HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM

ĐỒN NGỌC HÂN

NGHIÊN CỨU NI CẤY CALLUS CÀ GAI LEO
(SOLANUM HAINANENSE HANCE) VÀ ẢNH
HƯỞNG CỦA CHẤT KÍCH ỨNG ĐẾN SỰ TÍCH
LŨY HỢP CHẤT THỨ CẤP TRONG CALLUS

Chuyên ngành:

Công nghệ sinh học

Mã số:

60 42 02 01

Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Thị Lý Anh

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2018


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan: Số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là
trung thực và chưa từng được cơng bố trong bất kỳ cơng trình nghiên cứu
nào khác, các thơng tin trích dẫn trong luận văn đều được ghi rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày 01 tháng 10 năm 2017
Tác giả luận văn

Đoàn Ngọc Hân

ii


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân,
tôi đã nhận được rất nhiều quan tâm giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cô,
cán bộ kĩ thuật, bạn bè và người thân.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy, cơ, cán bộ nhân viên
Phịng Cơng nghệ Sinh học Thực vật – Viện Sinh học Nông Nghiệp – Học viện
Nông nghiệp Việt Nam đã tạo điều kiện tốt nhất cho tơi hồn thành luận văn này.

Tơi xin cảm ơn ThS. Nguyễn Thị Thanh Phương - cán bộ của Viện
Sinh học Nông nghiệp, người đã luôn sát cánh bên tôi, nhiệt tình giúp đỡ,
chỉ bảo tơi trong suốt thời gian thực tập trên Viện.
Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Nguyễn Thị Lý Anh

– Viện trưởng Viện Sinh học Nơng nghiệp tận tình hướng dẫn giúp đỡ,
động viên tơi trong suốt q trình thực hiện luận văn.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, người
thân, bạn bè, những người ln bên cạnh động viên giúp đỡ tơi trong q
trình học tập và thực hiện đề tài.
Xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 01 tháng 10 năm 2017
Tác giả luận văn

Đoàn Ngọc Hân

iii



MỤC LỤC
Lời cam đoan.................................................................................................................................. ii
Lời cảm ơn..................................................................................................................................... iii
Mục lục.............................................................................................................................................. iv
Danh mục chữ viết tắt............................................................................................................. vii
Danh mục bảng.......................................................................................................................... viii
Danh mục hình............................................................................................................................... x
Trích yếu luận văn..................................................................................................................... xii
Phần 1. Mở đầu.............................................................................................................................. 1
1.1.

Tính cấp thiết của đề tài............................................................................................ 1

1.2.

Mục tiêu nghiên cứu................................................................................................... 2

1.3.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn.............................................................................. 2

Phần 2. Tổng quan tài liệu....................................................................................................... 3
2.1.

Sản xuất các hợp chất thứ cấp từ nuôi cấy mơ tế bào thực vật........3

2.1.1.

Vai trị của hợp chất thứ cấp ở thực vật.......................................................... 3


2.1.2.

Tầm quan trọng của nuôi cấy tế bào thực vật đối với sản xuất các hợp

chất thứ cấp.................................................................................................................... 3
2.1.3.

Phương pháp nuôi cấy mô tế bào để sản xuất các hợp chất thứ cấp. .4

2.1.4.

Các nghiên cứu sản xuất hợp chất thứ cấp bằng nuôi cấy mơ tế bào thực

vật......................................................................................................................................... 6
2.2.

Ứng dụng chất kích ứng để cải thiện tích lũy hợp chất thứ cấp trong ni

cấy tế bào thực vật

8

2.2.1.

Giới thiệu về chất kích ứng.................................................................................... 8

2.2.2.

Cơ chế tác động............................................................................................................ 8


2.2.3.

Một số nghiên cứu ứng dụng chất kích ứng trong ni cấy tế bào thực vật
10

2.3.

Cây cà gai leo............................................................................................................... 11

2.3.1.

Giới thiệu chung về cây cà gai leo................................................................... 11

2.3.2.

Một số nghiên cứu khác trên cà gai leo........................................................ 13

2.4.

Đánh giá sự tích lũy hợp chất thứ cấp qua thử nghiệm hoạt tính sinh học

của chiết xuất dược liệu........................................................................................ 14

iv


2.4.1.

Xác định hoạt tính chống oxy hóa in vitro thơng qua q trình peroxy hóa


lipit tế bào gan chuột
2.4.2.

14

Đánh giá tác dụng bảo vệ gan của chiết xuất dược liệu trên chuột bị

nhiễm độc CCl4 in vivo........................................................................................... 15
2.4.3.

Một số nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của các chiết xuất cây dược liệu
15

Phần 3. Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu............................... 17
3.1.

Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu............................................ 17

3.1.1.

Đối tượng nghiên cứu............................................................................................. 17

3.1.2.

Địa điểm và thời gian nghiên cứu..................................................................... 17

3.2.

Nội dung nghiên cứu............................................................................................... 17


3.2.1.

Xác định môi trường thích hợp nhất cảm ứng tạo callus cà gai leo
17

3.2.2.

Nhân sinh khối callus.............................................................................................. 18

3.2.3.

Đánh giá sự tích lũy các hoạt chất thứ cấp thơng qua thử nghiệm hoạt

tính sinh học dịch chiết callus, dịch chiết cây cà gai leo tự nhiên 20
3.3.

Phương pháp nghiên cứu..................................................................................... 22

3.3.1.

Phương pháp nuôi cấy in vitro........................................................................... 22

3.3.2.

Nuôi cấy cây in vitro................................................................................................. 22

3.3.3. Nuôi cấy callus, nhân sinh khối callus........................................................... 23
3.3.4.


Đánh giá hoạt tính sinh học dịch chiết callus............................................ 23

3.3.5. Xử lý số liệu.................................................................................................................. 24
Phần 4. Kết quả và thảo luận............................................................................................... 25
4.1.

