BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN HẢI ANH

NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA GEN AtXRN4 VÀ
tasiRNA-ARF TRONG ĐIỀU KIỆN NHIỆT ĐỘ CAO VÀ
HẠN Ở CÂY ARABIDOPSIS THALIANA

LUẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP

Hà Nội - 2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN HẢI ANH

NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA GEN AtXRN4 VÀ
tasiRNA-ARF TRONG ĐIỀU KIỆN NHIỆT ĐỘ CAO VÀ
HẠN Ở CÂY ARABIDOPSIS THALIANA
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số 62 42 02 01

LUẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP
Người hướng dẫn khoa học:
1. GS. TS. Motoaki Seki
2. PGS. TS. Nguyễn Văn Đồng

Hà Nội - 2017


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu do tơi thực hiện. Tồn bộ
số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án này là trung thực và chưa từng được
công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu để nhận học vị nào khác. Thơng tin
tổng hợp trong luận án được trích dẫn nguồn gốc một cách đầy đủ và chính xác.
Hà Nội, ngày tháng

năm 2017

Nghiên cứu sinh





i


LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin chân thành cảm ơn chương trình đào tạo IPA
(International Program Associate) liên kết giữa Viện Khoa học Nông nghiệp
Việt Nam (VAAS, Việt Nam), Viện RIKEN (Nhật Bản) và ban đào tạo sau đại

học – Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam đã giúp đỡ tơi trong q trình
thực hiện luận án này.
Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS. TS. Motoaki Seki (Trưởng nhóm
nghên cứu mạng lưới hệ gen thực vật – RIKEN CSRS) và PGS.TS. Nguyễn
Văn Đồng (Giám đốc Phòng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ tế bào thực vật Viện Di truyền nơng nghiệp), đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện
thuận lợi để tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu này.
Tơi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ của nhóm nghiên cứu về mạng lưới
hệ gen thực vật, Viện RIKEN, Nhật Bản - nơi tơi thực hiện các nội dung chính
trong đề tài luận án, đã tạo điều kiện và thời gian cho tơi hồn thành luận án
này.
Để hồn thành luận án, tơi cịn nhận được sự động viên, khuyến khích giúp đỡ
của các bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Tất cả những sự giúp đỡ và tình cảm
q báu đó là nguồn động lực lớn giúp tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu
này.
Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày

tháng năm 2017

Tác giả luận án





ii


MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN.................................................................................................i
LỜI CẢM ƠN......................................................................................................ii
MỤC LỤC..........................................................................................................iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT........................................................................viii
DANH MỤC BẢNG............................................................................................x
DANH MỤC HÌNH............................................................................................xi
MỞ ĐẦU..............................................................................................................1
1. Tính cấp thiết của đề tài...................................................................................1
2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài........................................................................2
3. Nội dung nghiên cứu của đề tài........................................................................2
3.1. Nội dung 1: Xác định vai trò của enzyme 5'-3' exoribonuclease (AtXRN4)
trong việc điều khiển mức độ biểu hiện gen trong điều kiện thường và điều kiện
nhiệt độ cao..........................................................................................................2
3.2. Nội dung 2: Xác định vai trị của tasiRNA-ARF trong việc hình thành và
phát triển cấu trúc hoa trong điều kiện hạn..........................................................2
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn..........................................................................3
4.1. Ý nghĩa khoa học..........................................................................................3
4.2. Ý nghĩa thực tiễn...........................................................................................4
5. Tính mới của nghiên cứu.................................................................................4
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU..............................................................6
1.1. Đặt vấn đề.....................................................................................................6
1.1.1. Biến đổi khí hậu làm tăng nhiệt độ bề mặt trái đất, gây nên hiện tượng
hạn hán trên diện rộng..........................................................................................7
1.1.2. Tác động của nhiệt độ cao và hạn hán đến thực vật.................................11
1.1.2.1. Tác động của nhiệt độ cao lên thực vật................................................11
1.1.2.2. Tác động của hạn hán đến thực vật.......................................................12
1.1.3. Phản ứng của thực vật với các điều kiện bất thuận: nhiệt độ cao và hạn
hán......................................................................................................................14





