MOTIP LIEN KET ADN TRONG CAC PROTEIN DIEU HOA GEN

<span class='text_page_counter'>(1)</span>MÔ TÍP LIÊN KẾT ADN TRONG CÁC PROTEIN ĐIỀU HÒA GEN. Làm thế nào để xác định một tế bào khi mà hàng nghìn gen của nó được sao chép? Như đã trình bày trong chương 6, phiên mã của mỗi gen được kiểm soát bởi một vùng điều hòa của ADN tương đối gần vị trí nơi quá trình phiên mã bắt đầu. Một số vùng điều hòa khá đơn giản và hoạt động như các công tắc bởi một tín hiệu duy nhất. Rất nhiều vùng điều hòa khác có cấu trúc phức tạp và tương tự như các bộ vi xử lý rất nhỏ, đáp ứng với nhiều tín hiệu rằng chúng hiểu và tích hợp để chuyển các gen lân cận sang trạng thái hoạt động hoặc không. Cho dù phức tạp hay đơn giản, những thiết bị như công tắc này được tìm thấy trong tất cả các tế bào và chúng được cấu tạo từ 2 loại thành phần cơ bản: (1) đoạn trình tự ngắn của ADN và (2) là các protein điều hòa hoạt động gen, protein này sẽ nhận biết và gắn vào đoạn ADN trên. Chúng ta bắt đầu thảo luận về protein điều hòa hoạt động gen bằng cách mô tả làm thế nào mà chúng được phát hiện ra. Các protein điều hòa gen được phát hiện bằng cách sử dụng gen của vi khuẩn Phân tích di truyền vi khuẩn thực hiện trong những năm 1950 đã cung cấp bằng chứng đầu tiên cho sự tồn tại của các protein điều hòa gen (thường gọi nôm na là "yếu tố phiên mã") mà chúng sẽ chuyển các tập hợp gen cụ thể sang dạng hoạt động hoặc không hoạt động. Một trong những yếu tố điều hòa này, chất ức chế lamda, được mã hóa bởi một loại virus của vi khuẩn, thực khuẩn thể lambda. Chất ức chế này sẽ ức chế các gen của virus mà mã hóa cho các thành phần protein của hạt virus mới và do đó cho phép bộ gen của virus tồn tại một cách im lặng trong nhiễm sắc thể vi khuẩn, nhân lên cùng với vi khuẩn khi gặp điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của vi khuẩn (quan sát hình 5-78). Chất ức chế ở virus lamda là một trong những protein điều hòa hoạt động gen đầu tiên được mô tả, và được hiểu cặn kẽ nhất, như chúng ta sẽ thảo luận dưới đây. Các chất điều chỉnh khác ở vi khuẩn phản ứng với các yếu tố dinh dưỡng bằng cách đóng các gen mã hóa một nhóm cụ thể các enzym chuyển hóa vật chất khi chúng không cần thiết. Chất ức chế Lac, chất đầu tiên trong những protein này ở vi khuẩn đã được phát hiện ra, ức chế quá trình sản xuất các protein chịu trách nhiệm chuyển hóa lactozo khi loại đường này thiếu từ mức trung bình. Bước đầu tiên hướng tới sự hiểu biết về điều hòa hoạt động gen là sự phân lập của các chủng vi khuẩn và phage lambda đột biến không thể đóng các nhóm gen cụ thể. Nó đã được đề xuất vào thời điểm đó, và sau đó được chứng minh rằng hầu hết những thể đột biến này thiếu hụt protein hoạt động như các chất ức chế cụ thể cho các bộ gen đó. Bởi vì những protein này, giống như hầu hết các protein điều hòa hoạt động gen, tồn tại với một lượng nhỏ, do đó rất khó khăn và tốn thời gian nếu muốn tách chúng ra. Chúng cuối cùng cũng được tinh chế bằng cách tinh chế các chiết xuất từ tế bào. Khi được tách ra, các protein này được quan sát thấy đang gắn với các trình tự ADN đặc biệt gần với các gen mà chúng điều hòa. Các trình tự ADN chính xác mà chúng nhận ra sau đó quyết định bởi một tổ hợp các gen cổ điển và các phương pháp nghiên cứu tương tác protein – ADN được thảo luận trong chương này. Mặt bên ngoài của xoắn ADN có thể được đọc bởi các protein.

<span class='text_page_counter'>(2)</span> Như đã thảo luận ở chương 4, phân tử ADN trong 1 nhiễm sắc thể tồn tại dưới dạng một chuỗi xoắn kép rất dài (hình 7-6). Các protein điều hòa gen phải nhận biết được trình tự nucleotit đặc hiệu chứa bên trong cấu trúc này. Ban đầu người ta nghĩ rằng những proteins này có thể xâm nhập trực tiếp vào liên kết hidro giữa các cặp bazơ bên trong chuỗi xoắn kép để phân biệt giữa một trình tự ADN này với một trình tự ADN khác. Điều này bây giờ đã rõ ràng, tuy nhiên, mặt ngoài của chuỗi xoắn kép liên kết với trình tự thông tin ADN mà protein điều hòa gen có thể nhận ra không cần phải mở chuỗi xoắn kép. Hình 7-6. Cấu trúc xoắn kép của ADN. Một mô hình lấp đầy khoảng cách của ADN trình diễn các rãnh lớn và nhỏ ở mặt ngoài của chuỗi xoắn kép. Các nguyên tử được đánh dấu như trái bi: cacbon, màu xanh thẫm; nitơ, xanh nhạt; hidro, trắng; oxy, màu đỏ; photpho, màu vàng.. Các cạnh của mỗi cặp base được tiếp xúc với bề mặt của chuỗi xoắn kép, làm lộ ra một khuôn mẫu đặc biệt của các nhóm cho liên kết hidro, các nhóm nhận liên kết hidro, và các tương tác kị nước để giúp cho protein nhận biết được cả hai đường rãnh lớn và nhỏ (hình 7-7). Nhưng chỉ trong các rãnh lớn là các mô hình khác nhau rõ rệt cho mỗi sự sắp xếp 4 cặp bazơ (hình 7-8). Vì lý do này, các protein điều hòa gen thường tạo các liên kểt đặc biệt với các rãnh lớn như chúng ta có thể quan sát trong hình 7-8. Hình 7-7. Các cặp bazơ khác nhau thế nào trong ADN có thể nhận dạng từ cạnh sắc của chúng mà không cần mở chuỗi xoắn kép. Bốn hình thái có thể xảy ra của cặp bazơ được trình bày, với liên kết hidro cho chỉ ra màu xanh, liên kết hidro nhận màu đỏ, và các liên kết hidro của cặp bazơ tự do như là một loạt của đường kẻ song song màu đỏ. Các tổ hợp metyl, mà hình dạng đầu kị nước nhô lên, cho biểu thị màu vàng, và các nguyên tử hidro gắn với các nguyên tử cacbon, và chính vì thế không dùng cho liên kết hidro, màu trắng..

<span class='text_page_counter'>(3)</span> Hình 7-8. Một mã nhận dạng ADN. Cạnh của mỗi cặp bazơ, nhìn đây giống như các rãnh lớn hoặc rãnh nhỏ, chứa một mẫu đặc biệt của các hidro cho, các hidro nhận, và các tổ hợp metyl. Từ rãnh lớn, hình dạng một trong 4 cặp bazơ hiển thị chỉ một mẫu của các nét đặc trưng. Từ rãnh nhỏ, tuy nhiên, các mẫu tương tự của G-C và C-G giống của A-T và TA. Mã màu sắc là như trong hình 7-7.. Công tắc (Switches) Một trình tự nucleotit đặc biệt có thể được “đọc” như là một mô hình các tính năng phân tử trên bề mặt của chuỗi xoắn kép ADN. Một trình tự nucleotit đặc biệt, thường ít hơn chiều dài của 20 cặp nucleotit, có chức năng như các thành phần cơ bản của công tắc gen bằng cách đưa ra các điểm nhận biết cho sự gắn vào của các protein điều hòa gen nhất định. Hàng ngàn các trình tự gen như vậy đã được xác định., mỗi trình tự được nhận ra bởi một protein điều hòa gen khác nhau (hoặc bằng một tổ hợp các proteins điều hòa gen liên quan với nhau). Một số protein điều hòa hoạt động gen được thảo luận trong bài học của chương này được liệt kê trong bảng 7-1, dọc theo trình tự ADN mà chúng nhận ra. Bây giờ chúng ta quay lại chính các protein điều hòa hoạt động gen, thành phần cơ bản thứ hai của công tắc gen. Chúng ta bắt đầu với những tính năng cấu trúc cho phép những protein này nhận ra các đoạn trình tự ADN ngắn đặc biệt, chứa trong một chuỗi xoắn kép dài hơn rất nhiều. Bảng 7-1: Một số protein điều hòa gen và các trình tự ADN mà chúng nhận biết được..

