ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---    ---

Nguyễn Quang Duy

XÂY DỰNG BỘ KIT ĐỊNH LƯỢNG PCR HBV (QPCR)
ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS VIÊM GAN B (HBV)

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Hà Nội - 2017


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---    ---

Nguyễn Quang Duy

XÂY DỰNG BỘ KIT ĐỊNH LƯỢNG PCR HBV (QPCR)
ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS VIÊM GAN B (HBV)

Chuyên ngành Sinh học Thực nghiệm
Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. Võ Thị Thương Lan

Hà Nội - 2017

Lời cảm ơn
Để hồn thành khóa luận này, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.
TS. Võ Thị Thương Lan. Cô đã hướng dẫn và truyền đạt cho em kiến thức và kinh
nghiệm quý báu. Cô cũng luôn nhắc nhở, bảo ban và động viên em trong suốt thời
gian hoàn thành luận văn này. Dưới sự hướng dẫn của cô, em không chỉ học được
nhiều về kiến thức chun mơn mà cịn có được những bài học về cuộc sống. Đây sẽ
là những hành trang quý báu để em bước tiếp trong sự nghiệp của mình.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ths. Phạm Anh Thùy Dương, chị là
người đã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo tận tình trong suốt quá trình em thực hiện
đề tài. Chị cũng là người dạy cho em tính tự giác và thái độ nghiêm túc trong các
công việc được giao.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS. Tạ Bích Thuận, cơ là người
ln động viên và chia sẻ với em những khó khăn trong suốt thời gian qua, giúp em
có thế hồn thành tốt luận văn của mình.
Em xin gửi lời cảm ơn đến NCS. Ngơ Thị Hà, CN. Nguyễn Thu Trang và
những người bạn trong phịng thí nghiệm Sinh Y đã ln giúp đỡ và động viên tinh
thần em trong suốt thời gian thực hiện đề tài
Cuối cùng em xin gửi lòng biết ơn tới gia đình đã hỗ trợ em vật chất và tinh
thần trong thời gian em thực hiện khóa luận này.
Hà Nội, ngày

tháng

Học viên cao học

Nguyễn Quang Duy

năm



DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

PCR

: Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

Real-time PCR

: Real-time Polymerase Chain Reaction (PCR thời gian thực)

HBcAg

: Hepatitis B core antigen (Kháng nguyên lõi virus)

Anti - HBc

: Kháng thể của HBcAg

HBeAg

: Hepatitis B envelope antigen (Kháng nguyên vỏ virus)

Anti - HBe

: Kháng thể của HBeAg

HBsAg


: Hepatitis B surface antigen (Kháng nguyên bề mặt virus)

Anti - HBs

: Kháng thể của HBsAg

HBV

: Hepatitis B virus (Virus viêm gan B)

cccDNA

: Covalently closed circular DNA (Cấu trúc DNA siêu xoắn)

Genotype

: Kiểu gen

Sub genotype

: Dưới kiểu gen

ORF

: Open Reading Frame (Khung đọc mở)

HBxAg

: Hepatitis B virus X antigen (Kháng nguyên X của virus)



DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1

:

So sánh các kit thương mại được sử dụng để định lượng HBV

15

Bảng 2.1

:

Trình tự các mồi được sử dụng trong nghiên cứu

25

Bảng 2.2

:

Trình tự các đầu dò Taqman được sử dụng trong nghiên cứu

25

Bảng 2.3

:


Điều kiện phản ứng PCR tối ưu để khuếch đại HBV

26

Bảng 2.4

:

Thành phần và điều kiện phản ứng real-time PCR

27

Bảng 2.5

:

Thành phần gel polyacrylamide 8% dùng trong điện di DNA

27

Bảng 2.6

:

Thành phần và điều kiện phản ứng cắt plasmid HBV

29

Bảng 3.1


:

Giá trị Ct của các plasmid HBV khi sử dụng các nồng độ 41
Taqman khác nhau

Bảng 3.2

:

Giá trị Ct của plasmid HBV và plasmid IC ở 6 nồng độ khảo 42
sát

Bảng 3.3

:

Giá trị Ct của plasmid HBV và plasmid IC từ hai điều kiện bảo 43
quản khác nhau

Bảng 3.4

:

Giá trị Ct của plasmid HBV và các mẫu bệnh phẩm

46


DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang
Hình 1.1

:

Hình ảnh dưới kính hiển vi tử và số lượng gần đúng của 2
các thành phần liên quan đến HBV trong 1 ml huyết thanh
bệnh nhân mang HBV mãn tính

Hình 1.2

:

Cấu trúc hệ gen của HBV

4

Hình 1.3

:

Quá trình xâm nhiễm của HBV

5

Hình 1.4

:

Phân bố địa lý về genotypes của HBV trên thế giới


7

Hình 1.5

:

Phân bố tỷ lệ người nhiễm HBV theo địa lý

8

Hình 1.6

:

Kĩ thuật DNA nhánh

12

Hình 1.7

:

