ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------

Phạm Thị Thùy

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP
MULTIPLEX PCR XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÁC
NHÂN GÂY NHIỄM KHUẨN HUYẾT

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2016


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

----------

Phạm Thị Thùy

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP
MULTIPLEX PCR XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÁC
NHÂN GÂY NHIỄM KHUẨN HUYẾT

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. Lã Thị Huyền
PGS.TS. Nguyễn Quang Huy

Hà Nội - 2016


Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan: Luận văn là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân,
được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. TS. Nguyễn Quang Huy và
TS. Lã Thị Huyền.
Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa được ai cơng bố
trong bất kỳ cơng trình nào khác.
Tơi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình.
Hà Nội, tháng 12 năm 2016
Học viên

Phạm Thị Thùy


Lời cảm ơn
Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành và sâu sắc tới:
PGS. TS. Nguyễn Quang Huy – Trưởng khoa Sinh học - Trường đại học Khoa
học Tự nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội và TS. Lã Thị Huyền – Phụ trách phịng
Cơng nghệ Tế bào Động vật – Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm và Khoa
học Việt Nam đã tận tình hướng dẫn tơi trong q trình nghiên cứu để hồn thành
luận văn thạc sĩ.
Tơi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Sinh học – Trường đại học
Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội nói chung và thầy cơ giáo chun
ngành Sinh học thực nghiệm học nói riêng đã chỉ bảo tận tình và tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi thực hiện luận văn.

Tơi xin chân thành cảm ơn Khoa Hóa sinh, khoa Vi sinh và các khoa phòng
liên quan của Bệnh viện Thanh Nhàn đã cung cấp mẫu thí nghiệm cho tơi.
Tơi xin gửi lời cảm ơn tới các cô chú, anh chị và các bạn cơng tác tại phịng
phịng Cơng nghệ Tế bào Động vật cùng tồn thể các cơ chú, anh chị và các bạn
đồng nghiệp Khoa Hóa sinh – Bệnh viện 198 đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện
thuận lợi để tơi hồn thành luận văn.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những người thân, bạn bè đã
động viên và giúp đỡ tôi trong thời gian qua.
Hà Nội, tháng 12 năm 2016
Học viên

Phạm Thị Thùy


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................3
1.1. Nhiễm khuẩn huyết ..........................................................................................3
1.1.1. Khái niệm, lịch sử và tình hình nhiễm khuẩn huyết trên thế giới và Việt
Nam ......................................................................................................................3
1.1.2. Dấu hiệu của nhiễm khuẩn huyết...............................................................7
1.2. Tác nhân vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết thường gặp ...................................7
1.2.1. Tụ cầu khuẩn Staphylococcus aureus ........................................................8
1.2.2. Acinetobacter baumannii ...........................................................................9
1.2.3. Klebsiella pneumoniae.............................................................................11
1.2.4. Pseudomonas aeruginosa ........................................................................12
1.2.5. Escherichia coli .......................................................................................14
1.3. Các phương pháp chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết ...........................................15
1.3.1. Chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết bằng phương pháp cấy máu ...................15
1.3.2. Lai huỳnh quang tại chỗ ..........................................................................15

1.3.3. Các kỹ thuật khuếch đại DNA .................................................................16
1.3.4. Giải trình tự ..............................................................................................18
1.4. Multiplex PCR và ứng dụng ...........................................................................19
1.4.1. Giới thiệu chung về multiplex PCR .........................................................19
1.4.2. Các loại phản ứng multiplex PCR ...........................................................19
1.4.3. Thiết kế mồi cho phản ứng multiplex PCR .............................................20
1.4.4. Ưu điểm của phương pháp multiplex PCR ..............................................21
1.4.5. Tối ưu hóa các thành phần cho phản ứng multiplex PCR .......................22
1.4.6. Ứng dụng của phản ứng multiplex PCR ..................................................24
1.4.7. Tình hình ứng dụng kỹ thuật PCR trong việc xác định các tác nhân nhiễm
khuẩn huyết ........................................................................................................25
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................27


2.1. Vật liệu ...........................................................................................................27
2.1.1. Hóa chất và sinh phẩm .............................................................................27
2.1.2. Thiết bị .....................................................................................................28
2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................28
2.2.1. Thiết kế primer ........................................................................................29
2.2.2. Tách chiết DNA .......................................................................................29
2.2.3. Phương pháp làm giàu DNA vi khuẩn.....................................................30
2.2.4. Xác định nồng độ DNA ...........................................................................31
2.2.5. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose ............................................31
2.2.6. Phương pháp PCR....................................................................................32
2.2.7. Phương pháp giải trình tự gen .................................................................33
2.2.8. Đạo đức trong nghiên cứu .......................................................................34
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................35
3.1. Kết quả lựa chọn và thiết kế mồi đặc hiệu gen đích.......................................35
3.2. Kết quả kiểm tra các cặp mồi bằng thực nghiệm ...........................................38
3.2.1. Kiểm tra DNA tổng số tách chiết từ các chủng vi khuẩn ........................38