iii


1.1.3.1. Phản ứng của thực vật khi bị tác động bởi nhiệt độ cao.......................14
1.1.3.2. Phản ứng của thực vật khi bị tác động bởi điều kiện hạn hán...............16
1.2. Tổng quan về cơ chế điều hồ sau phiên mã..............................................17
1.2.1. Q trình phân rã mRNA.........................................................................17
1.2.1.1. Các chu trình phân rã mRNA cơ bản....................................................17
1.2.1.2. Các chu trình phân rã mRNA đặc biệt..................................................23
1.2.2. Cơ chế điều hồ phiên mã thơng qua các sRNA (small RNA)................29
1.2.2.1. mỉNA.....................................................................................................31
1.2.2.2. siRNA....................................................................................................34
1.3. Tổng hợp các nghiên cứu về vai trò của enzyme AtXRN4 và tasi-RNA ở
thực vật...............................................................................................................38
1.3.1. Các nghiên cứu về chức năng và vai trò của enzyme AtXRN4 ở thực
vật.......................................................................................................................38
1.3.2 Các nghiên cứu về vai trò và chức năng của tasiRNA ở thực vật.............45
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................49
2.1. Vật liệu nghiên cứu.....................................................................................49
2.1.1. Vật liệu thực vật sử dụng trong nghiên cứu vai trò của gen AtXRN4 trong
chống chịu nhiệt độ cao.....................................................................................49
2.1.2. Vật liệu thực vật sử dụng trong nghiên cứu vai trò của tasiRNA liên quan
đến hình thành cấu trúc hoa của cây Arabidopsis trong điều kiện chịu
hạn......................................................................................................................50
2.1.3. Hoá chất và thiết bị thí nghiệm sử dụng trong nghiên cứu......................50
2.1.4. Địa điểm nghiên cứu................................................................................51
2.2. Phương pháp nghiên cứu.............................................................................51
2.2.1. Xử lý hạt trong nuôi cấy in vitro..............................................................51

2.2.2 Nuôi cấy in vitro.......................................................................................51
2.2.3. Nuôi cấy trong nhà kính..........................................................................52
2.2.4. Thí nghiệm đánh giá khả năng chịu nhiệt................................................52




iv


2.2.4.1. Thí nghiệm đánh giá khả năng chịu nhiệt độ cao của các dịng đột
biến…………………………………………………………………………….52
2.2.4.2. Thí nghiệm đánh giá khẳ năng chịu nhiệt của các dịng đột biến có bổ
sung bước thích nghi nhiệt độ............................................................................53
2.2.5. Thí nghiệm đánh giá khả năng chịu hạn..................................................53
2.2.6. Thí nghiệm so sánh mật độ và kích thước khí khổng ở cây WT và cây đột
biến atxrn4-3......................................................................................................53
2.2.7. Tách chiết mRNA và tổng hợp cDNA.....................................................54
2.2.7.1. Tách chiết mRNA.................................................................................54
2.2.7.2. Tổng hợp cDNA...................................................................................55
2.2.8. Phương pháp RT-PCR.............................................................................56
2.2.9. Phương pháp qRT-PCR...........................................................................57
2.2.9.1. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu vai trò của gen AtXRN4 đến khả
năng chịu nhiệt độ cao.......................................................................................58
2.2.9.2. Các cặp mồi sử dụng cho nghiên cứu vai trò của tasiRNA-ARF đến
hình thành cấu trúc hoa Arabidopsis trong điều kiện chịu hạn..........................59
2.2.10. Phân tích biểu hiện gen bằng phương pháp Microarray........................60
2.2.10.1. Phân tích biểu hiện gen bằng Microarray trong nghiên cứu vai trò của
gen AtXRN4 trong điều kiện chịu nhiệt độ cao..................................................60
2.2.10.2. Phân tích biểu hiện gen bằng Microarray trong nghiên cứu vai trị của

tasiRNA-ARF đến hình thành cấu trúc hoa Arabidopsis trong điều kiện chịu
hạn......................................................................................................................61
2.2.11. Phân tích mức độ phân rã mRNA..........................................................62
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...................................................63
3.1. Kết quả nghiên cứu vai trò của gen AtXRN4 trong điều kiện chịu nhiệt độ
cao......................................................................................................................63
3.1.1. Đánh giá khả năng sống sót của cây WT và cây đột biến atxrn4 khi nhiệt
độ tăng nhanh đến ngưỡng gây chết..................................................................63




v


3.1.2. Đánh giá vai trò của gen AtXRN4 đến khả năng làm mát và thoát hơi
nước ở cây Arabidopsis......................................................................................68
3.1.3. Đánh giá vai trị của gen AtXRN4 đến việc hình thành khí khổng và kích
thước khí khổng ở Arabidopsis..........................................................................72
3.1.4. Đánh giá tác động của đột biến gen AtXRN4 đến sự thay đổi mức độ biểu
hiện của hệ gen ở Arabidopsis...........................................................................74
3.1.5. Đánh giá tác động của gen AtXRN4 đến sự thay đổi mức độ biểu hiện của
các gen thuộc nhóm cảm ứng nhiệt ở điều kiện thường....................................76
3.1.6. Đánh giá vai trò của gen AtXRN4 trong việc điều hoà mức độ biểu hiện
một số gen liên quan đến khả năng thoát hơi nước ở Arabidopsis................... 90
3.1.7. Nghiên cứu xác định mRNA của các gen nào là mục tiêu để protein
AtXRN4 phân rã…………………………….................……………………...92
3.1.8. Đánh giá vai trò của gen AtXRN4 đến việc điều khiển khả năng cảm ứng
nhiệt ở Arabidopsis............................................................................................94
3.1.9. Đột biến gen HSFA2 làm mất khả năng chịu nhiệt độ cao và khả năng