<span class='text_page_counter'>(4)</span> Các protein điều hòa gen có chứa các mô tip cấu trúc có thể đọc trình tự ADN Phân tử nhận biết trong sinh học thường dựa trên sự phù hợp chính xác giữa các bề mặt của hai phân tử, và các nghiên cứu về protein điều hòa gen đã cung cấp một số ví dụ rõ ràng về nguyên tắc này. Một protein điều hòa gen sẽ nhận biết cả một trình tự ADN cụ thể bởi vì bề mặt của phân tử protein bổ sung các tính năng bề mặt đặc biệt của chuỗi xoắn kép trong khu vực đó. Trong hầu hết các trường hợp, protein tạo thành một mối liên lạc với ADN, liên quan đến các liên kết hydro, liên kết ion, và tương tác kỵ nước. Mặc dù mỗi liên kết đơn là yếu, 20 hay là như vậy thường được hình thành tại bề mặt protein-ADN gắn với nhau để đảm bảo rằng sự tương tác của cả hai rất cụ thể và rất mạnh (Hình 7 - 9). Trong thực tế, ADN-protein tương tác bao gồm một số những phân tử tương tác chặt chẽ và cụ thể nhất được biết đến trong lĩnh vực sinh học. Hình 7-9. Liên kết của một protein điều hòa gen tới các rãnh lớn của ADN. Chỉ có một liên kết duy nhất được hiển thị. Thông thường, bề mặt proteinADN sẽ bao gồm từ 10-20 liên kết như vậy, liên quan đến axit amin khác nhau, góp phần vào lực liên kết của sự tương tác proteinADN.. Mặc dù mỗi ví dụ về sự nhận biết protein-ADN là chi tiết duy nhất trong chi tiết, tinh thể x-ray và nghiên cứu NMR quang phổ của hàng trăm protein gen điều hành đã bộc lộ ra rằng nhiều người trong số đó có chứa một hoặc một số khác của một tập hợp nhỏ các mô tip cấu trúc liên kết ADN. Những mô tip này thường sử dụng hoặc ở dạng xoắn α hoặc ở dạng tấm β để liên kết vào các rãnh lớn của ADN, rãnh này, như chúng ta đã thấy, có chứa đầy đủ thông tin để phân biệt một chuỗi ADN từ bất kỳ một chuối khác. Sự phù hợp này tốt đến nỗi mà nó đã được đề xuất rằng các kích thước của các đơn vị cấu trúc cơ bản của axit nucleic và protein cùng nhau tiến hóa để cho phép các phân tử cài vào nhau. Mô tip xoắn-gấp-xoắn là một trong những mô tip liên kết ADN đơn giản nhất và thường gặp nhất. Motip liên kết protein - ADN đầu tiên được công nhận là dạng xoắn-gấp-xoắn. Nó được xác định trong protein vi khuẩn, kể từ đó đã được tìm thấy trong hàng trăm protein liên kết ADN từ cả hai sinh vật nhân chuẩn và nhân sơ. Nó được xây dựng từ hai chuỗi xoắn α với nhau bằng một chuỗi xoắn của các axit amin, tạo nên "gấp" (Hình 7-10). Hai chuỗi xoắn được kết hợp ở một góc cố định, chủ yếu thông qua sự tương tác giữa hai chuỗi xoắn. Xoắn C-cuối cùng được gọi là xoắn công nhận bởi vì nó phù hợp với các.

<span class='text_page_counter'>(5)</span> rãnh chính của ADN, chuỗi bên axit amin khác nhau từ protein tới protein, đóng một vai trò quan trọng trong việc nhận ra các trình tự ADN chuyên biệt mà protein liên kết. Hình 7-10. Mô tip xoắn-gấp-xoắn liên kết ADN. Xoắn-gấp-xoắn này được thể hiện trong (A), nơi mà mỗi vòng tròn màu trắng biểu thị cacbon trung tâm của một acid amin. C-thiết bị đầu cuối dạng xoắn α (màu đỏ) được gọi là xoắn công nhận bởi vì nó tham gia vào nhận dạng cụ thể trình tự ADN. Như thể hiện trong (B), xoắn này phù hợp với các rãnh lớn của ADN, nơi nó tiếp xúc với các cạnh của các cặp base (xem hình 7-7). N-thiết bị đầu cuối xoắn α (màu xanh) chức năng chủ yếu như là một thành phần cấu trúc giúp xác định vị trí xoắn nhận dạng.. Bên ngoài vùng xoắn-gấp-xoắn, cấu trúc của các protein khác nhau có chứa mô tip này có thể rất khác nhau (Hình 7-11). Vì vậy, mỗi protein "thể hiện" mô tip xoắn-gấp-xoắn tới ADN theo một cách độc đáo, một đặc điểm cho thấy để nâng cao tính linh hoạt của các mô tip xoắn-gấp-xoắn bằng cách tăng số lượng các mô tip trình tự ADN có thể sử dụng để nhận biết. Hơn nữa, trong hầu hết các protein này, các bộ phận của chuỗi polypeptide bên ngoài miền xoắn-gấp-xoắn cũng làm cho sự tương tác quan trọng với ADN, giúp tinh chỉnh sự tương tác.. Hình 7-11. Một số protein xoắn-gấp-xoắn liên kết ADN. Tất cả các protein liên kết ADN như là những nhị trùng phân mà hai bản sao của xoắn nhận dạng (xi lanh màu đỏ) được tách ra bởi chính xác một vòng của xoắn ADN (3.4 nm). Các xoắn khác của mô tip xoắn-gấp-xoắn là màu xanh, như trong hình 7-10. Protein ức chế lamda và Cro kiểm soát biểu hiện gen của vi khuẩn lamda, và protein ức chế tryptophan và protein hoạt động catabolite (CAP) kiểm soát các biểu hiện bộ gen vi khuẩn E. coli.. Nhóm các protein xoắn-gấp-xoắn được chỉ ra trong hình 7-11 cho thấy đặc điểm chung của nhiều trình tự protein liên kết ADN đặc trưng. Chúng liên kết như hai mạch đối xứng với các chuỗi ADN gồm hai nửa giống nhau liên kết với nhau, chúng cũng được sắp xếp một cách đối xứng (hình 7-12). Sự sắp xếp này cho phép mỗi đơn phân protein tạo thành một bộ liên kết gần như giống hệt nhau và làm tăng ái lực liên kết: là một.