Kĩ thuật lai bắt giữ

13

Hình 1.8

:


PCR cạnh tranh định lượng

14

Hình 1.9

:

Biểu đồ khuếch đại của một mẫu trong real-time PCR

16

Hình 1.10

:

Real-time PCR sử dụng đầu dị Taqman

20

Hình 2.1

:

Sơ đồ thí nghiệm

23

Hình 3.1


:

Kết quả khuếch đại gen P từ 2 mẫu dương tính HBV bằng 31
cặp mồi HBV F/R

Hình 3.2

:

Kết quả sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn chèn HBV 105 bp 32
trên gel agarose 2%

Hình 3.3

:

Kết quả xác định nồng độ và điện di kiểm tra plasmid HBV 32

Hình 3.4

:

Kết quả so sánh trình tự đoạn chèn của plasmid HBV với 8 33
trình tự genotype

Hình 3.5

:


Kết quả xác định nồng độ và điện di kiểm tra plasmid HBV 34
sau khi cắt với ScaI và tinh sạch

Hình 3.6

:

Sản phẩm IC khuếch đại từ DNA thực khuẩn thể

35


Hình 3.7

:

Kết quả sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn chèn IC 218 bp trên 35
gel agarose 2%.

Hình 3.8

:

Kết quả xác định nồng độ và điện di kiểm tra plasmid IC

Hình 3.9

:

Kết quả so sánh trình tự đoạn chèn IC với trình tự trên 37

NCBI

Hình 3.10

:

Kết quả khảo sát dải nồng độ plasmid HBV trộn 105 copy 38
plasmid IC với nồng độ mồi 0.67 µM.

Hình 3.11

:

Kết quả khảo sát dải nồng độ 102, 103, 106, 107 copy 38
plasmid HBV trộn 105 copy plasmid IC với nồng độ mồi
0.8 µM, 1.0 µM và 1.2 µM

Hình 3.12

:

Kết quả khảo sát dải nồng độ 3, 5, 102, 105 copy plasmid 39
HBV trộn 105 copy plasmid IC ở nhiệt độ gắn mồi 62oC

Hình 3.13

:

Khảo sát độ nhạy phát hiện plasmid HBV


Hình 3.14

:

Kết quả phối trộn 5x104 và 105 copy plasmid IC với 5, 50, 41
102 và 105 copy plasmid HBV

Hình 3.15

:

Kết quả phối trộn 104 và 5x104 copy plasmid IC với 10, 25, 41
50 và 102 copy plasmid HBV

Hình 3.16

:

Đường chuẩn với 6 nồng độ plasmid HBV 108, 104, 102, 25, 42
10 và 5 copy

Hình 3.17

:

Đường chuẩn xây dựng từ hai set plasmid

Hình 3.18

:


Đường tín hiệu khuếch đại trong phản ứng định lượng bốn 45
mẫu bệnh phẩm

Hình 3.19

:

Đường chuẩn định lượng bốn mẫu bệnh phẩm.

36

40

44

45


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................. 2
1.1.

Giới thiệu về Hepatitis B Virus .....................................................................2

1.1.1.

Cấu trúc HBV ......................................................................................2


1.1.2.

Cơ chế xâm nhiễm của HBV ...............................................................4

1.1.3.

Phân loại ..............................................................................................6

1.2.

Dịch tễ học của viêm gan B ...........................................................................7

1.2.1.

Tình hình mắc viêm gan B trên thế giới và ở Việt Nam .....................7

1.2.2.

Phương thức lây truyền .......................................................................9

1.2.3.

Các giai đoạn nhiễm HBV...................................................................9

1.3.

Các phương pháp chuẩn đoán nhiễm HBV .................................................11

1.3.1.


Kĩ thuật DNA nhánh (Branched DNA technology) ..........................12

1.3.2.

Kĩ thuật lai bắt giữ (Hybrid capture technology) ..............................12

1.3.3.

PCR cạnh tranh định lượng (Quantitative-competitive PCR) ...........13

1.3.4.

Real-time PCR ...................................................................................16

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGUYÊN CỨU ............. 22
2.1.

Thiết kế thí nghiệm ......................................................................................22

2.2.

Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị .................................................................24

2.2.1.

Đối tượng nghiên cứu ........................................................................24

2.2.2.


Hóa chất và sinh phẩm ......................................................................24


2.2.3.
2.2.

Trang thiết bị .....................................................................................25

Phương pháp nghiên cứu .............................................................................26

2.2.1.

Phương pháp PCR và phương pháp real-time PCR ..........................26

2.2.2.

Phương pháp điện di ..........................................................................27

2.2.3.

Phương pháp ligate ............................................................................28

2.2.5.

Phương pháp xác định nồng độ DNA ...............................................29

2.2.6.

Cắt và tinh sạch plasmid sau khi cắt .................................................29


2.2.7.

Phương pháp pha loãng .....................................................................30

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 31
3.1.

