusion: The procedure for simultaneous assay of IRB and HCTZ in human plasma by LC-MS/MS was
succesfully developed and validated, that proves high sensitivity, specificity and accuracy. The procedure can be
applied for in vivo bioequivalence study of combination medical products containing IBR and HCTZ.
Keywords: LC-MS/MS, irbesartan, hydrochlorothiazide, human plasma
nghiên cứu lâm sàng về IRB và HCTZ cho
ĐẶT VẤNĐỀ
thấy sự kết hợp này có hiệu quả lâm sàng(1).
Phối hợp của irbesartan (IRB) và
Cho đến nay, chỉ có một chế phẩm phối hợp
hydroclorothiazid (HCTZ) được chỉ định
R và HCTZ được sản xuất trong nước với
trong điều trị phù nề và tăng huyết áp. Các

132

B – Khoa học Dược


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 2 * 2020
giá thành rẻ hơn so với các sản phẩm ngoại
nhập. Để giảm chi phí điều trị cho người bệnh
thì cần phải đánh giá tương đương sinh học

giữa thuốc generic và thuốc phát minh. Kỹ
thuật LC-MS/MS có nhiều ưu điểm như độ
nhạy và tính đặc hiệu cao, thời gian phân tích
ngắn và giới hạn định lượng các chất thấp trên
các nền mẫu dịch sinh học. Vì vậy, kỹ thuật
này đang được áp dụng phổ biến để định
lượng hoạt chất trong dịch sinh học. Hiện tại,
chỉ có một vài cơng trình định lượng đồng thời
IRB và HCTZ trong huyết tương người bằng
kỹ thuật LC-MS/MS được công bố trên thế
giới(2,3). Tuy nhiên, cho đến nay chưa có tác giả
nào trong nước cơng bố quy trình định lượng
đồng thời IRB và HCTZ trong huyết tương
người. Bài báo này công bố một quy trình định
lượng
đồng
thời
irbesartan
và
hydroclorothiazid trong huyết tương người
bằng kỹ thuật LC-MS/MS theo hướng dẫn của
US- DA và MA, là cơ sở để phục vụ cho việc

Nghiên cứu
đánh giá tương đương sinh học của các chế
phẩm chứa IRB và HCTZ.

ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU
Đối tượng nghiên cứu
IRB và HCTZ trong các mẫu huyết tương

người giả lập.

g ên vật liệ
Chất chuẩn
Irbesartan (IRB) có số lơ QT201 040717, hàm
lượng 99,40% tính trên nguyên trạng;
Telmisartan (chuẩn nội, IS) có số lơ QT217
030617, hàm lượng 99,70% tính trên nguyên
trạng. Tất cả do Viện Kiểm nghiệm thuốc TP. Hồ
Chí Minh cung cấp. Hydroclorothiazid (HCTZ)
có số lơ 0114308.01, hàm lượng 99,55% tính trên
nguyên trạng do Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung
ương cung cấp. Hình 1 minh họa cơng thức cấu
tạo của IRB, HCTZ và IS.

8
7

9

3

5

4
3

6

4


1

5
3

6

1
1'

6'

4
2'

1'

3'

6'

1

5

1
5'

7

5'

2

6
2
5

2

3

4

2'

4'

4
3

3'

1

2

5

2


6

5

1

4

2
3

7
6

4'

Telmisartan (IS)

Irbesartan (IRB)
5
6
4
7

3

1 2
8


Hydroclorothiazid (HCTZ)
Hình 1. Cơng thức cấu tạo của irbesartan, hydroclorothiazid và chuẩn nội telmisartan

B – Khoa học Dược

133


Nghiên cứu
Dung mơi, hố chất
Acetonitril và methanol đạt tiêu chuẩn dùng
cho LC-MS. Ethyl acetat, tert-butyl methyl ether,
dicloromethan, acid phosphoric, amoni format,
acid formic đạt tiêu chuẩn phân tích.
Huyết tương trắng
Do bệnh viện Truyền máu và Huyết học TP.
Hồ Chí Minh cung cấp, được bảo quản ở  -25oC.
Thiết bị và dụng cụ phân tích
Các thiết bị phân tích đều được hiệu chuẩn
theo yêu cầu của GLP và ISO/IEC 17025, bao
gồm: hệ thống LC-MS/MS 8040 (Shimadzu Nhật Bản), cân phân tích (Mettler Toledo - Thuỵ
Sĩ) và máy đo pH (Mettler Toledo - Thuỵ Sĩ). Các
dụng cụ thủy tinh đạt yêu cầu chính xác dùng
trong phân tích: bình định mức, micropipet.
Phương pháp nghi n cứu

Chuẩn bị mẫu
Dung dịch chuẩn
Gồm R , HCTZ, S được pha trong
methanol với nồng độ mỗi chất là 1 µg/mL để

tiến hành khảo sát điều kiện khối phổ. Hỗn hợp
chuẩn gồm IRB, HCTZ, IS được pha trong
methanol với nồng độ mỗi chất là 100 ng/mL để
tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký. Mẫu giả lập
được chuẩn bị bằng cách thêm hỗn hợp chuẩn
vào huyết tương trắng với tỷ lệ 5% thể tích.