Kết quả............................................................................................................................. 25

4.1.1.

Xác định mơi trường thích hợp nhất cảm ứng tạo callus cà gai leo
25

4.1.2.

Nhân sinh khối callus.............................................................................................. 33

4.1.3.

Đánh giá sự tích lũy các hợp chất thứ cấp qua thử nghiệm hoạt tính sinh

học dịch chiết callus, dịch chiết cà gai leo tự nhiên.............................. 45
4.2.

Thảo luận........................................................................................................................ 49

4.2.1.

Cảm ứng tạo callus................................................................................................... 49


4.2.2.

Nhân sinh khối callus.............................................................................................. 50

4.2.3.

Đánh giá sự tích lũy các hợp chất thứ cấp qua thử nghiệm hoạt tính sinh

học dịch chiết callus................................................................................................ 52


v


Phần 5. Kết luận và đề nghị.................................................................................................. 54
5.1.

Kết luận............................................................................................................................ 54

5.2.

Đề nghị............................................................................................................................. 54

Tài liệu tham khảo...................................................................................................................... 55
Phụ lục............................................................................................................................................. 59

vi


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt

Nghĩa tiếng Việt

αNAA

α- naphtyl axetic acid

BA

Benzyl adenine

CT

Cơng thức

DAM

Dialdehyt malonyl

ĐC

Đối chứng

HCTC

Hợp chất thứ cấp

HTCO


Hoạt tính chống oxy hóa

LED

Light emitting diode

LSD5%

Độ lệch tiêu chuẩn mức ý nghĩa 5%

MS

Murashige and Skoog

NADCC

Sodium dichloroisocyanurate

POL

Q trình peroxyd hóa lipit

TB

Trung bình

TN

Thí nghiệm


YE

Yeast extract

2,4-D

2,4-Dichlorophenoxyscetic acid

vii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 4.1. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến khả năng tạo callus từ đoạn
thân cà gai leo........................................................................................................ 25
Bảng 4.2. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến khả năng tạo callus từ
mảnh lá cà gai leo................................................................................................ 26
Bảng 4.3. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và 2,4-D đến khả năng tạo callus từ đoạn
thân cà gai leo........................................................................................................ 28
Bảng 4.4. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và 2,4-D đến khả năng tạo callus từ mảnh
lá cà gai leo............................................................................................................. 29
Bảng 4.5. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và 2,4-D đến khả năng tạo callus từ đoạn
thân cà gai leo........................................................................................................ 30
Bảng 4.6. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và 2,4-D đến khả năng tạo callus từ mảnh
lá cà gai leo............................................................................................................. 31
Bảng 4.7. Ảnh hưởng của môi trường đến nhân sinh khối callus từ đoạn thân cà
gai leo......................................................................................................................... 33
Bảng 4.8. Ảnh hưởng của môi trường đến nhân sinh khối callus từ mảnh lá cà
gai leo......................................................................................................................... 34
Bảng 4.9.


Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng đến nhân sinh khối callus từ đoạn

thân cà gai leo........................................................................................................ 35
Bảng 4.10. Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng đến nhân sinh khối callus từ

mảnh lá cà gai leo................................................................................................ 36
Bảng 4.11. Ảnh hưởng của chiếu sáng đèn LED đến khả năng nhân sinh khối

callus từ đoạn thân............................................................................................. 37
Bảng 4.12. Ảnh hưởng của chiếu sáng đèn LED đến khả năng nhân sinh khối

callus từ mảnh lá 38
Bảng 4.13. Ảnh hưởng của acid salisylic đến khả năng nhân sinh khối....40
Bảng 4.14. Ảnh hưởng của acid salisylic đến khả năng nhân sinh khối callus trên

môi trường A2........................................................................................................ 41
Bảng 4.15. Ảnh hưởng của chất chiết nấm men đến khả năng nhân sinh khối

callus trên môi trường A1................................................................................ 42
Bảng 4.16. Ảnh hưởng của chất chiết nấm men đến khả năng nhân sinh khối

callus trên môi trường A2................................................................................ 43

viii


Bảng 4.17. Tổng hợp kết quả các yếu tố ảnh hưởng đến nhân sinh khối callus
.............................................................................................................................................................. 45

Bảng 4.18. Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết cà gai leo..........................46

Bảng 4.19. Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết callus nhân sinh khối trên mơi

trường A2.................................................................................................................. 46
Bảng 4.20. Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết callus nhân sinh khối trên môi

trường A2 + 3 g/l nấm men............................................................................. 47
Bảng 4.21. Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết callus nhân sinh khối trên mơi

trường A2 + 100µM acid salisylic................................................................ 48
Bảng 4.22. So sánh hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết callus, dịch chiết cà

gai leo tự nhiên..................................................................................................... 49

ix


DANH MỤC HÌNH
Hình 4.1.

Ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến khả năng tạo callus từ

đoạn thân cà gai leo......................................................................................... 26
Hình 4.2.

Ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến khả năng tạo callus từ

mảnh lá cà gai leo............................................................................................. 27
Hình 4.3.

Ảnh hưởng của tổ hợp BA và 2,4-D đến khả năng tạo callus từ đoạn


thân cà gai leo..................................................................................................... 28
Hình 4.4.

Ảnh hưởng của tổ hợp BA và 2,4-D đến khả năng tạo callus từ mảnh

lá cà gai leo........................................................................................................... 29
Hình 4.5.

Ảnh hưởng của tổ hợp BA và 2,4-D đến khả năng tạo callus từ đoạn

thân cà gai leo..................................................................................................... 31
Hình 4.6.

Ảnh hưởng của tổ hợp BA và 2,4-D đến khả năng tạo callus

từ

mảnh lá cà gai leo............................................................................................. 32
Hình 4.7.