Tách dòng plasmid mang đoạn gen P của HBV ..........................................31

3.2.

Tạo mẫu chuẩn HBV ...................................................................................33

3.3.

Tạo DNA nội chuẩn .....................................................................................34

3.3.1.

Thiết kế đoạn IC ................................................................................35

3.3.2.

Tách dịng IC .....................................................................................35

3.4.

Chuẩn hóa điều kiện phát hiện HBV và IC .................................................37

3.4.1.


Tối ưu thành phần và điều kiện phản ứng .........................................37

3.4.2.

Khảo sát độ giới hạn phát hiện HBV ................................................39

3.4.3.

Tối ưu hóa nồng độ plasmid IC phối trộn với plasmid HBV ............40

3.4.4.

Tối ưu điều kiện phản ứng real-time PCR ........................................42

3.5. Xây dựng đường chuẩn định lượng HBV và xác định giới hạn phát hiện
HBV trong real-time PCR .....................................................................................42
KẾT LUẬN .............................................................................................................. 47
KIẾN NGHỊ ............................................................................................................. 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 48



MỞ ĐẦU
Viêm gan virus B (Hepatitis B virus - HBV) là một nhóm bệnh truyền nhiễm
phổ biến và nguy hiểm hàng đầu trên thế giới. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế
giới, ước tính có khoảng 257 triệu người mắc bệnh viêm gan B mãn tính. Trong đó,
hơn 887.000 người tử vong mỗi năm do các biến chứng của viêm gan B, bao gồm xơ
gan và ung thư gan. Việt Nam là một trong những nước có tỷ lệ mắc viêm gan B cao.
Các nghiên cứu gần đây cho thấy tỉ lệ nhiễm HBV trong dân số dao động từ 10% đến

20%. Nếu không được theo dõi và điều trị kịp thời, 1/4 số bệnh nhân mắc viêm gan B
mãn tính sẽ tử vong do ung thư gan và suy gan.
Ngày nay, nhờ các tiến bộ của công nghệ hiện đại, việc điều trị bằng các thuốc
kháng virus đã giúp giảm thiểu và ngăn chặn bệnh viêm gan tiến triển tới bệnh lý
nặng như xơ gan, ung thư tế bào gan nguyên phát, suy gan… Để có hiệu quả, theo dõi
tải lượng virus giúp lựa chọn phác đồ điều trị hay kiểm tra đáp ứng thuốc của bệnh
nhân là rất cần thiết. Kỹ thuật Real-time PCR cho phép xác định số lượng virus HBV
hồn chỉnh có trong huyết thanh của người bệnh thông qua việc định lượng vật chất
di truyền của virus. Với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cùng thời gian tiến hành ngắn
nên real-time PCR được coi là tiêu chuẩn vàng trong việc theo dõi và điều trị đối với
bệnh nhân nhiễm HBV. Tuy nhiên, hầu hết các bộ kit thương mại phục vụ cho xét
nghiệm real-time PCR định lượng HBV đều nhập từ nước ngồi và có giá thành cao.
Khắc phục điều này, chúng tôi tiến hành đề tài “Xây dựng bộ kit định lượng PCR
HBV (qPCR) để phát hiện virus viêm gan B” với giá thành phù hợp nhưng vẫn đảm
bảo tính chính xác của xét nghiệm.

1


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Giới thiệu về Hepatitis B Virus

1.1.1.

Cấu trúc HBV

1.1.1.1. Hình thái
Virus viêm gan B là một loại virus hướng gan có vật chất di truyền là DNA

thuộc họ Hepadnaviridae virus [4, 36]. Trong huyết thanh của bệnh nhân ở giai đoạn
virus đang tái bản, có thể quan sát thấy ba kiểu cấu trúc bao gồm: hình cầu, hình ống
và hạt dane hồn chỉnh [36]. Cấu trúc hình cầu có đường kính 20 nm. Cấu trúc hình
ống có chiều rộng 22 nm và chiều dài thay đổi. Những dạng này được cấu tạo bởi
kháng nguyên bề mặt (HBsAg) và lipit có nguồn gốc từ vật chủ, khơng chứa axit
nucleic của virus do đó khơng có khả năng lây nhiễm [18]. Hạt dane có đường kính
42 nm gồm lớp vỏ lipid và HBsAg bao quanh một nucleocapsid chứa hệ gen của
virus và polymerase sẽ giúp virus nhân lên trong cơ thể vật chủ [29].

Hình 1.1: Hình ảnh dưới kính hiển vi tử và số lượng gần đúng của các thành phần
liên quan đến HBV trong 1 ml huyết thanh bệnh nhân mang HBV mãn tính [19].

