HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

PHÙNG MINH TUẤN

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG BIỂU HIỆN HNF - 4α
TRONG TẾ BÀO GỐC CUỐNG RỐN NGƯỜI

Chuyên ngành:

Công nghệ sinh học

Mã số:

60 42 02 01

Người hướng dẫn khoa học:

1. TS. Nguyễn Văn Hạnh
2. TS. Nguyễn Hữu Đức

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả
nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa
từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được
cám ơn, các thơng tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày 9 tháng 5 năm 2017

Tác giả luận văn

Phùng Minh Tuấn

i


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hồn thành luận văn, tơi đã
nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cơ giáo, sự giúp đỡ,
động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình.
Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc TS.
Nguyễn Văn Hạnh – Quyền trưởng phịng Cơng nghệ phơi – Viện Công nghệ sinh học –
Viện Hàn lâm Khoa học và cơng nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công
sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.

Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý
đào tạo, Bộ môn Công nghệ sinh học Động vật, Khoa Công nghệ sinh học Học viện Nơng nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tơi trong q trình học
tập, thực hiện đề tài và hồn thành luận văn.
Tơi xin bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc TS.Nguyễn Hữu Đức –
Trưởng bộ môn Công nghệ sinh học Động vật – Khoa Công nghệ sinh học –
Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã ln theo sát, hướng dẫn và tận tình giúp
đỡ tơi trong cuộc sống cũng như q trình thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn anh Đỗ Trung Kiên, em Nguyễn Thị Nga và
các anh chị cán bộ phịng Cơng nghệ phơi, viện Cơng nghệ sinh học đã giúp
đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Xin cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí nghiên cứu từ đề tài: “Nghiên cứu biệt hóa
tế bào chức năng gan từ tế bào gốc người và chuột”, Mã số: VAST.ĐL.03/16-17,
đề tài trọng điểm cấp viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện

thuận lợi và giúp đỡ tơi về mọi mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận văn.

Hà Nội, ngày 9 tháng 5 năm 2017

Tác giả luận văn

Phùng Minh Tuấn

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN................................................................................................................................... I
LỜI CẢM ƠN........................................................................................................................................ II
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.......................................................................................................... V
DANH MỤC HÌNH ẢNH.................................................................................................................. VI
DANH MỤC BẢNG BIỂU............................................................................................................. VII
TRÍCH YẾU LUẬN VĂN............................................................................................................. VIII
THESIS ABSTRACT........................................................................................................................ IX
PHẦN 1. MỞ ĐẦU............................................................................................................................... 1
1.1.

TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI...................................................................................... 1

1.2.

MỤC ĐÍCH, YÊU CẦU....................................................................................................... 2

1.2.1.


Mục đích.................................................................................................................................. 2

1.2.2.

Yêu cầu.................................................................................................................................... 2

PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................................................. 3
2.1.

TẾ BÀO GỐC........................................................................................................................ 3

2.1.1.

Định nghĩa tế bào gốc...................................................................................................... 3

2.1.2.

Phân loại, đặc tính của tế bào gốc............................................................................ 4

2.1.3.

Ứng dụng của tế bào gốc.............................................................................................. 7

2.2.

TẾ BÀO GỐC CUỐNG RỐN........................................................................................ 11

2.2.1.

Cấu tạo, chức năng của dây rốn.............................................................................. 11


2.2.2.

Tế bào gốc dây rốn.......................................................................................................... 12

2.2.3.

Nghiên cứu về các phương pháp phân lập và nuôi hWJSCs..................15

2.3.

NGHIÊN CƯÚ VỀ BIỆT HÓA HWJSCS................................................................... 16

2.4.

GEN HNF - 4Α..................................................................................................................... 18

2.4.1.

Đặc điểm gen HNF - 4α.................................................................................................. 18

2.4.2.

Nghiên cứu về biểu hiện gen HNF - 4α trong q trình biệt hóa tế bào gốc.19

PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................ 22
3.1.

ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU.............................................................. 22


3.2.

NGUYÊN VẬT LIỆU......................................................................................................... 22

iii


3.2.1.

Mẫu xét nghiệm................................................................................................................. 22

3.2.2.

Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất........................................................................ 22

3.3.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................................................. 24

3.3.1.

Thu nhận và xử lí dây cuống rốn............................................................................. 24

3.3.2.

Phân lập tế bào gốc trung mô cuống rốn........................................................... 25

3.3.4.

Phương pháp Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction (RT – PCR)

29

3.3.5. Điện di trên gel agarose................................................................................................ 32
3.3.6. Phân lập gen HNF - 4α................................................................................................... 33
3.3.7. Phương pháp tách gel sử dụng kit Gene Jet gel extraction kit..............34
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN....................................................................................... 35
4.1.

PHÂN LẬP VÀ NHÂN NUÔI TẾ BÀO...................................................................... 35

4.1.1.

Phân lập tế bào.................................................................................................................. 35

4.1.2.

Cấy chuyển tế bào........................................................................................................... 38

4.1.3.

Đông lạnh tế bào............................................................................................................... 39

4.2.

ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH TẾ BÀO GỐC CUỐNG RỐN......................................... 41

4.2.1.

Đánh giá tính ổn định di truyền của TBGTM..................................................... 41


4.2.2.

Tách chiết RNA tổng số................................................................................................ 43

4.2.3.

Định lượng RNA tổng số.............................................................................................. 43

4.2.4.

Đánh giá đặc tính TBGTM và biểu hiện gen HNF – 4a trước khi biệt hóa
44

4.2.5.

Đánh giá biểu hiện gen HNF - 4α sau khi xử lý biệt hóa............................. 47

4.3.

PHÂN LÂP̣ GEN HNF - 4Α............................................................................................ 49

4.3.1.

Khuếch đại trình tự mã hóa của gen HNF - 4α................................................. 49

4.3.2.

Tinh sạch đoạn DNA sau khi khuếch đại............................................................. 50

PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ........................................................................................ 53

5.1.

KẾT LUẬN............................................................................................................................ 53

5.2.