Ảnh hưởng của mơi trường A1 (MS + 0,5 mg/l BA + 1,5 mg/l 2,4-D)

và A2 (MS + 0,1 mg/l BA + 1 mg/l 2,4-D) đến nhân sinh khối callus

từ đoạn thân cà gai leo
Hình 4.8.

33


Ảnh hưởng của mơi trường A1 (MS + 0,5 mg/l BA + 1,5 mg/l 2,4-D)

và A2 (MS + 0,1 mg/l BA + 1 mg/l 2,4-D) đến nhân sinh khối callus

từ mảnh lá cà gai leo....................................................................................... 34
Hình 4.9.

Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng đến nhân sinh khối callus có

nguồn gốc đoạn thân cà gai leo................................................................ 35
Hình 4.10. Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng đến nhân sinh khối callus có
nguồn gốc mảnh lá cà gai leo.................................................................... 36
Hình 4.11. Ảnh hưởng của chiếu sáng đèn LED đến khả năng nhân sinh khối
callus từ đoạn thân.......................................................................................... 38
Hình 4.12. Ảnh hưởng của chiếu sáng đèn LED đến khả năng nhân sinh khối
callus có nguồn gốc mảnh lá..................................................................... 39
Hình 4.13. Ảnh hưởng của acid salisylic đến khả năng nhân sinh khối callus
trên môi trường A1........................................................................................... 40
Hình 4.14. Ảnh hưởng của acid salisylic đến khả năng nhân sinh khối callus
trên môi trường A2........................................................................................... 41

x


Hình 4.15. Ảnh hưởng của nấm men đến khả năng nhân sinh khối callus trên
mơi trường A1

43

Hình 4.16. Ảnh hưởng của nấm men đến khả năng nhân sinh khối callus trên

môi trường A2

xi

44


TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
Tên tác giả: Đồn Ngọc Hân
Tên luận văn: "Nghiên cứu nuôi cấy callus cà gai leo(Solanum hainanense Hance) và
ảnh hưởng của chất kích ứng đến sự tích lũy hợp chất thứ cấp trong callus"

Ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60 42 02 01

Tên cơ sở đào tạo: Học Viện Nơng Nghiệp
Việt Nam Mục đích nghiên cứu
Tìm được mơi trường ni cấy thích hợp và nhân nhanh sinh khối
callus cà gai leo. Đánh giá được sự tích lũy các hợp chất thứ cấp qua thử
nghiệm hoạt tính sinh học của dịch chiết callus cà gai leo.
Phương pháp nghiên cứu
Các thí nghiệm cảm ứng tạo callus cà gai leo được thực hiện trên đối tượng là
đoạn thân và mảnh lá cà gai leo in vitro. Môi trường nuôi cấy sử dụng là mơi trường MS
(Murashige and Skoog, 1962) có bổ sung thêm các chất điều tiết sinh trưởng . Các tổ hợp
BA + α-NAA và BA + 2,4-D được sử dụng để đánh giá khả năng cảm ứng tạo callus.
Callus có nguồn gốc đoạn thân và mảnh lá sau 4 tuần tuổi được sử dụng cho các thí
nghiệm nhân sinh khối callus, các nhân tố: môi trường nuôi cấy, chế độ chiếu sáng, các
elicitor được đánh giá ảnh hưởng đến khả năng nhân sinh khối callus. Callus được nhân
sinh khối trên các môi trường cho khả năng nhân callus tốt nhất sau 3 tuần tuổi được

0

sấy khô đến khối lượng khơng đổi, sau đó chiết bằng dung mơi cồn 70 và được đánh
giá hoạt tính chống oxy hóa cùng với dịch chiết của cây cà gai leo trồng tự nhiên thơng
qua q trình peoxy hóa lipit tế bào gan chuột theo phương pháp của Blagodorov (1987).

Kết quả chính và kết luận
1.
Môi trường A1 (MS + 0,5 mg/l BA + 1,5 mg/l 2,4-D) và A2 (MS +
0,1 mg/l BA + 1 mg/l 2,4-D) là thích hợp để cảm ứng tạo callus.
2.

Khi chiếu sáng bằng đèn huỳnh quang, môi trường nuôi cấy A 2 ưu

thế hơn khi nhân sinh khối callus mô thân và mô lá so với môi trường A 1.
3.
hơn

Chế độ chiếu sáng 16 giờ sáng/8 giờ tối thích hợp để nhân nhanh callus

chế độ không chiếu sáng. Dưới điều kiện chiếu sáng đèn LED, tỉ lệ B/R: 30/70 thích hợp
nhất với nhân callus nguồn gốc từ mảnh lá trên môi trường A 2. Đối với callus nguồn gốc
từ đoạn thân tỉ lệ B/R : 40/60 thích hợp hơn để nhân callus trên môi trường A 1.
4.

Môi trường A1 và A2 bổ sung 100 µM acid salisylic; mơi trường A 1 và A2 bổ

sung 3 g/l nấm men kích thích sự tăng trưởng khối lượng khơ TB callus từ 1,81đến 3,35

xii



lần so với đối chứng không bổ sung elicitor.
5.

Nồng độ 20 mg/100 ml dịch chiết callus có hiệu quả chống oxy hóa

cao nhất so với các nồng độ thử nghiệm khác. Ở nồng độ này HTCO của
dịch chiết callus cao gấp 1,83 lần so với dịch chiết của cây trồng tự nhiên.

6.Bổ sung elicitor vào môi trường nuôi cấy làm tăng hoạt tính chống
oxy hóa của dịch chiết callus từ 1,26-1,49 lần so với đối chứng không bổ
sung elicitor; tăng từ 2,31-2,73 lần so với dịch chiết cây tự nhiên.

xiii


THESIS ABSTRACT
Master candidate: Doan Ngoc Han
Thesis title: “Study on callus culture on Solanum hainanense Hance and
effect of some elicitors on generating secondary compounds in callus”
Major: Biotechnology

Code: 60 42 02 01

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture
(VNUA) Research Objectives
To find a suitable culture medium, to multiply callus of Solanum
hainanense Hance and to analysis the generation of sencondary compounds by
testing biological activation of extracted callus from Solanum hainanense Hance.