2


1.1.1.2. Hệ gen
Hệ gen của HBV là phân tử DNA dạng vịng chiều dài khoảng 3200 nucleotide
(3.2 kb) có dạng xoắn kép khơng hồn tồn gồm hai sợi đơn có chiều dài khác nhau.
Sợi ngồi (sợi âm) có chiều dài cố định là 3.2 kb và gắn một gốc tyrosine của protein
P tại đầu 5’. Sợi trong (sợi dương) có chiều dài thay đổi từ 50-100% chiều dài của bộ
gen và nối với một phân tử RNA ngắn tại đầu 5’ [37]. Hệ gen của virus mã hóa cho 4
khung đọc mở (Open Reading Frames-ORF) là S, C, P và X nằm gối lên nhau [36]:
-

Khung đọc mở S mã hóa cho protein bề mặt virus (HBsAg) được chia thành 3
vùng preS1, preS2 và S nhờ ba codon khởi đầu khác nhau [48]. HBgAg được chia
làm 3 loại: L-HBsAg là thành phần chính của thụ thể được dịch mã từ mRNA
preS1; protein M và S-HBsAg được dịch mã từ mRNA preS2/S và mRNA preS
[13].


-

Khung đọc mở C mã hóa cho kháng nguyên lõi (HBcAg) hoặc kháng nguyên e
(HBeAg) hỗ trợ đóng gói cấu trúc genome tùy thuộc vào vị trí bắt đầu dịch mã.

-

Khung đọc mở X mã hóa cho protein HBxAg. Protein HBx có vai trị trong nhân
bản HBV bao gồm tín hiệu kích hoạt phiên mã, sửa chữa DNA và ức chế quá trình
phân hủy protein [15].

-

Khung đọc mở P mã hóa cho polymerase là một protein lớn được chia thành 4
domain: terminal protein domain (đóng vai trị như mồi tổng hợp DNA virus),
spacer domain (chưa rõ vai trò), reverse transcriptase domain (chịu trách nhiệm
cho phiên mã và nhân bản RNA virus) và RNAase H domain (phân hủy RNA tiền
gen). Trong đó, RNA tiền gen đóng vai trị là khn tổng hợp DNA virus thơng
qua q trình phiên mã ngược [29].

3


Hình 1.2: Cấu trúc hệ gen của HBV [44].

1.1.2.

Cơ chế xâm nhiễm của HBV
Quá trình xâm nhập của HBV vào tế bào gan của vật chủ được bắt đầu bằng


tương tác không đặc hiệu giữa vùng preS1 của protein L-HBsAg với bề mặt tế bào
gan hoặc đặc hiệu với thụ thể NTCP [54]. Sau khi xâm nhập vào tế bào, virus di
chuyển nhờ hệ thống vi ống đến phức hệ màng nhân. Tại đây, virus sẽ bỏ lớp vỏ
capsid giải phóng DNA vào trong nhân [31]. Trong nhân tế bào gan, DNA của sợi
dương được tổng hợp hoàn chỉnh. Sau đó, các sợi sẽ co xoắn lại cùng với protein
histon tạo thành phân tử cccDNA (covalently closed circular DNA) có dạng nhiễm
sắc thể mini, đóng vai trị phiên mã tổng hợp mRNA của virus [43]. Đoạn dài nhất 3.5
kb mã hóa protein lõi, tiền lõi và polymerase. Đoạn 2.4 kb mã hoá cho protein LHBsAg, trong khi đoạn 2.1 kb mã hoá protein M và S-HBsAg. Đoạn nhỏ nhất 0.7 kb
mã hoá protein X [39]. Cấu tạo bền vững của phân tử cccDNA tạo nên tính kháng
thuốc của HBV. Khi cccDNA cịn ổn định ở trong tế bào, nó sẽ làm khn mẫu cho
tất cả các mRNA virus. Do đó, cccDNA là nguồn tạo các thế hệ virus mới [13, 23].
Các mRNA được phiên mã từ cccDNA sẽ được vận chuyển ra bào tương, làm
khn cho q trình dịch mã tổng hợp polymerase, vỏ capsid, protein bề mặt và
protein X. Trong khi nucleocapsid được lắp ráp trong bào tương, RNA tiền gen kết

4


hợp cùng polymerase khởi động quá trình phiên mã ngược. RNA tiền gen đóng vài
trị làm khn cho q trình tổng hợp DNA sợi âm. Sau khi tổng hợp xong sợi âm,
RNA tiền gen bị phân cắt bởi RNase. Sợi âm được sử dụng làm khuôn tổng hợp sợi
dương. Quá trình tổng hợp sợi dương hiếm khi hồn thành nên thường bắt gặp sợi
dương có độ dài khác nhau trong virus HBV [13, 54].
Một số virus mang bộ gen hoàn chỉnh sẽ quay trở lại nhân tế bào gan và DNA
mới được tổng hợp sẽ lại chuyển dạng cccDNA để duy trì một lượng khn ổn định
cho q trình phiên mã. Số virus còn lại sẽ đi vào hệ thống lưới nội chất chứa các
protein bề mặt của virus thông qua hình thức “nảy chồi”. Bằng cách này các “lõi”
virus sẽ bọc bởi các kháng nguyên bề mặt tạo ra cấu trúc virus hồn chỉnh và thốt
khỏi tế bào gan đi vào hệ thống tuần hồn [17].