3.2.2. Kết quả PCR kiểm tra từng cặp mồi đơn trên các chủng vi khuẩn đích .39
3.2.3. Kết quả xác định trình tự các sản phẩm PCR từ các chủng vi khuẩn
Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, Klebsiella
pneumoniae và Pseudomonas aeruginosa .........................................................40
3.2.4. Kiểm tra tính đặc hiệu của các cặp mồi ...................................................43
3.2.5 Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu của các cặp mồi và các gen đích trong
phản ứng multiplex PCR....................................................................................45
3.3. Kết quả tối ưu phản ứng multiplex PCR xác định đồng thời 5 vi khuẩn đích ....... 47
3.3.1. Kết quả tối ưu nồng độ mồi của phản ứng multiplex PCR ......................47
3.3.2. Kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi của phản ứng multiplex PCR ...............48
3.3.3. Kết quả lựa chọn Master Mix trong phản ứng multiplex PCR ................50
3.4. Kết quả thử nghiệm phương pháp multiplex PCR trên các chủng nhiễm
khuẩn thuần ...........................................................................................................51


3.5. Kết quả thử nghiệm phương pháp multiplex PCR trên mẫu bệnh phẩm .......53
3.5.1. Kết quả thử nghiệm phương pháp multiplex PCR trên các mẫu bệnh
phẩm cấy máu ....................................................................................................53
3.5.2. Kết quả thử nghiệm phương pháp multiplex PCR trên các mẫu lâm
sàng ....................................................................................................................58
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................61
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................62
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Tiêu chí đặt tên của ACCP / SCCM [16] ....................................................4
Bảng 2.1. Trình tự Nucleotide của các cặp mồi ........................................................27
Bảng 3.1. Trình tự mồi và kích thước sản phẩm PCR theo tính tốn lý thuyết ........37
Bảng 3.2. Kết quả thử nghiệm phản ứng multiplex PCR..........................................52

Bảng 3.3. So sánh kết quả multiplex PCR trên các mẫu bệnh phẩm cấy máu .........55
với kết quả của phương pháp cấy máu ......................................................................55


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1 Mối quan hệ giữa các phản ứng viêm toàn thân và nhiễm trùng, vùng giao
nhau chỉ ra nhiễm khuẩn huyết [16, 56]......................................................................5
Hình 1.2. Hình ảnh và cấu trúc gen vi khuẩn Staphylococcus aureus ........................8
Hình 1.3. Hình ảnh và cơ chế xâm nhập của vi khuẩn Acinetobacter baumannii ....10
Hình 1.4. Hình ảnh và tác động của vi khuẩn Klebsiella pneumonia .......................11
Hình 1.5. Hình ảnh và tác động của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa .................13
Hình 1.6. Hình ảnh và phân loại vi khuẩn Escherichia coli .....................................14
Hình 1.7. Mơ hình mơ tả phản ứng multiplex PCR ..................................................20
Hình 3.1. Điện di kiểm tra DNA tổng số của các chủng Staphylococcus aureus,
Acinetobacter

baumannii,

Escherichia

coli,

Klebsiella

pneumoniae

và

Pseudomonas aeruginosa tách chiết từ các chủng chuẩn .........................................38
Hình 3.2. Kiểm tra tính đặc hiệu của các cặp mồi và các gen đích của các chủng vi

khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết tương ứng. ................................................................40
Hình 3.3. Kiểm tra khả năng nhân bản đặc hiệu của các cặp mồi femA, gltA, oprL, mdh,
phoA với các chủng Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas
aeruginosa, Klebsiella pneumoniae và Escherichia coli. ..............................................43
Hình 3.4. Kiểm tra tính đặc hiệu giữa các cặp mồi và các gen đích trong phản ứng
multiplex PCR. ..........................................................................................................45
Hình 3.5. Tối ưu nồng độ mồi cho phản ứng multiplex PCR. ..................................47
Hình 3.6. Tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng multiplex PCR ............................49
Hình 3.7. Lựa chọn thành phần Mastermix trong phản ứng multiplex PCR ............50
Hình 3.8. Thử nghiệm phương pháp multiplex PCR trên mẫu bệnh phẩm cấy
máu. ...........................................................................................................................53
Hình 3.9. Thử nghiệm phương pháp multiplex PCR trên mẫu lâm sàng..................59


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ACCP

American College of Chest Physicians

AW1

Wash buffer AW1

AW2

Wash buffer AW2

BN

Bệnh nhân


DNA

Deoxyribonucleic acid (acid Deoxyribonucleic)

dNTP

Deoxyribonucleoside triphosphate

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

EtBt

Ethidium bromide

EtOH

Ethanol

ICU

Intensive care unit (Đơn vị chăm sóc đặc biệt )

MLST

Multilocus sequence typing (Xác định trình tự nhiều
gen đặc trưng)


MRSA

Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (Tụ cầu
vàng kháng Methicillin)

Mutiplex PCR

Phản ứng khuếch đại nhiều DNA đích

NKH

Nhiễm khuẩn huyết

NVYT

Nhân viên y tế

PAF

Platelet-activating factor

RNA

Ribonucleic acid (Acid Ribonucleic)

SCCM

Socity Critical Care Medicine

SDS


Sodium dodecyl sulfate

SNP

Single nucleotide polymorphism (Đa hình sợi đơn )