Materials and Methods
Callus induction experiments are carried out on in vitro cells extracted from
leaf part and body part of Solanum hainanense Hance. The culture medium used in
the research is MS medium (Murashige and Skoog, 1962) which is provided growth
accomodating elements. The BA + α-NAA and BA + 2,4-D combinations are used to
analysis the callus induction. 4-week old callus cells from body and leaf part are
used for experiments. Culture medium, light regimen and elicitors affect the ability to
multiply living mass of callus. The best results are obtained after 3 weeks, which
after that is dried to fixed weight then extract with 70% alcohol liquid. They later are
analysised the antioxidant quality, which is compared to normal Solanum
hainanense Hance extracts by the Blagodorov method (1987).

Main findings and conclusions
1.

A1 medium (MS + 0,5 mg/l BA + 1,5 mg/l 2,4-D) and A 2 medium (MS +

0,1 mg/l BA + 1 mg/l 2,4-D) are suitable for the callus induction process.
2.

When being lightened by fluorescent light, the A2 medium is more predominant in

multiplying living mass of leaf tissues and body tissues than the A1 medium.

3.
In the 16-hour bright, 8-hour dark light regimen, the callus stem
happens faster than in normal condition. When being lightened by LED light,
the 30/70 B/R ratio is the best rate for multiplying callus from leaf part while
40/60 ratio is more suitable for multiplying callus from body part.

4.

Providing 100 µM acid salisylic into A 1and A2 medium and 3 g/L

yeast extract into A1 and A2 medium help stimulate the dry weight of callus to
increase from 1,81 to 3,35 times in comparision to not providing elicitors.

xiv


5.

20mg/100ml is the best callus extract concentration to be antioxidant. At

this concentration, the HTCO of callus extracts is 1,83 time higher than natural ones.

6.

Providing

elicitors

into

culture

medium

help


increase

the

antioxidant quality of callus extracts from 1,26 to 1,49 time compared to not
providing elicitors and from 2.31 to 2.73 time compared to natural ones.

xv


PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Cà gai leo cịn có tên khác là cà gai dây, cà vạnh, cà quýnh, cà lù, gai
cườm,... tên khoa học là Solanum hainanense Hance. Cà gai leo phân bố ở các
tỉnh miền Bắc cho đến Huế tại Việt Nam và một số nước như Lào, Campuchia,
Trung Quốc (Viện Dược liệu, 1993). Cà gai leo được đánh giá cao về tác dụng
giải độc gan. Theo kinh nghiệm từ dân gian, cây cà gai leo có tác dụng hiệu quả
đối với người bệnh mắc các bệnh lý về gan như: vàng da, vàng mắt, mụn nhọt,
mẩn ngứa... Trong cây cà gai leo có chứa các chất alkaloid, glycoalkaloid có tác
dụng ức chế sự sao chép và làm âm tính virus viêm gan B, chống oxy hóa, ngăn
ngừa xơ gan hiệu quả (Nguyễn Bích Thu và cs., 2000). Cà gai leo là cây thuốc
quý có tiềm năng lớn cho việc sản xuất dược phẩm chữa bệnh.

Tuy nhiên, hiện nay cà gai leo chủ yếu được khai thác từ nguồn
tự nhiên có chất lượng khơng đồng đều. Cà gai leo có thể được nhân
giống bằng hạt nhưng hệ số nhân giống không cao do cây ít quả, quả
nhỏ và ít hạt. Hơn nữa, cây nhân giống bằng hạt có chất lượng khơng
đồng đều, gây khó khăn cho việc tiêu chuẩn hóa ngun liệu.

Ni cấy mô và tế bào thực vật với những ưu điểm vượt trội

và ứng dụng để tăng thu sinh khối trong thời gian ngắn, hàm lượng
hợp chất thứ cấp (HCTC) cao, chủ động dễ điều khiển quy trình sản
xuất trên quy mô công nghiệp, tạo nguồn vật liệu ổn định và tập
trung, góp phần giải quyết những khó khăn nói trên (Misawa, 1994).
Chất kích ứng là một chất mà khi đưa với nồng độ nhỏ vào hệ thống tế bào
sống thì khởi động hoặc cải thiện sự sinh tổng hợp các HCTC trong tế bào đó
(Namdeo, 2007). Chất kích ứng thực vật báo hiệu việc hình thành các HCTC, bổ sung
chất kích ứng vào mơi trường ni cấy là phương thức để thu được các sản phẩm
HCTC có hoạt tính sinh học một cách hiệu quả nhất. Sử dụng các chất kích ứng sinh
học và phi sinh học để kích thích hình thành các HCTC trong ni cấy tế bào vừa có
thể rút ngắn thời gian lại đạt năng suất cao (Discosmo et al., 1995).

Hiện nay đã có một số nghiên cứu về sự tích lũy hợp chất thứ cấp trong
callus cà gai leo. Các nghiên cứu đều thu được kết quả là hàm lượng
glycoalkaloid toàn phần trong callus và tế bào đều cao hơn so với cây tự nhiên,

1


tuy nhiên hiệu suất vẫn chưa cao. Sử dụng các chất kích ứng thực vật có thể
cải thiện được vấn đề này. Ngồi ra chưa có nhiều nghiên cứu đánh giá hoạt
tính sinh học của các hợp chất thứ cấp tích lũy trong callus cà gai leo.