cảm ứng nhiệt của cây đột biến atxrn4-3...........................................................97
3.2. Thảo Luận: Vai trò của gen AtXRN4 trong việc đáp ứng với điều kiện nhiệt
độ cao.................................................................................................................99
3.3. Kết quả nghiên cứu vai trò của tasiRNA-ARF trong việc bảo đảm cấu trúc
bình thường của hoa trong điều kiện hạn ở Arabidopsis.................................101
3.3.1. Đánh giá vai trị của tasiRNA-ARF đến việc hình thành hạt ở
Arabidopsis thơng qua đột biến gen RDR6......................................................101
3.3.2. Xác định nguyên nhân làm giảm khả năng thụ phấn ở cây Arabidopsis
đột biến, mất khả năng sinh tổng hợp tasiRNA...............................................104
3.3.3. Đánh giá vai trò của tasiRNA trong việc điều khiển mức độ biểu hiện của
các gen liên quan đến hình thành cấu trúc hoa ở Arabidopsis.........................106
3.3.4. Đánh giá vai trò của tasiRNA đến việc điều hoà mức độ biểu hiện của
các gen liên quan đến việc hình thành cấu trúc hoa, các gen sinh tổng hợp và
phản ứng với auxin……..........…………………………………………….....109




vi


3.4. Thảo luận: tasiRNA-ARF đóng vai trị quan trọng trong việc đảm bảo cấu
trúc thông thường của hoa ở cây Arabidopsis khi đáp ứng với điều kiện chịu
hạn....................................................................................................................112
IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................114
4.1. Kết luận.....................................................................................................114
4.2. Kiến nghị...................................................................................................115
TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................116






vii


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu
ABA
APX
BTB
CAT
Col-0
cRNA
DCL
DCP
EJC
ERF
FAO
FDR
GO
GR
HSE
HSF
HSP
miRNA
mRNA
MS
ncRNA
NGD

NMD
NSD
PABP
PAN
PARN
PCR
POD
PTC

Tên đầy đủ
Abscisic acid
Ascorbate perosidase
Bắc Trung Bộ
Catalase
Columbia 0
Complementary RNA
Dice like protein
Decapping protein
Exon junction complex
Ethylene response factor
Food and Agriculture Organization
False discovery rate
Gene ontology
Glutathione
Heat shock element
Heat shock factor
Heat shock protein
Micro RNA
Messanger RNA
Murashige and Skoog

Non-coding RNA
No-go decay
Nonsense mediate decay
Non-stop mRNA decay
Poly(A) binding-protein
Poly(A) binding-protein (PABP)-dependent poly(A)
nuclease
Poly(A) ribonuclease
Polymerase chain reaction
Peroxidase
Pemature termination codon

PTGS
ra-siRNA
RDR
RISC

Post transcriptional gene silencing
Repeat associated small interfering RNA
RNA dependent Rnase
RNA-induced silencing complex





viii


RITS

RNAi
ROS
RT-PCR
RT-qPCR
SD
siRNA
snoRNA
SOD
T-DNA
tasiRNA
TGS
UTR
VCS
WT
XRN





RNAi-induced transcriptional silencing complex
RNA interference
Reactive Oxygen Species
Reverse transcriptase polymease chain reaction
Reverse transcriptase quantitative polymease chain reaction
Standard deviation
Small interferon RNA
Small nucleolar RNA
Superoxide dismutase
Transfer DNA

trans-acting siRNA
Transcriptional gene silencing
Untranslated reagion
VARISCO
Wild type
Exoribonuclease