Khảo sát điều kiện khối phổ
Quy trình phân tích được thực hiện trên hệ
thống LC-MS/MS với các điều kiện khối phổ ban
đầu như tốc độ dịng khí nitơ 15,0 lít/phút, tốc độ
dịng khí phun 3,0 lít/phút, nhiệt độ khí bay hơi
250oC, nhiệt độ buồng ion hóa 400oC, áp suất khí
phun 25 psi, điện thế mao quản 4000 V.
Các điều khảo sát bao gồm : chế độ S để
khảo sát mảnh ion phân tử của các chất, chế độ
MRM để khảo sát mảnh ion định lượng của
các chất, thế phân mảnh và năng lượng va
chạm được khảo sát và tối ưu hóa bằng cơng
cụ tối ưu hóa tự động Optimize Voltage của
phần mềm Lab Solutions 5.0 sao cho thu được

134

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 2 * 2020
tín hiệu các mảnh ion có tỷ số khối lượng/điện
tích (m/z) cao nhất.

Khảo sát điều kiện sắc ký
Dựa vào đặc tính, cấu trúc hóa học của các

chất phân tích và tham khảo tài liệu được cơng
bố(2), các điều kiện sắc ký sau đây được lựa chọn
để khảo sát: hệ pha động acetonitril/ methanol –
amoni format 5 mM (pH từ 3 – 6), thay đổi tỷ lệ
thích hợp và nồng độ amoni format; Tốc độ
dòng 0,35 – 0,45 mL/phút; Nhiệt độ cột sắc ký 30
- 45oC; Thể tích tiêm mẫu 2 – 10 µL. Chọn điều
kiện sắc ký thích hợp sao cho các pic hoạt chất và
pic chất chuẩn nội cân đối, thời gian phân tích
ngắn và tín hiệu cao.
Khảo sát phương pháp lý mẫu
Dựa theo các cơng trình đã cơng bố(2,4) và độ
phân cực của chất phân tích, phương pháp tủa
protein và chiết lỏng - lỏng đã được lựa chọn.
Chọn phương pháp xử lý mẫu sao cho hiệu suất
chiết cao, ổn định, sự ảnh hưởng của nền mẫu là
tối thiểu.
Xác định khoảng nồng độ định lượng
Sau khi đã thiết lập được điều kiện sắc ký,
điều kiện khối phổ và phương pháp xử lý mẫu,
cần phải tính tốn xây dựng khoảng nồng độ
tuyến tính của từng hoạt chất trong quy trình và
các mức nồng độ của các mẫu kiểm chứng
(LLOQ, LQC, MQC, HQC) phù hợp với đường
chuẩn và theo những hướng dẫn của quy trình
định lượng thuốc trong dịch sinh học(5,6). Dựa
vào nồng độ Cmax của IRB và HCTZ từ các tài liệu
tham khảo(2,3) xác định khoảng nồng độ định
lượng các hoạt chất.
Thẩm định quy trình phân tích:

Quy trình định lượng IRB và HCTZ trong
huyết tương người bằng kỹ thuật LC-MS/MS
được thẩm định dựa theo những quy định và
yêu cầu trong hướng dẫn của US-FDA và
EMA về các chỉ tiêu tính đặc hiệu; đường
chuẩn và khoảng tuyến tính; giới hạn định
lượng dưới; độ đúng và độ chính xác; hiệu
suất chiết; ảnh hưởng của nền mẫu, lượng

B – Khoa học Dược


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 2 * 2020
mẫu tồn dư và độ pha loãng; độ ổn định của
hoạt chất(5,6).

KẾT QUẢ
Kh

át điều ki n khối phổ

Bảng 1. Các thông số khối phổ tối ưu để phân tích
IRB, HCTZ và IS
Hoạt chất
IRB HCTZ
IS
Thơng số
Kiểu ion hóa ESI
+
+

Điện thế ion hóa (V)
4000 4000 4000
o
Nhiệ độ
b y ơi ( C)
250
250
250
Tố độ dịng khí phun (L/phút)
3
3
3
5.0

Nghiên cứu
Hoạt chất
IRB
Thơng số
Tố độ dị g
b y ơi (L/
)
15
o
Nhiệ độ buồng ion hố ( C)
400
Chế độ ghi phổ
Thế Q1 (V)
-24
Nă g
ng va ch m (V)