Xuất phát từ đó, chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu nuôi
cấy callus cà gai leo(Solanum hainanense Hance) và ảnh hưởng của
chất kích ứng đến sự tích lũy hợp chất thứ cấp trong callus.
1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Tìm được mơi trường ni cấy thích hợp và nhân nhanh sinh
khối callus cà gai leo.
Đánh giá được sự tích lũy các hợp chất thứ cấp qua thử

nghiệm hoạt tính sinh học của dịch chiết callus cà gai leo.
1.3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN
1.3.1. Ý nghĩa khoa học
Đề tài nghiên cứu đã làm rõ được ảnh hưởng của các nhân tố : loại mô
nuôi cấy, chất điều tiết sinh trưởng, chế độ chiếu sáng... đến sự cảm ứng tạo
callus và nhân nhanh sinh khối callus cà gai leo. Đặc biệt, đã xác định được tác
động của một số chất kích ứng đến sự tăng trưởng và tích lũy hợp chất thứ cấp
của callus cà gai leo qua đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết callus.

Các kết quả đạt được sẽ bổ sung thêm nguồn tài liệu khoa học phục
vụ công tác nghiên cứu, giảng dạy về sản xuất hợp chất thứ cấp bằng nuôi
cấy tế bào thực vật, một lĩnh vực còn chưa được phổ biến ở nước ta.

1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Đưa ra được giải pháp tạo nguồn dược liệu chủ động, dồi
dào, có chất lượng đồng đều, góp phần khắc phục những hạn chế
về nguồn dược liệu cà gai leo khai thác trong tự nhiên.

2


PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. SẢN XUẤT CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP TỪ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO
THỰC VẬT
2.1.1. Vai trò của hợp chất thứ cấp ở thực vật
Ở

thực vật, quá trình trao đổi chất tạo ra nhiều loại hợp chất hữu cơ hoặc

các chất chuyển hóa, được xếp thành nhóm các chất trao đổi sơ cấp và thứ cấp.

Các hợp chất sơ cấp được tìm thấy trong hầu hết các lồi trong khi đó các hợp
chất thứ cấp tìm thấy chỉ trong một số lồi thực vật (Taiz and Zeiger, 2006).
Những bằng chứng từ thực nghiệm và thực tế cho thấy, các hợp chất thứ cấp ở
thực vật có các chức năng cơ bản sau: bảo vệ cơ thể chống lại các loài động vật
ăn cỏ; kháng nấm, vi khuẩn, virus; chống lại sự cạnh tranh về ánh sáng, nước và
chất dinh dưỡng; thu hút các loài động vật trong quá trình thụ phấn và phát tán
hạt; tạo ra các tín hiệu trong giao tiếp giữa thực vật với các loài vi sinh vật cộng
sinh; chống lại tia tử ngoại và các tác nhân vật lý bất lợi khác (Wink, 1999). Thực
vật sản xuất hơn 80.000 hợp chất khác nhau thông qua con đường trao đổi thứ
cấp. Các sản phẩm thứ cấp được dự trữ chủ yếu trong các cấu trúc đặc biệt
hoặc các cơ quan dự trữ như rễ, các tế bào dự trữ, không bào, hệ thống màng…
(Arnason et al., 1995). Ngày nay các hợp chất thứ cấp ở thực vật được dùng
trong dược phẩm, hóa chất nông nghiệp, thuốc nhuộm, gia vị, chất tạo mùi,
thuốc trừ sâu; chúng đã đóng góp giá trị lớn trong sản xuất công nghiệp
(Gautam et al., 1998).

2.1.2. Tầm quan trọng của nuôi cấy tế bào thực vật đối với sản xuất
các hợp chất thứ cấp
Nuôi cấy tế bào thực vật đã được ứng dụng thành công để sản xuất lượng
lớn HCTC dưới các điều kiện cụ thể (Neumen et al., 2009). So với phương pháp
truyền thống sản xuất HCTC bằng ni cấy tế bào thực vật có nhiều ưu việt và thuận
lợi hơn như rút ngắn thời gian, giảm chi phí nhân cơng, giả quyết vấn đề mặt bằng
và nhất là có thể thu được một lượng lớn sản phẩm như mong muốn. Ngày nay,
phương pháp này đã được ứng dụng rộng rãi trên quy mô lớn và ngày càng có
nhiều nghiên cứu nhằm để tăng hàm lượng các HCTC tích lũy trong tế bào thực vật
được ni cấy. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng nuôi cấy tế bào thực vật có khả
năng sản xuất các sản phẩm thứ cấp với hàm lượng lớn hơn so với các chất đó
được chiết từ cây ngoài tự nhiên (Mulabagal and Tsay, 2004).

3



Ưu điểm của sản xuất HCTC bằng nuôi cây mô, tế bào in vitro là có
thể cung cấp sản phẩm một cách liên tục và đáng tin cậy dựa trên cơ sở:
-

Tổng hợp các HCTC có giá trị được thực hiện dưới sự điểu khiển

các yếu tố môi trường nuôi cấy, độc lập với khí hậu và thổ nhưỡng.
Loại bỏ các ảnh hưởng sinh học đến sản xuất HCTC trong tự
nhiên.
hơn.
-

Chọn được cây trồng cho nhiều loại HCTC với sản lượng cao

Với việc tự động hóa, điều khiển sinh trưởng và điều hịa q trình

chuyển hóa của tế bào, chi phí có thể giảm và lượng sản phẩm tăng lên.

-

Kiểm soát chất lượng và hiệu suất của sản phẩm.