TAE

Tris-EDTA-Acetic acid


MỞ ĐẦU
Nhiễm khuẩn huyết (NKH) là một bệnh nhiễm khuẩn toàn thân nặng,
gây ra do vi khuẩn và độc tố của vi khuẩn lưu hành trong máu. NKH có nguy
cơ tử vong cao do sốc nhiễm khuẩn và rối loạn chức năng nhiều cơ quan. Đặc
điểm lâm sàng của NKH rất đa dạng, diễn tiến thường nặng và khơng có
chiều hướng tự khỏi nếu không được điều trị kịp thời.
Nhiều năm qua, NKH vẫn là một trong mười nguyên nhân chủ yếu gặp
ở bệnh nhân nhập viện. Theo báo cáo của Trung tâm thống kê quốc gia chăm
sóc sức khỏe của Mỹ cho thấy: Năm 2008, bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết
nhập viện tăng gấp đôi so với năm 2000 (326.000 so với 727.000) . Đặc biệt,
nghiên cứu của Elixhauser A. và tập thể (2009), nhiễm khuẩn huyết ngay lúc
nhập viện là 836.000 ca. Chi phí điều trị mỗi ca NKH dao động từ 10.00050.000 đô la và lên tới 17 tỷ đô la mỗi năm cho các trường hợp NKH và thời
gian nằm viện trung bình tăng thêm 19,6 ngày. Theo thống kê của
Fleischmann C. và tập thể (năm 2016) dựa trên 1553 báo cáo từ năm 1979
đến năm 2015 của các nước cho thấy: Đối với các nước thu nhập cao, cứ
100.000 người nhập viện mỗi năm có 437 trường hợp nhiễm khuẩn huyết
(sepsis) và 270 trường hợp nhiễm trùng khuẩn nặng (severe sepsis) và tỉ lệ tử
vong là 17% đối với nhiễm khuẩn huyết và 26% đối với các nhiễm khuẩn

huyết nặng trong thời gian này. Theo tính tốn ngoại suy của các nhà khoa
học này ước tính tồn cầu có khoảng 31,5 triệu ca nhiễm khuẩn huyết và 19,4
triệu trường hợp nhiễm khuẩn huyết nặng, và khoảng 5,3 triệu người chết mỗi
năm.
Bệnh nhân mắc nhiễm khuẩn huyết thường có tiến triển bệnh nhanh,
đặc biệt là ở các đối tượng trẻ em và người già. Vì vậy, việc phát hiện sớm tác
nhân gây bệnh có ý nghĩa quan trọng để điều trị kịp thời và góp phần hạn chế
1


biến tính, giảm tỷ lệ tử vong ở bệnh nhân mắc nhiễm khuẩn huyết. Hiện nay,
cấy máu kết hợp với xét nghiệm sinh hóa là phương pháp phổ biến nhất để
phát hiện mầm bệnh. Phương pháp này tiến hành đơn giản, dễ thao tác với chi
phí thấp nhưng có nhược điểm là tốn nhiều thời gian, không loại trừ được
trường hợp âm tính giả.
Việc phát hiện DNA của vi khuẩn trong mẫu máu của bệnh nhân được
cho là một phương pháp có độ nhạy và chính xác cao. Tuy nhiên, cho đến
hiện nay vẫn chưa có phương pháp phát hiện DNA của vi khuẩn nào được cho
là chuẩn để ứng dụng vào chẩn đốn nhiễm khuẩn huyết. Vì vậy, nghiên cứu
xây dựng một phương pháp chẩn đốn nhanh, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao
đang là nhu cầu bức thiết hiện nay. Multiplex PCR có thể coi là giải pháp cho
những vấn đề trên. Phương pháp này sử dụng nhiều cặp mồi trong cùng một
phản ứng cho phép phát hiện nhiều loại tác nhân gây nhiễm khuẩn huyết trong
thời gian ngắn với độ chính xác cao.
Xuất phát từ những thực tế trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Nghiên
cứu xây dựng phƣơng pháp multiplex PCR xác định một số tác nhân gây
nhiễm khuẩn huyết” nhằm góp phần vào việc chẩn đoán và điều trị cho các
bệnh nhân nghi ngờ mắc nhiễm khuẩn huyết tại Việt Nam. Nội dung chính
của đề tài bao gồm:



Lựa chọn và thiết kế các mồi đặc hiệu các gen đích của các

chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết.


Tối ưu điều kiện phản ứng multiplex PCR.



Thử nghiệm phương pháp multiplex PCR trên mẫu bệnh phẩm

của bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết.