KIẾN NGHỊ........................................................................................................................... 53

iv


Chữ viết tắt
HNF - 4α

MSC
iPS cell
ES
EG
DNA
RNA
cDNA
Bp
Kb
bFGF
CHT
CT
DMEM/F12
dNTP
EGF
FBS

HSC
hWJSCs
ICM
IVF
ITS
ICSI
TBGTM
RT – PCR
TBG
WJ
E.coli
Taq
UV
CDS
TAE

v


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 2.1. Chức năng của tế bào gốc...................................................................................... 3
Hình 2.2. Cấy ghép tế bào gốc tự thân (bên trái), cấy ghép đồng loại (bên phải)
8

Hình 2.3. Sử dụng iPS cell trong thử nghiệm thuốc.................................................... 10
Hình 2.4. Cấu tạo của dây rốn.................................................................................................. 12
Hình 3.1. Mẫu dây rốn trước khi xử lý................................................................................. 25
Hình 3.2. Sử dụng dao và panh để chọn lọc phần mơ cần sử dụng.................. 26
Hình 3.3. Mẫu dây rốn trước khi xử lý................................................................................. 26
o


Hình 3.4. Tủ ni cấy tế bào 37 C, 5% CO2...................................................................... 27
Hình 3.5. Quy trình tách RNA tổng số bằng kit RNeasy Mini Kit (QUIAGEN) 28
Hình 3.6. Nguyên lý RT-PCR..................................................................................................... 30
Hình 4.1. Tế bào bắt đầu mọc ra từ rìa mảnh mơ.......................................................... 35
Hình 4.2. Tế bào trước khi cấy chuyển (trái) và ở lần cấy chuyển thứ 4 (phải)
36

Hình 4.3. Tế bào phát triển thành những mảng song song, cuộn xoắn và gối
lên nhau.......................................................................................................................... 37
Hình 4.4. Tế bào mọc kín đĩa ni......................................................................................... 38
0

Hình 4.5. Tế bào sau khi được ủ với trypsin 0.25% trong 5 phút ở 37 C.........39
Hình 4.6. Tế bào soi trên kính hiển vi sau khi nhuộm Trypan Blue..................... 40
Hình 4.7. Nhiễm sắc thể (NST) ở lần cấy chuyển thứ 2............................................. 42
Hình 4.8. Điện di đồ tách chiết RNA tổng số.................................................................... 43
Hình 4.9. Điện di đồ RT – PCR mẫu TBGTM sau phân lập....................................... 46
Hình 4.10. Điện di đồ RT-PCR mẫu ni cấy 4 tuần sau xử lý biệt hóa .............47
Hình 4.11. Điện di đồ PCR khuếch đại CDS của gen HNF - 4α................................ 50
Hình 4.12. Kết quả kiểm tra đối chiếu trình tự gen từ genbank ............................. 52

vi


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 3.1. Trang thiết bị và dụng cụ........................................................................................ 23
Bảng 3.2. Hóa chất thí nghiệm.................................................................................................. 23
Bảng 3.3. Thành phần phản ứng PCR................................................................................... 31
Bảng 3.4. Trình tự các cặp mồi sử dụng đánh giá chỉ thị TBGTM .........................32

Bảng 3.5. Thành phần phản ứng PCR khuếch đại CDS gen HNF - 4α................33
Bảng 4.1. Kết quả đo mật độ quang (OD) của các mẫu RNA tách chiết.............44
Bảng 4.2. Trình tự oligonucleotide các mồi được sử dụng...................................... 45
Bảng 4.3. Thống kê biểu hiện của các chỉ thị phân tử trong tế bào gốc ...........46
Bảng 4.4. Trình tự được đọc bằng mồi vector (PacI–HNF-4α và PacI–HNF-4α)
..................................................................................................................................................................... 51

vii


TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
Tế bào gốc (TBG) là tế bào tiềm năng trong cơ thể. Khả năng biệt hóa cho
phép TBG có thể phân chia phát triển thành tất cả các loại tế bào chuyên hóa.
TBG dây rốn cũng có đầy đủ tính chất của một TBG đa năng như TBG tủy xương
(TBG tủy xương thuộc loại TBG trưởng thành) (Phan Kim Ngọc, 2009). Gần đây, một số
nghiên cứu biệt hóa các tế bào gốc cuống rốn thành tế bào gan đã mở ra hy vọng cho
hàng trăm triệu bệnh nhân viêm gan và ung thư gan (Cai et al, 2007; Cantz et al, 2008).
Tuy nhiên, cho đến nay, cơ chế chính xác của q trình biệt hóa từ TBG cuống rốn
thành tế bào gan vẫn cần phải được làm rõ hơn. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài
“Đánh giá khả năng biểu hiện HNF - 4α trong tế bào gốc cuống rốn người” để phục vụ
cho các nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc cuống rốn thành tế bào gan theo định hướng
vừa là yếu tố chỉ thị biệt hóa vừa là tác nhân gây biệt hóa.
Trong đề tài này, chúng tôi đã sử dụng một số phương pháp nghiên cứu sau: Phương
pháp phân lập tế bào (Được áp dụng theo A.Petsa (2009)), phương pháp tách RNA tổng số
(Kit RNeasy Mini Kit (QUIAGEN)), phương pháp Reverse Transcription – Polymerase Chain
Reaction (RT – PCR) (thực hiện theo Kary Mullis (1985)), phương pháp tách gel (Kit Gene Jet
gel extraction), phương pháp tách plasmid (Kit Gene Jet plasmid miniprep), phương pháp
điện di trên gel agarose (Thực hiện theo Kirkpatrick (1990)).

Sau thời gian thực hiện đề tài, chúng tôi đã thu được kết quả: nghiên cứu đã phân

lập được tế bào gốc cuống rốn có đặc trưng của tế bào gốc trung mơ như: dương tính
CD90, CD73, CD105, âm tính với các chỉ thị đặc trưng cho tế bào gan là: ALB, HNF - 4α,
G6P. Kết quả nghiên cứu cho thấy biểu hiện của gen HNF - 4α âm tính ở tế bào gốc
cuống rốn trước xử lý biệt hóa. Sau xử lý biệt hóa với DMSO, chỉ thị gen HNF - 4α đã
biểu hiện sau 4 tuần nuôi cấy. Nghiên cứu đã phân lập thành công gen HNF - 4α với
mức độ tương thích 100% với trình tự gen được kiểm tra trên genbank.

viii


THESIS ABSTRACT
Stem cells are the potential cells in the body. The cell's ability to
differentiate into other specialized cell types.
The umbilical cord stem cells are capable of having all characteristics of pluripotent
stem cells such as bone marrow stem cells (Phan Kim Ngoc, 2009). Recently a series of
studies have demonstrated to differentiate the umbilical cord stem cells into liver cells,
giving hope for the hundreds of millions of patients with hepatitis and liver cancer (Cai
et al., 2007; Cantz et al., 2008). However, the exact mechanism of the differentiation from
umbilical cord blood stem cells into hepatocytes still need to be clarified. We conducted
a study on the topic of "Evaluating the ability of expression HNF - 4α in the umbilical
cord stem cells" to serve the study of differentiation from the umbilical cord stem cells
into hepatocytes oriented as both an indicator and differentiation.