<span class='text_page_counter'>(6)</span> phép gần đúng, tăng gấp đôi số lượng các liên kết năng lượng tự do của sự tương tác và do đó điều chỉnh ái lực liên tục. Hình 7-12. Một chuỗi ADN cụ thể được nhận dạng bởi các protein Cro thực khuẩn thể lambda. Các nucleotide đánh dấu màu xanh lá cây trong dãy này được sắp xếp đối xứng, cho phép mỗi nửa của chuỗi ADN được nhận dạng trong cùng một cách bởi mỗi monomer protein, cũng được hiển thị màu xanh lá cây. Xem Hình 7-11 cho các cấu trúc thực tế của protein.. Protein homeodomain tạo thành một lớp đặc biệt của các protein xoắn-gấp-xoắn Không lâu sau khi các protein điều hòa gen đầu tiên được phát hiện ở vi khuẩn, thì việc phân tích gen ở ruồi giấm dẫn đến các đặc tính của một lớp quan trọng của các gen, các gen chọn homeotic, đóng một vai trò quan trọng trong phát triển bay. Như đã thảo luận trong Chương 22, chúng đã chứng minh là chúng có vai trò cơ bản trong sự phát triển của các loài động vật cao hơn. Đột biến trong những gen đó có thể gây ra một phần cơ thể bay khác, cho thấy rằng các protein mà chúng mã hóa kiểm soát nhiều quyết định quan trọng trong sự phát triển. Khi trình tự nucleotide của một số gen homeotic chọn lọc được xác định trong đầu những năm 1980, mỗi trình tự là để mã hóa một chuỗi gồm 60 axit amin giống hệt nhau xác định loại protein này và được gọi là các homeodomain. Khi cấu trúc ba chiều của các homeodomain đã được xác định thì người ta chưa thấy mô tip xoắn-gấp-xoắn nó liên quan đến cấu trúc ba chiều của protein điều hòa gen ở vi khuẩn, cung cấp một trong những chỉ dẫn mà những nguyên tắc của gen quy định được thiết lập có liên quan đến sinh vật bậc cao. Hơn 60 protein homeodomain đã được phát hiện ở ruồi giấm, và protein homeodomain đã được xác định trong hầu như tất cả các sinh vật nhân chuẩn điển hình được nghiên cứu, từ nấm men tới thực vật và tới con người. Cấu trúc của một homeodomain liên kết chuỗi ADN đặc trưng được hiển thị trong hình 7-13. Trong khi các mô típ xoắn-gấp-xoắn của các protein điều hòa gen ở vi khuẩn thường được gắn trong các bối cảnh khác nhau về cấu trúc, mô típ xoắn-gấp-xoắn của homeodomain luôn luôn được bao quanh bởi những cấu trúc tương tự (mà tạo ra các phần còn lại của homeodomain), cho thấy rằng các mô típ luôn luôn đưa tới ADN trong cùng một cách. Thật vậy, nghiên cứu cấu trúc đã cho thấy rằng một loại protein homeodomain nấm men và một loại protein của ruồi giấm có tổ chức tương tự và nhận ra ADN chính xác gần như giống nhau, mặc dù chúng giống hệt nhau chỉ 17 trong 60 axit amin. (xem Hình 3-13).

<span class='text_page_counter'>(7)</span> Hình 7-13 Một homeodomain liên kết với trình tự đặc trưng của ADN. Hai quan điểm khác nhau của cùng một cấu trúc được chỉ ra. (A) homeodomain được xếp thành ba chuỗi xoắn α, được gắn với nhau bằng cách tương tác kỵ nước. Phần có chứa xoắn 2 và 3 tương tự như motif xoắn-gấp-xoắn (B) xoắn nhận dạng (xoắn 3, đỏ) tạo nên những liên kết quan trọng với các rãnh lớn của ADN. Các (ASN) của xoắn 3, ví dụ, liên kết với một adenine, như thể hiện trong hình 7-9. Một nhánh linh hoạt gắn liền với xoắn 1 tạo nên những liên kết với các cặp nucleotide trong rãnh nhỏ. Các homeodomain hiển thị ở đây là từ protein điều hòa gen ở nấm men, nhưng nó gần giống homeodomains từ nhiều sinh vật nhân chuẩn. <ACGT> (Trích từ C. Wolberger et al, 67:517528 Cell, năm 1991. Với sự cho phép của Elsevier.). Có một số loại mô tip liên kết ADN chứa Kẽm hình ngón tay. Mô tip xoắn-gấp-xoắn chỉ bao gồm các axit amin. Một nhóm quan trọng thứ hai của những mô tip liên kết ADN bao gồm một hoặc nhiều nguyên tử kẽm như là thành phần cấu trúc. Mặc dù tất cả những mô tip liên kết ADN phối hợp với nguyên tử kẽm như vậy được gọi là kẽm hình ngón tay, mô tả này chỉ đề cập đến sự xuất hiện của chúng trong sơ đồ mô tả phát hiện ban đầu (Hình 7-14A). Nghiên cứu tiếp theo đã chỉ ra rằng chúng chia thành một số nhóm khác biệt về cấu trúc, hai trong số đó, chúng ta xem xét ở đây. Loại đầu tiên được phát hiện trong các protein kích hoạt phiên mã của một gen nhân chuẩn ARN ribosome. Nó có cấu trúc đơn giản, trong đó kẽm giữ xoắn α và một tấm β (hình 7-14B). Đây là loại nguyên tử kẽm thường được tìm thấy trong các cụm song song vì thế vòng xoắn α của mỗi cụm có thể liên kết với các rãnh lớn của ADN, tạo thành một đoạn gần như liên tục xoắn α dọc theo rãnh. Bằng cách này, một số tương tác mạnh và cụ thể của protein – ADN được thiết lập thông qua một đơn vị cấu trúc cơ bản lặp đi lặp lại (Hình 7-15). Hình 7-14. Một kiểu của protein Kẽm hình ngón tay. Protein này thuộc tổ hợp Cys-Cys-His-His của protein kẽm hình ngón tay, được đặt tên sau khi các axit amin nắm bắt kẽm. (A) Schematic vẽ chuỗi acid amin của một kẽm hình ngón tay từ một protein của lớp này. (B) Các cấu trúc ba chiều của kiểu như thế này của kẽm hình ngón tay được xây dựng từ tấm β đối song song (axit amin từ 1-10) theo sau bởi một chuỗi xoắn α (axit amin từ 10-24). Bốn axit amin liên kết kẽm (Cys 3, Cys 6, His 19, His 23) giữ chặt 1 axit amin cuối cùng của tổ hợp chuỗi xoắn α với một đầu của tấm β (Trích từ MS Lee et al, 245:635-637 Khoa học, năm 1989. Với sự cho phép từ AAAS)..

<span class='text_page_counter'>(8)</span> Hình 7-15. Liên kết ADN được tạo nên bởi một protein kẽm hình ngón tay. (A) cấu trúc của một đoạn protein điều hòa ở chuột liên kết với ADN ở vị trí cụ thể. Protein này nhận dạng những ADN bằng cách sử dụng kẽm hình ngón tay loại Cys-CysHis-His (xem Hình 7-1 sắp xếp như lặp đi lặp lại trực tiếp <ATCT> ( hình ngón tay có tương tự như trình tự axit amin. Và liên hệ với ADN theo cách giống nhau. Trong cả hai (A) và (B) nguyên tử kẽm mỗi ngón tay được đại diện bởi một hình cầu nhỏ. (Trích từ N. Pavletich C. pabo, Khoa học 252:810817, 1991.V sự cho phép từ AAAS.). Một loại kẽm hình ngón tay được tìm thấy trong một tổ hợp lớn của các protein thụ thể trong tế bào (được thảo luận chi tiết trong Chương 15). Nó tạo thành một loại khác nhau của cấu trúc (tương tự như trong một số khía cạnh tới các mô típ xoắn-gấp-xoắn) trong đó hai xoắn α được đóng gói cùng với các nguyên tử kẽm (Hình 7-16). Giống như các protein xoắn-gấp-xoắn, các protein này thường hình thành nhị phân cho phép một trong hai xoắn α của mỗi tiểu đơn vị tương tác với các rãnh chính của ADN. Mặc dù hai loại cấu trúc kẽm hình ngón tay được thảo luận trong phần này có cấu trúc riêng biệt, nhưng chúng cho thấy hai tính năng quan trọng: cả hai đặc điểm này sử dụng như một yếu tố cấu trúc, và sử dụng cả hai xoắn α để nhận ra các rãnh lớn của ADN. Hình: 7-16 Một nhị phân của miền kẽm hình ngón tay của tập hợp thụ thể trong tế bào liên kết trình tự ADN đặc trưng của nó. Mỗi miền kẽm hình ngón tay có chứa hai nguyên tử Zn (được chỉ định bởi thể cầu màu xám nhỏ), một xoắn ADN nhận dạng ổn định (một tiểu đơn vị thể hiện màu nâu và một cái khác màu đỏ), và một ổn định một vòng lặp (thể hiện trong màu tím) tham gia vào hình thành nhị phân. Mỗi nguyên tử Zn được điều phối bởi bốn dư lượng. Giống như cysteine khoảng cách thích hợp các protein xoắn-gấp-xoắn được hiển thị trong hình 7-11, hai xoắn nhận dạng của nhị phân giúp tách ra bằng một khoảng cách tương ứng với một vòng của chuỗi xoắn kép ADN. Ví dụ cụ thể được hiển thị là một phân đoạn của các thụ thể glucocorticoid. Đây là một loại protein mà qua đó các tế bào phát hiện và đáp ứng phiên mã để tạo ra hormon glucocorticoid trong tuyến thượng thận trong phản ứng với stress. (Trích từ BFLuisietal, Nature 352:497-505,1991. Với sự cho phép từ nhà xuất bản Macmillan Ltd). Tấm β có thể nhận dạng ADN Trong các môtip liên kết ADN thảo luận cho đến nay, cơ chế xoắn α là cơ chế chủ yếu được sử dụng để nhận ra các trình tự ADN chuyên biệt. Một nhóm lớn các protein điều hòa gen đã phát triển một chiến lược hoàn toàn khác nhau. Trong trường hợp này, một tấm β gồm hai sợi, với chuỗi bên axit amin mở rộng từ các bảng đối hướng tới ADN, đọc các thông tin trên bề mặt của rãnh lớn (Hình 7 - 17). Như trong trường hợp của sự nhận dạng chuỗi xoắn α, môtip tấm β có thể được sử dụng để nhận dạng rất nhiều chuỗi ADN khác nhau, chính xác trình tự ADN được nhận dạng phụ thuộc vào trình tự của các axit amin tạo nên tấm β..