2


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Nhiễm khuẩn huyết

1.1.1. Khái niệm, lịch sử và tình hình nhiễm khuẩn huyết trên thế giới và
Việt Nam
Trong lịch sử, nhiễm khuẩn huyết là một bệnh rất khó khăn để xác định
và chẩn đốn. Từ 100 trước công nguyên, các học giả La Mã (116 TCN-27
TCN) đã mô tả về nhiễm khuẩn huyết như sau: “những sinh vật nhỏ, khơng
thể nhìn thấy bằng mắt, có đầy trong khơng khí và qua hơi thở gây ra các
bệnh nguy hiểm”. Tiếp đó các nhà sử học, nhà triết học, nhân chủng học và
tiêu biểu là một học giả thời kì phục hưng Niccolo Machiavelli (1469-1527)

trong báo cáo của mình cũng đã lần lượt mơ tả đầy đủ về nhiễm khuẩn huyết.
Ngày nay, chúng ta đã biết rằng sốt lao phổi không phải nhiễm khuẩn
huyết. Tuy nhiên trong một thời gian dài, sốt lao phổi được cho là nhiễm
khuẩn huyết bởi trong giai đoạn y học chưa phát triển, việc mơ tả nhiễm
khuẩn huyết rất khó để được chấp nhận cho đến khi triệu chứng bệnh trở nên
rõ ràng và khó khăn trong điều trị cùng với tính nghiêm trọng của bệnh thì
người ta bắt đầu quan tâm hơn và nỗ lực tìm hiểu đưa ra khái niệm về nhiễm
khuẩn huyết [8]. Trong thực tế sự hiện diện của nhiều vi sinh vật gây bệnh
hay độc tố của chúng trong máu hoặc mô dẫn tới sự phủ định của những khái
niệm chung này đồng thời kéo theo vô số nỗ lực phát triển về dịch tễ học, các
công cụ chẩn đoán và xét nghiệm để xác định nhiễm khuẩn huyết [9].
Vào năm 1992, American College of Chest Physicians (ACCP) và
Socity Critical Care Medicine (SCCM) cùng công bố các khái niệm của
nhiễm trùng huyết (Bảng 1, Hình 1) [16]. Đây là một trong những khái niệm
phổ biến nhất về nhiễm khuẩn huyết trong các đơn vị chăm sóc sức khỏe y tế
đặc biệt, các trung tâm dịch vụ chăm sóc sức khỏe chuyên sâu khác nhau trên
3


khắp thế giới. Việc mô tả biểu hiện của các phản ứng viêm toàn thân và đưa
ra định nghĩa cụ thể cho nhiễm khuẩn huyết, nhiễm khuẩn huyết nặng, sốc
nhiễm trùng và hội chứng rối loạn chức năng đa cơ quan là những vấn đề
quan trọng trong lĩnh vực nhiễm khuẩn huyết [14, 16, 56].
Bảng 1.1 Tiêu chí đặt tên của ACCP / SCCM [16]
Tiêu chí đặt tên
của ACCP /

Dấu hiệu, Triệu chứng

SCCM

Nhiệt độ cơ thể > 38°C hoặc <36°C, Nhịp tim ≥90 bpm,
Hội chứng

Khả năng hô hấp ≥ 20 lần / phút (hoặc PaCO2 <32 mmHg)

đáp ứng viêm

Tế bào bạch cầu ≥ 12,000 / µl hoặc ≤ 4000 / µl hoặc > 10%
chưa phát triển các triệu chứng.

Nhiễm khuẩn

Ít nhất có hai tiêu chí của hội chứng đáp ứng viêm hoặc

huyết
Nhiễm khuẩn
huyết nặng
Sốc nhiễm trùng

Hội chứng rối loạn
chức năng nội tạng

nghi ngờ nhiễm trùng.
Nhiễm khuẩn huyết với rối loạn chức năng cơ quan cấp tính
(bao gồm cả tăng truyền dịch và hạ huyết áp) gây ra bởi
nhiễm trùng huyết.
Nhiễm khuẩn huyết với hạ huyết áp kéo dài hoặc hoặc tràn
dịch mơ mặc dù chất lỏng hồi sức thích hợp.
Xuất hiện rối loạn chức năng nội tạng tại một bệnh cấp tính
bệnh nhân khơng thể duy trì cân bằng nội mơ khi khơng có

tác động hỗ trợ.

4


Hình 1.1 Mối quan hệ giữa các phản ứng viêm toàn thân và nhiễm trùng,
vùng giao nhau chỉ ra nhiễm khuẩn huyết [16, 56].
Nhiễm khuẩn huyết là một trong những nguyên nhân gây bệnh tật và tử
vong hàng đầu ở các bệnh nhân phải nhập viện trên toàn thế giới. Đây là một
tình trạng bệnh lý do đáp ứng của cơ thể với sự có mặt của vi khuẩn hay các
vi sinh vật gây bệnh khác hoặc độc tố được tạo ra bởi sinh vật gây bệnh lưu
hành trong máu và đi tới khắp các cơ quan trong cơ thể. Nhiễm khuẩn huyết
gây ra các triệu chứng lâm sàng đa dạng, suy đa tạng, sốc nhiễm khuẩn với tỉ
lệ tử vong rất cao (từ 20 – 50%), trong đó sốc nhiễm khuẩn là biểu hiện nặng
của nhiễm khuẩn huyết [15].
Mặc dù tần suất mắc nhiễm khuẩn huyết khác nhau tùy theo quốc gia,
bệnh viện, mùa trong năm, đường vào của vi khuẩn và đối tượng bệnh nhân,
nhưng nhiều nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ NKH chỉ chiếm 3 - 10% bệnh nhân
(BN) nhập viện và có thể tăng tới 75% nếu BN nằm điều trị tại khoa Hồi sức
tích cực (HSTC). Bệnh gây tỷ lệ tử vong cao, dao động 30 - 50% tùy theo
nghiên cứu của các tác giả ở những bệnh viện (BV) khác nhau trên thế giới
[12, 24]. NKH trong các đơn vị chăm sóc đặc biệt là một thách thức lớn đối
với các bác sĩ điều trị [68].
5