In this thesis, we have used the following research methods: Cellular
isolation (Applied by A.Petsa (2009)), total RNA extraction (Kit RNeasy Mini
Kit (QUIAGEN)), The Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction (RTPCR) method (Kary Mullis, 1985), Kit Gene Jet Gel Extraction, Gene Gene Jet
Plasmid Miniprep, Agarose gel electrophoresis (Follow Kirkpatrick (1990)).
After the implementation of the project, we have obtained the following results:
Research has isolated cord stem cells with characterized mesenchymal stem cells
such as positive with the CD90, CD73, CD105 markers, negative with specific

indicators for hepatocellular carcinoma are: ALB, HNF - 4α, G6P. Results show that
the expression of the HNF-4α gene is negative in cord blood stem cells prior to
differentiation. After DMSO treatment and 4 weeks of culture, the HNF-4α gene
expression was demonstrated. The study successfully isolated the gene HNF - 4α
with 100% compatibility with the gene sequence tested on Genbank.

ix


PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Tế bào gốc (TBG) là tế bào tiềm năng trong cơ thể. Khả năng biệt hóa
cho phép TBG có thể phân chia phát triển thành tất cả các loại tế bào chuyên
hóa. Với đặc điểm này, TBG có thể được khai thác với nhiều ứng dụng.
Nhiều nghiên cứu ứng dụng TBG trong lĩnh vực y sinh học đã được thực hiện nhằm
điều trị các bệnh nan y khác nhau như: tiểu đường, liệt do chấn thương tuỷ sống, suy tim do
tổn thương cơ tim, một số bệnh ung thư và bệnh lý gen…. Đặc biệt,

trong chuyên khoa huyết học, TBG có thể điều trị trên 70 loại bệnh lý huyết
học khác nhau liên quan đến tổn thương cơ quan tạo máu, một số bệnh di
truyền bẩm sinh về chuyển hoá và suy giảm miễn dịch, ung thư máu…TBG
còn được sử dụng trong các chuyên ngành khác như: thẩm mỹ, trong
nghiên cứu dược lý. Nói cách khác, TBG mở ra một hướng phát triển, biện
pháp chữa trị mới với những căn bệnh đến giờ vẫn vô phương cứu chữa,
thắp sáng hy vọng về tiềm năng y học của kỹ thuật tái sinh.
Trước đây, nguồn TBG sử dụng cho các nghiên cứu chủ yếu là TBG phơi.
Nhưng vì phải lấy các TBG này từ phôi cho nên phần lớn các Giáo hội công giáo và
chính trị gia đã phản đối gay gắt vì cho rằng đây là vấn đề xâm phạm đến đạo đức,
niềm tin tơn giáo (Bongso et al, 2013). Để tìm hướng giải quyết mới cho vấn đề này,
các nhà khoa học đã tìm ra TBG từ nhiều nguồn khác nhau, trong đó có TBG từ

người trưởng thành. TBG trưởng thành là TBG đa năng, có khả năng biệt hóa thành
nhiều dòng tế bào khác nhau. Tuy nhiên, việc thu thập TBG gặp phải khó khăn khi
lượng tế bào thu được rất ít, có thể ảnh hưởng đến sức khỏe, tế bào ít tiềm năng và
khó biệt hóa. Người ta cũng đã tìm thấy một loại TBG đa năng trong dây rốn của trẻ
sơ sinh (TBG nhũ nhi), đây được cho là một phát hiện quan trọng vì có thể thu thập
TBG từ dây rốn - vốn được coi là một loại rác thải y tế (Romanow et al, 2003).
TBG dây rốn cũng có đầy đủ tính chất của một TBG đa năng như TBG tủy
xương (TBG tủy xương thuộc loại TBG trưởng thành) (Phan Kim Ngọc, 2009). Hiệu
quả ứng dụng trong lâm sàng cao hơn vì việc thu thập TBG dây rốn khá dễ dàng, an
tồn, khơng ảnh hưởng đến sức khỏe của mẹ và con, có thể chủ động kiểm

1


sốt tình trạng nhiễm các bệnh truyền nhiễm như HIV, viêm gan B, viêm gan C
qua việc xét nghiệm trước sinh đối với sản phụ. Bên cạnh đó, tế bào gốc có khả
năng biệt hóa và khả năng tự làm mới. Biệt hóa là khả năng tạo ra các tế bào
chuyên hóa trong cơ thể trong khi tự làm mới là q trình duy trì tính gốc khơng
đổi qua các thế hệ tế bào (Tuch, 2006). Nhờ đó, biệt hóa tế bào gốc thành các
dạng tế bào chuyên hóa khác đang là hướng nghiên cứu có tiềm năng ứng
dụng cao. Gần đây, một số nghiên cứu biệt hóa các tế bào gốc cuống rốn thành
tế bào gan đã mở ra hy vọng cho hàng trăm triệu bệnh nhân viêm gan và ung
thư gan (Cai et al, 2007; Cantz et al, 2008). Tuy nhiên, cho đến nay, cơ chế chính
xác của q trình biệt hóa từ TBG cuống rốn thành tế bào gan vẫn cần phải
được làm rõ hơn. Bên cạnh những tác nhân mơi trường trong các mơi trường
biệt hóa tế bào gốc như dexamethasone hay yếu tố sinh trưởng như FGF
(fibroblast growth factor), một số yếu tố phiên mã, ví dụ như gen HNF-4α, cũng
đang được tập trung nghiên cứu. Từ đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài
“Đánh giá khả năng biểu hiện HNF - 4α trong tế bào gốc cuống rốn người” để
phục vụ cho các nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc cuống rốn thành tế bào gan

theo định hướng vừa là yếu tố chỉ thị biệt hóa vừa là tác nhân gây biệt hóa.

1.2. MỤC ĐÍCH, U CẦU
1.2.1. Mục đích
Đánh giá được khả năng biểu hiện của gen HNF - 4α trong tế bào
gốc người trước và sau khi biệt hóa.
Phân lập được gen HNF - 4α phục vụ cho các nghiên cứu sau này
dùng làm tác nhân biệt hóa.
1.2.2. Yêu cầu
- Phân lập nhân nuôi ổn định được tế bào gốc cuống rốn người.
Đánh giá biểu hiện của gen HNF - 4α ở tế bào gốc cuống rốn
người trước và sau khi xử lý biệt hóa.
- Phân lập được gen HNF - 4α.