<span class='text_page_counter'>(9)</span> Hình 7-17 Các protein ức chế vi khuẩn Met. Các protein ức chế vi khuẩn Met điều hòa các gen mã hóa các enzym xúc tác tổng hợp methionine. Khi axit amin này có đủ, nó liên kết với các ức chế, gây ra một sự thay đổi trong cấu trúc của protein cho phép nó liên kết với ADN một cách chặt chẽ, ngừng tổng hợp enzy. (A) để liên kết ADN thật chặt, ức chế Met phải được liên kết chặt chẽ adenosyl-S methionine, được biểu thị màu đỏ. Một tiểu đơn vị của protein đối xứng được hiển thị màu xanh lam trong khi những cái khác được hiển thị xanh nhạt. Hai tấm dây xoắn β liên kết với ADN được hình thành bởi một sợi từ mỗi tiểu đơn vị và được thể hiện trong màu xanh đậm và tối. (B) Đơn giản hóa sơ đồ ức chế Met liên kết với ADN, cho thấy hai sợi β của các ức chế liên kết với các rãnh lớn của ADN như thế nào. Để rõ ràng, các khu vực khác của ức chế đã bị bỏ qua. (A, chuyển thể từ S. Phillips, Curr.Opin.Struct Biol 1:89-98, 1991, với sự cho phép của Elsevier, B, thích nghi từ W.Somers và S.Phillips, Nature 359:387-393,1992, với sự cho phép từ các nhà xuất bản Macmillan Ltd). Một số protein sử dụng các móc thâm nhập vào rãnh lớn và rãnh nhỏ để nhận ra ADN Một vài protein liên kết ADN sử dụng móc peptit nhô ra để đọc trình tự nucleotide, chứ không phải xoắn α và tấm β. Ví dụ, p53, ức chế khối u ở người, nhận ra các cặp nucleotide từ hai rãnh lớn và nhỏ bằng cách sử dụng các móc như vậy (Hình 7-18). Vai trò bình thường của protein p53 quy định chặt chẽ sự phát triển của tế bào và sự tăng sinh. Tầm quan trọng của nó có thể được đánh giá cao bởi thực tế là gần một nửa của tất cả các loại ung thư của người có đột biến soma trong gen p53, bước này là chìa khóa cho sự tiến triển của các khối u, như chúng ta sẽ thấy trong Chương 20. Nhiều p53 đột biến được quan sát thấy trong các tế bào ung thư phá hủy hoặc thay đổi tính chất liên kết ADN của nó, thực sự, Arg 248, mà liên kết các rãnh nhỏ ADN (xem hình 7-18) là các đột biến thường gặp nhất tồn tại trong ung thư ở người.. Hình 7-18. ADN được nhận dạng bởi protein P53. Tiếp điểm D rất quan trọng được thực hiện bởi arginine 248 alysine 120, mở rộng từ các móc nhô ra vào rãnh nhỏ và rãnh lớn. nếp gấp của protein p53 cần một nguyên tử kẽm (hiển thị hình cầu), nhưng cách mà kẽm kết hợp với protein là phức hoàn toàn khác nhau từ các cách mà protein chứa kẽm hình ngón tay được mô tả trước đây.. Môtip dây kéo (zipper) lơsin làm trung gian liên kết ADN và protein nhị trùng hóa (Dimerization).

<span class='text_page_counter'>(10)</span> Nhiều protein điều hòa gen nhận dạng ADN như các đồng nhị phân (homodimers-hai đơn phân giống nhau), có lẽ bởi vì, như chúng ta đã thấy, đây là một cách đơn giản để đạt được sự liên kết mạnh (xem hình 7-12). Thông thường, các phần của protein chịu trách nhiệm cho sự nhị trùng hóa khác biệt với phần chịu trách nhiệm cho liên kết ADN. Tuy nhiên một môtip kết hợp hai chức năng một cách nhẹ nhàng và kinh tế. Nó được gọi là môtip dây kéo leucine (lơsin), đặt tên như vậy vì cách hai xoắn α, từ mỗi đơn phân, được nối với nhau để tạo ra một cuộn dây cuộn ngắn (xem hình 3-9). Các xoắn được gắn kết với nhau bởi các tương tác giữa các chuỗi bên axit amin kỵ nước (thường nằm trên leucines) mở rộng từ một bên của mỗi chuỗi xoắn. Chỉ cần vượt qua bề mặt sự nhị trùng hóa hai chuỗi xoắn α tách biệt với nhau để tạo thành một cấu trúc hình chữ Y, cho phép chuỗi phụ của chúng liên kết với các rãnh lớn của ADN. Nhị phân do đó kẹp chặt chuỗi xoắn kép giống như kẹp áo trên dây phơi (Hình 7-19) Hình 7-19. Một dây kéo leucine nhị phân liên kết với ADN. Hai phần dãy xoắn α liên kết ADN- (dưới) nhị trùng hóa thông qua khu vực xoắn α dây kéo leucine (trên) để tạo thành một cấu trúc hình chữ Y ngược. Mỗi cánh tay của chữ Y được hình thành bởi một chuỗi xoắn α duy nhất, một từ đơn phân làm trung gian liên kết với một trình tự ADN đặc hiệu trong rãnh chính của ADN. <TGTT> Mỗi xoắn α liên kết với một nửa của một cấu trúc ADN đối xứng. Cấu trúc thể hiện là của protein nấm men: Gcn4, điều hòa phiên mã để đáp ứng với sự sẵn có của các axit amin trong môi trường. (Trích từ TEEllenberger et al., Cell71 :1223-1237, 1992. Với sự cho phép của Elsevier. Dị nhị trùng hóa (Heterodimerization) mở rộng các kho trình tự ADN mà protein điều hòa gen có thể nhận ra Nhiều protein điều hòa gen mà chúng tôi quan sát thấy, đến nay liên kết ngoài với ADN như các đồng nhị phân, đó là, các chất nhị phân tạo thành hai tiểu đơn vị giống hệt nhau. Tuy nhiên, nhiều protein điều hòa gen cũng có thể kết hợp với các đối tác không giống nhau để hình thành các chất dị nhị phân (heterodimers) bao gồm hai tiểu đơn vị khác nhau. Bởi vì các dị nhị phân thường được hình thành từ hai loại protein có liên kết ADN riêng biệt, trộn và kết hợp các protein điều hòa gen theo cách này có thể mở rộng rất nhiều các kho liên kết ADN riêng biệt mà những protein này có thể hiển thị. Như minh họa trong hình 7-20, 3 đặc điểm riêng biệt liên kết ADN có thể, về nguyên tắc, được tạo ra từ hai loại đơn phân dây kéo leucine, trong khi đó sáu đặc điểm khác có thể được tạo ra từ ba loại đơn phân và tiếp tục như vậy..