Tại Mỹ, một nghiên cứu trong vòng 22 năm từ năm 1979 - 2000 trên
những
BN xuất viện cho thấy, có tổng số 10.319.418 trường hợp được chẩn đoán là
NKH, chiếm 1,3% số BN nhập viện, trong đó các trường hợp mắc mới là

17,3%/năm. Tần suất mắc bệnh trên 100.000 dân cư tăng từ 164.000 ca
(82,7ca/100.000 dân) năm 1979 lên tới 660.000 ca (240,5 ca/100.000 dân)
trong những năm gần đây. Tuy nhiên, ngược lại tỷ lệ tử vong lại giảm từ
28,7% (năm 1979 – 1984) xuống còn 17,9% (năm 1995 – 2000) do những nỗ
lực can thiệp trong chẩn đoán, điều trị đem đến [55]. Một nghiên cứu khác
của Lambiase và tập thể (2011) cho thấy tỷ lệ NKH tiên phát tăng từ
11,6/10000 ca (năm 2000) lên đến 24/10000 ca (năm 2008) và NKH mắc phải
trong quá trình nằm viện tăng từ 22,1/10.000 ca (năm 2000) lên đến
37/10.000 ca (năm 2008) [48].
Tại Anh, nghiên cứu của Harrison và tập thể (2006) trên 92.673 BN
nhập viện cho thấy, tình trạng NKH nặng xuất hiện trong vòng 24 giờ đầu
tăng từ 23,5% (1996) lên đến 28,7% (2004) và tử vong cũng tăng từ 9.000 ca
(48,3%) năm 1996 lên đến 14.000 ca (44,7%) năm 2004 [37].
Nghiên cứu của Jason và tập thể (2011), tại 150 khoa HSTC của 16
nước trong khu vực châu Á, tỷ lệ NKH trên BN nằm tại khoa HSTC tỷ lệ dao
động từ 5 – 53% tùy theo quốc gia [40]. Nghiên cứu của Divatia và tập thể
(2012), ở Ấn độ trên BN nhập vào khoa HSTC cho thấy, tỷ lệ NKH là 26% và
tử vong là 38% [27].
Tại Việt nam, trong báo cáo của Nguyễn Văn Kính và Tập thể (2008),
khi phân tích thực trạng sử dụng kháng sinh tại Việt Nam cho thấy, tỷ lệ NKH
nói chung là 8% [3]. Mới đây, nghiên cứu của Vũ Đình Phú và tập thể (2013)
ở các khoa HSTC của 15 bệnh viện trong toàn quốc cho thấy tỷ lệ NKH
chiếm 10,4% [4].
6


1.1.2. Dấu hiệu của nhiễm khuẩn huyết
 Các dấu hiệu và triệu chứng chung: Sốt cao (đôi khi hạ thân nhiệt), thở
nhanh hoặc nhiễm kiềm hô hấp, tràn dịch, phù nề.
 Dấu hiệu chung về phản ứng gây viêm: Tăng hoặc giảm số lượng tế bào

bạch cầu, tăng dấu hiệu viêm (C-reactive protein, procalcitonin,
interleukin-6).
 Thay đổi huyết áp động mạch: Hạ huyết áp động mạch, nhịp tim nhanh
không rõ nguyên nhân, áp lực mạch máu thấp, tràn dịch dưới da, lượng
nước tiểu giảm.
 Các dấu hiệu của rối loạn chức năng nội tạng: thiếu oxy máu (tổn
thương phổi cấp tính), tình trạng thần kinh bị ảnh hưởng, khơng giải
thích được thay đổi chức năng thận, tăng đường huyết, giảm tiểu cầu
hoặc đông máu nội mạch rải rác, không rõ nguyên nhân thay đổi trong
các thử nghiệm chức năng gan (bilirubin), không dung nạp thức ăn
(thay đổi nhu động ruột) [21]
1.2. Tác nhân vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết thƣờng gặp
Nhiễm khuẩn huyết do vi khuẩn xâm nhập trực tiếp vào máu hoặc từ
các ổ nhiễm khuẩn ở mô và cơ quan như: Da, mô mềm, cơ, xương khớp, hô
hấp, tiêu hóa... Ban đầu, bệnh được mơ tả gắn liền với các vi khuẩn Gram âm.
Nguyên nhân là do nhiễm khuẩn huyết được coi là một phản ứng của cơ thể
với nội độc tố (endotoxin) một phân tử tương đối đặc hiệu cho các vi khuẩn
Gram âm. Tuy nhiên trong giai đoạn 1979-2000, nguyên nhân gây nhiễm
khuẩn huyết do vi khuẩn Gram dương lại chiếm ưu thế [17].
Trong các chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết, Staphylococcus
aureus là chủng Gram dương phổ biến nhất, còn Acinetobacter baumannii,
Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae và Pseudomonas aeruginosa chiếm
ưu thế trong các chủng Gram âm [38].
Tác nhân gây NKH nổi lên hiện nay là vi khuẩn Gram âm và Gram
dương bởi bệnh cảnh lâm sàng thường nặng và hay kèm theo có sốc nhiễm
7