ix


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. So sánh sự khác biệt và tương đồng giữa sRNA và mRNA…...…..30
Bảng 1.2. So sánh sự khác nhau giữa miRNA và siRNA..................................33
Bảng 2.1. Các cặp mồi RT-qPCR sử dụng trong nghiên cứu vai trò của gen
ATXRN4 đến khả năng chịu nhiệt độ cao…………………..................……….58
Bảng 2.2 Các cặp mồi RT-PCR sử dụng cho nghiên cứu vai trò tasiRNA-ARF
đến hình thành cấu trúc hoa Arabidopsis trong điều kiện chịu hạn ….......…...59
Bảng 2.3. Các cặp mồi RT-qPCR sử dụng cho nghiên cứu vai trị của tasiRNAARF đến hình thành cấu trúc hoa Arabidopsis trong điều kiện chịu hạn..........60
Bảng 3.1 Danh sách 88 gen thuộc nhóm “đáp ứng với điều kiện bất thuận” tăng
mức độ biều hiện ở cây đột biến atxrn4-3 so với cây WT đồng thời cũng tăng
mức độ biểu hiện do nhiệt độ cao ở WT............................................................77
Bảng 3.2. Danh sách các gen thuộc nhóm “đáp ứng với nhiệt dộ”
(GO:0009408) tăng mức độ biểu hiện trên dòng đột biến atxrn4-3 so với WT
trong điều kiện nhiệt dộ thường ........................................................................86
Bảng 3.3. So sánh mức độ biểu hiện của gen liên quan đến hình thành và cấu
trúc của khí khổng giữa cây đột biến atxrn4-3 và cây WT ở điều kiện
thường…………………………………………………………………………91






x


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Mức độ biến đổi của nhiệt độ trung bình bề mặt trái đất....................8
Hình 1.2. Thay đổi về số lượng ngày/đêm lạnh, ngày/đêm nóng trên tồn
cầu........................................................................................................................9
Hình 1.3. Tình hình khan hiếm nước ngọt trên thế giới....................................10
Hình 1.4. Tác động của hạn hán đến (A) quá trình sinh trưởng của thực vật (B)
quá trình quang hợp của thực vật.......................................................................13
Hình 1.5. Cơ chế đáp ứng các yếu tố bất thuận phi sinh học thơng qua các HSF
và HSP ..............................................................................................................15
Hình 1.6. Cơ chế đáp ứng điều kiện hạn ở thực vật..........................................17
Hình 1.7. Các chu trình phân rã mRNA cơ bản ở sinh vật đa bào....................18
Hình 1.8. Chu trình phân rã mRNA theo cơ chế kiểm sốt NMD....................27
Hình 1.9. Chu trình phân rã RNA theo các cơ chế NGD (A) và NSD (B).......28
Hình 1.10. Phân loại RNA. RNA được phân thành hai nhóm chính: nhóm mã
hố và nhóm khơng mã hố...............................................................................29
Hình 1.11. Quá trình sinh tổng hợp và hoạt động của miRNA.........................32
Hình 1.12. Cơ chế sinh tổng hợp và vai trị của các siRNA.............................35
Hình 1.13. Quá trình sinh tổng hợp và hoạt động của tasiRNA.......................37
Hình 1.14. Mơ hình thể hiện cơ chế phân rã các trình tự mRNA đầu 3’ là sản
phẩm của q trình phân rã bằng miRNA.........................................................39
Hình 1.15. Mơ hình thể hiện vai trị phân rã các mRNA khơng mũ m7Gpp và
đi poly(A) của enzyme AtXRN4...................................................................41
Hình 1.16. Vai trị của enzyme AtXRN4 trong điều hồ đáp ứng Ethylene.....43
Hình 1.17. Sơ đồ miêu tả vai trò của tasiRNA-ARF trong việc điều hồ số
lượng mRNA của các gen ARF, từ đó tác động đến việc kéo dài rễ phụ ở cây

Arabidopsis........................................................................................................47
Hình 3.1. Đột biến ở gen AtXRN4 làm tăng khả năng tỷ lệ sống sót của cây
Arabidopsis khi nhiệt độ tăng nhanh đến ngưỡng gây chết...............................65




xi


Hình 3.2. Đột biến ở gen AtXRN4 làm giảm tỷ lệ sống sót của cây Arabidopsis
khi nhiệt độ tăng đến ngưỡng gây hại................................................................67
Hình 3.3. Đột biến ở gen AtXRN4 làm tăng khả năng làm mát ở Arabidopsis
trong điều kiện nhiệt độ cao...............................................................................69
Hình 3.4. Đột biến ở gen AtXRN4 làm tăng khả năng thốt hơi nước ở
Arabidopsis........................................................................................................71
Hình 3.5. Đột biến gen AtXRN4 làm thay đổi kích thước khí khộng ở
Arabidopsis........................................................................................................73
Hình 3.6. Phân tích mức độ biểu hiện của hệ gen Arabidopsis khi gen AtXRN4
bị đột biến trong điều kiện nhiệt độ thường và nhiệt độ cao..............................75
Hình 3.7. So sánh mức độ biểu hiện của một số gen liên quan đến khả năng
chịu nhiệt độ cao giữa........................................................................................89
Hình 3.8. mRNA của hai gen HSFA2 và ERF1 là mục tiêu trực tiếp để phân rã
của AtXRN4 ở điều kiện nhiệt độ thường.........................................................93
Hình 3.9. Enzyme AtXRN4 đóng vai trị phân rã mRNA của HSFA2 khi cây
được đưa về nhiệt độ thường sau quá trình cảm ứng nhiệt................................96
Hình 3.10. Đột biến ở gen HSFA2 làm mất đi khả năng chịu nhiệt độ cao và
khả năng cảm ứng nhiệt của cây đột biến atxrn4-3...........................................98
Hình 3.11. Đột biến gen RDR6 làm giảm khả năng thụ phấn của Arabidopsis
trong điều kiện hạn...........................................................................................103