<span class='text_page_counter'>(11)</span> Hình 7-20 Dị nhị trùng hóa của các protein dây kéo leucine có thể làm thay đổi liên kết ADN đặc hiệu. Đồng nhị phân dây kéo leucine liên kết với trình tự ADN đối xứng thể hiện trong các bản vẽ bên trái và trung tâm. Hai loại protein nhận ra trình tự ADN khác nhau, như đã biểu thị các khu vực màu đỏ và màu xanh trong ADN. Hai đơn phân khác nhau có thể kết hợp để tạo thành một dị nhị phân, nhận dạng một chuỗi ADN lai, bao gồm từ một vùng màu đỏ và một vùng màu xanh.. Tuy nhiên, có nhiều hạn chế trong sự phức tạp này: ví dụ, nếu tất cả các loại các protein dây kéo leucine trong một tế bào nhân chuẩn điển hình được hình thành các dị nhị phân, thì khối lượng "chồng chéo” giữa các mạch điều hòa gen của một tế bào có lẽ sẽ phù hợp để gây ra sự phức tạp. Có hay không có một chất dị nhị phân đặc biệt có thể được hình thành phụ thuộc vào bề mặt kị nước của hai dây kéo leucine xoắn α với nhau, cái mà phụ thuộc vào các trình tự chính xác axit amin của hai khu vực dây kéo. Như vậy, mỗi protein dây kéo leucine trong tế bào có thể hình thành các chất nhị trùng với một tập nhỏ các protein dây kéo leucine khác. Dị nhị trùng hóa là một ví dụ của kiểm soát tổ hợp, trong đó sự kết hợp của các protein khác nhau, chứ không phải là các protein riêng lẻ, kiểm soát một quá trình tế bào. Dị nhị trùng hóa như là một cơ chế để kiểm soát tổ hợp biểu hiện gen xảy ra trong nhiều loại khác nhau của các protein điều hòa gen (Hình 7-21). Kiểm soát tổ hợp là một chủ đề lớn mà chúng ta sẽ gặp nhiều lần trong chương này, và sự hình thành các tổ hợp gen điều hành hai phần khác nhau chỉ là một trong nhiều cách trong đó các protein làm việc trong sự kết hợp để kiểm soát biểu hiện gen. Hình 7-21: Một dị nhị phân bao gồm hai protein cùng lĩnh vực (homeodomain) liên kết với vị trí nhận dạng ADN của nó. Xoắn màu vàng 4 của protein trên bên phải (Mat anpha 2) là phi cấu trúc trong sự vắng mặt của protein ở bên trái (Mata1), tạo thành một chuỗi xoắn chỉ nhờ vào dị nhị trùng hóa. ADN được nhận dạng do cả hai protein, một số các tiếp xúc protein-ADN được thực hiện bởi Mat anpha 2 đã được thể hiện trong hình 7-13. Những protein hai từ men vừa chớm nở, chất dị nhị phân xác định một loại tế bào đặc biệt (xem hình 7-65). Các xoắn được đánh số theo hình 7-13. (Trích từ T.Li et al, 270:262269 Khoa học, năm 1995. Với sự cho phép của AAAS).. Một số protein điều hòa gen tất yếu đã trở thành " hardwired " trong tế bào, ví dụ, hai phần liên kết AND khác nhau có thể, thông qua sắp xếp lại gen xảy ra trong quá trình tiến hóa, có thể tham gia vào một chuỗi polypeptit hiển thị một liên kết ADN mới (Hình 7-22)..

<span class='text_page_counter'>(12)</span> Hình 7-22. Hai phạm vi liên kết ADN liên kết cộng hóa trị được nối lại bằng một polipeptit linh hoạt.. Mô tip xoắn-móc-xoắn làm trung gian Dimerization và liên kết ADN Một môtip liên kết ADN quan trọng khác, liên quan đến dây kéo leucine, là môtip xoắn-móc-xoắn (HLH), khác với các motip xoắn-gấp-xoắn thảo luận trước đó. Một motip HLH bao gồm một chuỗi xoắn α ngắn kết nối bởi một chuỗi xoắn α thứ hai dài hơn. Tính linh hoạt của móc cho phép một chuỗi xoắn α gấp lại và gói ngược lại với cái còn lại. Như thể hiện trong hình 7-23, cấu trúc hai xoắn liên kết với cả ADN và các motip HLH của một protein HLH thứ hai. Protein HLH thứ hai có thể giống nhau (tạo ra một đồng nhị phân) hoặc khác nhau (tạo ra một dị nhị phân). Trong cả hai trường hợp, hai xoắn α kéo dài từ bề mặt nhị trùng hóa tạo thành liên kết đặc trưng với ADN.. Hình 7-23. Một xoắn-móc-xoắn nhị trùng liên kết ADN. Hai loại đơn phân được kết hợp với nhau trong một bó bốn xoắn: mỗi đơn phân đóng góp hai xoắn α nối với nhau bằng một cái móc linh hoạt của protein (màu đỏ). Một trình tự ADN chuyên biệt được liên kết bởi hai xoắn α mà nhô ra từ từ bó bốn xoắn. (Trích từ ARFerre-DAmare et al, 363:38-45 Thiên nhiên, năm 1993. Với sự cho phép từ nhà xuất bản Macmillan Ltd). Một số protein HLH thiếu sự mở rộng chuỗi xoắn α chịu trách nhiệm liên kết với ADN. Những protein bị cắt ngắn có thể hình thành các dị nhị phân với các protein HLH đủ độ dài, nhưng các dị nhị phân không thể liên kết với ADN một cách chặt chẽ bởi vì chúng hình thành chỉ một nửa trong số các liên kết cần thiết. Như vậy, ngoài để tạo các chất nhị phân hoạt động, sự dị nhị trùng hóa cung cấp cho các tế bào cách sử dụng rộng rãi để giúp protein điều hòa gen trong kiểm tra (Hình 7-24). Hình 7-24 quy định kìm hãm bằng cách cắt ngắn protein HLH. Motip HLH là chịu trách nhiệm cho cả nhị trùng hóa và liên kết ADN. Ở bên trái, một đồng nhị phân HLH nhận dạng một chuỗi ADN đối xứng. Bên phải, các liên kết của một protein HLH đủ dài (màu xanh) cắt ngắn protein HLH (màu xanh) thiếu liên kết ADN chuỗi xoắn α tạo ra một dị nhị phân không có khả năng liên kết ADN một cách chặt chẽ. Nếu có mặt quá mức, phân tử protein cắt ngắn ngăn cản nhị trùng hóa của protein HLH đủ dài và do đó ngăn cản nó tới liên kết với ADN..

<span class='text_page_counter'>(13)</span> Chưa dự đoán các chuỗi ADN được nhận dạng bởi tất cả các protein điều hòa gen Các motip liên kết ADN khác nhau mà chúng tôi đã thảo luận cung cấp khung cấu trúc chuỗi bên axit amin cụ thể mở rộng để liên kết với cặp bazơ đặc hiệu trong ADN. Điều này là hợp lý để đưa ra, do đó, cho dù có mã nhận dạng cặp axit amin – bazơ đơn giản là một cặp bazơ GC, ví dụ, luôn luôn liên kết bởi một chuỗi bên axit amin đặc biệt? Câu trả lời là không, mặc dù một số loại tương tác axit aminbazơ xuất hiện thường xuyên hơn những cái khác (Hình 7-25). Như chúng ta đã thấy trong Chương 3, bề mặt protein của hầu như bất kỳ hình dạng và cấu trúc hóa học có thể được thực hiện từ 20 axit amin khác nhau, và một protein điều hòa gen sử dụng các mô hình khác nhau của chúng các để tạo ra một bề mặt và bổ sung cho một chuỗi ADN cụ thể. Chúng tôi biết rằng các cặp bazơ tương tự có thể được nhận ra theo một cách chính xác tùy thuộc vào môi trường của nó (Hình 7-26). Tuy nhiên, các nhà sinh học phân tử bắt đầu hiểu về các nguyên tắc nhận dạng protein-ADN cũng đủ để tạo ra một protein mới nhận ra chuỗi ADN nhất định. Hình 7-25. Một trong những tương tác protein – ADN phổ biến nhất. Bởi vì về hình học cụ thể của các hydro liên kết các “chất nhận” (xem hình 7-7), mặt bên của arginine rõ ràng nhận guanine. Hình 7 – 9 thể hiện những tương tác protein – ADN phổ biến khác.. Sau khi nêu ra những đặc điểm chung của các protein điều hòa gen, chúng ta chuyển sang một số trong những phương pháp đang được sử dụng để nghiên cứu chúng. Hình 7 – 26. Tóm tắt thông tin cụ thể trình tự tương tác giữa 6 “protein chứa kẽm hình ngón tay” với trình tự nhận biết ADN của nó. Mặc dù nghĩ rằng tất cả 6 “protein chứa kẽm hình ngón tay” có cùng 1 cấu trúc tổng thể (xem hình 7-14), mỗi 1“protein chứa kẽm hình ngón tay” liên kết với một trình tự ADN khác nhau. Số axit amin tạo thành chuỗi xoắn α nhận biết ADN (hình 7-14 và 7-15), và những điều đó làm cho trình tự ADN đặc trưng có màu xanh. Bazơ liên kết protein là màu cam. Mặc dù các liên kết guanine – arginine là phổ biến (xem hình 7-25), guanine có thể cũng được nhận ra bởi serine, histidine, lysine, như đã được chỉ ra. Hơn nữa, axit amin tương tự (serine, trong ví dụ này) có thể nhận ra nhiều hơn một base. Hai trong số những hình đã miêu tả là từ protein TTK (một loại protein thực hiện chức năng phát triển của ruồi giấm); hai cái là từ protein của chuột (zif268) được thể hiện trong hình 7 – 15, và hai là từ một protein của con người (GL1) có hình thức sai, có thể là nguyên nhân gây ra một.