2


PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. TẾ BÀO GỐC
2.1.1. Định nghĩa tế bào gốc
Tế bào gốc là những tế bào khơng (hoặc chưa) chun hóa trong
mơ sống, chúng có khả năng trở thành các tế bào chuyên hóa với các
chức phận sinh lí. Trong điều kiện in vivo hoặc in vitro, mỗi tế bào gốc
có thể tự làm mới với các tính năng riêng biệt (Phan Kim Ngọc, 2009;
Ariff et al, 2005). Các tế bào gốc này có thể biệt hóa được thành các tế
bào chuyên dụng khác nhau, hoặc thành cả 1 cơ thể hồn thiện.

Hình 2.1. Chức năng của tế bào gốc
Nguồn: />
Ngày nay, tế bào gốc được tách và thu nhận từ rất nhiều nguồn (phôi thai

giai đoạn tiền làm tổ, thai, cơ thể trưởng thành, sinh phẩm phụ sản). Dưới các
điều kiện hiện tại, những tế bào gốc chưa biệt hóa có thể vạn năng (có khả năng
biệt hóa thành các tế bào từ ba lá phơi), hay đa năng (chỉ có khả năng biệt hóa
thành một số có giới hạn nhất định các tế bào chuyên hóa).

3


2.1.2. Phân loại, đặc tính của tế bào gốc
2.1.2.1. Đặc tính của tế bào gốc
Một tế bào được gọi là tế bào gốc cần có hai đặc tính quan trọng
sau: khả năng biệt hóa, và sự tự làm mới (Phan Kim Ngọc, 2009;
Gerald et al, 2003; Nair et al, 2007).
a) Khả năng biệt hóa
Tế bào gốc là tế bào chưa chun hóa, vì vậy, nó có khả năng biệt hóa thành

các tế bào chức năng chuyên biệt. Thu nhận tế bào gốc ở những giai đoạn
khác nhau, tại nơi thu nhận khác nhau…mà khả năng này thay đổi. Tiềm
năng biệt hóa của chúng có thể là vạn năng, đa năng, hay là vài tiềm năng.

Các tế bào gốc phôi giai đoạn phơi sớm có khả năng biệt hóa thành
bất kì một loại tế bào nào của ba lá phôi (ngoại bì, trung bì, và nội bì),
thậm chí là cả một cơ thể hoàn chỉnh được gọi là tế bào vạn năng.
Các tế bào thu ở gian đoạn phơi nang có khả năng biệt hóa thành hầu hết
các tế bào chức năng của cơ thể, tuy nhiên nó khơng thể hình thành nên cả một
cơ thể hoàn chỉnh. Các tế bào này cịn được gọi là tế bào đa tiềm năng.
Ngồi ra, các tế bào gốc thu nhận tại các cơ quan chuyên hóa của cơ thể
trưởng thành chỉ có khả năng biệt hóa thành một số loại tế bào khác nhau. Tiềm
năng biệt hóa của chúng rất thấp. Tuy nhiên chúng cũng có những lợi ích riêng mà
ở các tế bào khác khơng có, chúng được biết đến là các tế bào vài tiềm năng.


Để xác định tính vạn năng của một tế bào gốc, người ta có thể sử dụng các
phương pháp như: sử dụng marker phân tử, kiểm tra tính vạn năng in vitro. Để
kiểm tra tính vạn năng in vitro, chúng ta phải thực hiện ba thí nghiệm sau:
-

Tiến hành tiêm các tế bào gốc cần kiểm tra vào khoang phơi, giai đoạn phơi

nang của một lồi/giống khác. Nếu là tế bào gốc vạn năng, chúng sẽ sát nhập với
các tế bào ICM của phôi nhận thành một khối và từ đó giữa chúng sẽ có sự “phân
cơng” biệt hóa cho nhau. Kết quả là những tế bào tiêm vào sẽ tham gia vào việc
hình thành các cơ quan, bộ phận của cơ thể sinh ra, gọi là sự khảm và cơ thể có sự
khảm này gọi là thể khảm. Đây là thí nghiệm cho thấy rõ tính vạn năng của các tế
bào gốc. Tuy nhiên, phương pháp này không được phép sử dụng ở người.

4


-

Thí nghiệm thứ hai là tiến hành tiêm các tế bào gốc ứng viên vạn năng

vào tinh hoàn, dưới da, hay vỏ thận của động vật khiếm khuyết miễn dịch.
Nếu có tính vạn năng, sau khi tiêm sẽ hình thành các khối u quái chứa các
mô khác nhau xuất phát từ cả ba lá phôi, nhưng bị sắp xếp rất rối loạn.
-

Thí nghiệm thứ ba là các tế bào gốc có khả năng biệt hóa in vitro. Sự

biệt hóa tự phát sẽ xảy ra khi nuôi trong môi trường không có lớp feeder,

hay nhân tố ức chế bệnh bạch cầu (LIF). Chúng sẽ hình thành những lùm tế
bào chứa đầy dịch gọi là thể phôi. Nếu các thể phôi bán vào đĩa ni, chúng
sẽ biệt hóa thành nhiều kiểu mơ và các khối u (Phan Kim Ngọc, 2009).

b) Sự tự làm mới
Sự tự làm mới có thể được định nghĩa là quá trình tạo ra những bản sao các tế

bào gốc, thơng qua q trình ngun phân.
Trong tính tự làm mới, sự phân chia tế bào đối xứng có thể tạo ra hai tế bào
gốc, sự phân chia không đối xứng có thể tạo một tế bào gốc, hoặc là một tế bào
gốc, hay một tế bào gốc với khả năng biệt hóa có giới hạn (Phan Kim Ngọc, 2009).
Hai hoạt động chủ yếu của chu kì tế bào là: tổng hợp DNA để nhân đôi nhiễm sắc
thể trong pha S và sự phân chia tế bào trong pha M. Pha G 1 (xảy ra trước pha S và sau
pha M) có nhiệm vụ chuẩn bị các vật liệu cho q trình nhân đơi DNA cịn pha G 2 (xảy ra
sau pha S) tổng hợp vật liệu cho quá trình phân chia tế bào. Pha M là pha diễn ra 2 quá
trình quan trọng: nguyên phân (mitosis) và phân bào (cytokinesis).

Nhưng không phải tế bào nào cũng trải qua chu trình như vậy mà vài tế
bào dừng lại pha G0, tồn tại ở trạng thái nghỉ hay im lặng (trạng thái khơng phân
chia) và đi vào q trình biệt hóa. Các tế bào này cũng có thể tiếp tục phân chia
khi nhận được các tín hiệu ngoại bào kích hoạt quá trình phát triển.