Hình 3.12. Đột biến gen RDR6 làm thay đổi tương quan chiều dài giữa nhị và
nhuỵ hoa ở Arabidopsis...................................................................................105
Hình 3.13. Q trình làm câm gen bằng tasiRNA-ARF đóng vai trị quan trọng
trong việc hình thành cấu trúc hoa ở Arabidopsis trong điều kiện hạn............108
Hình 3.14. Kết quả phân tích hệ gen ở nụ hoa của cây WT và cây đột biến rdr6
trong điều kiện thường và điều kiện hạn..........................................................111





xii




MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Áp lực gia tăng dân số cùng với việc biến đổi khí hậu đã và đang tác
động mạnh mẽ đến hệ sinh thái, đặc biệt là cây trồng. Tăng dân số cùng với
các yếu tố khác như: nhiệt độ tăng, hạn hán, ngập mặn làm cho diện tích
cũng như sản lượng của cây nông nghiệp bị suy giảm nặng nề, ảnh hưởng
lớn đến an ninh lương thực toàn thế giới. Để khắc phục các thực trạng trên,
ngoài việc giảm thiểu các nguy cơ gây ô nhiễm môi trường, các nguy cơ
làm thiếu hụt nguồn tài nguyên thì việc nghiên cứu, chọn tạo ra các giống
cây trồng có khả năng tăng sức chống chịu với các điều kiện bất thuận cũng
sẽ là mục tiêu hàng đầu của các nhà khoa học. Việc nghiên cứu cơ chế đáp
ứng với các điều kiện bất thuận vì thế là vấn đề tiên quyết giúp tạo nên cơ
sở khoa học để tiến hành cải tạo các giống cây trồng phục vụ cho an ninh
lương thực và phát triển cơng nghiệp.

Q trình đáp ứng với các điều kiện bất thuận ở thực vật thơng qua
nhiều chu trình sinh lý khác nhau, dựa trên việc điều khiển mức độ biểu
hiện các gen liên quan. Các nghiên cứu đã cho thấy khơng chỉ q trình
điều hồ trước phiên mã mà cả q trình điều hồ sau phiên mã cũng đóng
vai trị quan trọng trong việc giúp thực vật đáp ứng với các điều kiện bất
thuận phi sinh học (Hirayama and Shinozaki, 2010). Để bổ sung cơ sở dữ
liệu về cơ chế điều hoà biểu hiện gen sau phiên mã, trong nghiên cứu này,
chúng tôi tập chung xác định và đánh giá vai trị của chu trình phân rã
mRNA cơ bản, có sự tham gia của enzyme 5'-3' exoribonuclease trong việc
đáp ứng điều kiện nhiệt độ cao. Chúng tôi cũng đồng thời nghiên cứu vai
trò của cơ chế bất hoạt gen bằng tasiRNA trong việc đáp ứng điều kiện hạn
hán.



1




2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
Nghiên cứu này tập chung vào hai mục tiêu chính:
- Xác định vai trị của cơ chế điều hồ sau phiên mã theo chiều 5’-3’
do hoạt động của enzyme AtXRN4 trong việc điều khiển mức độ biểu hiện
gen ở điều kiện thường và điều kiện nhiệt độ cao trên đối tượng cây mơ
hình Arabidopsis.
- Xác định vai trị của cơ chế điều hồ sau phiên mã do hoạt động
của tasiRNA-ARF trong việc hình thành và phát triển cấu trúc hoa
Arabidopsis khi bị tác động bởi điều kiện hạn.
3. Nội dung nghiên cứu của đề tài

3.1. Nội dung 1: Xác định vai trò của cơ chế điều hoà sau phiên mã theo
chiều 5’-3’ do hoạt động của enzyme AtXRN4 trong việc điều khiển mức độ
biểu hiện gen ở điều kiện thường và điều kiện nhiệt độ cao trên đối tượng
cây mơ hình Arabidopsis.
- Xác định tác động của đột biến gen AtXRN4 đến hình thái phát triển
của cây Arabidopsis trong điều kiện nhiệt độ thường và nhiệt độ cao.
- Xác định tác động của đột biến gen AtXRN4 đên mức độ biểu hiện
của hệ gen, sàng lọc các nhóm gen liên quan đến khả năng đáp ứng chịu
nhiệt độ cao ở cây Arabidopsis bằng phương pháp microarray và RTqPCR.
- Xác định được các gen có mRNA là mục tiêu trực tiếp để phân rã
do enzyme AtXRN4, đồng thời xác định vai trò của các gen này trong việc
đáp ứng điều kiện nhiệt độ cao.
3.2. Nội dung 2: Xác định vai trò của cơ chế điều hoà sau phiên mã do
hoạt động của tasiRNA-ARF trong việc hình thành và phát triển cấu trúc
hoa Arabidopsis khi bị tác động bởi điều kiện hạn