Một số sản phẩm trao đổi chất từ dịch nuôi cấy huyền phù có chất

lượng cao hơn chiết rút từ cây tự nhiên (Mulabagal and Tsay, 2004).
2.1.3. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào để sản xuất các hợp chất thứ cấp

2.1.3.1. Nuôi cấy callus

Nuôi cấy tế bào thực vật được khởi đầu bằng việc hình thành các tế bào
khơng phân hóa, được gọi là callus. Các mẫu mô được tách từ thực vật trên
mơi trường dinh dưỡng cơ bản có chất làm rắn là agar hình thành nên callus.
Mơi trường dinh dưỡng cơ bản này chứa các chất dinh dưỡng khoáng đa
lượng, vi lượng, nguồn carbon và nhiều loại chất điều hịa sinh trưởng thực
vật. Ảnh hưởng của thành phần mơi trường dinh dưỡng hoặc chất điều hòa
sinh trưởng là các chỉ tiêu quan trọng để xác định môi trường tối ưu cho
nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng của callus. Các thông số phổ biến nhất
dùng trong đánh giá sinh trưởng trong nuôi cấy callus bao gồm khối lượng
tươi, khối lượng khô và chỉ số sinh trưởng (Loyola-Vargas and VázquezFlota, 2006). Do trong nuôi cấy callus, các tế bào của callus có thể trải qua
biến dị dịng soma trong q trình cấy chuyển nên các dịng tế bào ổn định di
truyền được lựa chọn để tránh sự sản xuất thất thường các chất trao đổi thứ
cấp. Thông thường, trên cùng một loại môi trường nuôi cấy, sau một số lần
cấy chuyển, callus có thể được xem là dịng tế bào đồng nhất khi các thơng
số sinh trưởng của dịng tế bào được lặp lại trong quá trình cấy chuyển
(Davey and Anthony, 2010). Bouque et al. (1998) đã nghiên cứu nuôi cấy 217
dịng callus khác nhau từ các lồi của chi Psoralea nhận thấy, sau 16 lần cấy
chuyển (48 tuần), có khoảng 90% số dòng callus sinh trưởng ổn định.

4


2.1.3.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào
Để nuôi cấy huyền phù tế bào, các khối callus được chuyển vào nuôi cấy
trong môi trường lỏng được khuấy bởi máy lắc, quay hoặc màng lọc xoay. Mô
callus nuôi cấy nên là loại mơ dễ vỡ vụn để có thể phân tán cao nhất thành dịch
huyền phù tế bào. So với nuôi cấy callus, nuôi cấy huyền phù sản xuất ra lượng
lớn sinh khối tế bào, có thể dễ dàng chiết tách các chất chuyển hóa thứ cấp
(Davey and Anthony, 2010). Trong quá trình ni cấy, nhờ những chuyển động
xốy của mơi trường, các tế bào sẽ dần dần tách ra khỏi callus. Sau một thời

gian ngắn nuôi cấy, trong dịch huyền phù là hỗn hợp các tế bào đơn, các khối tế
bào với kích thước khác nhau và các tế bào chết. Dịch huyền phù tốt là dịch
huyền phù chứa tỷ lệ cao các tế bào đơn và tỷ lệ nhỏ các cụm tế bào. Có thể cải
thiện khả năng tách rời của các tế bào trong môi trường bằng cách thay đổi
thành phần môi trường nuôi cấy (Misawa, 1994). Sự kết khối của tế bào có thể
được loại bỏ bởi sự thay đổi điều kiện môi trường nuôi cấy, nhưng thường trong
cuối pha lag của q trình ni cấy, các tế bào trở nên kết dính với nhau. Để thu
được dịch huyền phù gồm phần lớn các tế bào đơn, người ta thường sử dụng
các enzyme phá hủy thành tế bào hoặc dùng các sàng (rây). Tuy nhiên, các dịch
huyền phù đồng nhất đã được thiết lập thường chúng có xu hướng quay trở lại
tình trạng kết khối ban đầu (Misawa, 1994).
Nuôi cấy huyền phù tế bào là tiến hành nuôi tế bào trong mơi trường
lỏng có dung tích nhất định để thiết lập hệ huyền phù tế bào. Nhìn chung, có ba
phương thức ni cấy huyền phù tế bào là ni cấy mẻ, ni cấy mẻ có bổ sung
chất dinh dưỡng và ni cấy liên tục. Trong q trình ni cấy, bình ni cấy
khơng chỉ thường xun có sự tăng lên của các sản phẩm trao đổi chất mà cịn
ln ln diễn ra sự trao đổi khơng khí với bên ngồi. Nhìn chung, mơi trường
thích hợp cho ni cấy callus thì cũng thích hợp cho ni cấy huyền phù tế bào.
Tuy nhiên, trong một số trường hợp, nồng độ của các auxin và cytokinin đòi hỏi
cao hơn (Davey and Anthony, 2010). Khi các chất dinh dưỡng của môi trường
nuôi cấy bị tiêu hao, cùng với sự tạo thêm một số sản phẩm trao đổi chất có hại,
thì sự phân chia và sinh trưởng của tế bào sẽ bị ức chế. Khi đó, thơng qua cấy
chuyển hoặc thay đổi mơi trường ni cấy sẽ kích thích sự sinh trưởng mạnh
mẽ trở lại của huyền phù tế bào (Nguyễn Quang Thạch và cs., 2009).

5


2.1.4. Các nghiên cứu sản xuất hợp chất thứ cấp bằng nuôi cấy mô
tế bào thực vật

2.1.4.1. Các nghiên cứu trong nước
Một số dược liệu ở nước ta như nghệ đen, dừa cạn, đinh lăng,
cà gai leo, sâm Ngọc Linh... cũng được nghiên cứu tách chiết hợp
chất thứ cấp từ tế bào thực vật nuôi cấy in vitro.
Cây dừa cạn (Catharanthus roseus) là một trong những loài cây dược
liệu chứa nhiều alkaloid. Từ dừa cạn người ta chiết được các chất chữa ung
thư như vinblastin, vincristin và chữa cao huyết áp như ajmalicin, serpentin.
Tuy nhiên, hàm lượng của những chất này trong cây tự nhiên rất thấp. Bùi
Văn Lệ và Nguyễn Ngọc Hồng (2006) đã nghiên cứu khảo sát sơ bộ ảnh
hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng lên q trình tạo sinh khối tế
bào và tích lũy alkaloid tồn phần có trong dịch ni cấy.