2.1.2.2. Phân loại tế bào gốc
Sau khi các kết quả các cơng trình của Shinya Yamanaka (Đại học
Kyoto Nhật Bản) và James Thompson (Đại học Jinconsin của Mỹ) được
cơng bố chính thức, cũng như thuyết tế bào ung thư được nhiều người
nghiên cứu thẩm định, tế bào gốc được chia thành năm nhóm chính:

Tế bào gốc phơi (ESC - Embryonic stem cell) (thu nhận từ phôi
thai, giai đoạn tiền làm tổ).


5


Tế bào gốc nhũ nhi (thu nhận từ thai, mô cuống rốn, máu cuống
rốn, nhau thai, dịch ối, màng lót dây rốn).
- Tế bào gốc trưởng thành (thu nhận từ cơ thể trưởng thành).
-

Tế bào gốc vạn năng cảm ứng (iPSC – TBG vạn năng cảm ứng) (được tạo

ra từ thao tác in vitro trên chính bộ gene đã biệt hóa chức năng của chúng).

Tế bào gốc ung thư (CSC – Cancer stem cell) (chỉ có trong khối
u, và là nguồn gốc của khối u) (Phan Kim Ngọc, 2009).
Ngoài ra, dựa vào các chỉ tiêu khác nhau như: khả năng biệt hóa
của tế bào gốc, nơi thu nhận tế bào gốc, kiểu tế bào biệt hóa, ta có thể
chia các tế bào gốc thành các nhóm tế bào khác nhau.
Dựa vào khả năng biệt hóa: tế bào tồn năng, tế bào vạn năng, tế
bào đa năng, tế bào vài tiềm năng….
Dựa vào vị trí thu nhận: tế bào gốc phơi, tế bào mầm, tế bào gốc
ung thư biểu mô phôi, tế bào gốc trưởng thành.
- Dựa vào kiểu tế bào biệt hóa: tế bào gốc cơ tim, tế bào gốc
xương.

2.1.2.3. Các marker bề mặt của tế bào gốc
Nghiên cứu nhận diện tế bào gốc bằng cách xác định chức năng của chúng và
nhận diện thông qua các marker của tế bào. Việc nghiên cứu để xác định các kháng
nguyên bề mặt là rất cần thiết. Có nhiều marker bề mặt biểu hiện đặc trưng cho các
dòng tế bào gốc khác nhau, có thể ví dụ mội số marker đặc trưng như sau:


CD14: Kháng nguyên tế bào bạch cầu đơn nhân. Các tế bào gốc
trung mơ biểu hiện âm tính (Phan Kim Ngọc, 2009).
-

CD34: Là marker đầu tiên được dùng để nhận diện các tế bào tạo máu

người và là marker được sử dụng phổ biến cho việc thu nhận quần thể tế bào
tiền thân nội mô, tế bào tiền thân tạo máu, tế bào nội mơ trưởng thành. Ngồi ra
CD34 cịn biểu hiện dương tính ở dịng tế bào tiền thân lympho, tế bào tiền thân
dòng tủy, tiền thân đại thực bào, bạch cầu hạt, tiền thân hồng cầu (Phan Kim
Ngọc, 2009). Đối với tế bào gốc trung mô, CD34 biểu hiện âm tính.
-

CD45: Một tyrosine phosphatase A được biết là marker HSC của các tế bào

tiền thân dòng tủy và âm tính trong các tế bào gốc trung mơ thu được từ cuống rốn

6


người. Sử dụng kháng nguyên CD45 để loại trừ tế bào gốc máu trong
quần thể tế bào gốc trung mô thu nhận từ cuống rốn người và như vậy
có thể phân lập được quần thể tế bào (Karen et al, 2008).
CD90 biểu hiện dương tính với các tế bào gốc trung mô thu được
từ cuống rốn.
-

CD73: Được gọi là ecto - 5' - nucleotidase là enzyme bề mặt tế bào


liên kết glycosyl-phosphatidylinositol (GPI) được tìm thấy trong hầu hết
các mơ. CD73, được định nghĩa như là một kháng nguyên phân biệt
lymphocyte, có chức năng như là một phân tử đồng tín hiệu trên các tế
bào lympho T và là một phân tử kết dính quan trọng cho sự liên kết
lymphocyte với nội mô (Bin Zhang (2010). Marker CD73 là marker bề mặt
cho kết quả dương tính với các tế bào gốc trung mô (Teresa et al, 2016).
-

CD105: Endoglin (CD105), một glycoprotein màng tế bào biểu hiện chủ yếu

trên các dòng tế bào trong hệ thống mạch máu, và biểu hiện quá nhiều trên các tế
bào màng nội mạc tử cung, có liên quan đến sự phát triển của mạch máu và là dấu
hiệu mạnh mẽ của việc hình thành vi mạch. CD105 bám vào một vài factor trong
nhân tố tăng trưởng chuyển hóa (TGF-Transforming Growth Factor-beta), điều
chỉnh các chức năng tế bào khác nhau bao gồm sự tăng sinh, phân biệt và di
chuyển. Trong các khối u ác tính ở người có các biểu hiện khác nhau, CD105 được
biểu hiện rất mạnh trên các tế bào nội mạc của cả mạch máu ở trong và ngồi tử
cung, trong khi nó được biểu hiện yếu hoặc khơng có trong tế bào ung thư
(Fonsatti et al, 2003). Sử dụng kết hợp các marker kháng thể bề mặt đơn dòng liên
hợp ta sẽ nhận diện đươc nhóm tế bào gốc trung mơ theo Bin Zhang (2010).

2.1.3. Ứng dụng của tế bào gốc
2.1.3.1. Cấy ghép tế bào gốc
Cấy ghép tế bào gốc đang là một phương pháp hữu hiệu nhất để chữa trị một số bệnh
hiểm nghèo như ung thư, các bệnh về gan… Các tế bào gốc đưa vào cơ thể có chức năng
bù đắp vai trò của các tế bào hỏng, hoặc có thể là phụ giúp trong q trình hóa trị liều cao.
Khi cấy ghép các tế bào gốc, chúng phải được thu nhận và làm giàu thông qua nuôi cấy hay
các phương pháp khác để sau đó đưa vào cơ thể bệnh nhân. Trong cơ thể bệnh nhân, các tế
bào gốc này sẽ biệt hóa và khơi phục lại những


7


tổn thương, mất mát trong bệnh nhân. Hiện nay, có hai phương pháp cấy ghép tế bào gốc:
cấy ghép tự thân, cấy ghép đồng loại. Cấy ghép đồng loại là cấy ghép tế bào gốc của người
khác, có thể là người thân hoặc người khả năng phù hợp với cơ thể bệnh nhân về các chỉ
tiêu sinh lý hóa. Điều này dẫn tới một số hạn chế như thải loại ghép, thời gian chờ đợi
nguồn cho tế bào gốc… Khác với nó, cấy ghép tự thân là sử dụng chính tế bào gốc của
bệnh nhân, ghép vào cơ thể của họ. Vì thế giảm thiểu được khả năng thải loại ghép và tránh
tình trạng chờ đợi nguồn cho. Do đó, cấy ghép tế bào gốc tự thân đang là một phương pháp
đầy hứa hẹn cho nền y học hiện nay.