2




- Đánh giá sự khác biệt về kiểu hình do việc mất khả năng sinh tổng
hợp tasiRNA-ARF trong điều kiện chịu hạn.
- Xác định vai trò của tasiRNA-ARF lên mức độ biểu hiện của hệ
gen, sàng lọc được các nhóm gen liên quan đến khả năng chịu hạn bằng
phương pháp microarray.
- Phân tích mức độ biểu hiện của một số gen đặc trưng liên quan đến
việc hình thành cấu trúc hoa trong điều kiện chịu hạn, khẳng định việc thay

đổi cấu trúc hoa sau khi xử lý hạn liên quan đến vai trị điều hồ sau phiên
mã của tasiRNA-ARF.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
4.1. Ý nghĩa khoa học
Nghiên cứu này sẽ góp phần bổ sung vào cơ sở dữ liệu về vai trị của
điều hồ sau phiên mã, đáp ứng với các yếu tố bất thuận phi sinh học, từ đó
cho thấy khơng chỉ q trình điều hồ biểu hiện gen trước phiên mã mà q
trình điều hồ sau phiên mã cũng góp phần quan trọng để cây trồng có thể
đáp ứng với các điều kiện bất thuận.
Nghiên cứu xác định được vai trò của enzyme AtXNR4 trong việc
đảm bảo số lượng mRNA của các gen HSFA2 và ERF1 luôn ở mức độ cho
phép trong điều kiện thường, vai trò này của enzyme AtXNR4 còn được
thể hiện trong việc kiểm soát lượng mRNA của gen HSFA2 trong điều kiện
cảm ứng nhiệt, nhanh chóng đưa cây trở lại trạng thái phiên mã bình
thường sau khi nhiệt độ thay đổi từ mức cao xuống mức bình thường.
Nghiên cứu này cũng chỉ ra được q trình điều hồ sau phiên mã
thơng qua tasiRNA-ARF là cần thiết, để đảm bảo việc hình thành cấu trúc
hoa ở Arabidopsis được diễn ra bình thường, trong trường hợp cây bị tác
động bởi điều kiện hạn hán.



3




4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Nghiên cứu này góp phần cung cấp thêm cơ sở dữ liệu để từ đó các
nghiên cứu ứng dụng có thể được thực hiện, nhằm áp dụng các chu trình

điều hồ sau phiên mã làm thay đổi mức độ biểu hiện của hệ gen hay một
số gen nhất định trong các điều kiện bất thuận.
Đối với mRNA của các gen là mục tiêu trực tiếp để phân rã của
AtXRN4, việc tìm ra các trình tự gắn đặc hiệu để AtXRN4 có thể gắn vào
sẽ có một ý nghĩa quan trọng. Khi các trình tự này bị biến đổi, AtXRN4 có
thể sẽ khơng gắn được vào mRNA từ đó mất khả năng phân rã. Việc này có
thể sẽ giúp các nhà khoa học có thêm phương tiện để nghiên cứu điều hoà
biểu hiện gen đáp ứng với các điều kiện bất thuận
Ở thực vật, mức độ biểu hiện của các gen ARF chịu tác động chủ yếu
bởi hàm lượng auxin nội sinh, lượng auxin này sẽ biến đổi tuỳ thời kỳ sinh
trưởng cũng như do tác động của các yếu tố môi trường. Việc nắm được cơ
chế điều hoà sau phiên mã của các gen ARF cũng sẽ giúp các nhà khoa học
có thêm phương thức can thiệp vào việc điều khiển mức độ biểu hiện của
các gen này trong các điều kiện bất thuận, từ đó tạo nên các giống cây
trồng có khả năng chống chịu cao.
5. Tính mới của nghiên cứu
Nghiên cứu cũng lần đầu tiên đưa ra được các gen cụ thể (ERF1 và
HSFA2) có mRNA bị phân rã theo chiều 5'-3' do hoạt động của enzyme
AtXRN4, từ đó khám phá thêm được vai trị của enzyme này trong việc
điều hồ mức độ biểu hiện gen HSFA2 trong điều kiện thường cũng như
điều kiện cảm ứng nhiệt.
Nghiên cứu này cũng chứng minh được vai trị của tasiRNA-ARF
trong việc đảm bảo sự phát triển bình thường của cấu trúc hoa ở
Arabidopsis, chứng minh vai trò điều hoà sau phiên mã của tasiRNA đến



4





các gen chịu hạn và các gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp và đáp
ứng auxin.