-26
Thế Q2 (V)
-20
Ion phân tử
429,15
Ion phân mảnh
207,00

HCTZ

IS

15
15
400
400
MRM
14
-24
20
-50
16
-26
295,90 515,00
268,95 276,10

Bảng 1 tóm tắt điều kiện khối phổ tối ưu để
phân tích IRB và HCTZ. Hình 2 minh họa phổ
khối của các chất phân tích.
Inten. (x1,000,000)


Inten. (x1,000,000)
115

207

(A)

(B)

4.0

1.5

429

3.0

429

1.0

2.0

195

0.5

1.0
0.0

100

200

300

400

0.0
100

m/z

Inten. (x10,000,000)

150

200

250

300

350

400

450

500


550

m/z

Inten. (x100,000)
4.0

296

1.00

269

(C)

(D)

205

3.0

296

0.75

2.0

298


0.50
0.25

332

239

165

1.0

359

126

0.00
100

150

200

250

300

350

400


m/z

Inten. (x1,000,000)

0.0
100

1.50

515

(E)

150

200

250

300

350

400

450

550

m/z


Inten. (x1,000,000)

276

(F)
)
497

1.25

5.0

500

1.00
0.75
0.50

2.5

0.0
350

400

450

500


550

289

193

0.25

537

371 413

515
317

600

650

700

750

m/z

0.00
100

150


200

250

300

467
350

400

450

500

550

m/z

Hình 2. Phổ khối (ion phân tử và ion phân mảnh) của IRB (A và B), HCTZ (C và D), và IS (E và F) ở
cùng nồng độ 1 µg/mL
đầu như sau: cột sắc ký Gemini C18 (250 x 2
Kh
át điều ki n sắc ký
mm; 5 µm), nhiệt độ cột 40oC, tốc độ dịng 0,4
Quy trình phân tích được thực hiện trên hệ
mL/phút, thể tích tiêm 5 µL. Hỗn hợp chuẩn
thống LC-MS/MS với các điều kiện sắc ký ban

B – Khoa học Dược


135


Nghiên cứu
IRB và HCTZ: 100 ng/mL. Nồng độ dung dịch
chuẩn nội 100 ng/mL.

Khảo sát pha động
Hai hệ pha động sau đây đã được tiến
hành khảo sát: acetonitril–amoni format 10
mM pH 5 (80:20) và methanol–amoni format
10 mM pH 5 (80:20). Các kết quả khảo sát cho
thấy với pha động acetonitril - amoni format
10 mM pH 5 (80:20), các chất phân tích khơng
tách hồn tồn, pic khơng cân đối. Trong khi
đó, với pha động methanol - amoni format 10
mM pH 5 (80:20), các chất tách hồn tồn, pic
cân đối và tín hiệu cao nên pha động này được
lựa chọn để khảo sát tiếp.
Khảo sát nồng độ dung dịch amoni format
Tiến hành khảo sát nồng độ dung dịch
amoni format từ 1-10 mM. Các kết quả khảo sát
cho thấy với dung dịch amoni format 1 mM, các
chất không tách được. Khi nồng độ dung dịch
amoni format tăng từ 3-10 mM, thời gian lưu của
các chất giảm, tất cả các chất tách hoàn toàn.
nồng độ 5 mM, pic các chất cân đối, cường độ tín
hiệu các chất khác nhau không nhiều so với
nồng độ 3 và 10 mM. Ngoài ra, việc sử dụng

dung dịch muối có thể gây ức chế sự ion hóa và
gây ơ nhiễm nguồn ion nên dung dịch amoni
format nên được sử dụng ở mức nồng độ cần
thiết và tối thiểu. Vì vậy, nồng độ dung dịch
amoni format 5 mM được lựa chọn.
Khảo sát tỷ lệ pha động
Tiến hành khảo sát tỷ lệ pha động với tỷ lệ
methanol từ 60 - 90%. Các kết quả khảo sát cho
thấy với tỷ lệ methanol 80%, tất cả các chất tách
hoàn toàn, thời gian phân tích ngắn, pic cân đối
và cường độ tín hiệu cao nên pha động methanol
- amoni format 5 mM pH 5 với tỷ lệ 80:20 được
lựa chọn.
hảo sát p d ng dịch amoni format: Tiến
hành khảo sát pH dung dịch amoni format
từ 3 đến 6. Các kết quả khảo sát cho thấy khi
pH dung dịch amoni format tăng từ 3 đến 4, các
chất khơng tách hồn tồn. Trong khi đó, các
chất tách hoàn toàn và chiều cao pic HCTZ tăng

136

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 2 * 2020
khi pH tăng từ 5 đến 6. Tuy nhiên, dung dịch
đệm amoni format ở pH 6 không ổn định, dễ bị
thay đổi pH khi tiến hành sắc ký trong thời gian
dài do amoni format bị phân ly thành NH4+ trong
dung dịch làm pH giảm. Vì vậy, pha động
methanol - đệm amoni format 5 mM với pH 5
(80:20) được lựa chọn.