Cây đinh lăng (Polyscias fruticosa) là một loài thực vật chứa nhiều
saponin. Phạm Thị Tố Liên và Võ Thị Bạch Mai (2007) đã tạo callus từ các
mẫu cây con trên môi trường MS bổ sung 2 mg/L 2,4-D. Callus tạo thành
sau 14 tuần được chuyển sang nuôi cấy trên môi trường lỏng bổ sung 1,0
mg/L 2,4-D và 20% nước dừa để thu sinh khối và chiết rút saponin.
Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) có tác dụng phòng chống ung thư,
bảo vệ tế bào gan, kích thích hệ miễn dịch, chống stress và trầm cảm, chống oxy
hóa, lão hóa. Thanh et al. (2007) đã nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi
trường lên sản xuất sinh khối và ginsenoside trong nuôi cây huyền phù tế bào
cây sâm Ngọc Linh. Kết quả cho thấy, môi trường ½MS và MS thích hợp cho cả
sản xuất sinh khối cũng như ginsenoside, sinh khối và ginsenoside đạt lần lượt
là 9,8 g/L và 6,81 mg/g khối lượng khô. Nồng độ sucrose tăng từ 20-50 g/L đã
tăng sản xuất sinh khối, tuy nhiên khi sucrose tăng đến 70 g/L thì ức chế cả sinh
trưởng và tích lũy ginsenoside của tế bào. Nồng độ nitrogen thích hợp cho cả
sinh trưởng và tích lũy ginsenoside là 30 mM.
Củ cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) có chứa các hoạt chất sinh học
chủ yếu là curcumin, terpenoid và tinh dầu. Các nghiên cứu cho thấy, curcumin có
khả năng chống được sự phát sinh khối u; một số dạng ung thư ở chuột như ung

thư ruột kết, ung thư dạ dày, ung thư vú và ung thư buồng trứng . Võ Châu Tuấn và
cs. (2014) đã nghiên cứu thiết lập các điều kiện và môi trường

6


ni cấy thích hợp để sản xuất nhanh sinh khối tế bào, đồng thời xác định được
khả năng tích lũy và hoạt tính sinh học một số hợp chất trong tế bào nghệ đen
nuôi cấy huyền phù trong hệ lên men 10 L.Kết quả cho thấy môi trường cơ bản
MS có 20 g/L sucrose, 0,8% agar, bổ sung thêm 0,5 mg/L BA và 0,5 mg/L 2,4-D
thích hợp cho ni cấy callus từ bẹ lá cây nghệ đen in vitro. Môi trường cơ bản
MS có 30 g/L sucrose, bổ sung thêm 0,5 mg/L BA và 1,5 mg/L 2,4-D, tốc độ khuấy
150 vịng/phút, tốc độ sục khí 2,5 L/phút thích hợp cho sinh trưởng của tế bào
nghệ đen trong hệ lên men 10 L. Sinh khối đạt cực đại là 603 g tươi (53,25 g khô)
sau 14 ngày nuôi cấy với cỡ mẫu là 200 g. Hàm lượng tinh dầu trong tế bào đạt
cao nhất là 2,57% khối lượng khô sau 14 ngày nuôi cấy, gấp khoảng 1,6 lần tinh
dầu ở củ cây nghệ đen tự nhiên 1 năm tuổi. Hàm lượng curcumin trong tế bào
đạt cao nhất là 1,16% sau 14 ngày nuôi cấy, gấp khoảng 2,7 lần curcumin ở củ
cây nghệ đen tự nhiên 1 năm tuổi.

2.1.4.2. Các nghiên cứu ngoài nước
Rễ của cây nhân sâm (Panax ginseng) là một loại dược phẩm quý giá, có
tác dụng chữa bệnh rối loạn tiêu hóa, bệnh đái đường, suy nhược cơ thể...
Trong rễ của nó chứa nhiều loại saponin và sapogenin khác nhau. Trong đó,
ginsenoside-Rb có hoạt tính an thần, cịn Rg có hoạt tính kích thích. Furuya et al.
(Đại học Kitasato, Nhật) đã nghiên cứu nuôi cấy mô callus Panax ginseng từ
những năm 1970. Kaisha (1990) đã nghiên cứu quy trình sản xuất trên quy mô
lớn, sử dụng nhiều kiểu hệ lên men khác nhau. Năm 1990, Staba (Đại học
Minnesota, Mỹ) cũng đã thu được các tế bào nuôi cấy Panax ginseng chứa
ginsenoside. Choi (1993) đã nghiên cứu nuôi cấy Panax ginseng trên quy mô

công nghiệp, tác giả nhận thấy 2,4-D và KIN ảnh hưởng tới hàm lượng saponin
trong callus và các tế bào nuôi cấy huyền phù; 3,62% saponin tổng số được tìm
thấy trong callus ni cấy trên mơi trường cơ bản MS bổ sung 5,00 mg/L 2,4-D
và 1,00 mg/L KIN, nhưng lại thu được 8,78% khi nuôi cấy trên mơi trường có
10,00 mg/L 2,4-D và 1,00 mg/L KIN (Misawa, 1994).

Callus Taxus mairei được tạo ra từ mảnh lá và thân trên môi trường
B5 bổ sung 2 mg/L 2,4-D hoặc NAA. Dịng tế bào được tạo ra từ callus có
nguồn gốc từ thân và lá. Một trong những dòng tế bào này sau khi bổ
sung các tiền chất và nuôi trong 6 tuần thì cứ một lít dịch huyền phù tế
bào sẽ sản xuất khoảng 200 mg taxol (Mulabagal and Tsay, 2004).