5




CHƯƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Cơng nghiệp hố và hiện đại hố nhanh chóng khơng chỉ mang lại
lợi ích thiết yếu cho cuộc sống con người mà còn đem lại những tác động
tiêu cực đến hệ sinh thái toàn cầu. Bùng nổ dân số cùng với sự phát triển xã
hội đã và đang tạo áp lực lên hệ sinh thái bằng việc tận dụng tối đa nguồn
tài nguyên tự nhiên như nhiên liệu hoá thạch, đất đai và nguồn nước... Tuy
nhiên một trong những tác động tiêu cực nhất do q trình phát triển nhanh
chóng đó là làm biến đổi khí hậu tồn cầu theo hướng khơng mong muốn.
Biến đổi khí hậu là hiện tượng thời tiết trung bình đặc thù của một
vùng bị thay đổi. Nó có thể bao gồm thay đổi về lượng mưa trung bình,
thay đổi về nhiệt độ trung bình hay các yếu tố thời tiết đặc thù khác
( Các tác động chủ yếu tạo nên biến đổi khí hậu bao
gồm các yếu tố tự nhiên cũng như các yếu tố hình thành do tác động của
con người thơng qua q trình sinh hoạt và phát triển. Những thiệt hại do
biến đổi khí hậu gây ra đối với sự sống, đó là làm tăng số lượng và mức độ
của các hiện tượng bất thuận phi sinh học như: nhiệt độ tăng cao, nhiệt độ

xuống thấp, hạn hán, ngập mặn, nhiễm phèn... Các hiện tượng trên tác động
một cách nhanh chóng đến mơi trường sống của các lồi sinh vật, từ đó tạo
nên các hiện tượng bất thuận sinh học như: tăng cường sự phát triển của
các loại bệnh do vi khuẩn, vi rút hay các yếu tố bất thuận sinh học khác.
Trong các yếu tố bất thuận phi sinh học kể trên, nhiệt độ môi trường tăng
cao và hạn hán là hai yếu tố gây tác động mạnh mẽ và trực tếp đến quá
trình phát triển và sinh trưởng của thực vật, từ đó tác động tiêu cực đến
năng suất và chất lượng cây trồng trên toàn thế giới.



6




1.1.1. Biến đổi khí hậu làm tăng nhiệt độ bề mặt trái đất, gây nên hiện
tượng hạn hán trên diện rộng
Trái đất tiếp nhận năng lượng thông qua bức xạ ánh sáng mặt trời.
Một phần bức xạ được phản chiếu trở lại, ra ngồi khí quyển, tuy nhiên
khoảng 50% bức xạ được giữ lại trong bầu khí quyển để làm ấm trái đất.
Các hoạt động sống và hoạt động công nghiệp của con người đã và đang
làm gia tăng lượng khí nhà kính cũng như tăng cường số lượng các hạt bụi
nhỏ trong khơng khí, làm cho phần bức xạ được hấp phụ trong bầu khí
quyển tăng lên, từ đó làm tăng thêm nhiệt độ bề mặt trái đất
( Các
thống kê cho thấy nhiệt độ bề mặt trái đất, bề mặt nước biển và nhiệt độ
khí quyển đang ngày càng tăng nhanh trong nhữngnhững thập kỷ gần đây
(Hình 1.1). Từ những năm giữa thế kỷ 20, việc đánh giá sự biến đổi nhiệt
độ bề mặt đất cho thấy ngưỡng nhiệt độ thấp nhất và cao nhất đều tăng lên,

cùng với đó là sự tăng về số lượng ngày nắng nóng và giảm về số lượng
ngày lạnh trong năm (Hình 1.2) (Hartmann et al., 2014).



7




Nguồn: Hartmann et al., 2014
Hình 1.1. Mức độ biến đổi của nhiệt độ trung bình bề mặt trái đất. (A) Mức
độ biến đổi nhiệt độ trung bình của cả 3 yếu tố (nhiệt độ bề mặt đất, nhiệt
độ bề mặt đại dương và nhiệt độ tầng đối lưu). Nhiệt độ trung bình trong
khoảng thời gian 1961 – 1990 được sử dụng làm giá trị tham chiếu (0oC).
Dữ liệu được tổng hợp từ 3 cơ sở dữ liệu (MLOST, HadCRUT4 và GISS).
(B) Dữ liệu của hình (A) thể hiện trên bản đồ thế giới với 3 cơ sở dữ liệu
khác nhau (MLOST, HadCRUT4 và GISS). Các điểm màu trắng thể hiện
các vị trí khơng thu thập được dữ liệu nhiệt độ.