Hình 2.2. Cấy ghép tế bào gốc tự thân (bên trái), cấy ghép đồng loại (bên phải)

2.1.3.2. Công nghệ mô, cấy ghép cơ quan
Mục tiêu của công nghệ mô là tái tạo các cấu trúc sinh học bằng sửa chữa thay thế
các mô bị tổn thương. Ba yếu tố cấu thành nên công nghệ mô là: (1) tế bào phải

8


hiện diện để tạo ra mô cấu trúc; (2) nhân tố phát triển thích hợp và các kích
thích biệt hóa cho tế bào phải tồn tại để biến đổi tế bào thành dịng thích hợp;
(3) các chất nền làm giàn giáo hoạt động giúp cho sự bám dính bề mặt tế bào,
sự biệt hóa và sự trưởng thành mơ mong muốn (Phan Kim Ngọc, 2009).
Hai ứng dụng của các tế bào gốc thường thấy trong công nghệ mô là tái tạo da có liên
quan đến sự hình thành cấu trúc của các phiến hai chiều và sự hình thành xương liên quan
đến quá trình tái cấu trúc của cấu trúc bên trong dạng ba chiều.

2.1.3.3. Liệu pháp gen

Liệu pháp gen có thể được phát huy bằng cách sử dụng tế bào gốc biến đổi di
truyền như một vector mang gen chuyển. Để ứng dụng thành công liệu pháp gen tế
bào gốc, đòi hỏi các gen liệu pháp được đưa vào đang còn khả năng tự làm mới
hay trong các thế hệ con cháu đã biệt hóa của chúng. Nguyên tắc đảm bảo có sự
tồn tại của gen mục tiêu trong các tế bào chủ thì gen chuyển phải được sát nhập
vào một trong các nhiễm sắc thể của tế bào hoặc có sự hợp nhất gen mục tiêu vào
bên trong các vi nhiễm sắc thể trong quá trình tổng hợp. Ngồi ra, trong liệu pháp
gen tế bào gốc cịn tiến hành sửa chữa bộ gen, đầu tiên phân phối các phân tử sửa
chữa vào tế bào, sao cho việc này không làm mất chức năng SCs và đồng thời phải
sửa chữa thành cơng trực tiếp lên trình tự gen trong các SCs (Phan Kim Ngọc,
2009). Các rủi ro do hệ thống mang gen có thể gây ra và sự đáp ứng thải loại miễn
dịch. Sử dụng tế bào gốc đưa gen vào cơ thể, nghĩa là thu nhận tế bào sinh dưỡng
trưởng thành của cơ thể dùng để cho nhân, nhân này được chuyển vào tế bào
trứng loại bỏ nhân và sau đó tế bào này sẽ phát triển tạo thành phôi mới.

9


2.1.3.4. Kiểm nghiệm hóa chất

Hình 2.3. Sử dụng iPS cell trong thử nghiệm thuốc
Nguồn: />
Đối với các tế bào ở các mơ non, khối u lành tính; thì những tế bào gốc là
những tế bào bình thường về di truyền, đồng nhất trong quần thể, nên có thể
ni cấy và duy trì trong một thời gian dài, và khắc phục được hạn chế của các
kết luận dựa trên chức năng gen. Do vậy, tế bào gốc là công cụ quan trọng cho
sự phát triển các hệ thống mơ hình in vitro thử nghiệm thuốc và hóa chất, ngồi
ra chúng cịn có tiềm năng dự đốn trước độc tính trong cơ thể người.

2.1.3.5. Biến đổi gen động vật

Có thể chuyển gen bằng cách biến đổi di truyền các tế bào gốc. Các phương
pháp thường dùng như: chuyển NST, lai tế bào, dung hợp vi tiêm tế bào, chuyển
DNA bằng calcium phosphate, vi tiêm DNA, sử dụng retrovirus vector và điện
khoan…Các tế bào gốc phôi ở giai đoạn 16 – 32 tế bào được sử dụng để biến nạp
gen bằng cách nhiễm với vector virus. Sau khi chọn ra các tế bào đã được biến nạp
gen chuyển, tiến hành đưa chúng vào phôi khác ở giai đoạn phôi nang để tạo ra
động vật chuyển gen thể khảm. Tỷ lệ các phôi sống sau thao tác khá cao (80%),
trong đó 90% biểu hiện tính trạng của gen chuyển. Tiếp đó, người ta tiến hành lai
tạo qua các đời, để thu được động vật đồng hợp tử về các tính trạng mong muốn
đã được chuyển trước đó (Phan Kim Ngọc, 2009).

10


2.1.3.6. Điều trị bệnh tự miễn
Bệnh tự miễn là kết quả của sự hoạt hóa sai lệch của hệ thống miễn dịch,
thông qua sự kết hợp của các nhân tố môi trường và di truyền với nhau, dẫn tới
sự thất bại trong các cơ chế duy trì tính kháng miễn dịch (Phan Kim Ngọc,
2009). Các liệu pháp phổ biến để điều trị bệnh tự miễn là làm giảm sự phản ứng
miễn dịch hay loại bỏ sự đáp ứng đó. Việc làm nay khiến bệnh nhân dễ bị nhiễm
các bệnh khác, đe dọa đến sự sống. Nghiên cứu về tế bào gốc hiện đang cung
cấp chiến lược mới để hủy bỏ các tế bào miễn dịch bị “lạc đường”, và tái tạo trả
lại cho cơ thể các tế bào miễn dịch bình thường. Hiện nay, việc cấy ghép tế bào
gốc được xem là một phương pháp chữa trị bệnh tự miễn. Cho tới nay, phương
pháp này đã thu được những kết quả đáng kể. Tháng 11, 2010; ca ghép đầu tiên
đã thành công tại bệnh viên Quân đội Trung ương 108 trực tiếp tiến hành.