Khảo sát tốc độ dòng
Tiến hành khảo sát tốc độ dòng từ 0,35–0,45
mL/phút. Các kết quả khảo sát cho thấy khi tốc
độ dịng tăng thì thời gian lưu của các chất phân
tích giảm nhiều nhưng áp suất hệ thống lớn hơn
200 bar khi tốc độ dòng lên đến 0,45 mL/phút. Vì
vậy tốc độ dịng 0,4 mL/phút được lựa chọn.

Khảo sát nhiệt độ cột
Khi khảo sát nhiệt độ cột từ 30 - 45oC, tất cả
các chất đều tách hoàn toàn trong khoảng nhiệt
độ khảo sát. Khi nhiệt độ cột tăng thời gian lưu
của các chất phân tích giảm khơng đáng kể
nhưng áp suất hệ thống giảm dưới 200 bar khi
nhiệt độ cột từ 40 - 45oC do độ nhớt của pha
động giảm. Khi nhiệt độ cột 45oC, hệ số đối xứng
của HCTZ lớn hơn 1,5. Ngoài ra, nếu sử dụng
cột sắc ký ở nhiệt độ cao trong thời gian phân
tích dài sẽ làm giảm tuổi thọ cột. Vì vậy nhiệt độ
cột 40oC được lựa chọn.

Khảo sát thể tích tiêm
Khi thể tích tiêm mẫu tăng từ 2 - 10 µL,
thời gian lưu của các chất phân tích thay đổi
khơng đáng kể nhưng hệ số đối xứng của
hydroclorothiazid thay đổi nhiều và có giá trị
khoảng từ 1,5 trở lên khi thể tích tiêm mẫu
tăng từ 3 đến 10 µL. Với thể tích tiêm 2 µL tín
hiệu các pic vẫn cao. Vì vậy, thể tích tiêm 2 µL

được lựa chọn.
Từ các kết quả khảo sát, điều kiện sắc ký
thích hợp để định lượng đồng thời IRB và HCTZ
như sau: pha động methanol – dung dịch đệm
amoni format 5 mM pH 5 (80:20, tt/tt), cột sắc ký
Gemini C18 (250 x 2 mm; 5 µm), nhiệt độ cột
40oC, tốc độ dịng 0,4 mL/phút, thể tích tiêm 2 µL
và nhiệt độ khay chứa mẫu 10oC.

B – Khoa học Dược


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 2 * 2020

Khảo sát nồng độ kiềm hóa huyết tương
Hiệu suất chiết HCTZ không ổn định với giá
trị RSD lớn hơn 20%. Vì vậy, khơng kiềm hóa
mẫu huyết tương khi chiết mẫu.
Khảo sát nồng độ acid hóa huyết tương
Khi acid hóa huyết tương, hiệu suất chiết
các chất cao hơn so với khơng acid hóa huyết
tương. Với nồng độ acid phosphoric 10% hiệu
suất chiết của chuẩn nội và chất phân tích cao
và ổn định nên nồng độ này được lựa chọn để
acid hóa mẫu huyết tương trước khi chiết.
Khảo sát thể tích acid hóa huyết tương
Với thể tích 50 µL H3PO4 10%, hiệu suất chiết
các chất cao, ổn định và tương đương nhau.
Khảo sát số lần chiết
Sau 2 lần chiết, hiệu suất chiết của tất cả các

chất khoảng 95% nên số lần chiết được chọn là 2.
Từ các kết quả khảo sát, quy trình xử lý mẫu
huyết tương được đề xuất như sau:
Lấy chính xác 1 mL huyết tương, cho vào
ống nghiệm, thêm 50 μL dung dịch chuẩn nội
telmisartan 1000 ng/mL, lắc 10 giây, acid hóa

B – Khoa học Dược

I r b e s a r t a n /3 . 8 5 0

Minh họa sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn (Hình 3).