<span class='text_page_counter'>(14)</span> số loại bệnh ung thư. (Dựa theo C.Branden và J.Tooze, Giới thiệu về cấu trúc Protein, tái bản lần 2. New York: Nhà xuất bản Garland, năm 1999.. Một thí nghiệm thay đổi gel – nhận biết chuỗi protein liên kết ADN đặc hiệu Sự phân tích gen, cái mà cung cấp 1 con đường tới protein điều hòa gen của vi khuẩn, nấm men và ruồi giấm, điều này thì nhiều khó khăn hơn ở động vật có xương sống. Do đó, sự phân lập của những protein điều hòa gen ở động vật có xương sống phải chờ tới sự phát triển của những phương pháp mới. Nhiều trong số những phương pháp tin cậy dựa trên sự khám phá được khi chiết xuất tế bào của 1 protein liên kết ADN, nhận biết chính xác một chuỗi ADN đã biết để kiểm soát sự biểu hiện của một gen đặc biệt. Một trong những cách phổ biến nhất để phát hiện và nghiên cứu trình tự cụ thể protein liên kết ADN là căn cứ trên ảnh hưởng của một protein liên kết trên sự di chuyển của các phân tử ADN trong một vùng điện trường. Một phân tử ADN được đánh giá cao mang điện tích âm và do đó sẽ di chuyển nhanh chóng hướng tới một điện cực dương khi nó chịu chi phối của một điện trường. Khi phân tích bằng điện di trên gel polyacrylamide (xem trang 534), phân tử ADN được tách theo kích thước của chúng vì các phân tử nhỏ hơn có thể xâm nhập màng lọc gel một cách dễ dàng hơn so với những phân tử lớn. Các phân tử protein liên kết với một phân tử ADN sẽ làm cho nó di chuyển chậm hơn qua gel. Nói chung, liên kết protein càng lớn, càng làm chậm sự phát triển của phân tử ADN. Hiện tượng này cung cấp cơ sở cho việc khảo nghiệm thay đổi gel – di động, cho phép ngay cả một lượng rất nhỏ của một trình tự protein liên kết ADN đặc hiệu dễ dàng được phát hiện. Trong xét nghiệm này, một đoạn ADN ngắn của chiều dài chuỗi trình tự đặc hiệu (tạo ra hoặc do nhân bản ADN vô tính hoặc bằng tổng hợp hóa học, sẽ được thảo luận trong Chương 8) được đánh dấu phóng xạ và trộn với một dịch chiết tế bào; hỗn hợp sau đó được tải lên một loại gel polyacrylamide và bị điện di. Nếu đoạn ADN phù hợp với vùng nhiễm sắc thể, ví dụ, một số trình tự protein liên kết, phương pháp chụp phóng xạ tự ghi (xem trang 602 - 603) sẽ cho biết một loạt các đoạn ADN, mỗi một đoạn phát triển chậm đến mức độ khác nhau và đại diện cho một phức hợp ADN – protein riêng biệt. Các protein chịu trách nhiệm cho mỗi đoạn trên gel sau đó có thể được tách khỏi nhau bởi sự cắt phân đoạn lần tiếp theo của chiết xuất tế bào (Hình 7-27). Khi một dãy trình tự cụ thể ADN – protein đã được thanh lọc, xét nghiệm gel – di động có thể được sử dụng để nghiên cứu độ bền và tính đặc hiệu của những sự tương tác của nó với những chuỗi ADN khác, thời gian tồn tại của phức hợp ADN – protein, và các đặc tính quan trọng khác đối với chức năng của các protein trong tế bào..

<span class='text_page_counter'>(15)</span> Hình 7 – 27. Một thí nghiệm sự chuyển động của gel. Nguyên tắc của khảo nghiệm được hiển thị ở biểu đồ (A). Trong ví dụ này, một dịch chiết của một tế bào kháng thể sinh ra được trộn với một đoạn ADN phóng xạ có chứa khoảng 160 nucleotide quy định một chuỗi ADN từ một gen mã hóa “chuỗi nhẹ” của kháng thể được tạo ra bởi dòng tế bào. Ảnh hưởng của các protein trong dịch chiết xuất có tính di động trên đoạn ADN được phân tích bằng điện di gel – polyacrylamide theo phương pháp “sự phóng xạ tự ghi”. Những đoạn ADN tự do di chuyển nhanh chóng xuống dưới cùng của gel, trong khi những đoạn ADN liên kết với protein thì di chuyển chậm, phát hiện sáu nhóm di chuyển chậm cho thấy trong dịch chiết xuất có chứa sáu nhóm trình tự cụ thể ADN liên kết protein (gọi tắt là C1 - C6) liên kết với trình tự này. (Để đơn giản, bất kỳ đoạn ADN liên kết với nhiều hơn một protein đã được bỏ qua trong hình.) Ở (B) một kỹ thuật sắc ký đồ tiêu chuẩn (xem trang 512 - 513) đã sử dụng chia ra các chiết xuất (trên), và mỗi phần được trộn với đoạn ADN phóng xạ, áp dụng cho một làn gel polyacrylamide, và phân tích như ở A (B, sửa đổi từ C. Sheidereit, AH và Roeder RG, Cell 51: 783 793, 1987. Với sự cho phép của Elsevier). Tinh chế sắc ký ái lực ADN của trình tự đặc hiệu ADN liên kết protein Một phương pháp tinh chế protein đặc biệt hiệu quả được gọi là sắc ký ái lực ADN có thể được sử dụng khi trình tự ADN mà protein điều hòa gen được xác định. Một oligonucleotit sợi kép có trình tự chính xác được tổng hợp bằng phương pháp hóa học và liên kết với một chất nền xốp không hòa tan như agar; chất nền với các oligonucleotide kèm theo sau đó được sử dụng để xây dựng một cột có chọn lọc với protein liên kết để nhận biết những chuỗi ADN đặc hiệu (Hình 7 - 28). Thanh lọc.