8




Nguồn: Hartmann et al., 2014
Hình 1.2. Thay đổi về số lượng ngày/đêm lạnh, ngày/đêm nóng trên tồn
cầu. Dữ liệu được tổng hợp từ 3 nguồn (HadEX2, HadGHCND và

GHCNDEX). Điểm màu ghi thể hiện các vị trí khơng thu thập được dữ
liệu. Nhiệt độ trung bình trong khoảng thời gian 1961 – 1990 (0oC) được sử
dụng làm giá trị tham chiếu.



9




Một trong những hậu quả tiếp theo của hiện tượng nhiệt độ tăng cao
do biến đổi khí hậu là tình trạng thiếu hụt nguồn nước dẫn đến hạn hán.
Thiếu hụt nguồn nước khơng chỉ do biến đổi khí hậu mà còn do áp lực tăng
dân số, khiến lượng nước ngọt cần cho các nhu cầu sử dụng tăng nhanh.
Theo đánh giá của tổ chức nơng lương thế giới (FAO), tồn thế giới có
khoảng 3800 km3 nước ngọt, trong đó 70% được sử dụng cho tưới tiêu
(FAO, 2007). Biến đổi khí hậu đã và đang làm lượng nước này ngày càng
bị thiếu hụt (Hình 1.3). Tác động của hạn hán khơng chỉ làm giảm diện tích
đất canh tác do hoang mạc hố mà cịn tác động trực tiếp đến sự phát triển
của cây trồng, dẫn đến giảm năng suất và chất lượng. Ở một số khu vực,
hạn hán có thể làm giảm đến 50% năng suất cây trồng (Boyer, 1982).
Trong khoảng thời gian 2008–2012, lượng mưa ở các quốc gia Mỹ La Tinh
(Brazil, Argentina, Paraguay, Uruguay) liên tục bị suy giảm. Hạn hán khiến
cho sản lượng đậu tương của Brazil bị mất tới 64% và của Argentina là
30% (2011-2012) (Agrodigital, 2012).

Hình 1.3. Tình hình khan hiếm nước ngọt trên thế giới (FAO, 2007)




10




1.1.2. Tác động của nhiệt độ cao và hạn hán đến thực vật
1.1.2.1. Tác động của nhiệt độ cao lên thực vật
Mức độ tác động của nhiệt độ cao lên thực vật phụ thuộc vào loại
cây (Cây ngắn ngày, cây dài ngày, cây lương thực hay cây ăn rau...) và thời
kỳ phát triển của cây (Nẩy mầm, sinh trưởng, ra hoa....). Mỗi đối tượng
thực vật sẽ có một ngưỡng nhiệt độ sinh trưởng khác nhau, nếu nhiệt độ
môi trường sống nằm ngồi ngưỡng đó, q trình sinh trưởng và phát triển
sẽ bị tác động một cách nghiêm trọng. Ví dụ, ngưỡng nhiệt độ cao nhất cây
ngơ có thể chịu được là 38oC, trong khi đối với các cây rau (xúp lơ, cải) thì
ngưỡng nhiệt độ cao nhất là 25oC. Nhiệt độ cao cũng tác động tiêu cực đến
quá trình hình thành hoa và quá trình tạo hạt ở thực vật. Nghiên cứu trên
cây ngô cho thấy nhiệt độ tăng cao hơn 35oC ở thời điểm thụ phấn sẽ làm
giảm khả năng tồn tại của hạt phấn (Herrero and Johnson, 1980, Schoper et
al., 1987, Dupuis and Dumas, 1990). Khi nhiệt độ môi trường trên ngưỡng
30oC, khả năng phân chia của tế bào và khả năng gia tăng số lượng các thể
tinh bột ở hạt ngơ cũng bị tác động, từ đó làm giảm đáng kể về chất lượng
(Commuri and Jones, 2001). Ở lúa, nhiệt độ tăng quá 33oC cũng làm giảm
khả năng thụ phấn của hạt phấn và khi nhiệt độ lên đến 40oC, hạt phấn lúa
sẽ mất khả năng thụ phấn (Kim et al., 1996).
Dự đoán đến những năm cuối thế kỷ 21, ảnh hưởng của nhiệt độ cao
sẽ ngày càng có tác động tiêu cực lên sản lượng của các loại cây trồng nơng
nghiệp chủ chốt trên tồn thế giới (sản lượng giảm từ 2,5% đến 10%)
(Hatfield et al., 2011). Sản lượng các cây lúa mỳ, ngô và bông trên thế giới
sẽ giảm từ 36% đến 40% với kịch bản nồng độ CO2 thấp và từ 63% đến

70% với kịch bản nồng độ CO2 cao do tác động của sự gia tăng nhiệt độ
môi trường (Schlenker and Roberts, 2009).



11