40000

30000

20000

T e lm is a r t a n /4 . 2 0 3

Khảo sát dung môi chiết
Với dung môi ethyl acetat, hiệu suất chiết
chuẩn nội và IRB lần lượt tăng lên khoảng 6 và 2
lần so với dung mơi tert-butyl methyl ether,
trong khi đó hiệu suất chiết HCTZ thì tương
đương. Với hỗn hợp dung mơi tert-butyl methyl
ether – ethyl acetat (5:5), hiệu suất chiết chuẩn
nội tăng so với dung mơi ethyl acetat, trong khi
đó hiệu suất chiết R thì tương đương nhưng

hiệu suất chiết HCTZ giảm khoảng 3 lần. Vì vậy
dung mơi chiết ethyl acetat được lựa chọn để
tiếp tục khảo sát.

bằng 50 µL dung dịch H3PO4 10% (tt/tt), lắc 10
giây. Chiết 2 lần, mỗi lần 2,5 mL ethyl acetat, lắc
xốy 1500 vịng/phút trong 1 phút, lắc vòng 300
vòng/phút trong 5 phút, ly tâm 4000 vòng/phút
trong 5 phút, lấy dịch trong của 2 lần chiết, bốc
hơi dung mơi tới cắn dưới dịng khí nitơ ở 40oC.
Hịa tan cắn trong 500 µL methanol, lắc xốy
2500 vịng/phút trong 1 phút, siêu âm 5 phút, ly
tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút ở 0oC, lọc qua
màng lọc milipore 0,22 µm.

H C T Z /1 . 5 9 9

Khảo sát phương pháp lý mẫu
Kết quả khảo sát cho thấy phương pháp tủa
protein khơng phù hợp vì mẫu sau khi xử lý cho
pic HCTZ bị chẻ đơi nên hiệu suất khơng chính
xác khi áp dụng với chất có nồng độ trong huyết
tương thấp như HCTZ. Do đó phương pháp
chiết lỏng – lỏng được lựa chọn.

Nghiên cứu

10000

0

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

min

Hình 3. Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn nồng độ 100 ng/mL

Xác định khoảng nồng độ định lượng
Các kết quả thăm dò và xây dựng phương
pháp sắc ký cho phép xây dựng được khoảng
nồng độ định lượng các hoạt chất, được trình
bày trong Bảng 2. Ngồi ra, để đáp ứng phần
yêu cầu tính tuyến tính và đặc hiệu, cần chuẩn
bị thêm mẫu trắng và mẫu khơng. Trong đó,
mẫu trắng là mẫu huyết tương khơng có
chuẩn nội cịn mẫu không là mẫu huyết tương
trắng được thêm chuẩn nội.
Th

định quy trình phân tích


Bảng 3 tóm tắt kết quả thẩm định quy trình
định lượng IRB và HCTZ trong huyết tương
người bằng kỹ thuật LC-MS/MS theo hướng
dẫn của US-FDA và EMA. Hình 4 minh họa
sắc ký đồ huyết tương trắng và mẫu giả lập
chứa chất phân tích ở LLOQ.

137


Nghiên cứu

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 2 * 2020

Bảng 2. Nồng độ của các hoạt chất trong huyết tương
Dung dịch

1 (LLOQ) 2 (LQC)

Nồng độ của các hoạt chất trong huyết tương (ng/mL)
3
4
5
6
7 (MQC)
8

9 (HQC) 10 (ULOQ)

IRB


5

15

300

600

1500

1800

3000

3600

4800

6000

HCTZ

0,9

3

15

30


75

90

150

180

240

300

IS

90

ULOQ: giới hạn định lượng trên; Dung dịch 1, 2, 3: chỉ số thứ tự dung dịch. Các dung dịch LLOQ, LQC, MQC, HQC và
ULOQ lần lượt có nồng độ tương đương với các dung dịch 1, 2, 7, 9 và 10

Bảng 3. Tóm tắt kết quả thẩm định
STT

1

2

3

4

5
6

7
8
9

Chỉ tiêu

Kết qu
Mẫu huyế ơ g giả lập ở mức nồ g độ LLOQ có các pic HCTZ (1,675 phút), IRB (3,886
phút) và telmisartan (4,489 phút) tách hoàn toàn. Mẫu huyế ơ g ắng không xuất hiện pic
t i các vị trí pic của IRB, HCTZ và IS. Tỷ số thời gi
ủa IRB và HCTZ so v i IS lầ
t
đặc hiệu
là 0,861 và 0,376. Tín hiệ đá ứng của mẫu trắng t i thời điểm trùng v i thời gi
ủa
IRB và
Z
g v t quá 20% tín hiệ đá ứng của chất phân tích ở nồ g độ LLOQ.
Tín hiệ đá ứng của mẫu trắng t i thời điểm trùng v i thời gi
ủa chu n nội khơng
v t q 5% tín hiệ đá ứng của chu n nội ở mẫu LLOQ.
Ở nồ g độ IRB 5 ng/mL và HCTZ 0,9 ng/mL, các kết quả
i â
đều cho tỷ số
Gi i h n đị
ng
S/N l