Hình 1.3: Q trình xâm nhiễm của HBV [17]. HBV gắn kết với thụ thể trên bề mặt
và xâm nhập vào tế bào. Sau đó, HBV di chuyển tới nhân và chuyển dạng thành
cccDNA làm khuôn để tổng hợp mRNA; mRNA được dịch mã để tổng hợp protein
bề mặt virus, lõi, polymerase và protein X; mRNA này tiếp tục tham gia vào quá
trình phiên mã ngược thành DNA virus kết hợp với capsid tạo thành hạt virus, các hạt
virus này hoặc di chuyển vào mạng lưới nội chất hoặc quay lại nhân tế bào gan.

5


1.1.3.

Phân loại
Dựa vào cấu trúc hệ gen, HBV được chia làm nhiều kiểu gen (genotypes).

Trước đây, có 8 genotypes đã được biết rõ (A-H). Theo các nghiên cứu gần đây, 2
genotypes khác được xác định là I và J. Một vài genotypes của HBV được phân chia
thành dưới kiểu gen (sub-genotypes). Trong phân loại, các genotype có trình tự khác
nhau hơn 8%, các sub-genotype trong cùng một genotype khác nhau 4-8% [52]. Hiện
nay, hơn 30 sub-genotype của HBV đã được xác định, nhưng các cơ chế gây bệnh
khác nhau giữa chúng chưa được rõ ràng. Có nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng sự khác
biệt giữa genotypes và sub-genotypes phụ thuộc vào phân bố địa lý và liên quan đến
sự tiến triển của bệnh, tiến triển lâm sàng và khả năng đáp ứng điều trị [12].
Genotypes A, B, C, D và F được chia thành nhiều sub-genotype và genotypes E, G và
H khơng có sub-genotype nào được xác định [28, 42]. Genotype A phổ biến ở vùng
cận Sahara-Châu Phi, Bắc Âu và Tây Phi. Genotype B và C xuất hiện phổ biết ở Châu
Á. Genotype C chủ yếu quan sát thấy ở Đông Nam Á. Genotype D chiếm ưu thế ở
Châu Phi, Châu Âu, các nước Địa Trung Hải và Ấn Độ. Genotype G được báo cáo ở
Pháp, Đức và Hoa Kỳ. Genotype H thường gặp ở Trung và Nam Mỹ. Genotype I gần
đây được tìm thấy ở Việt Nam và Lào. Genotype HBV mới nhất là genotype J được

xác định ở quần đảo Ryukyu của Nhật Bản [35].

6


Hình 1.4: Phân bố địa lý về genotypes của HBV trên thế giới [35]. Các con số bên
cạnh các biểu đồ hình trịn là số lượng mẫu kiểm tra. Kích thước của biểu đồ hình
trịn đã được điều chỉnh sao để hiển thị rõ các phần trong biểu đồ [34].

Các kiểu gen có thể liên quan đến một số thể đột biến trên khung đọc mở C.
Do đó, chúng có thể dẫn đến sự khác nhau về diễn biến tiền lâm sàng cũng như về tỷ
lệ viêm gan tối cấp giữa các nhóm kiểu gen khác nhau. Ví dụ: kiểu gen B và đặc biệt
dưới kiểu gen Bj khiến người bệnh dễ mắc viêm gan tối cấp nhiều hơn so với kiểu
gen A hoặc C [10].
1.2.

Dịch tễ học của viêm gan B

1.2.1.

Tình hình mắc viêm gan B trên thế giới và ở Việt Nam
Dựa vào sự có mặt của kháng nguyên bề mặt HBsAg, tổ chức Y tế Thế giới

(WHO) ước tính trong năm 2015 trên tồn thế giới có khoảng 257 triệu người đang bị
nhiễm HBV và khoảng 887,000 ca tử vong do HBV, chủ yếu từ các biến chứng bao
gồm xơ gan và ung thư gan [58]. Dựa trên tỉ lệ nhiễm HBV, các vùng trên thế giới
được xếp vào các mức độ nhiễm cao, trung bình và thấp (Hình 1.5).

7



Hình 1.5: Phân bố tỷ lệ người nhiễm HBV theo địa lý [57].