2.2. TẾ BÀO GỐC CUỐNG RỐN
2.2.1. Cấu tạo, chức năng của dây rốn
Dây rốn là đoạn kết nối giữa rốn của thai nhi và nhau thai bám ở

thành tử cung của người mẹ, có vai trị là cầu nối giữa người mẹ và em
bé để vận chuyển chất dinh dưỡng từ người mẹ chuyển qua đứa trẻ.
Dây rốn thường có chiều dài 50 cm và dày 2 cm, có một tĩnh mạch và hai động
mạch bao quanh bởi các mơ nhầy hay gelatin, cịn gọi là lớp Wharton’s jelly (WJ) và
được bọc bởi màng ối. Có thể xác định ba vùng khác nhau của lớp WJ: vùng dưới
màng ối, chất nền Wharton, và lớp mô bao quanh các mạch máu. Vùng chất nền
Wharton gồm các phân tử collagen loại I, III, VI nằm ở trong những khoảng khơng
gian có hình dạng giống như rãnh. Xung quanh rãnh này là các phân tử collagen
loại VI, laminin và heparin sulfate proteoglycan. Các khoảng không gian chứa đầy
chất nền Wharton có dạng rãnh được bao quanh bởi các tế bào chất nền là các
nguyên bào sợi cơ mảnh có dạng ống biểu hiện vimentin, desmin và actin cơ trơn.
Dây rốn giai đoạn sớm chỉ có vimentin và desmin. Cấu trúc và thành phần của dây
rốn giúp bảo vệ các mạch máu khỏi bị nén và cũng có thể hỗ trợ quá trình trao đổi
giữa máu dây rốn và dịch ối (hình 2.4).

11


Hình 2.4. Cấu tạo của dây rốn
Các nghiên cứu mới đây chỉ ra rằng dây rốn là một nguồn giàu TBG.
Có hai loại TBG đã được xác định trong dây rốn: TBGTM từ lớp WJ, tĩnh
mạch, các vùng xung quanh và giữa các động mạch, vùng dưới màng ối
và máu của dây rốn; TBG tạo máu từ máu dây rốn (Ishige et al., 2009).

2.2.2. Tế bào gốc dây rốn
2.2.2.1. Đặc điểm tế bào gốc dây rốn
Cuống rốn là một trong những nguồn tế bào gốc trung mô dồi dào
nhất. Tế bào gốc có nguồn gốc từ mơ cuống rốn phù hợp nhất cho tái
sinh mô, do chức năng sửa chữa mơ của tế bào gốc trung mơ. Hơn
nữa, nó lại là một phụ phẩm sau sinh, do đó, sử dụng cuống rốn làm

nguồn thu nhận tế bào gốc là một hướng phát triển đầy hứa hẹn.
Cuối thập niên 80 và đầu thập niên 90, các thầy thuốc nhận thấy máu từ cuống
rốn và nhau của người rất giàu tế bào gốc tạo máu (Hematopoietic Stem Cell_ HSC).
Máu dây rốn là một nguồn tế bào gốc tạo máu vô cùng quý giá (Phan Kim Ngọc,
2008). Từ thành công đầu tiên của việc cấy ghép tế bào từ máu dây rốn cho trẻ em,
đến nay, việc thu nhận và cấy ghép tế bào này đã phát triển nhanh chóng.
5

Cuống rốn người đem lại số lượng lớn MSC, 4x10 tế bào mỗi mẫu, hoặc 105

15x10 tế bào cho 1 cm cuống rốn (Karahuseyinoglu et al., 2007). Ngoài ra, trong

12


chất nền Wharton’s Jelly của cuống rốn, cũng là một nguồn tế bào gốc trung mô dồi
dào. Wharton’s Jelly (WJ) là một mơ gelatin trong dây rốn có chứa các tế bào
stroma giống nguyên bào sợi (Dea Won Kim et al., 2013). Tế bào gốc trung mô được
phân lập, nuôi cấy từ toàn bộ dây rốn và từ màng Wharton’s Jelly bắt đầu mọc từ
ngày 11 và ngày 13. Sau 15 ngày, tế bào phát triển chiếm 2/3 đĩa nuôi cấy, mật độ tế
bào bắt đầu tăng. Tuy nhiên mật độ tế bào cao hơn ở đĩa nuôi cấy nguyên mơ cuống
rốn khi so sánh bằng kính hiển vi. Khơng có yếu tố tăng trưởng được thêm vào mơi
trường ni cấy trong cả 2 loại trong suốt quá trình phân lập và ni cấy (F.
Hendijani et al., 2014). Do đó, ở thí nghiệm này chúng tơi đã chọn ni cấy nguyên
vẹn mô cuống rốn là phương pháp để phân lập MSC.

Hiện nay đã có rất nhiều các ngân hàng cuống rốn được mở ra trên thế
giới cũng như trong Việt Nam. Theo báo Người lao động, tháng 5 năm 2008,
ngân hàng cuống rốn đầu tiên của Việt Nam chính thức đi vào hoạt động tại
thành phố Hồ Chí Minh. Tháng 3 năm 2014, ngân hàng lưu trữ máu cuống rốn

thứ 5 của Việt Nam ra mắt tại Hà Nội. Sau khi được thu thập, xử lý, kiểm tra chất
lượng và bảo quản, nó sẽ phục vụ điều trị các bệnh cần ghép tế bào gốc như:
các bệnh lý về máu (suy tủy, ung thư máu, thalassemia,…) và các bệnh lý khác.
Trong điều kiện nuôi cấy in vitro các tế bào lắng xuống đáy bình, bám vào bề mặt đáy
để sinh trưởng và sinh sản bằng phân bào, như vậy mặt tiếp xúc coi như điều kiện cần thiết
cho tế bào sinh sản. Chúng thường phát triển thành lớp tế bào trật tự cho tới khi bám hết
giá thể chúng ngừng sinh sản và không di động được do lực ức chế tiếp xúc bề mặt. Trái lại
tế bào ung thư có thể phát triển và sinh sản trong mơi trường nuôi cấy dạng lỏng sệt hoặc
dạng huyền phù và tạo thành các quần thể tế bào vô trật tự hoặc nhiều lớp chồng lên nhau
trên giá thể. Điều đặc biệt là các tế bào ung thư không chịu tác động của lực ức chế tiếp
xúc, chúng có thể di động chiếm một khơng gian nào đó cho đến khi chúng ngừng sinh sản.
Như vậy, in vivo cũng như in vitro tế bào lành của các mô chịu tác động của lực ức chế tiếp
xúc cũng như lực định vị, trái lại tế bào ung thư không chịu tác động của các lực đó. Điều
này có thể là do thay đổi trong tính di truyền cũng như trong cấu trúc và tính chất của màng
sinh chất của các tế bào ung thư đặc biệt là trong cấu trúc của các receptor màng đóng vai
trị nhận biết và đánh dấu. Do đó, có thể quan sát hình thái và độ bám dính để đánh giá tính
ổn định di truyền trong q trình tăng trưởng của TBG.