ơ 5 và đ độ
xá và độ đ g
q i đị . D đó á ồ g độ ày đ c
d i (n=6)
chấp nhận là gi i h đị
g d i.
P ơ g ì
ồi quy
Đ ờng chu n và khoảng
2
- IRB (0,005 – 6,00 µg/mL): y = 1,2933x + 0,0867; R = 0,9964
tuyến tính (n=10)
2
- HCTZ (0,9 – 300 ng/mL): y = 0,0001x + 0,0001; R = 0,9981
Độ đ g và độ chính xác
Ở 4 mức nồ g độ LLOQ, LQC, MQC và HQC: IRB (95,26 – 106,00%; CV: 3,38 – 9,31%),
trong ngày và khác ngày
HCTZ (101,03 – 107,20%; CV: 2,34 – 6,27%),
(n=18)
Ở 3 mức nồ g độ LQC, MQC và HQC: IRB (90,70 – 103,52%; CV: 1,69 – 4,62%), HCTZ
Hiệu suất chiết (n=6)
(94,72 – 103,61%; CV: 1,63 – 8,56%), IS (88,48 – 103,12%; CV: 1,64 – 3,40%)
o
Dung dịch chu n gốc ổ định ở -20 C trong ít nhất 62 ngày. Chất phân tích trong huyết
o
o
Độ ổ định
ơ g ổ định ở nhiệ độ phòng 25 C trong 6 giờ, buồng tiêm mẫu 10 C trong 48 giờ, sau 3
o
chu kỳ đ g- ã đ g và ở -70 C trong vòng 62 ngày.

Tỷ số MFIRB/ MFIS và MFHCTZ/ MFIS ở mức nồ g độ LQC và HQC có giá trị CV lầ
t là
Ả
ởng nền mẫu
1,74-5,83% và 2,61-8,88% (≤ 15 ). P ơ g á
â
ó bị ả
ởng bởi nền mẫu
(Matrix factor, MF), (n=6)
g vẫn nằm trong mức cho phép.
Kết quả khảo sát cho thấy khơng có sự ả
ởng củ
ng mẫu tồ d đối v i IRB,
L ng mẫu tồ d ( =6)
HCTZ và IS.
Tỷ lệ thu hồi củ IRB và
Z đều nằm trong gi i h n cho phép 85 – 115% v i giá trị CV
Hệ số pha lỗng
của tỷ lệ thu hồi khơng q 15%. Vậy quy trình xử lý mẫ đã xây dựng khơng bị ả
ởng
bởi độ pha lỗng.

Hình 4. Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng (A), (B), (C) và mẫu huyết tương giả lập có chứa irbesartan ( ’),
hydroclorothiazid ( ’) và telmisartan (C’) ở mức nồng độ LLOQ

138

B – Khoa học Dược



Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 2 * 2020
BÀNLUẬN
Kỹ thuật ion hóa ESI có những ưu điểm như
ion hóa êm dịu hơn, thích hợp để phân tích các
hợp chất kém bền với nhiệt, khơng tạo ra quá
nhiều phân mảnh giúp cho việc lựa chọn mảnh
ion định lượng đặc hiệu hơn và có độ nhạy cao
hơn. Trong nghiên cứu này, chuẩn nội và
irbesartan được ion hóa với kiểu ESI(+), trong
khi đó hydroclorothiazid được ion hóa với kiểu
ESI(-). Năm 2015, Katteboina và cộng sự đã khảo
sát các kiểu ion hóa R và đã rút ra kết luận IRB
nên được ion hóa ở chế độ ESI(+) vì sẽ thu được
cường độ tín hiệu cao nhất và ổn định(7). HCTZ
là chất có nhóm SO2 tạo hệ thống liên hợp  -  -  ,
N có đơi điện tử tự do tham gia vào hệ thống
liên hợp làm cho H liên kết với N rất linh động
nên dễ bị cắt đứt. Vì vậy, HCTZ khơng có khả
năng nhận proton để chuyển thành cation mà
ngược lại dễ chuyển thành anion hơn nên phù
hợp với chế độ ion hóa âm. Chuẩn nội
telmisartan có các nguyên tử nitơ thứ cấp, dễ
nhận proton tạo cation nên phù hợp với chế độ
ion hóa dương. Kỹ thuật ghi phổ MRM được lựa
chọn trong phân tích định lượng vì có độ đặc
hiệu và độ nhạy cao. Trong thực tế, khi tiến hành
phân tích vết như định lượng hoạt chất trong
dịch sinh học, đòi hỏi lựa chọn ít nhất hai ion
phân mảnh, một ion định tính, một ion định
lượng cũng như để có được sự chọn lọc tốt hơn

từ các thành phần nội sinh trong nền mẫu huyết
tương. Vì vậy, kỹ thuật ghi phổ MRM đã được
lựa chọn để phân tích định lượng trong nghiên
cứu này. tứ cực thứ nhất, các ion phân tử có
giá trị m/z lần lượt là 429,15 và 295,90 tương ứng
với R và HCTZ, đã được chọn để đưa vào
buồng va chạm. Lựa chọn này cũng giống với
các nghiên cứu định lượng IRB và HCTZ trong
huyết tương(2-4). Trong buồng va chạm, ion phân
mảnh của IRB và HCTZ có giá trị m/z lần lượt là
207,10 và 268,95 cho tín hiệu cao và ổn định nên
được chọn là ion định lượng.
Việc lựa chọn pha động, tốc độ dịng, thể
tích tiêm mẫu và cột phân tích phù hợp sẽ cải
thiện độ nhạy và độ chọn lọc của phương
pháp phân tích định lượng. Đối với những
chất có hàm lượng rất thấp như HCTZ trong