khuẩn. Tử vong ở bệnh nhân có sốc nhiễm khuẩn, có thể lên tới 80%. Hơn
nữa, việc điều trị mầm bệnh là vi khuẩn rất khó khăn do khả năng đề kháng

với kháng sinh cao của chúng [79]. Do đó phương pháp xác định nhanh tác
nhân gây nhiễm khuẩn là hết sức quan trọng. Phương pháp multiplex PCR
hiện nay là phương pháp có khả năng đáp ứng được yêu cầu của thực tế. Vì
vậy chúng tơi tiến hành nghiên cứu phát hiện 5 chủng vi sinh vật gây nhiễm
trùng huyết phổ biến (Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii,
Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae và Pseudomonas aeruginosa) sử
dụng phương pháp multiplex PCR với mong muốn góp phần vào việc phát
hiện sớm nhiễm khuẩn huyết và góp phần điều trị hiệu quả.
1.2.1. Tụ cầu khuẩn Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus là vi khuẩn Gram dương hàng đầu gây nhiều
bệnh khác nhau, từ bệnh nhẹ về da, nhiễm trùng mô mềm tới ảnh hưởng đời
sống bệnh nhân như nhiễm trùng sau phẫu thuật, nhiễm trùng huyết và hội
chứng sốc độc tố. Staphylococcus aureus kháng Methicillin (MRSA) và
Staphylococcus aureus mẫn cảm với Methicillin (MSSA) là nguyên nhân gây
tỷ lệ lớn nhiễm trùng bệnh viện dẫn tới điều trị khó khăn [65].

Hình 1.2. Hình ảnh và cấu trúc gen vi khuẩn Staphylococcus aureus
( /> /> />8


Theo nghiên cứu của Anthony và tập thể (2016), trong số 71 bệnh nhân
được chăm sóc đặc biệt thì số bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết chiếm 49%,
nguyên nhân do Staphylococcus aureus chiếm tỉ lệ cao nhất (18,2%) và 8%
Staphylococcus aureus được phân lập kháng Methicillin [11].
Trong thập kỷ qua, các trường hợp nhiễm MRSA ngày càng gia tăng,
MRSA gây nhiễm khuẩn bệnh viện và nhiễm khuẩn mắc phải từ cộng đồng
bao gồm viêm nội mạc tim, viêm tủy xương, hội chứng sốc nhiễm độc, viêm
phổi, ngộ độc thực phẩm và nhọt độc [39]. MRSA kháng methicillin ở tụ cầu
qua trung gian PBP2a, một loại protein được gọi là protein liên kết penicillin
(78 kDa). Protein này có ái lực thấp với nhóm kháng sinh β-lactam. Gen femA

mã hóa cho protein PBP2a kháng methicillin, do đó gen này được sử dụng
như một marker phân tử phát hiện MRSA [40, 42].
Staphylococcus aureus kháng Methicillin được phát hiện trong một
nghiên cứu của Hassanain và tập thể (2009). Trong nghiên cứu này các tác giả
sử dụng phương pháp nhân bản gen đa mồi. 5 gen được nhân bản bao gồm:
16S rRNA của chi Staphylococcus, MecA của Staphylococcus aureus, gen
MecA mã hóa cho kháng methicillin, gen Luks mã hóa sản xuất của PantonValentine leukocidin (PVL) cytotoxin hoại tử và một gen nội chuẩn để tránh
hiện tượng âm tính giả. Thử nghiệm trên 230 chủng phân lập lâm sàng, cho
thấy phương pháp có độ nhạy 97,6% và độ đặc hiệu lên tới 99,3% [38, 75].
1.2.2. Acinetobacter baumannii
Acinetobacter baumannii là cầu trực khuẩn, gram âm, hiếu khí, khơng
lên men glucose. Nhu cầu sinh trưởng đơn giản và khả năng chống chịu các
điều kiện môi trường rất cao do vậy Acinetobacter baumannii xuất hiện phổ
biến trong môi trường và là một phần của hệ vi khuẩn trong cơ thể người [44].
Trong những nghiên cứu gần đây, chúng ngày càng được chỉ ra là một vi sinh
vật quan trọng trong các loại nhiễm trùng khác nhau ở bệnh viện bao gồm
9


nhiễm trùng do viêm phổi, nhiễm trùng máu, nhiễm trùng đường tiết niệu,
nhiễm trùng vết thương và viêm màng não [45]. Acinetobacter baumannii có
khả năng sống sót trong điều kiện khắc nghiệt cùng với khả năng tiếp nhận và
tích lũy các gen kháng kháng sinh cao cấp dẫn tới sự kháng thuốc hàng loạt
[22, 48].