Vùng lưu hành dịch cao: là vùng có tỷ lệ người mang HBsAg ≥8% và người đã
từng phơi nhiễm với HBV >60%. Khoảng 45% dân số thế giới sống ở khu vực dịch tễ
này, bao gồm các nước Châu Á, Châu Phi, một phần Trung Đông, lưu vực sơng
Amazon [45].
Vùng lưu hành dịch trung bình: là vùng có tỷ lệ người mang HBsAg từ 2-7%
và tỷ lệ người đã từng phơi nhiễm với HBV từ 20-60%, bao gồm một phần Nam Âu,
Đông Âu, Nga và Nam-Trung Mỹ [47].
Vùng lưu hành dịch thấp: là vùng có tỷ lệ người mang HBsAg <2% và tỷ lệ
người từng phơi nhiễm với HBV <20%, bao gồm Mỹ, Tây Âu, Úc với khoảng 12%
dân số thế giới sống ở vùng này [58].
Việt Nam là nước có tỷ lệ mắc viêm gan B cao trong đó ước tính có khoảng
8,6 triệu người nhiễm HBV. Tỷ lệ nhiễm HBV mãn tính được ước tính khoảng 8,8%
ở phụ nữ và 12,3% ở nam giới . Người nhiễm HBV mãn tính thường khơng có các
biểu hiện rõ ràng làm người bệnh thường có tâm lý chủ quan. Do đó, ở Việt Nam,
nhiễm HBV mãn tính là ngun nhân chính gây xơ gan và ung thư gan.

8


1.2.2.

Phương thức lây truyền
HBV lây truyền khi các tổn thương trên bề mặt da và niêm mạc tiếp xúc với

dịch tiết hoặc máu của người đã nhiễm virus. HBV có hàm lượng lớn trong máu và
dịch tiết từ vết thương. Lượng virus được phát hiện thấp hơn trong tinh dịch, dịch tiết
âm đạo và có rất ít trong nước bọt. HBV khơng lây truyền qua khơng khí và đồ ăn

[57]. Các con đường lây truyền chính của virus như sau:
-

Lây truyền từ mẹ sang con có thể xảy ra quanh lúc chuyển dạ sinh. Lây truyền
trong tử cung ít gặp, chỉ xảy ra từ 2-5% số lây truyền từ mẹ sang con. Khơng có
bằng chứng cho thấy virus có thể lây truyền qua việc cho con bú. Nguy cơ lây
truyền từ mẹ sang con phụ thuộc vào sự tồn tại của kháng nguyên HBeAg và
lượng virus cao trong máu mẹ. Tỷ lệ lây truyền lên đến 70-90% nếu mẹ dương
tính với HBeAg và 5-20% nếu mẹ âm tính với HBeAg [57].

-

Lây truyền từ trẻ này sang trẻ khác có thể là nguyên nhân của nhiều
trường hợp nhiễm HBV. Lây truyền thường xảy ra giữa những trẻ cùng
sống trong gia đình, giữa những trẻ trong cùng một trường học, nhà trẻ. Cơ chế
của lây truyền có thể do những vết thương trên da tiếp xúc với máu hoặc các dịch
tiết vết thương [57].

-

Lây truyền qua con đường tiêm truyền không an tồn, truyền máu. HBV có thể lây
truyền qua máu, các sản phẩm máu, bệnh phẩm có máu của người mang bệnh, kim
tiêm không đảm bảo vô trùng, dụng cụ tiêm chích, sử dụng chung kim xăm mình,
kim châm cứu, dụng cụ phẫu thuật, dụng cụ nha khoa bị nhiễm máu hoặc huyết
thanh khơng đựợc khử trùng thích hợp [57].

-

Lây truyền qua quan hệ tình dục [57].


1.2.3.

Các giai đoạn nhiễm HBV

1.2.3.1. Nhiễm HBV cấp tính
Thời gian ủ bệnh sau khi lây nhiễm HBV kéo dài từ 6 tuần đến 6 tháng và các
biểu hiện khi phát bệnh thay đổi tùy thuộc vào độ tuổi. Ở trẻ sơ sinh nói chung khơng

9


có các biểu hiện lâm sàng, các biểu hiện điển hình của bệnh quan sát thấy ở 5-15% trẻ
từ 1 đến 5 tuổi. Chỉ 33-50% các trường hợp nhiễm HBV ở người lớn và trẻ lớn có
biểu hiện lâm sàng. Các triệu chứng lâm sàng thường gặp là sốt nhẹ, mệt mỏi, chán
ăn, buồn nôn và nôn, vàng da, vàng mắt, nước tiểu sẫm mầu, phân bạc màu, đau
bụng. Đôi khi có các biểu hiện ngồi gan như phát ban trên da, đau khớp và viêm
khớp. Viêm gan tối cấp khoảng 1-2% số bệnh nhân viêm gan cấp và tỷ lệ tử vong do
hôn mê gan là 63-93% số bệnh nhân viêm gan tối cấp [2].
1.2.3.2. Nhiễm HBV mãn tính
Người nhiễm HBV mãn tính được xác định khi tồn tại HBsAg trong huyết
thanh ít nhất 6 tháng hoặc khi dương tính với HBsAg và âm tính với IgM anti-HBc
trong huyết thanh. Nguy cơ nhiễm virus mãn tính phụ thuộc nhiều vào tuổi của người
nhiễm virus. Nguy cơ cao nhất lên đến 90% là khi lây nhiễm trong giai đoạn mới
sinh, 25-50% ở giai đoạn 1-5 tuổi, 6-10% ở trẻ lớn và người trưởng thành. Hậu quả
của tình trạng nhiễm HBV mãn tính là các bệnh như xơ gan hay ung thư gan nguyên
phát. Thời gian nhiễm HBV kéo dài là yếu tố chính gây nên các bệnh lý gan nguy
hiểm. Khoảng 25% những người nhiễm HBV ở tuổi nhỏ và sơ sinh sẽ phát triển thành
xơ gan hoặc ung thư gan và 15% với nhóm nhiễm HBV ở độ tuổi vị thành niên và
trưởng thành [39]. Nhiễm HBV mãn tính sẽ trải qua 4 giai đoạn sau:
Giai đoạn dung nạp miễn dịch (immune tolerance): Là giai đoạn HBV có mặt