B – Khoa học Dược

Nghiên cứu
một nền mẫu phức tạp như huyết tương, nếu
hệ số đối xứng khơng đạt u cầu, tín hiệu
khơng cao thì sẽ gây sai số trong định lượng.
Vì vậy cần phải tiến hành khảo sát pha động,
tốc độ dòng, thể tích tiêm mẫu, cột phân tích,
nhiệt độ cột để lựa chọn được điều kiện sắc ký
thích hợp. Amoni format là một muối dễ bay
hơi nên đã được sử dụng là một thành phần
của pha động khi phân tích bằng kỹ thuật sắc

ký lỏng với đầu dò khối phổ. Trong nghiên
cứu này, nồng độ và pH của dung dịch đệm
amoni format đã được khảo sát và đánh giá sự
phù hợp khi kết hợp với các dung môi hữu cơ
như methanol và acetonitril để có được pha
động thích hợp.
Cường độ tín hiệu đáp ứng khi phân tích
mẫu bằng phương pháp khối phổ dễ bị ảnh
hưởng của nhiều yếu tố như: quá trình chuẩn bị
mẫu, điều kiện ion hóa chất phân tích, độ nhạy
của bộ phận phát hiện. Do đó, cường độ tín hiệu
của chất phân tích chịu sự thay đổi đáng kể giữa
các lần phân tích khác nhau trên cùng một mẫu
phân tích, cùng nồng độ chất phân tích và cùng
một máy phân tích. Bên cạnh đó, huyết tương
người là nền mẫu phức tạp nên dễ ảnh hưởng
đến kết quả phân tích. Vì vậy, một chất chuẩn
nội thường được yêu cầu thêm vào huyết tương
ở giai đoạn sớm nhất có thể trong quá trình xử lý
mẫu. Cả chất chuẩn nội và chất phân tích được
phân tích đồng thời để bù lại cho mọi biến đổi có
thể có trong q trình xử lý và phân tích mẫu.
Do đó, việc sử dụng chuẩn nội giúp quy trình
định lượng đạt được kết quả chính xác và tin
cậy. Dựa vào các tài liệu tham khảo(2-4) chất
chuẩn nội được lựa chọn để sử dụng thường là
các chất đồng vị ổn định và các chất có cấu trúc
tương tự với chất phân tích. Tuy nhiên, các chất
đồng vị ổn định có giá thành cao và ít có sẵn trên
thị trường. Vì vậy, trong nghiên cứu này các chất

có cấu trúc tương tự với chất phân tích như
losartan, valsartan, telmisartan đã được lựa chọn
để khảo sát. Các chất này thỏa mãn được yêu cầu
về mặt cấu trúc gần giống với IRB và HCTZ. Từ
kết quả thực nghiệm tối ưu hóa điều kiện khối

139


Nghiên cứu
phổ của từng chuẩn nội, telmisartan có cường độ
tín hiệu của ion định lượng cao hơn so với
losartan, valsartan ở cùng nồng độ 1 µg/mL.
Ngồi ra, telmisartan có sẵn dạng tinh khiết trên
thị trường và giá thành hợp lý. Vì vậy,
telmisartan đã được lựa chọn làm chuẩn nội của
phương pháp phân tích.
Trong q trình xây dựng quy trình xử lý
mẫu, phương pháp chiết pha rắn có chi phí
cao nên không được lựa chọn để khảo sát,
phương pháp tủa protein với dung môi tủa
protein như methanol và acetonitril cho thấy
pic bị chẻ đơi, hiệu suất khơng ổn định với
chất có nồng độ thấp như HCTZ. Với phương
pháp chiết lỏng-lỏng, kết quả cho thấy mẫu
sau khi chiết sạch hơn, ít pha loãng hơn so với
phương pháp tủa protein nên nồng độ các
chất phân tích tăng lên, dẫn đến cường độ tín
hiệu tăng đối với HCTZ. Vì vậy, phương pháp
chiết lỏng-lỏng đã được lựa chọn. Việc acid