Hình 1.3. Hình ảnh và cơ chế xâm nhập của vi khuẩn Acinetobacter
baumannii
/> />Nguyễn Thị Thanh Hà đã tiến hành nghiên cứu lâm sàng trên 287 bệnh
nhân NKH do Acinetobacter baumannii và nhận thấy: NKH gặp nhiều ở trẻ
em, tử vong cao (33,1%), lâm sàng thường nặng và diễn tiến nặng gặp ở

người lớn nhiều hơn trẻ em với tỷ lệ tử vong cao hơn (50,8% so với 20,4%),
hôn mê nhiều hơn (26,6% và 13,7%), phải hô hấp hỗ trợ nhiều (40% và
22,1%), tỷ lệ sốc nhiễm khuẩn cao (45,8% và 26,3%), suy đa tạng nhiều hơn
(45,8% và 31,7%), phải sử dụng thủ thuật xâm lấn nhiều hơn và người lớn có
nguy cơ tử vong cao hơn trẻ em [2]. Bằng kỹ thuật sinh học phân tử
Multiplex-PCR đã phát hiện gen OXA trên 62 chủng Acinetobacter
baumannii từ những BN được chẩn đoán NKH: 62 chủng đều mang gen
10


OXA_51 (100%); 36 chủng mang gen OXA_23 rải rác ở cả 6 bệnh viện của 3
miền Bắc, Trung và Nam, 7 chủng mang gen OXA_58 chỉ gặp ở miền Bắc và
Nam. Đặc biệt, các chủng Acinetobacter baumannii mang gen OXA_58
kháng kháng sinh lên đến 100% với nhóm carbapenem, 100% với ceftazidin.
Các chủng mang gen OXA_23 có mức kháng thấp hơn với imipenem
(66,7%), meropenem (55,6%) và kháng rất cao với ceftazidine (91,6%) và
thấp nhất với cefepim (30,5%) [2].
1.2.3. Klebsiella pneumoniae
Klebsiella pneumoniae là vi khuẩn gram âm và là mầm bệnh cơ hội
chiếm tới 10% tỷ lệ nhiễm trùng bệnh viện, là nguyên nhân phổ biến của bệnh
nhiễm trùng đường tiết niệu, nhiễm khuẩn huyết và viêm phổi ở bệnh nhân
suy giảm miễn dịch, đồng thời là tác nhân gây bệnh quan trọng đối với bệnh
nhiễm trùng cộng đồng [49]. Tầm quan trọng của Klebsiella pneumoniae
trong cơ sở y tế đang gia tăng do khả năng kháng kháng sinh phổ rộng βlactamase của chúng. Các nghiên cứu chỉ ra rằng sinh vật kháng kháng sinh
phổ rộng có xu hướng đa kháng thuốc dẫn tới khả năng thất bại trong điều trị.
Do vậy mà chúng ngày càng đóng vai trị quan trọng trong nhiễm trùng bệnh
viện và nhiễm trùng cộng đồng [50].

Hình 1.4. Hình ảnh và tác động của vi khuẩn Klebsiella pneumonia
/>11



Một số phương pháp sinh học phân tử đã được sử dụng cho việc phát
hiện

Klebsiella pneumoniae như phân tích đa hình nhân bản ngẫu nhiên

DNA (RAP-PCR), điện di trường xung đẩy hoặc đa hình khuếch đại các đoạn
dài (AFLP) [51].

Tuy nhiên, các phương pháp này dựa trên các băng điện

di vì vậy kết quả có thể khơng rõ ràng, nhưng nhìn chung các phương pháp
này rất thích hợp để điều tra khu trú dịch tễ học. Tuy nhiên, rất khó để so sánh
kết quả do phịng thí nghiệm khác nhau cơng bố cho thực hiện một phân tích
dịch tễ học trên toàn thế giới. Để khắc phục những hạn chế của các phương
pháp trên, phương pháp xác định trình tự nhiều gen đặc trưng (MLST) đã
được phát triển, đó là một phương pháp giải trình tự nucleotide các đoạn trình
tự điển hình của vi khuẩn hoặc nấm [52]. Phương pháp này dễ dàng được
chuẩn hóa, lưu trữ và trao đổi thơng tin điện tử. Nó được áp dụng thành cơng
cho việc khu trú dịch tễ học của một loạt các vi khuẩn gây bệnh quan trọng ở
mức lâm sàng như Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus,
Enterococcus faecium, Neisseria meningitidis và Campylobacter jejuni. Gần
đây, phương pháp MLST nhằm phát hiện Klebsiella pneumoniae sử dụng 7
gen quản gia bao gồm rpoB, GAPA, MDH, PGI, phoE, infB, và tonB đã được
phát triển [53].
1.2.4. Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa là trực khuẩn, Gram âm được tìm thấy phổ
biến trong môi trường tự nhiên, con người và động vật. Chúng sinh trưởng
mạnh trong điều kiện ẩm ướt và có thể sử dụng một loạt các hợp chất hữu cơ.

Pseudomonas aeruginosa gây nhiễm trùng nghiêm trọng dẫn tới tỷ lệ tử vong
cao ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch và là một trong các nguyên nhân gây
nhiễm trùng bệnh viện [54, 55].