trong cơ thể nhưng chưa có sự phản ứng của hệ thống miễn dịch cơ thể chống HBV.
HBsAg, HBeAg đựợc tìm thấy trong huyết thanh, HBV-DNA thường rất cao (>105
copy/mL), các enzyme gan (ALT, AST) bình thường hoặc tăng rất ít. Những tổn
thương gan ít thấy mặc dù có sự nhân lên mạnh mẽ của HBV và xuất hiện kháng
nguyên HBcAg trong tế bào gan. Sau đó, người mang HBV chuyển sang giai đoạn
kích hoạt miễn dịch [30, 32].
Giai đoạn kích hoạt miễn dịch (immune active) là giai đoạn mà hệ thống miễn
dịch cơ thể hoạt động mạnh mẽ chống lại sự có mặt của HBV. HBV-DNA huyết
thanh giảm và các enzyme gan tăng. Ở giai đoạn này, những hội chứng bệnh lý gan

10


có thể xuất hiện; ALT, AST tăng cao hoặc dao động. Ở một số bệnh nhân có hiện
tượng chuyển đổi huyết thanh: HBeAg từ dương tính sang âm tính, sau đó xuất hiện
kháng thể anti-HBe trong máu [30].
Giai đoạn mang HBsAg không hoạt động (inactive HBsAg carrier) hay giai
đoạn virus không nhân lên hoặc nhân lên chậm (low replication). Trong giai đoạn
này, sự nhân lên của HBV vẫn tồn tại nhưng rất thấp vì bị ức chế do hệ miễn dịch của
vật chủ hoạt động hiệu quả. Đặc trưng cho giai đoạn này là chuyển đổi huyết thanh
HBeAg âm tính và anti-HBe dương tính. Người nhiễm HBV nhưng khơng xác định
được HBsAg, mà chỉ có thể phát hiện bằng anti-HBs. Enzyme ALT bình thường,
HBV-DNA trong huyết thanh rất thấp hoặc không phát hiện được. Ở một số bệnh
nhân đã chuyển đổi huyết thanh, thường kèm theo đột biến có chọn lọc làm gián đoạn
tạo HBeAg. Do vậy, ở các bệnh nhân HBeAg chuyển về âm tính có thể tiến triển đến
viêm gan B mạn tính thể HBeAg âm tính [30].
Giai đoạn tái hoạt động (HBV reactivation) hay giai đoạn hoạt động miễn
dịch HBeAg âm tính. Người mang HBV có sự hiện diện của HBsAg, âm tính với
HBeAg và dương tính với kháng nguyên anti-HBe. Lượng HBV-DNA phát hiện lớn
hơn 104 copy/mL. Ở giai đoạn này ALT bình thường hoặc tăng cao. Viêm gan có khả

năng chuyển thành xơ gan [30, 32].
Việc tái hoạt động của virus ở người nhiễm HBV mãn tính diễn ra chậm nên
người bệnh cần đi khám định kì, sử dụng các phương pháp chuẩn đốn HBV để có
kiểm sốt và điều trị bệnh kịp thời.
1.3.

Các phương pháp chuẩn đoán nhiễm HBV
Hiện nay, việc định lượng DNA HBV được coi là dấu chuẩn phân tử hữu ích

nhất để chẩn đoán người nhiễm HBV [55]. Dưới đây là những phương pháp thường
được sử dụng trong định lượng HBV.

11


1.3.1.

Kĩ thuật DNA nhánh
Kĩ thuật DNA nhánh (Branched DNA – bDNA) là kĩ thuật khuếch đại tín hiệu

để phát hiện sự có mặt của nucleic acid đặc hiệu bằng việc đo tín hiệu được tạo ra từ
q trình lai tạo nhánh (branched). Phân tử bDNA gồm hai đầu, một đầu liên kết với trình
tự đặc hiệu và đầu cịn lại có nhiều nhánh, có khả năng liên kết với nhiều đầu dị phát tín
hiệu. Dựa vào tín hiệu khuếch đại trong phân tử đích có thể xác định được số phân tử DNA
đích trong mẫu. Vì vậy, bDNA là kĩ thuật định lượng và được sử dụng trong xác định tải
lượng virus [7, 11, 33]. Thông thường, kĩ thuật DNA nhánh thực hiện trong hai ngày.