hóa huyết tương bằng acid phosphoric trước
khi chiết giúp cắt đứt liên kết giữa dược chất
và protein nên làm tăng hiệu suất chiết đáng
kể và hầu như chiết kiệt các chất. Qua thực
nghiệm cho thấy hiệu suất chiết các chất phân
tích đều cao và ổn định, đảm bảo phương
pháp chiết lỏng-lỏng hồn tồn có thể áp dụng
cho quy trình phân tích các chất trong mẫu
huyết tương người sau này.
Đề tài đã xây dựng được quy trình xử lý
mẫu thích hợp nên có hiệu suất chiết rất cao
với giá trị trung bình lần lượt là 97,47%,
98,48% và 96,44% tương ứng với IRB, HCTZ
và chuẩn nội telmisartan. So sánh với một số
cơng trình đã cơng bố trước đó(2,8) quy trình xử
lý mẫu trong nghiên cứu của chúng tơi có hiệu
suất chiết cao và ổn định hơn (CV 10%).
Độ nhạy của phương pháp phân tích cũng có
thể được xem là giới hạn định lượng dưới
(LLOQ). Vì vậy, việc xác định LLOQ đóng vai
trị quan trọng trong phát triển phương pháp
phân tích hoạt chất trong dịch sinh học. Trong
nghiên cứu của chúng tôi, LLOQ của IRB và

140

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 2 * 2020
HCTZ lần lượt là 5 ng/mL và 0,9 ng/mL, thấp
hơn so với quy trình sử dụng cùng kỹ thuật
phân tích LC-MS/MS đã được cơng bố trước đó.

Nghiên cứu của Tutunji và cộng sự có LLOQ của
IRB và HCTZ lần lượt là 60 ng/mL và 1 ng/mL(2).
Như vậy, độ nhạy của phương pháp với kỹ
thuật xử lý mẫu bằng phương pháp chiết lỏnglỏng cho phép xác lập giá trị LLOQ ở mức thấp
hơn với các mức đã công bố trước đây. Đây là
một trong những ưu điểm của phương pháp
phân tích.

KẾT LUẬN
Quy trình định lượng đồng thời IRB và
HCTZ trong huyết tương người bằng kỹ thuật
LC-MS/MS đã được xây dựng và thẩm định đáp
ứng các yêu cầu theo hướng dẫn của US-FDA và
EMA về thẩm định phương pháp phân tích hoạt
chất trong dịch sinh học. Phương pháp xử lý
mẫu nhanh và đơn giản. Các kết quả thẩm định
đã chứng tỏ quy trình có tính đặc hiệu, độ nhạy
cao, độ đúng và độ chính xác cao. Quy trình có
thể được ứng dụng để xác định sinh khả dụng
và đánh giá tương đương sinh học của chế phẩm
chứa IRB và HCTZ.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.
2.

3.

4.


5.
6.

ộ Y Tế (2015). Dược thư Quốc Gia Việt Nam, pp.777-779, 835837. Nhà Xuất Bản Y Học, Hà Nội.
Tutunji LF, Maha F, Tutunji, Mamoun I, et al (2010).
Simultaneous
determination
of
irbesartan
and
hydrochlorothiazide in human plasma using HPLC coupled
with tandem mass spectrometry: Application to bioequivalence
studies. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 985990.
Qiua X, Wang Z, Wanga B, et al (2014). Simultaneous
determination of irbesartan and hydrochlorothiazide
inhuman plasma by ultra high performance liquid
chromatographytandem mass spectrometry and its
application to abioequivalence study. Journal of
Chromatography B, 957:110-115.
Singh B, Lokhandae RS, Dwivedi A, Sharma S, Dubey N
(2013). Improved simultaneous quantitation of candesartan
and hydrochlorthiazide in human plasma by UPLC–MS/MS
and its application in bioequivalence studies. Journal of
Pharmaceutical Analysis, 4(2):144-152.
EMA (2015). Guideline on bioanalytical method validation,
pp.1-23. European Medicines Agency, United Kingdom UK.
FDA (2018). Guidance for industry - Bioanalytical method

B – Khoa học Dược



Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 2 * 2020

7.

8.

validation, pp.1-41. Rockville, USA.
Shah JV, Shah PA, Sanyal M, et al (2017). Simultaneous
quantification of amiloride and hydrochlorothiazide in human
plasma by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.
Journal of Pharmaceutical Analysis, 7(5):288-296.
Katteboina MY, Pilli NR, Inamadugu JK, et al (2015). LCMS/MS assay for irbesartan in human plasma using solid phase

B – Khoa học Dược

Nghiên cứu
extraction technique: a pharmacokinetic study. International
Journal of Pharmaceutical Sciences, 7(9):335-340.

Ngày nhận bài:
Ngày phản biện nhận xét bài báo:
Ngày bài báo được đăng:

18/10/2019
08/11/2019
20/03/2020

141