<span class='text_page_counter'>(16)</span> khoảng 10.000 – vòng xoắn có thể đạt được bằng phương thức này với chi phí tương đối thấp.. Hình 7 – 28. Sắc ký ái lực. Trong bước đầu tiên, tất cả các phân tử protein có thể liên kết với ADN được tách ra từ những tế bào protein tồn tại trên một cột chứa rất nhiều chuỗi ADN khác nhau. Hầu hết những trình tự đặc hiệu protein liên kết ADN có ái lực liên kết yếu (không rõ nguyên nhân) cho kích thước lớn của ADN và do đó nó bị giữ lại trên cột. Ái lực này đủ lớn để hút ion, và protein có thể bị rửa sạch bằng dung dịch chứa một lượng nồng độ muối vừa phải. Trong bước thứ hai, hỗn hợp các protein liên kết ADN được truyền qua một cột chỉ chứa ADN của một trình tự đặc hiệu. Thông thường, tất cả các protein liên kết ADN sẽ dính vào cột, phần lớn bởi sự liên kết không đặc hiệu. Một lần nữa tách rửa bằng các giải pháp dùng nồng độ muối vừa phải, để lại trên cột chỉ có những phân tử protein đó (thường là một hoặc chỉ một vài) liên kết đặc hiệu và do đó rất chặt chẽ với các trình tự ADN đặc hiệu. Những phần tử cụ thể còn lại có thể được tách rửa từ cột bằng các giải pháp có chứa một nồng độ rất cao của muối.. Mặc dù hầu hết các protein điều hòa gen xuất hiện ở mức rất thấp trong tế bào, protein tinh khiết thường có thể được phân lập bởi sắc ký ái lực để có được một phần chuỗi acid amin bằng phép đo quang phổ khối lượng hoặc phương pháp khác (được thảo luận trong Chương 8). Nếu giải trình tự toàn bộ hệ gen (genome) của sinh vật được biết đến, một phần axit amin có thể được sử dụng để xác định các gen. Gen này không chỉ cung cấp hoàn chỉnh chuỗi axit amin của protein; nó còn cung cấp các phương tiện để sản xuất các protein với số lượng không giới hạn thông qua các công nghệ kỹ thuật di truyền, cũng được thảo luận trong Chương 8..

<span class='text_page_counter'>(17)</span> Trình tự ADN được nhận dạng bởi một protein điều hòa gen có thế xác định bằng thực nghiệm. Protein điều hòa gen có thể được phát hiện trước khi trình tự ADN nhận dạng được biết đến. Ví dụ, nhiều các vùng tương ứng protein của ruồi giấm đã được phát hiện thông qua sự phân lập của các đột biến làm thay đổi sự phát triển bay. Điều này cho phép các gen mã hóa các protein được xác định, và các protein sau đó có thể được lan rộng trong tế bào nuôi cấy và dễ dàng được làm sạch. ADN in dấu chân (xác định trình tự ADN, nơi bám protein) là một trong những phương pháp xác định trình tự ADN được nhận biết bởi một protein điều hòa gen một khi nó đã được làm sạch. Chiến lược này cũng đòi hỏi một mảnh tinh khiết của đoạn lặp kép ADN có chứa ở một nơi nào đó bên trong nó vị trí nhận biết cho protein. Trình tự nhận biết ngắn có thể xảy ra ngẫu nhiên trên bất cứ đoạn ADN dài nào, mặc dù cần thiết để sử dụng ADN tương ứng với một vùng điều hòa cho một gene được biết để kiểm soát bởi các protein liên quan. ADN in dấu chân dựa vào các enzyme nuclease hoặc hoá chất tách ADN ngẫu nhiên tại mỗi liên kết phosphodiester. Một protein điều hòa gen ngăn cản những liên kết phosphodiester khỏi bị tấn công (ăn mòn), do đó để lộ ra vị trí nhận biết chính xác của protein như là một khu vực được bảo vệ, hoặc in dấu chân (Hình 7-29). Hình 7-29. ADN in dấu chân. (A) Sơ đồ của phương pháp. Một đoạn ADN được đánh dấu ở trên kết thúc với P32, quá trình được mô tả trong hình 8 – 34, tiếp theo ADN được phân tách với nuclease hoặc hóa chất tạo ra một vết cắt sợi đơn ngẫu nhiên. Sau khi phân tử ADN bị làm biến tính để tách hai sợi, kết quả là các mảnh vỡ từ sợi có đánh dấu được tách trên gel và được phát hiện bởi phương pháp phóng xạ tự ghi (xem hình 8 – 33). Các mô hình của đoạn ADN được cắt trong những đoạn bị thiếu. Khi có mặt protein, nó bao gồm các nucletide tại vị trí liên kết của mình và bảo vệ liên kết phosphodiester của của nó khỏi sự phân tách. Kết quả là, những mảnh vỡ có đánh dấu nếu không đúng ở vị trí kết thúc thì liên kết bị mất để lại khoảng trống trong các mô hình gel được gọi là một "dấu chân". Trong ví dụ chỉ ra, protein liên kết ADN bảo vệ bảy liên kết phosphodiester từ các tác nhân phân tách ADN. (B) Một dấu chân thực tế được sử dụng để xác định vị trí gắn cho một gene quy định protein từ con người. Các tác nhân phân tách nhỏ,chứa phân tử sắt hữu cơ bình thường cắt giảm tại mỗi liên kết phosphodiester với tần số gần như bằng nhau. ((phần) B có được do sự giúp đỡ của Michele Sawadogo và Robert Roeder.).

<span class='text_page_counter'>(18)</span> Cách thứ hai để xác định trình tự ADN được nhận dạng bởi một loại protein điều hòa gen mà không đòi hỏi ưu tiên về sự am hiểu kiến thức của gene có thể quy định. Ở đây, các protein tinh khiết được sử dụng để lựa chọn, từ một vùng lớn ngẫu nhiên tạo ra những đoạn trình tự ADN ngắn khác nhau, chỉ có những trình tự đó liên kết một cách chặt chẽ với nó. Sau nhiều vòng lựa chọn như vậy, trình tự nucleotide liên kết chặt chẽ trong sợi kép ADN được xác định, và một trình tự ADN tương đồng nhận biết cho các protein điều hòa gen có thể được tạo thành (hình 7 – 30). Khi trình tự ADN được nhận dạng bởi một protein điều hòa gen được biết đến, thì việc lưu trữ hệ gene trên máy vi tính có thể xác định các gene tham gia phiên mã, protein điều hòa gen có thể liên quan đến kiểm soát. Hình 7 – 30 Một phương pháp để xác định chuỗi ADN được nhận dạng bằng protein điều hòa gen. Một protein điều hòa gen tinh khiết được trộn lẫn với hàng triệu đoạn ADN ngắn khác nhau, với mỗi một sự khác nhau về trình tự của các nucleotide. Một tập hợp của các đoạn ADN đó có thể được tạo bởi một quá trình tổng hợp ADN, một máy hóa học tổng hợp ADN của bất kỳ trình tự nào mong muốn (được thảo luận trong Chương 8). Ví dụ, có 411, hoặc có thể khoảng 4,2 triệu chuỗi cho một đoạn ADN của 11 nucleotide. Đoạn ADN sợi kép liên kết chặt chẽ với protein điều hòa gen này sau đó được tách ra từ các mảnh nhỏ ADN liên kết sai. Một phương pháp để thực hiện tách biệt này là thông qua thay đổi gel – di động, được mô tả trong hình 7 – 29. Sau khi phân tách phức hợp ADN – protein từ ADN tự do, các đoạn ADN được lấy ra từ protein, và sau khi thực hiện nhiều vòng bổ sung của cùng một quá trình xử lý (không được chỉ ra). Trình tự nucleotide của những đoạn ADN đó vẫn còn giữa lại qua nhiều vòng liên kết, sự nhả ra có thể được xác định, và do đó một trình tự ADN nhận dạng tương đồng có thể được tạo ra.. Tuy nhiên, chiến lược này là không rõ ràng. VD, nhiều SV sản xuất một tập hợp các protein điều hòa gen liên quan chặt chẽ nhận dạng trình tự AND rất giống nhau, và phương pháp này không thể giải quyết được điều đó. Trong hầu hết các trường hợp, dự đoán các vị trí hoạt động của các protein điều hòa gen thu được từ việc tìm kiếm các trình tự bộ gen, cuối cùng phải được kiểm tra bằng thực nghiệm. Hệ thống sinh học dấu chân xác định nhiều trình tự điều hòa ADN thông qua hệ gen so sánh Sự phổ biến rộng rãi của trình tự toàn bộ hệ gen cung cấp một phương pháp đơn giản đáng ngạc nhiên để xác định các vị trí quy định quan trọng trên ADN, ngay cả khi protein điều hòa gen liên kết chúng. Trong phương pháp này, bộ gen của một số loài có quan hệ gần gũi được so sánh. Nếu loài được lựa chọn đúng cách, thì các phần mã hóa protein của bộ gen sẽ rất giống nhau, nhưng các khu vực giữa các trình tự mã hóa các phân tử protein hoặc phân tử ARN có thể tách ra đáng kể, giống như hầu hết các trình tự này có chức năng không liên quan và do đó không hạn chế trong quá trình tiến hóa..