Hình 1.6: Kĩ thuật DNA nhánh [56]. Tách DNA và biến tính thành sợi đơn (1) và lai
với đầu dò bắt giữ trên giếng (2). Lai đầu dị đích (3), đầu dị tiền khuếch đại (4) và
đầu dò khuếch đại (5) với DNA trên giếng. Lai đầu dò được đánh dấu alkaline


phosphatase (6) với cách nhánh đầu dò khuếch đại (5), thêm chất nền dioxetane (7)
và đo tín hiệu màu.

1.3.2.

Kĩ thuật lai bắt giữ
Kĩ thuật lai bắt giữ (Hybrid capture technology) là phương pháp khuếch đại tín

hiệu bằng cách sử dụng kháng thể để cố định và các tín hiệu hóa học phát xạ. Kĩ thuật
lai bắt giữ là sự kết hợp của kĩ thuật acid nucleic như dùng đầu dò RNA để lai với
DNA kết hợp phương pháp miễn dịch sử dụng kháng thể lai với phức hợp RNA:DNA
giúp nhanh chóng phát hiện gen đích [46].

12


Kĩ thuật lai bắt giữ gồm một số bước chính: (1) giải phóng DNA từ tế bào và
biến tính DNA; (2) lai DNA đích với đầu dị RNA tạo phức hợp sợi kép RNA:DNA;
(3) phức hợp lai RNA:DNA bị bắt giữ bởi các kháng thể (phủ ở đáy giếng); (4) phát
hiện phức RNA:DNA-kháng thể bởi kháng thể thứ hai gắn alkaline phosphatase (AP)
và (5) phát hiện tín hiệu khuếch đại [4, 49, 60].

Hình 1.7: Kĩ thuật lai bắt giữ [5].

1.3.3.

PCR cạnh tranh định lượng (Quantitative-competitive PCR)
Kĩ thuật PCR cạnh tranh định lượng (Quantitative-competitive PCR) cho phép


phát hiện chính xác số copy DNA có trong mẫu. Phương pháp này có sự tham gia của
DNA cạnh tranh được thêm vào mẫu trước khi tách chiết và khuếch đại [56]. Các
bước chính của kĩ thuật PCR cạnh tranh định lượng được chỉ ra ở Hình 1.8.

13


Hình 1.8: PCR cạnh tranh định lượng [62]. C: sản phẩm cạnh tranh, T: sản phẩm đích.

Hai mồi a và b được thiết kế để khuếch đại trình tự DNA đích cần định lượng.
Đồng thời, một đoạn DNA cạnh tranh được thiết kế cũng được khuếch đại bởi hai
mồi này nhưng có chứa thêm một đoạn trình tự ở giữa (màu đỏ). Một lượng DNA
đích cố định sẽ được trộn với một dải nồng độ DNA cạnh tranh và sử dụng làm khuôn
cho phản ứng PCR. Sản phẩm sau khi khuếch đại sẽ được kiểm tra trên gel điện di và
xác định tỉ lệ giữa sản phẩm cạnh tranh (C) với sản phẩm đích (T). Từ tỉ lệ C/T và

14


lượng khuôn DNA cạnh tranh đã biết rõ từ trước, người ta xây dựng một đường
chuẩn. Từ đó, xác định số phân tử cạnh tranh tương ứng với tỉ lệ C/T=1. Giá trị này
cũng chính là số lượng phân tử của đích cần định lượng [62].
Các phương pháp trên đã được phát triển trở thành các bộ kit thương mại để
phục vụ cho chuẩn đoán và định lượng HBV. Tuy nhiên, kĩ thuật real-time PCR ra
đời cho phép biết kết quả ngay sau khi DNA được khuếch đại, nhờ đó giảm thiểu thời
gian cũng như thao tác tiến hành thí nghiệm. Đồng thời, real-time cho độ nhạy phát
hiện cao đã khiến cho các kĩ thuật định lượng trên trở nên lỗi thời [46].
Bảng 1.1: So sánh các kit thương mại được sử dụng để định lượng HBV
Kĩ thuật


Kit thương mại

Độ nhạy phát hiện

Tham khảo

DNA nhánh

VERSANT hepatitis B virus
DNA 3.0 (Bayer Healthcare
LLC, NY, USA)

2×103 copy/ml

Yao và cs, 2004
[2]

Lai bắt giữ

Ultrasensitive hybrid capture
2 (Digene)

8x103 copy/ml

Konnick và cs,
2005 [2]

PCR cạnh tranh
định lượng


COBAS Amplicor HBV
Monitor (Roche Diagnostics)

200 copy/ml

Konnick và cs,
2005 [2]

Real-time PCR

COBAS AmPliprep (Roche
Diagnostics, NJ, USA; with
total nucleic acid isolation)

35 copy/ml

Ronsin và cs,
2006 [4]

15