7


Với việc sử dụng chất kích kháng polysaccharide của nấm
men, Sarin (2005) đã thành công trong việc sản xuất với mức tương
đối cao của berberine trong nuôi cấy tế bào cây Thalictrum rugosum.
Ảnh hưởng của permidine lên sản xuất berberine trong nuôi cấy tế bào
cây Thalictrum minus cũng đã được công bố bởi Hara et al. (1993).

2.2. ỨNG DỤNG CHẤT KÍCH ỨNG ĐỂ CẢI THIỆN TÍCH LŨY HỢP
CHẤT THỨ CẤP TRONG NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT
2.2.1. Giới thiệu về chất kích ứng
Chất kích ứng (elicitor) được định nghĩa là một chất mà khi đưa với nồng
độ nhỏ vào hệ thống tế bào sống thì khởi động hoặc cải thiện sự sinh tổng hợp
các HCTC trong tế bào. Sự kích kháng thực vật là quá trình cảm ứng hoặc tăng
cường sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp do sự bổ sung theo hàm
lượng của elicitor (Namdeo, 2007). Trên cơ sở bản chất tự nhiên, elicitor có thể
được phân thành 2 nhóm là: elicitor phi sinh học và elicitor sinh học.


Elicitor phi sinh học là các chất có nguồn gốc không thuộc
sinh vật học, gồm các muối vô cơ, các kim loại nặng và các tác
nhân vật lý như sóng siêu âm, áp suất, nhiệt độ, và pH.
-

Elcitor sinh học là các chất có nguồn gốc sinh vật học, bao gồm các

polysacharide có nguồn gốc từ thành tế bào thực vật (pectin hoặc cellulose), các

vi sinh vật (chitin hoặc glucan) và các glycoprotein, G-protein hay các
protein nội bào có chức năng là gắn với các receptor và tác động bằng
cách hoạt hóa hoặc bất hoạt một số enzyme hoặc các kênh ion.

Ngồi ra, có thể phân loại elicitor dựa trên nguồn gốc của
chúng. Có 2 loại elicitor là elicitor ngoại sinh và elicitor nội sinh
Elicitor ngoại sinh là các chất có nguồn gốc bên ngồi tế bào
như các polysaccharide, polyamine và các acid béo.
-

Elicitor nội sinh là các chất có nguồn gốc bên trong tế bào, được hình

thành thơng qua các phản ứng thứ cấp, được cảm ứng bằng tín hiệu sinh học
hay phi sinh học, chẳng hạn như galacturonide hoặc hepta-β-glucoside v.v...

(Namdeo, 2007).
2.2.2. Cơ chế tác động
Elicitor thực vật là các hóa chất có nguồn gốc khác nhau, có khả năng gây

8



nên các đáp ứng về mặt hình thái, sinh lý và tích lũy phytoalexin (chất được sinh
ra ở thực vật khi chịu tác động của các tác nhân gây bệnh). Việc thực vật bị xử
lý bằng chất kích ứng hoặc bị tấn công bằng mầm bệnh gây ra một loạt các phản
ứng phịng vệ, bao gồm sự tích lũy các HCTC bảo vệ ở cả trong cây tự nhiên
cũng như trong ni cấy in vitro. Mặc dù đã có những nghiên cứu sâu về cơ chế
ảnh hưởng của elicitor lên sự sản xuất HCTC trong các thực vật, tuy nhiên cơ
chế tác động của elicitor vẫn chưa được hiểu đầy đủ. Có nhiều giả thuyết đã
được đưa ra như cơ chế truyền tin bởi Ca2+, các yếu tố ảnh hưởng đến sự
nguyên vẹn của màng tế bào, các con đường ức chế hay hoạt hóa nội bào hoặc
sự thay đổi áp suất thẩm thấu (Namdeo, 2007).
Những nghiên cứu bước đầu về sự tác động của các elicitor sinh học ở
hệ thống thực vật được nghiên cứu dựa vào cơ chế cảm ứng trên tế bào động
vật. Ở tế bào động vật, các thụ quan (receptor) định vị ở màng tế bào sẽ hoạt
hóa kênh ion và protein kinase. Tương tự như thế, các bằng chứng chứng minh
sự hiện diện của các thụ quan ở màng tế bào thực vật đã được ghi nhận. Cơ chế
cảm ứng này dựa trên sự tương tác giữa elicitor-thụ quan. Khi tế bào thực vật
được xử lý với elicitor thì một loạt các phản ứng sinh hóa xảy ra, bao gồm:

-

Elicitor gắn vào thụ quan ở màng tế bào.

Thay đổi dịng ion vào thơng qua màng tế bào thực vật như

kênh Cl- , K+ , …, ở thực vật, Ca2+ hoạt động như chất truyền tin
thứ hai với các đáp ứng khác nhau từ tín hiệu của mơi trường kể cả
mầm bệnh. Ví dụ, ở tế bào cây ngò tây, người ta từng phát hiện ra
kênh canxi đáp ứng cảm ứng và một kênh vận chuyển vào của calci

được tìm thấy trong vịng vài phút sau khi thêm vào elicitor từ nấm.
-

Gia tăng hoạt tính của phospholipase thực vật được tìm thấy ở một vài

mơ thực vật và nuôi cấy tế bào thực vật sau khi xử lý với elicitor, tổng hợp các
tín hiệu thứ cấp như InsP3 và deacylglycerol (DAG), giải phóng tín hiệu nội bào
trung gian Ca2+, nitric oxyde và con đường tín hiệu octadecanoid.
-

Sự thay đổi nhanh trong việc phosphoryl hóa protein được quan sát dựa

trên việc bổ sung elicitor của các nuôi cấy tế bào khác nhau. Những nghiên cứu gần
đây chứng minh rằng sự phosphoryl hóa đóng một vai trị quan trọng trong sự
chuyển tín hiệu thực vật chống lại mầm bệnh và stress, hoạt hóa protein kinase.

Hoạt hóa protein G (là một phần trong việc đáp ng tín hiệu với
elicitor).

9