<span class='text_page_counter'>(19)</span> Trong các trường hợp ngoại lệ chính là trình tự quy định kiểm soát phiên mã. Những trình tự này nổi bật như những hòn đảo được bảo tồn trong một biển các nucleotit (hình 7-31). Mặc dù sự đồng nhất của các protein điều hòa gen nhận ra các chuỗi ADN được bảo vệ phải được xác định bằng các phương tiện khác, hệ thống sinh học dấu chân là một phương pháp hiệu quả để xác định nhiều trình tự ADN kiểm soát biểu hiện gen. Hình 7-31: Hệ thống sinh học in dấu chân (footprinting). Ví dụ này so sánh trình tự ADN đầu trên của cùng một gen từ năm loại nấm men có liên quan chặt chẽ với nhau, nucleotide giống hệt nhau được đánh dấu bởi màu vàng. Hệ thống sinh học dấu chân cho thấy ADN nhận dạng các vị trí cho các protein điều hòa, vì chúng thường được bảo vệ hơn hơn so với trình tự xung quanh. Chỉ có khu vực đầu của một gen đặc biệt được thể hiện trong ví dụ này, nhưng phương pháp này thường được sử dụng để phân tích toàn bộ hệ gen. Các protein hòa gen liên kết với các vị trí được mô tả bằng màu đỏ được mô tả trong hình 7-21. Một số hệ thống dấu chân ngắn hơn trong ví dụ này đại diện cho các vị trí liên kết cho protein điều hòa gen bổ sung, không phải tất cả trong số đó đã được xác định.. Kết tủa kháng nguyên chất nhiễm sắc (chromatin immunoprecipititaion) xác định nhiều vị trí mà protein điều hòa gen chiếm đóng trong tế bào sống Một protein điều hòa gen sẽ không chiếm tất cả các vị trí liên kết ADN trong bộ gen tiềm năng của nó, tại một thời điểm cụ thể. Trong một số điều kiện, protein có thể không được tổng hợp, và như vậy sẽ không có mặt trong tế bào, nó có thể có mặt nhưng thiếu một đối tác dị nhị phân, hoặc nó có thể được loại trừ từ nhân cho đến khi một tín hiệu thích hợp được nhận từ môi trường của tế bào. Ngay cả nếu protein điều hòa gen có mặt trong nhân và có khả năng liên kết ADN, các thành phần của chất nhiễm sắc hoặc protein điều hòa gen khác có thể liên kết với các trình tự ADN giống nhau hoặc chồng chéo có thể hấp thụ các vị trí liên kết tiềm năng của nó trên ADN.. Hình 7-32: Kết tủa kháng nguyên chất nhiễm sắc. Phương pháp này cho phép xác định tất cả các vị trí trên một hệ gen mà một protein điều hòa gen chiếm giữ in vivo. Đối với sự khuếch tán của ADN bởi một chuỗi phản ứng trùng hợp (PCR), xem hình 8-45. Việc nhận ra các đoạn ADN bị kết tủa, khuếch tán có thể được xác định bởi việc lai xáo trộn với những đoạn ADN cực nhỏ, như mô tả trong chương 8.. Kết tủa kháng nguyên chất nhiễm sắc cung cấp một cách thực nghiệm xác định các thành phần trên ADN cho thấy rằng một protein điều hòa gen được đưa ra chiếm dưới một tập hợp các điều kiện.

<span class='text_page_counter'>(20)</span> cụ thể (hình 7- 32). Trong cách tiếp cận này, protein liên kết cộng hóa trị chéo với ADN trong tế bào sống, các tế bào bị phá vỡ, và ADN được cắt tự động thành những mảnh nhỏ. Kháng thể trực tiếp chống lại một loại protein điều hòa gen sau đó được sử dụng để làm sạch ADN mà đã trở thành liên kết cộng hóa trị chéo với protein trong tế bào. Nếu ADN này được lai với vi mạng mà chứa toàn bộ bộ gen được hiển thị như là một loạt các mảnh ADN rời rạc (hình 8- 73), vị trí chính xác của bộ gen của mỗi đoạn ADN kết tủa có thể được xác định. Bằng cách này, tất cả các vị trí bị chiếm bởi các protein điều hòa gen trong các tế bào gốc có thể được sắp xếp vào bộ gen của tế bào (hình 7- 33). Nhiễm sắc thể miễn dịch kết tủa cũng thường được sử dụng để xác định các vị trí dọc theo hệ gen được đóng gói theo các loại khác nhau của histone sửa đổi (đã thảo luận ở Chương 4). Trong trường hợp này, các kháng thể cụ thể cho việc sửa đổi histone đặc biệt liên quan được lựa chọn. Tóm tắt Những protein điều hòa gen nhận dạng những đoạn xoắn kép ADN giãn xoắn ngắn của trình tự xác định và do đó xác định trong hàng ngàn gen trong một tế bào sẽ được sao chép. Hàng ngàn protein điều hòa gen đã được xác định trong một loạt các sinh vật. Mặc dù mỗi protein này có nhiều tính năng đặc hiệu, nhưng hầu hết liên kết với ADN như các đồng nhị phân hoặc các dị nhị phân và nhận dạng ADN thông qua một trong một số ít các môtíp cấu trúc. Các môtíp cấu trúc thông thường bao gồm xoắn-gấp-xoắn, các homeodomain, dây kéo lơxin, xoắn-móc-xoắn, một số loại chứa kẽm hình ngón tay. Trình tự axit amin chính xác được xếp vào một motip xác định trình tự ADN đặc biệt mà một protein điều hòa gen công nhận. Dị nhị trùng hóa làm tăng phạm vi của các trình tự ADN có thể được công nhận. Kỹ thuật hiệu quả này đang phổ biến để xác định và cô lập các protein này, các gen mã hóa chúng, và các chuỗi ADN mà chúng nhận ra, và để lập bản đồ tất cả các gen mà chúng quy định trên một bộ gen..

<span class='text_page_counter'>(21)</span> Hình 7-33. Một gen điều hòa: bộ gen hoàn chỉnh được kiểm soát bởi ba protein điều hòa chính trong nấm men bia vừa chớm nở, được suy luận từ các vị trí ADN nơi mà các protein điều hòa liên kết. Protein điều hòa-Mata1, Matα1, và Matα2-xác định rõ hai loại đơn bội khác nhau (như với con đực và con cái) của sinh vật đơn bào. Nhiễm sắc thể 16 trong hệ gen của nấm men được thể hiện (màu xám), với thanh có màu chỉ ra vị trí rất nhiều sự kết hợp của 3 protein điều hòa liên kết với nhau. Phía trên mỗi vị trí liên kết là tên của một sản phẩm protein của gen được quy định. Matα1 hoạt động trong một hệ phức hợp với một protêin khác, Mcm1, kích hoạt biểu hiện của gen được đánh dấu bằng màu đỏ; Matα2 hoạt động trong phức hợp với Mcm1, ức chế gen được đánh dấu bằng màu xanh; và Mata1 trong hệ phức hợp với Matα2 ức chế gen được đánh dấu bằng màu xanh đậm (xem hình 7-21 và 7-65). Mũi tên 2 chiều tượng trưng cho những gen được sao chép khác nhau, mà được kiểm soát bởi những protêin điều hòa gen được biểu hiện. Sơ đồ hoàn chỉnh của nhưng protein điều hòa được liên kết được xác định sử dụng một sự kết hợp của nhiễm sắc thể miễn dịch kết tủa trọng hệ gen lớn (xem hình 7-32) và phát sinh loài in dấu chân (xem hình 7-29). Sự xác định của những mạch phiên mã hoàn chỉnh như thế này chỉ ra rằng những hệ thống phiên mã không hoàn toàn phức tạp, mặc dù chúng có thể xuất hiện ban đầu theo cách đó. Nghiên cứu loại này cũng có thể giúp bộc lộ tổng quan của những mạch phiên mã một cách hợp lý được sử dụng bởi những tế bào hiện đại..

<span class='text_page_counter'>(22)</span>