13


Về bộ máy di truyền, có sự khác biệt giữa tế bào lành và tế bào ung thư: tế
bào lành thường giữ bộ thể nhiễm sắc ổn định là 2n, trong khi đó các tế bào ung
thư thường có bộ thể nhiễm sắc dị bội (heteroploide) với các sai lệch rất đa dạng về
số lượng và cấu trúc. Hình thái nhiễm sắc của tế bào nhân chuẩn quan sát được ở
trung kỳ ngun phân thường có dạng hình chấm hoặc hình que và thường có kích
thước vào khoảng 0,2 – 3 μm đường kính và 0,2 – 50 μm chiều dài. Tuy nhiên ở các
mô khác nhau của cùng một cơ thể, có thể biến đổi hình dạng và kích thước để
thích nghi với chức năng của một giai đoạn phát triển. Nhiễm sắc thể ở người, bé
nhất là nhiễm sắc thể số 21 và 22 có kích thước L = 1,5 μm; còn chiếc lớn nhất là

nhiễm sắc thể số 1 có L = 10 μm. Nhuộm nhiễm sắc thể với thuốc nhuộm Giemsa và
quan sát hình thái, đếm số lượng của nhiễm sắc thể cũng là một phương pháp đánh
giá tính ổn định di truyền thường được sử dụng.

Tế bào lành còn khác biệt với tế bào ung thư trong nhiều đặc tính
sinh lý khác như chỉ số mitos (số tế bào đang phân bào trên 1000 tế
bào quan sát được với kính hiển vi thường), phân bào có hạn định nếu
mơi trường ni cấy được cấy chuyền đổi mới… (Shaer et al., 2014).
2.2.2.2. Tế bào gốc trung mô phân lập từ lớp Wharton Jelly (WJ) dây
rốn (hWJSCs)
Tế bào gốc trung mô phân lập từ lớp Wharton Jelly (WJ) dây rốn (hWJSCs
biểu hiện các chỉ thị của TBG, gồm chỉ thị của các loại tế bào ES, EG, các tế bào
tiền chất thần kinh hay TBG thần kinh, biểu hiện actin và vimentin cơ trơn, các
chỉ thị cho nguyên bào sợi cơ, nestin, enolase chuyên biệt thần kinh (NSE) và
protein sợi thần kinh đệm (glia Fibrillary xitic protein – IGFAP), c-kit, oct-4, Tra1,60; biểu hiện các mức thấp của telomerase và cũng hình thành các cấu trúc
tương tự các thể phôi khi nuôi cấy (Phan Kim Ngọc, 2009).
Qua phân tích bằng Flow cytometry, người ta thấy chúng có biểu hiện mức
cao các chỉ thị chất nền (CD44, CD105), chỉ thị integrin (CD29-CD51) và chỉ thị
TBGTM như: CD105, CD73, CD90 nhưng khơng biểu hiện các chỉ thị của dịng tạo
máu (CD34, CD45). Chúng có khả năng tăng sinh in vitro mạnh, và có thể cảm ứng
biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác: Đó là các tế bào cơ tim (cardiomyocyte) bằng
cách xử lý với 5 – azacytidine hay ni các TBG đó trong mơi trường cơ tim, kết

14


quả được chứng nhận là thành công khi chúng biểu biểu hiện các chỉ
thị tế bào cơ tim là N – cadtherin và troponi tim I …hWJSCs cịn có thể
biệt hóa thành các tế bào mỡ, sụn và xương bằng các yếu tố biệt hóa
phù hợp (Phan Kim Ngọc, 2009; Liu et al., 2014).

Flow cytometry là kỹ thuật phân loại, đánh giá và đếm tế bào theo
dòng chảy. Đây là phương pháp đếm và phân loại tế bào cho hiệu quả
rất cao (Sadettin et al, 2006). Nguyên tắc hoạt động là mỗi lần chỉ cho
một tế bào di chuyển ngang qua nguồn sáng kích thích, tia sáng va vào
tế bào chúng sẽ tán xạ hoặc hấp thu và phát ra một ánh sáng tán xạ.
2.2.3. Nghiên cứu về các phương pháp phân lập và nuôi hWJSCs
Tế bào gốc trung mô được xác định theo ba tiêu chuẩn: Bám trải
trên bề mặt nuôi cấy; biểu hiện các marker bề mặt CD73, CD90, CD105
và không biểu hiện các marker của tế bào tạo máu CD14, CD34, CD45
và HLA-DR lớp II; có khả năng tự làm mới và biệt hóa in vitro thành các
dòng tế bào khác nhau, bao gồm xương, mỡ và sụn.
Với mục đích nghiên cứu là phát triển các phương pháp thích hợp nhất để
phân lập TBGTM có nguồn gốc từ dây rốn người (hUCM – Human umbilical cord
matrix). Parvin Salehinejad và cộng sự đã thực hiện bốn nhóm phương pháp để
phân

lập

hWJSCs

(2012).

Bao

gồm

ba

nhóm


enzyme:

collagenase/hyaluronidase/trypsin (CHT), collagenase/trypsin (CT) và trypsin
(Trp) và một nhóm ni cấy mảnh mơ nhỏ (Exp). Ở cả bốn nhóm, đều phân lập
được các tế bào hUCM nhưng số lượng tế bào, khả năng tăng sinh, sự biểu
hiện các chỉ thị… của các tế bào bị cô lập ở các phương pháp là khác nhau.

Phân tích Flow cytometry cho thấy CD73, CD90 và CD105 được
thể hiện trong tất cả các nhóm, trong khi CD34 và CD45 khơng được
thể hiện. Các chỉ thị của TBGTM như CD73, CD90 được biểu hiện khác
nhau trong các nhóm khác nhau: CD90 biểu hiện cao nhất ở nhóm CT
và Exp; CD73 biểu hiện cao nhất ở nhóm Exp.
Về khả năng tăng sinh, nhóm Exp có khả năng tăng sinh cao nhất. Với các
nhóm enzyme, các tế bào không tiếp tục tăng sinh sau khoảng 30 ngày ni cấy,
nhưng ở nhóm Exp, tế bào có thể kéo dài thời gian tăng sinh tới 80 ngày.

15