12


Hình 1.5. Hình ảnh và tác động của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa
/>Pseudomonas aeruginosa là sinh vật phổ biến nhất được phân lập từ
phổi của 80% bệnh nhân trưởng thành với chứng xơ nang phổi. Sự có mặt của
chủng vi sinh vật này tương quan với sự suy giảm chức năng phổi và các triệu
chứng lâm sàng của bệnh nhân. Tại bệnh viện, các loại thiết bị y tế hoặc dụng
cụ có liên quan đóng vai trị như một nguồn cung cấp Pseudomonas
aeruginosa và những nguồn này trở thành tiêu điểm cho việc bùng phát lây
lan vi sinh vật [16].
Kích thước hệ gen của Pseudomonas aeruginosa khoảng từ 5,2 - 7,1
Mbp. Mức độ dao động kích thước có ý nghĩa quan trọng đối với các phương
pháp được sử dụng để nghiên cứu sự tiến hóa và dịch tễ học của vi sinh vật
này. Nghiên cứu gần đây cho thấy rằng hơn 80% trình tự hệ gen của các
chủng (chủng PAO1) được công bố (chỉ với 0,5% nucleotide bị phân tán).
Trong khi đó, hiện nay hàng loạt các phương pháp di truyền phân tử được sử
dụng để nghiên cứu dịch tễ học và phân tích di truyền quần thể. Lomholt và
tập thể (2001), Pirnay và tập thể (2002) sử dụng kỹ thuật giải trình tự của
gen mã lipoprotein màng ngồi kết hợp với huyết thanh đặc trưng và
pyoverdine để nghiên cứu di truyền khảm nhiễm thể mở rộng, đặc biệt là ở
gen oprD [53, 66].

13



1.2.5. Escherichia coli
Escherichia coli là vi khuẩn phổ biến nhất gây nhiễm trùng bệnh viện
và chúng được tìm thấy với tần suất cao ở nhiễm trùng đường hô hấp và
nhiễm trùng đường tiết niệu. Cả hai chủng Escherichia coli và Pseudomonas
aeruginosa đều là các tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện nghiêm trọng ở
các đơn vị chăm sóc y tế đặc biệt và gây ra nhiễm khuẩn y tế và nhiễm khuẩn
cộng đồng [57].

Hình 1.6. Hình ảnh và phân loại vi khuẩn Escherichia coli
/> />Escherichia coli là vi khuẩn Gram âm, thường có liên quan nhiều đến
nhiễm khuẩn bệnh viện và phổ biến trên bệnh nhân nhiễm trùng phổi. Họ vi
khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae) thường cư trú trên đường tiêu hoá của
người và động vật, đang là mối quan tâm lớn trong nhiễm khuẩn bệnh viện do
có khả năng kháng cao với các nhóm kháng sinh amiglycoside, β-lactamase
và có khả năng truyền tính kháng qua plasmid. Nhiều nghiên cứu trong nước
và quốc tế đã kh ng định, Escherichia coli gây nhiễm trùng chủ yếu trên
đường tiết niệu, sinh dục của phụ nữ và nhiễm trùng vết mổ [59].

14


1.3. Các phƣơng pháp chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết
1.3.1. Chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết bằng phƣơng pháp cấy máu
Phương pháp được dựa trên cơ sở một mẫu máu được nuôi cấy trong
mơi trường giàu dinh dưỡng sau đó được nhận diện và kiểm tra các tác nhân
gây bệnh bằng cách sử dụng xét nghiệm sinh hóa tiêu chuẩn. Phương pháp cấy
máu được thực hiện với các thiết bị tự động phát hiện sự tăng trưởng của vi
sinh vật bằng cách phân tích sự giải phóng CO2 bởi huỳnh quang hoặc cảm
biến hoặc cách khác là thay đổi áp suất trong bình ni cấy do sự tiêu thụ và
sản xuất khí này dùng để chỉ thị sự phát triển của vi sinh vật [30]. Mặc dù có

những ưu điểm nhất định nhưng thời gian thực hiện của phương pháp là quá
dài dẫn tới khó khăn để đưa ra quyết định điều trị nhanh chóng trong những
trường hợp cần thiết [60]. Trong khi đó độ nhạy của phương pháp cịn bị ảnh
hưởng bởi khoảng thời gian từ lấy máu đến nạp vào bình ni cấy [30, 61];
mầm bệnh dễ bị suy yếu trong thời gian chờ kết quả. Hơn nữa để có kết quả,
cần thêm một thời gian phát triển của sinh vật gây bệnh khoảng 24 đến 72 giờ
và việc nhuộm Gram cần thêm thời gian ủ qua đêm để thu được khuẩn lạc
riêng rẽ cho xét nghiệm. Hơn nữa, kết quả âm tính chỉ có thể được kết luận
sau 5-7 ngày. Ngoài ra, hiệu ứng ức chế của các loại thuốc kháng sinh hoặc
mầm bệnh khó ni cấy cũng làm hạn chế độ nhạy của phương pháp [62].
1.3.2. Lai huỳnh quang tại chỗ
Lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) là một trong những phương pháp được
nghiên cứu nhiều nhất trong các kỹ thuật thương mại. Phương pháp này phù
hợp cho việc phát hiện tác nhân gây bệnh trong nuôi cấy máu dương tính.
Trong khoảng 2,5- 3 giờ, FISH có thể xác định hơn 95% vi khuẩn và nấm
men thường được tìm thấy trong máu [63, 64]. Kết quả cấy máu dương tính
được chuẩn bị, lai với mẫu dị oligonucleotide gắn huỳnh quang hướng tới
đích là rRNA và quan sát bằng kính hiển vi [64]. Tuy nhiên phương pháp này
15